CN109568645B - 一种复合生长因子促修复凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复合生长因子促修复凝胶及其制备方法与应用，其中，所述凝胶以羧甲基壳聚糖、羟乙基纤维素和透明质酸钠形成复合凝胶基体，然后在所述复合凝胶基体中负载有人碱性成纤维生长因子和人酸性成纤维生长因子，实现生长因子与凝胶基体的联用，仿生构建创面修复微环境以促进创面的愈合；所述制备方法是先制备复合凝胶基体，然后采用肝素钠和甘露醇作为蛋白保护剂，最后，将复合凝胶基体与活性成分混合，得到所述复合生长因子促修复凝胶。本发明所述复合生长因子促修复凝胶内复合有生长因子，仿生构建创面修复微环境，改善了创面区微环境，促进了伤口和创面的愈合，显著提高创面愈合率，缩短创面愈合时间。

Description

一种复合生长因子促修复凝胶及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于凝胶领域，尤其涉及复合有生长因子的凝胶及其制备方法与应用。

背景技术

创面愈合指的是因为外伤或其他伤病的病变造成组织缺损后，局部组织通过再生、修复、重建而进行修补的一系列病理生理过程。其是一个动态、复杂的过程，其涉及到细胞外基质、激酶、各类细胞和许多其他因素等。由于创面愈合过程中病理和生理过程的复杂性，因此，彻底实现组织再生是极其困难的。

发明内容

为了克服上述问题，本发明人进行了锐意研究，将人碱性成纤维生长因子(bFGF)和人酸性成纤维生长因子(aFGF)与水凝胶联用，仿生构建创面修复微环境以促进创面的愈合，从而完成本发明。

本发明的一方面在于提供一种复合生长因子促修复凝胶，具体体现在以下几个方面：

(1)一种复合生长因子促修复凝胶，其中，基于1000重量份凝胶，其由包括以下重量配比的原料成分制成：

(2)根据上述(1)所述的凝胶，其中，基于1000重量份凝胶，所述人碱性成纤维生长因子和人酸性成纤维生长因子的用量分别为0.01～0.02重量份，优选为0.015重量份。

(3)根据上述(1)或(2)所述的凝胶，其中，基于1000重量份凝胶，所述羧甲基壳聚糖的用量为15～35重量份，羟乙基纤维素的用量为2～10重量份；优选地，所述羧甲基壳聚糖的用量为30重量份，羟乙基纤维素的用量为5重量份。

(4)根据上述(1)至(3)之一所述的凝胶，其中，基于1000重量份凝胶，所述透明质酸钠的用量为1～10重量份，优选为2～8重量份，例如5重量份。

(5)根据上述(1)至(4)之一所述的凝胶，其中，所述凝胶还包含甘油和抑菌剂，优选地，所述抑菌剂包括尼泊金甲酯和任选的尼泊金丙酯。

(6)根据上述(1)至(5)之一所述的凝胶，其中，基于1000重量份凝胶，

所述甘油的用量为10～50重量份，优选为20～50重量份，更优选为50重量份。

(7)根据上述(1)至(6)之一所述的凝胶，其中，基于1000重量份凝胶，任选地，所述尼泊金甲酯的用量为0.5～2重量份，尼泊金丙酯的用量为0.05～0.8重量份；优选地，所述尼泊金甲酯的用量为1～2重量份，任选地，尼泊金丙酯的用量为0.1～0.5重量份；更优选地，所述尼泊金甲酯的用量为1重量份，任选地，尼泊金丙酯的用量为0.2～0.4重量份。

(8)根据上述(1)至(7)之一所述的凝胶，其中，

所述凝胶还包含肝素钠和甘露醇，优选地，基于1000重量份的凝胶，所述肝素钠的用量为0.02～0.2重量份，甘露醇的用量为5～20重量份；和/或

所述凝胶于2～6℃保存，例如4℃。

本发明第二方面提供了一种上述(1)至(8)所述复合生长因子促修复凝胶的制备方法，其中，所述方法包括以下步骤：

步骤1、将尼泊金甲酯和任选的尼泊金丙酯加入水中，得到抑菌剂水溶液；

步骤2、将羧甲基壳聚糖、羟乙基纤维素、透明质酸钠和甘油加入步骤1得到的抑菌剂水溶液中，搅拌，然后进行灭菌处理，得到凝胶基体；

步骤3、将人碱性成纤维生长因子、人酸性成纤维生长因子、肝素钠和甘露醇加入水中，然后过滤除菌，得到活性成分；

步骤4、将步骤2得到的凝胶基体与步骤3得到的活性成分混合，搅拌，得到所述复合生长因子促修复凝胶。

本发明第三方面提供了上述(1)至(8)所述复合生长因子促修复凝胶或第二方面所述方法得到的复合生长因子促修复凝胶用于创面修复的应用。

附图说明

图1示出实施例得到的凝胶的扫描电镜图；

图2示出实施例1得到的凝胶中人碱性成纤维生长因子(bFGF)和人酸性成纤维生长因子(aFGF)的稳定性结果图；

图3示出实施例1(b)和空白组(a)对金黄色葡萄球菌的抗菌性能检测结果；

图4示出实施例1(b)和空白组(a)对大肠杆菌的抗菌性能检测结果；

图5示出采用实施例所述凝胶以及对照组(生理盐水)分别对大鼠进行创面修复实验结果；

图6示出采用实施例1所述凝胶以及对照组(生理盐水)进行大鼠创面修复时，创面修复面积与修复时间的关系结果图。

具体实施方式

下面通过实施例和实验例对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。

本发明一方面提供了一种复合生长因子促修复凝胶，其中，基于1000重量份凝胶，其由包括以下重量配比的原料成分制成：

其中，以人碱性成纤维生长因子和人酸性成纤维生长因子为活性成分，以羧甲基壳聚糖、羟乙基纤维素和透明质酸钠形成凝胶基质。其中，所述羧甲基壳聚糖和羟乙基纤维素之间可以通过氢键进行复合，形成可降解的水凝胶，用于承载生长因子。

在本发明中，采用羧甲基壳聚糖为凝胶主体的原因在于：

(1)其水溶性天然高分子，具有良好的生物相容性、生物可降解性，无毒副作用；(2)其具有一定的接触抑菌作用；(3)其具有止血作用，对血液中的红血球有凝聚作用，促进凝血，这是因为其所富含的正电荷与细胞表面带负电荷的胞壁酸相互吸引，引起血细胞的聚集，达到止血的目的；(4)其具有弱碱性，其表面的Zeta电势不是很高的正值，表明其不会对周围的组织产生强烈的刺激作用，故而可以止痛，还具有消炎作用；(5)其可以防止创面粘连；(6)可与生长因子协同促创面愈合。

根据本发明一种优选的实施方式，基于1000重量份凝胶，所述人碱性成纤维生长因子和人酸性成纤维生长因子的用量分别为0.01～0.02重量份。

在进一步优选的实施方式中，基于1000重量份凝胶，所述人碱性成纤维生长因子和人酸性成纤维生长因子的用量分别为0.015重量份。

其中，人碱性成纤维生长因子可参与多种组织的创伤修复过程，是重要的创伤愈合因子之一，对烧伤、外伤及各种慢性难愈合创面具有显著的促修复作用，并且安全、有效、无不良反应；人酸性成纤维生长因子对深二度烧伤及削痂术后应用具有良好的促愈合作用，因此，在本发明中，选择修复用生长因子用以促进创面愈合。

根据本发明一种优选的实施方式，基于1000重量份凝胶，人碱性成纤维生长因子和人酸性成纤维生长因子的总用量为0.03重量份。

其中，生长因子总浓度应控制在30μg/g，与临床生长因子用药浓度接近，从而避免高浓度生长因子潜在的致癌性。

根据本发明一种优选的实施方式，基于1000重量份凝胶，所述羧甲基壳聚糖的用量为15～35重量份，羟乙基纤维素的用量为2～10重量份。

在进一步优选的实施方式中，基于1000重量份凝胶，所述羧甲基壳聚糖的用量为30重量份，羟乙基纤维素的用量为5重量份。

其中，羧甲基壳聚糖和羟乙基纤维素的用量对凝胶的形成至关重要，尤其是羟乙基纤维素。具体地，若羟乙基纤维素的用量太少，体系粘度太小，不能形成凝胶；若羟乙基纤维素的用量太多，会导致体系中形成的氢键密度过大，体系的物理交联程度过大，这样，导致体系的粘度太大，涂抹困难，而且会导致凝胶中的活性生长因子不易释放。因此，在本发明中，严重控制羧甲基壳聚糖和羟乙基纤维素的用量。

在本发明中，所述羧甲基壳聚糖粘均分子量为200000～300000Da，羟乙基纤维素在20℃下、2％水溶液中的黏度为1500～2500mpa·s，因为，在这个黏度以及适当添加比例条件下能使凝胶保持稳定的形态。

其中，本发明中凝胶骨架主体为羧甲基壳聚糖，是通过引入羧甲基而破坏了壳聚糖的二次结构，故不具备很强的阳离子特征，其可与其他很多大分子进行复配，扩展了其使用范围。

根据本发明一种优选的实施方式，基于1000重量份凝胶，所述透明质酸钠的用量为1～10重量份。

在进一步优选的实施方式中，基于1000重量份凝胶，所述透明质酸钠的用量为2～8重量份，例如5重量份。

其中，采用透明质酸钠与羧甲基壳聚糖和羟乙基纤维素形成复合凝胶基体，其以独特的分子结构和理化性质在基体内显示出多种重要的生理功能，如水电解质扩散及运转、润滑修复、促进创伤愈合等。另外，透明质酸钠分子链单糖间存在氢键，使透明质酸钠在空间上呈刚性的柱形螺旋结构，因此，透明质酸钠不仅可以为凝胶基体提供网络结构支撑，还具有促创面修复的作用，同时羧甲基壳聚糖和羟乙基纤维素还可以与透明质酸钠很好的复合，水分子可以与三者通过氢键结合，使水分不易流失，此外，透明质酸钠还有稳定生长因子的作用。

根据本发明一种优选的实施方式，所述凝胶还包含甘油和抑菌剂。

其中所述甘油在凝胶中的作用为保湿剂、助溶剂。

在进一步优选的实施方式中，所述抑菌剂包括尼泊金甲酯和任选的尼泊金丙酯。

其中，所述尼泊金甲酯和尼泊金丙酯均为良好的抑菌剂，同时，两者之间具有复配作用，具体地，在两者的共同作用下，可杀铜绿色单假胞菌，而所述铜绿色单假胞菌容易引发伤口感染、脓肿，严重情况下，在烧伤后感染可引发死亡。因此，在本发明中，采用尼泊金甲酯和尼泊金丙酯作为复合抑菌剂。但是，由于尼泊金丙酯的水溶性稍微差一点，因此，在配方中加入甘油，可以促进尼泊金丙酯在水中的溶解。

根据本发明一种优选的实施方式，基于1000重量份凝胶，所述甘油的用量为10～50重量份。

在进一步优选的实施方式中，基于1000重量份凝胶，所述甘油的用量为20～50重量份。

在更进一步优选的实施方式中，基于1000重量份凝胶，所述甘油的用量为50重量份。

其中，甘油在这个范围内不仅使凝胶具有较好的保湿效果，同时使凝胶保持良好的分散性。

根据本发明一种优选的实施方式，基于1000重量份凝胶，所述尼泊金甲酯的用量为0.5～2重量份，任选地，尼泊金丙酯的用量为0.05～0.8重量份。

在进一步优选的实施方式中，基于1000重量份凝胶，所述尼泊金甲酯的用量为1～2重量份，任选地，尼泊金丙酯的用量为0.1～0.5重量份。

在更进一步优选的实施方式中，基于1000重量份凝胶，所述尼泊金甲酯的用量为1重量份，任选地，尼泊金丙酯的用量为0.2～0.4重量份。

其中，所述抑菌剂以尼泊金甲酯为主，任选地加入尼泊金丙酯。

根据本发明一种优选的实施方式，所述凝胶还包含肝素钠和甘露醇。

其中，所述肝素钠和甘露醇作为蛋白保护剂，用于保护生长因子的活性。甘露醇是生长因子稳定剂，而肝素钠是可以与生长因子结合的物质，其可以维持生长因子的生物活性、延缓生长因子的释放，实现控制缓释，防止生长因子从凝胶内快速释放。

在进一步优选的实施方式中，基于1000重量份的凝胶，所述肝素钠的用量为0.02～0.2重量份，甘露醇的用量为5～20重量份。

在更进一步优选的实施方式中，基于1000重量份的凝胶，所述肝素钠的用量为0.05～0.15重量份，例如0.1重量份，甘露醇的用量为5～15重量份，例如5重量份。

其中，肝素钠和甘露醇作为蛋白保护剂，其用量不宜太少，太少不起作用，也不宜太多，太多可能会引起负效应，尤其是肝素钠，尤其其抗凝血性，因此，需要严重控制器剂量，防止副作用的产生。

在本发明中，肝素钠可以分别与人碱性成纤维生长因子和人酸性成纤维生长因子形成稳定复合物，保持生长因子的生物活性，同时可以减缓生长因子的释放。具体地，肝素钠能够增强生长因子的有丝分裂促进活性，也能防止生长因子因酸或热而引起的失活，以及蛋白酶引起的降解，有效地保护生长因子的活性，稳定分子构象。

在本发明中，人碱性成纤维生长因子和人酸性成纤维生长因子的总用量与肝素钠的用量比为(3～5)：1，甘露醇浓度为0.5％～2％，在比例下生长因子有较好的稳定性。

根据本发明一种优选的实施方式，所述凝胶于2～6℃保存。

在进一步优选的实施方式中，所述凝胶于4℃保存。

本发明另一方面提供了一种上述复合生长因子促修复凝胶的制备方法，所述方法包括以下步骤：

步骤1、将尼泊金甲酯和任选的尼泊金丙酯加入水中，得到抑菌剂水溶液；

步骤2、将羧甲基壳聚糖、羟乙基纤维素、透明质酸钠和甘油加入步骤1得到的抑菌剂水溶液中，搅拌，然后进行灭菌处理，得到凝胶基体；

步骤3、将人碱性成纤维生长因子、人酸性成纤维生长因子、肝素钠和甘露醇加入水中，然后过滤除菌，得到活性成分；

步骤4、将步骤2得到的凝胶基体与步骤3得到的活性成分混合，搅拌，得到所述复合生长因子促修复凝胶。

根据本发明一种优选的实施方式，在步骤2中，所述灭菌处理为G₆₀灭菌或高温高压灭菌，优选G₆₀灭菌。

在进一步优选的实施方式中，所述凝胶在10KGy剂量的G₆₀辐射处理或者121℃高温高压下10～20分钟。

其中，在步骤2中，G₆₀辐射灭菌或者高温高压灭菌后凝胶基质黏度均有一定程度下降，加入甘油对胶体还有一定的保护作用。

根据本发明一种优选的实施方式，在步骤4中，于无菌条件下进行。

在进一步优选的实施方式中，在步骤4中，在搅拌后分装铝管，封口处理。

在本发明所述的制备方法中，先将生长因子与肝素钠和甘露醇混合，然后再于凝胶基体混合，这样的目的是先形成肝素钠/甘露醇-生长因子复合物。在本发明第一方面已有相关陈述，肝素钠/甘露醇的作用是保持生长因子的活性和稳定性。由于凝胶基质需要进行G60或高温灭菌，而如果不先进行肝素钠/人血白蛋白-生长因子的复配，而是直接与凝胶基质混合，则肝素钠会与羟甲基壳聚糖混合而影响其与生长因子的复配，原因在于，肝素钠具有强负电荷，而羟甲基壳聚糖带有正电荷，因此，两者之间会产生静电作用而结合，进而会影响肝素钠与生长因子的结合，因此在本发明中，先将肝素钠与生长因子进行复配处理，再与凝胶基质混合。

本发明第三方面提供了本发明第一方面所述凝胶或本发明第二方面所述制备方法得到的凝胶用于创面修复的应用。

其中，所述凝胶可以用于创面修复，在短时间内实现创面愈合。

本发明所具有的有益效果包括：

(1)本发明所述复合生长因子促修复凝胶以具有生物相容性的羧甲基壳聚糖和羟乙基纤维素形成主要的凝胶基体，同时在其中加入透明质酸钠提供凝胶骨架，形成复合凝胶基体；

(2)本发明所述复合生长因子促修复凝胶内复合有生长因子，仿生构建创面修复微环境，改善了创面区微环境，促进了伤口和创面的愈合，显著提高创面愈合率，缩短创面愈合时间；

(3)本发明所述复合生长因子促修复凝胶内还含有肝素钠和甘露醇，可以保持生长因子的活性，并控制生长因子进行缓释；

(4)本发明所述复合生长因子促修复凝胶具有良好的抑菌性能，具有一定的控制创面感染、促进创面愈合的作用；

(5)本发明所述方法简单，易于实现。

实施例

以下通过具体实施例进一步描述本发明。不过这些实施例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

其中，在实施例中，所述人碱性成纤维生长因子和人酸性成纤维生长因子购于西格玛(Sigma)。

实施例1

将1g尼泊金甲酯和0.1g尼泊金丙酯加入900g水中，得到抑菌剂水溶液；

将20g羧甲基壳聚糖、8g羟乙基纤维素、5g透明质酸钠和15g甘油加入步骤1得到的抑菌剂水溶液中，搅拌，然后进行10KGy辐射灭菌，得到凝胶基体；

将15mg人碱性成纤维生长因子、15mg人酸性成纤维生长因子、0.1g肝素钠和10g甘露醇加入100g水中溶解，然后过滤除菌，得到活性成分；

于无菌条件下，将得到的凝胶基体与活性成分混合，搅拌均匀，分装铝管，封口，得到所述复合生长因子促修复凝胶。

实施例2

将2g尼泊金甲酯和0.5g尼泊金丙酯加入900g水中，得到抑菌剂水溶液；

将30g羧甲基壳聚糖、6g羟乙基纤维素、10g透明质酸钠和20g甘油加入步骤1得到的抑菌剂水溶液中，搅拌，然后进行10KGy辐射灭菌，得到凝胶基体；

将10mg人碱性成纤维生长因子、10mg人酸性成纤维生长因子、0.2g肝素钠和6g甘露醇加入100g水中溶解，然后过滤除菌，得到活性成分；

于无菌条件下，将得到的凝胶基体与活性成分混合，搅拌均匀，分装铝管，封口，得到所述复合生长因子促修复凝胶。

实施例3

将0.5g尼泊金甲酯加入900g水中，得到抑菌剂水溶液；

将15g羧甲基壳聚糖、10g羟乙基纤维素、1g透明质酸钠和5g甘油加入步骤1得到的抑菌剂水溶液中，搅拌，然后进行10KGy辐射灭菌，得到凝胶基体；

将20mg人碱性成纤维生长因子、20mg人酸性成纤维生长因子、0.15g肝素钠和20g甘露醇加入100g水中溶解，然后过滤除菌，得到活性成分；

于无菌条件下，将得到的凝胶基体与活性成分混合，搅拌均匀，分装铝管，封口，得到所述复合生长因子促修复凝胶。

对比例

对比例1

重复实施例1的过程，区别在于：羟乙基纤维素的用量为30g。

发现得到的凝胶粘度很大，无法涂抹在创面上。

对比例2

重复实施例1的过程，区别在于：采用等量的卡波姆替换羧甲基壳聚糖和羟乙基纤维素，得到凝胶。

实验例

实验例1稳定性检测

将实施例1和对比例2制得的凝胶分别装于试管内，密封后放置4℃下，分别于1周、2周、4周、6周和8周检测凝胶的外观、PH值、黏度、涂感。其中，实施例1得到的凝胶检测结果如表1所示，对比例2得到的凝胶检测结果如表2所示。

表1：

	凝胶外观	PH值	是否分层	涂感	黏度
						一周	无分层	6.5	否	良好	27020mp.s
二周	无分层	6.5	否	良好	26326mp.s
						四周	无分层	6.5	否	良好	25114mp.s
六周	无分层	6.5	否	良好	24978mp.s

表2：

由上表可以看出，相较于对比例2得到的凝胶，本发明所述凝胶具有更好的稳定性。而对比例2得到的凝胶，随着放置时间的延长，粘度下降严重，从而也导致涂感变差。

实验例2扫描电镜检测

将实施例1制得的凝胶进行电镜检测，样品先进行低温处理，再冰冻干燥，进行扫描电镜检测，结果如图1所示。

由图1可以看出，凝胶中具有非常规则的微孔结构，在进行创面修复时，所述微孔结构可以促进药物释放，达到良好的修复效果，缩短修复时间。

实验例3生长因子稳定性检测

取实验例1制得的凝胶，生长因子Elisa试剂盒检测两种生长因子效价，结果如图2所示。

由图2可以看出，在放置数周、甚至数月后，人碱性成纤维生长因子(bFGF)和人酸性成纤维生长因子(aFGF)依然保持很高的稳定性，达到90％以上。

实验例4抗菌性检测

对实施例1制得的凝胶以及空白组(生理盐水)进行金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌性能检测，结果分别如图3和图4所示，其中，a表示空白组，b表示实施例1。

与空白组相比，实施例1得到的凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均出现抑菌圈(图3中b和图4中b箭头处)，说明，本发明所述凝胶具有一定的抑制细菌生长的作用，其抑菌能力可能来自羧甲基壳聚糖与抑菌剂的协同作用。

实施例5大鼠创面修复实验

将大鼠背部皮肤剃毛，先用记号笔画圈，然后用剪刀剪皮肤，形成直径约12mm的圆形创面，每天进行创面消毒和实施例1得到的凝胶处理，观察大鼠皮肤愈合情况。每组6只重复。同时，进行对照组实验，其中，对照组为生理盐水处理。创面修复情况分别如图5和图6所示。

其中，在图5和图6中可知，与对照组相比，本发明所述凝胶能加快创面愈合速度，在14d左右基本愈合。

同样，采用对比例2得到的凝胶对大鼠创面进行处理，发现，在相同处理时间下，其创面愈合情况差于本申请所述凝胶对大鼠的愈合情况，并且，采用对比例2得到的凝胶，需要大约18天左右才能愈合。

猜测原因在于，本申请所述凝胶采用羧甲基壳聚糖、羟乙基纤维素以及透明质酸钠作为复合凝胶基质，由实验例2也知，得到的凝胶具有微孔状结构，这样，所述凝胶不仅具有良好的应用强度，而且能够促进药物释放，达到良好的修复效果，缩短修复时间。

以上结合优选实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明。不过需要声明的是，这些具体实施方式仅是对本发明的阐述性解释，并不对本发明的保护范围构成任何限制。在不超出本发明精神和保护范围的情况下，可以对本发明技术内容及其实施方式进行各种改进、等价替换或修饰，这些均落入本发明的保护范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。

Claims (1)

1.一种复合生长因子促修复凝胶的制备方法，其特征在于，基于1000重量份凝胶，其由包括以下重量配比的原料成分制成：

所述凝胶还包含甘油和抑菌剂，所述抑菌剂包括尼泊金甲酯和尼泊金丙酯；

基于1000重量份凝胶，所述甘油的用量为50重量份，所述尼泊金甲酯的用量为1重量份，尼泊金丙酯的用量为0.2～0.4重量份；

所述凝胶还包含肝素钠和甘露醇，基于1000重量份的凝胶，所述肝素钠的用量为0.1重量份，甘露醇的用量为5重量份；

所述凝胶于4℃保存；

所述方法包括以下步骤：

步骤1、将尼泊金甲酯和任选的尼泊金丙酯加入水中，得到抑菌剂水溶液；

步骤2、将羧甲基壳聚糖、羟乙基纤维素、透明质酸钠和甘油加入步骤1得到的抑菌剂水溶液中，搅拌，然后进行灭菌处理，得到凝胶基体；

步骤3、将人碱性成纤维生长因子、人酸性成纤维生长因子、肝素钠和甘露醇加入水中，然后过滤除菌，得到活性成分；

步骤4、将步骤2得到的凝胶基体与步骤3得到的活性成分混合，搅拌，得到所述复合生长因子促修复凝胶。

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