CN109557065A - 一种检测土壤中β-D-葡萄糖苷酶活性的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测土壤中β‑D‑葡萄糖苷酶活性的分析方法，属于酶活性检测技术领域。该装置包括如下步骤：酶活性＝[(RS‑BU)*(SA‑SC)/(QS‑SC)]‑(NC‑BU)]*b*2*3000/(0.3*W*200)，其中，SC为上清液+50μl的醋酸缓冲液所测荧光强度值，QS为上清液+50μl的标样液所测荧光强度值，SA为上清液+50μl的4‑甲基伞形酮‑β‑D‑葡萄糖苷底物溶液所测荧光强度值，BU为200μl的醋酸缓冲液+50μl醋酸缓冲液所测荧光强度值，RS为200μl的醋酸缓冲液+50μl的标准品溶液所测荧光强度值，NC为200μl的醋酸缓冲液+50μl的4‑甲基伞形酮‑β‑D‑葡萄糖苷底物溶液所测荧光强度值。本发明可以减小背景值，能排除样品与荧光基团互作的背景值，排除缓冲液对标准品的背景值，提高测量结果的准确性，样品及药品用量少。
Description
技术领域
本发明涉及酶活性检测技术领域，特别涉及一种检测土壤中β-D-葡萄糖苷酶活性的分析方法。
背景技术
土壤胞外酶在生态系统中扮演着重要角色，其活性高低反映土壤微生物新陈代谢状况，对于保持土壤肥力和植物生产力极其重。β-D-葡萄糖苷酶，一种更准确检测土壤中β-D-葡萄糖苷酶活性的分析方法是目前研究最广泛的一种土壤酶，深度参与土壤有机质的转化过程，主要是由以纤维素为底物的微生物分泌，水解纤维二糖和其他水溶性的纤维糊精产生形成葡萄糖，供微生物自身生长利用，能够指示以土壤中有机或无机碳为底物的异养型呼吸强度，在有机质分解中起重要作用。总的说来，土壤β-D-葡萄糖苷酶的活性反映了土壤形成的生物气候及生态学条件、土壤生物化学过程的强度及土壤肥力水平。在进行土壤肥力评价时，常常需要测定在不同条件下的β-D-葡萄糖苷酶活性进行说明，因此，建立一种相对快速准确的β-D-葡萄糖苷酶活性的检测方法具有很重要的意义。
目前在酶检测领域发展成熟的一种方法是以伞形酮作为底物的内置荧光团结合β-消除反应的检测法，伞形酮又称7-羟基香豆素，是一种强荧光染料，以伞形酮标记底物作为探针，在酶催化作用下产物发生分子内β-消除反应而使底物上的伞形酮脱落，通过荧光强度的变化反映酶活。该方法被广泛应用于检测多种酶。
由于当前多功能酶标仪对荧光强度的检测具有很高的灵敏度，因此缓冲液、土壤、底物以及荧光基团与他们之间相互影响的背景值，对与检测结果的准确性具有很大影响。现今广泛运用的酶活荧光检测技术，仅仅通过无土对照和无底物对照，排除了土壤及底物的背景值，对于荧光检测这种相当灵敏的检测方法，任何的背景干扰对于结果的准确性都具有相当影响。
发明内容
本发明提供一种检测土壤中β-D-葡萄糖苷酶活性的分析方法，可以排除样品与荧光基团互作以及缓冲液对标准品的背景值，可以提高测量结果的准确性。
一种检测土壤中β-D-葡萄糖苷酶活性的分析方法，包括如下步骤：
配制醋酸缓冲液，取4.1g醋酸钠、161μl冰醋酸和无菌去离子水水定容至1000ml并调节PH至5.5；
配制4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷底物溶液，称取6.762mg的4-甲基伞形酮和30μl二甲基亚砜溶解溶解，加无菌去离子水稀释定容至100ml；
配制标准品溶液，称取1.762mg的4-甲基伞形酮和30μl二甲基亚砜溶解，再定容至1000ml，制得10μM标准品溶液；
将标准品溶液用蒸馏水分别稀释成浓度为0、0.025μM、0.05μM、0.125 μM、0.25μM、0.5μM的标准溶液，制得标样液，分别用移液枪吸取50μl 至96孔板中，后分别加入200μl醋酸缓冲液，再分别加入20μl的1M NaOH 溶液，然后进行荧光检测，如此重复制作3条标准曲线；
称取2份0.3g的土壤鲜样于5ml离心管中，其中1份用于烘干测土壤含水量W，另1份加入3mL醋酸缓冲液均质混匀，在涡旋仪上高速震荡5分钟，再4℃低温4000R离心5分钟；
吸取3份容量为200μ的经离心后的土壤鲜样与醋酸缓冲液混合物的上清液至96黑孔板中，其中一份再加50μl醋酸缓冲液，一份加50μl的10μM 的标样液，另一份加50μl的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷底物溶液；
在37℃培养2h后向黑孔板中每孔加入20μl的1M的NaOH溶液，终止反应；
设置荧光检测仪读板温度37℃、酶标板震荡时间1min、激发波长350nm、发射波长450nm，然后测定每孔的荧光强度值；
以标样液浓度和测定的吸光值A制作标准曲线，得到斜率b；
通过如下公式计算得酶活性：
酶活性＝[(RS-BU)*(SA-SC)/(QS-SC)]-(NC-BU)]*b*2*3000/(0.3*W*200)，
其中，SC为上清液+50μl的醋酸缓冲液所测荧光强度值，QS为上清液+50 μl的标样液所测荧光强度值，SA为上清液+50μl的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷底物溶液所测荧光强度值，BU为200μl的醋酸缓冲液+50μl醋酸缓冲液所测荧光强度值，RS为200μl的醋酸缓冲液+50μl的标准品溶液所测荧光强度值，NC为200μl的醋酸缓冲液+50μl的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷底物溶液所测荧光强度值。
更优地，1M的NaOH溶液通过20gNaOH+蒸馏水定容至50ml制得。
本发明提供一种检测土壤中β-D-葡萄糖苷酶活性的分析方法，通过增加“样品+标准品”和“缓冲液”对照，最大化减小背景值，精确检验土壤中β -D-葡萄糖苷酶活性，能排除样品与荧光基团互作的背景值，排除缓冲液对标准品的背景值，提高测量结果的准确性，样品及药品用量少，节省检测成本。
具体实施方式
下面对本发明的一个具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
下面对玉米连作(A)、豆米轮作(B)和豆米米轮作(C)3个处理的土壤的β-D-葡萄糖苷酶活性进行测定，三种不同种植制度的土壤均为过2mm筛后的鲜土。
每种土壤的具体分析步骤如下：
1.标曲制作及测定：配制标准品溶液，称取1.762mg的4-甲基伞形酮和 30μl二甲基亚砜溶解，再定容至1000ml，制得10μM标准品溶液，将10μM 的标准品溶液用蒸馏水分别稀释成浓度为0、0.025、0.05、0.125、0.25、0.5 μM的标准溶液，制得标样液，在分别用移液枪吸取50μl至96孔板中，后分别加入200μl醋酸缓冲液，再分别加入20μl的1M NaOH溶液，然后进行荧光检测，如此重复制作3条标曲线。其中，荧光检测仪读板温度37℃，设定激发波长为350nm，发射波长为450nm，酶标板震荡时间1min。
2.称取9份0.3g的处理土壤鲜样分别置于9个5ml离心管中，并提前测定好各处理土壤含水量W，分别向离心管中加入3mL醋酸缓冲液均质混匀，在涡旋仪上高速震荡5分钟，再4℃低温4000R离心5分钟。
3.离心完后，每个样品用移液枪吸取200μ上清液3份分别96黑孔板中，其中一份再加50μl醋酸缓冲液，一份加50μl标准品溶液(10μM)，另一份加50μl底物(4-MUB-β-D-葡萄糖苷)溶液，MUB(甲基伞形酮)，加板示意图如表1所示，下表中所称底物溶液即4-MUB-β-D-葡萄糖苷溶液。
表1
4.加完板后，在37℃培养2h后向每孔中加入20μl的1M NaOH溶液，终止反应。
5.提前设定好，荧光检测仪读板温度37℃，将96黑孔板置于荧光检测酶标仪上，设定酶标板震荡时间1min，设定激发波长为350nm，发射波长为450nm. 测定每孔的荧光强度值。
6.以标样液的系列浓度和测定的吸光值A，制作标准曲线，计算斜率b，如表2所示：
表2
7.将表3中所测的3个处理的荧光值及标曲斜率的平均值5.00E-09代入如下公式：
酶活性(nmol h-1g-1)＝100*b*[(RS-BU)*(SA-SC)/(QS-SC)-(NC-BU)]，所得不同处理介入果如表3所示：
表中数据在消除各种背景后仍显示了分析结果的稳定性及较高的精密度。
以上公开的仅为本发明的几个具体实施例，但是，本发明实施例并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种检测土壤中β-D-葡萄糖苷酶活性的分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
配制50mM醋酸缓冲液，取4.1g醋酸钠、161μl冰醋酸和无菌去离子水水定容至1000ml并调节PH至5.5；
配制200μM的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷底物溶液，称取6.762mg的4-甲基伞形酮和30μl二甲基亚砜溶解溶解，加无菌去离子水稀释定容至100ml；
配制10μM标准品溶液，称取1.762mg的4-甲基伞形酮和30μl二甲基亚砜溶解，再定容至1000ml，制得10μM标准品溶液；
将标准品溶液用蒸馏水分别稀释成浓度为0、0.025μM、0.05μM、0.125μM、0.25.0μM、0.5μM的标准溶液，制得标样液，分别用移液枪吸取50μl至96孔板中，后分别加入200μl醋酸缓冲液，再分别加入20μl的1M NaOH溶液，然后进行荧光检测，如此重复制作3条标准曲线；
称取2份0.3g的土壤鲜样于5ml离心管中，其中1份用于烘干测土壤含水量W，另1份加入3mL醋酸缓冲液均质混匀，在涡旋仪上高速震荡5分钟，再4℃低温4000R离心5分钟；
吸取3份容量为200μl的经离心后的土壤鲜样与醋酸缓冲液混合物的上清液至96黑孔板中，其中一份再加50μl醋酸缓冲液，一份加50μl的10μM的标样液，另一份加50μl的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷底物溶液；
在37℃培养2h后向黑孔板中每孔加入20μl的1M的NaOH溶液，终止反应；
在荧光检测仪读板温度37℃、酶标板震荡时间1min、激发波长350nm、发射波长450nm的条件下，测定每孔的荧光强度值；
以标样液浓度和测定的吸光值A制作标准曲线，得到斜率b；
通过如下公式计算得酶活性：
酶活性＝[(RS-BU)*(SA-SC)/(QS-SC)]-(NC-BU)]*b*2*3000/(0.3*W*200)，
其中，SC为上清液+50μl的醋酸缓冲液所测荧光强度值，QS为上清液+50μl的标样液所测荧光强度值，SA为上清液+50μl的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷底物溶液所测荧光强度值，BU为200μl的醋酸缓冲液+50μl醋酸缓冲液所测荧光强度值，RS为200μl的醋酸缓冲液+50μl的标准品溶液所测荧光强度值，NC为200μl的醋酸缓冲液+50μl的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷底物溶液所测荧光强度值。
2.如权利要求1所述的一种检测土壤中β-D-葡萄糖苷酶活性的分析方法，其特征在于，1M的NaOH溶液通过20gNaOH+蒸馏水定容至50ml制得。
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