CN111705108A - 一种检测凋落物β-葡萄糖苷酶活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测凋落物β‑葡萄糖苷酶活性的方法，属于生物化学技术领域。本发明提供的检测凋落物中β‑葡萄糖苷酶活性的方法主要步骤为：称取剪碎过筛的凋落物到离心过滤管中，加入培养缓冲液进行孵育，高速离心后混合上清液并调节至一定体积作为酶活待测液；将酶活待测液和灭活的酶活待测液分别加入样品活性孔和阴性对照孔，再加入荧光底物工作液4‑MUB‑β‑D‑葡萄糖苷溶液，在避光条件下震荡孵育；再向酶标孔加入Tris终止液；采用多功能酶标仪进行荧光检测；计算β‑葡萄糖苷酶活性。本发明的优点为：反应体系优化后，灵敏度高，检测消耗待测酶液的量少，缩短了操作时间，短时间内能大批量获得测定数据，操作简单，效率高。
Description
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，更具体地说，涉及一种检测凋落物β-葡萄糖苷酶活性的方法。
背景技术
凋落物分解是森林土壤物质转化的基础，是植物和微生物养分的主要来源，在维持森林生态系统碳及养分循环中起重要作用。微生物是森林凋落物分解的主要贡献者，在凋落物降解的过程中，凋落物上定殖的微生物会分泌各种胞外酶，改变凋落物的组成结构，从而促进凋落物的降解。作为参与凋落物分解最为重要的生物活性物质，酶活性涉及各种生物化学过程，与凋落物的分解直接相关，在很大程度上反映了土壤C、N、P等养分循环状况，且因凋落物类型及环境条件的不同而异。研究凋落物中各种酶类活性在凋落物分解过程的活性动态，对了解森林凋落物分的微观生态过程具有重要意义。
β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)即纤维二糖酶，主要作用是水解凋落物中的纤维二糖、纤维三糖及水溶性纤维糊精并转化为葡萄糖。虽然β-葡萄糖苷酶对纤维素无直接作用，但是其可以消除对外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶反应终产物的反馈抑制作用，是纤维素降解过程中的关键限速酶。由于凋落物中纤维素的降解与土壤腐殖质的形成具有一定的关联性，因此，β-葡萄糖苷酶活性可以一定程度上反映土壤中生物化学的强度和动态过程，是评价土壤肥力高低的可靠指标。同时，土壤微生物的分解和释放是β-葡萄糖苷酶的主要来源，在研究土壤微生物群落特征中不可忽视β-葡萄糖苷酶活性与之的联系和作用，可将其酶活性作为微生物活性较为稳定和灵敏的一个指标。
我国凋落物β-葡萄糖苷酶活性的测定是在土壤酶学方法基础上的延伸，但对森林凋落物β-葡萄糖苷酶活性测定的研究存在着方法粗放单一、与国际先进方法脱轨、实验设备更新换代较慢以及以纤维素酶总酶活代替β-葡萄糖苷活性等诸多问题。其中以水杨苷作底物的Barush和Swiain法，酶解产物用4-氨基安替比林作显色剂，再用分光光度法比色测定，但反应易受干扰，且检测灵敏度低；以硝基苯基-β-葡萄糖苷为底物进行酶解的比色法应用普遍，该方法虽操作简单，重现性好，但是易受干扰，消耗的酶液过多，且整体耗时过长。并且由于森林中原有凋落物构成复杂：可能有的表层凋落物没有或者很少有降解微生物定殖，微生物分泌胞外β-葡萄糖苷酶少，也有可能有的凋落物已经处于降解末期。这种复杂情况不利于多种样本之间进行比较研究酶活性及其变化差异，因此凋落物酶活性的检测比土壤酶活测定在前期也需要更多人工干预，使之标准化，以利于凋落物降解过程的研究。
综上，目前需要提供一种新的、标准化、快速便捷的凋落物β-葡萄糖苷酶活性的检测方法。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于一种检测凋落物β-葡萄糖苷酶活性的方法。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种检测凋落物β-葡萄糖苷酶活性的方法，包括如下步骤：
1)将培养缓冲液加入剪碎过筛后的待测凋落物，于离心过滤管离心得到酶滤液，将酶滤液进一步稀释制成酶活待测液；
2)将步骤1)中制得的一部分酶活待测液进行加热灭活，制成灭活酶液；
3)配制梯度浓度的MUB荧光标准物质溶液，采用多功能酶标仪进行荧光检测；
4)酶标板的酶标孔中分别加入酶活待测液和灭活酶液，再分别加入含有4-MUB-β-D-葡萄糖苷的荧光底物工作液进行反应，随后加入终止液终止反应；
5)采用多功能酶标仪对步骤4)反应结果进行荧光检测；
6)以MUB荧光标准物质溶液的梯度浓度和测定的对应吸光值A绘制出荧光标准曲线，得到标准曲线斜率b；
7)计算酶活待测液的稀释因子；
8)计算酶活待测液的比酶活。
优选地，所述的检测凋落物β-葡萄糖苷酶活性的方法，包括如下步骤：
1)将待测凋落物剪碎过2mm筛，每个样品称取3个0.15g分别加入3个离心过滤管中，分别加入600μL pH4.5的培养缓冲液，在4℃下孵育1h后，4℃下16000×g离心30min得到酶滤液后并混合，用培养缓冲液调节体积至4mL，制得酶活待测液；
2)将步骤1)制备的酶活待测液吸取1mL放入2mL离心管，在避光条件下85℃加热2h使酶液灭活充分后，使样品冷却至室温；
3)配制梯度浓度的MUB荧光标准物质溶液，采用多功能酶标仪进行荧光检测；
4)在黑色酶标板上，将33.3μL酶活待测液加入样品酶标孔；将33.3μL灭活酶液加入阴性对照酶标孔；将750μM荧光底物工作液，即4-MUB-β-D-葡萄糖苷溶液，按每孔66.7μL加入到所述样品酶标孔和阴性对照酶标孔中；在避光22℃的条件下160rpm震荡孵育反应15min后，迅速向所有酶标孔加入100μL pH10-11的1M Tris终止液终止反应；
5)采用多功能酶标仪对步骤4)反应结果进行荧光检测；
6)以MUB荧光标准物质溶液的梯度浓度和测定的对应吸光值A绘制出荧光标准曲线，得到标准曲线斜率b；
7)计算待测样品的稀释因子D＝(200μL*4mL)/(33.3μL*X)，200μL为100μL的反应液加100μL终止液体积，4mL为培养缓冲液调节混合酶滤液后的酶活待测液体积，33.3μL为100μL反应液中加入的酶活待测液体积，X为混合酶滤液的体积；
8)计算待测样品的比酶活：(As-A阴)*D/(b*t*m)，比酶活单位为pmol/min/g，As为样品酶活反应液的吸光值，A阴为样品对应灭活酶液的吸光值，D为稀释因子，b为标准曲线斜率，t为震荡孵育时间15min，m为3个离心过滤管凋落物的干重，单位为g。
优选地，步骤1)中所述培养缓冲液，其制备方法为：将3.025g Tris、3.9g马来酸、3.5g柠檬酸或3.825g一水柠檬酸、1.56g硼酸和122mL 1M氢氧化钠，用去离子水定容至250mL制备得到通用缓冲液原液；再将100mL所述通用缓冲液原液用盐酸调至pH 4.5，用去离子水定容至1000mL，灭菌后4℃备用。
优选地，步骤3)中具体为：称取8.8mg MUB溶入1mL 2-甲氧基乙醇和4mL无菌去离子水中，混合均匀，制备成MUB母液；取20μL MUB母液加入无菌去离子水20mL中进一步稀释成10μM MUB校准液，避光4-6℃保存不超过一周备用；取10μM MUB校准液加入无菌去离子水依次稀释为1μM，2μM，3μM，4μM，5μM的MUB荧光标准物质溶液；在黑色酶标板上，依次加入100μL浓度为0μM，1μM，2μM，3μM，4μM，5μM的MUB荧光标准物质溶液，4次重复，再分别加入100μLpH10-11的1M Tris终止液后，采用多功能酶标仪进行荧光检测。
优选地，步骤4)中所述酶活待测液加入样品酶标孔，是3次重复；所述灭活酶液加入阴性对照酶标孔，是1样1孔。
优选地，所述pH10-11的1M Tris终止液，其制备方法为：将129克Tris加入到750mL去离子水中，再用去离子水定容至1000mL，高压灭菌后室温下储存备用。
优选地，步骤5)中所述荧光检测具体为：激发光波波长364nm，发射光波波长450nm，滑动宽度为5nm，收集时间为500ms，测定的对应吸光值为A。
优选地，所述待测凋落物，其制备方法为：采集森林中构成林分特征树种的枯枝或落叶，经过杀青和烘干后，放入尼龙分解袋中，并将其埋入所述森林中用原表层0-10cm土壤覆盖并轻轻压实，埋藏至预设时间后，取出处于半降解的枯枝或落叶，去掉泥沙杂质，即为待测凋落物。
优选地，所述待测凋落物，其制备方法为：采集森林中构成林分特征树种的直径为5mm的枯枝，经过105℃杀青15min，80℃连续烘干48h后，称取7～10g放入300目10cm*8cm尼龙分解袋中，并将其埋入所述森林中，即在距离树主干1m用原表层0-10cm土壤覆盖并轻轻压实，埋藏至预设时间后，取出处于半降解的枯枝，去掉泥沙杂质，即为待测凋落物。
有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：
1)依据荧光分析技术这种强大的分析手段，采用荧光共轭物质作为酶解底物，通过β-葡萄糖苷酶酶解4-MUB-β-D-葡萄糖苷释放荧光探针4-MUB，通过收集4-MUB荧光强度的变化反映酶活性，大大降低了待测酶液中的其它物质的干扰；
2)采用微小孔径离心过滤管，大大降低了酶液中的干扰物质，优化了反应体系，检测方法灵敏度高，对待测酶液的需求量少，剩余酶液可用于其它酶活测定等用途；
3)将待测酶液和底物共同置于酶标板的酶标孔内，培养后，直接加入终止液后上机即可检测，缩短了操作时间，短时间内能大批量获得测定数据，操作简单，效率高。
5)提供了待测凋落物的制备方法，使得影响凋落物酶活的主要因素，包括凋落物类型、环境条件和时间等都在控制之下，这样不同样品凋落物β-葡萄糖苷酶活性检测结果就具有了相互参考和比较的可能，有利于研究凋β-葡萄糖苷酶对森林凋落物分解的微观生态过程的影响作用。
附图说明
图1为检测凋落物β-葡萄糖苷酶活性的酶标板结构及加样示意图；S1为33.3μL样品1酶活待测液+66.7μL荧光底物工作液+100μL终止液，S2为33.3μL样品2酶活待测液+66.7μL荧光底物工作液+100μL终止液，依此类推；N1为33.3μL样品1灭活酶液+66.7μL荧光底物工作液+100μL终止液；N2为33.3μL样品2灭活酶液+66.7μL荧光底物工作液+100μL终止液，依此类推。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1：建立检测凋落物β-葡萄糖苷酶活性的方法
1、试剂配制
1M氢氧化钠溶液：9.999g氢氧化钠，用去离子水定容至250mL配制，室温贮存。
通用缓冲液原液：以3.025g Tris、3.9g马来酸、3.5g柠檬酸(或3.825g一水柠檬酸)、1.56g硼酸，和122mL氢氧化钠(1M)，用去离子水定容至250mL制备。
培养缓冲液：将100mL通用缓冲液原液用盐酸调至所需的pH值(pH 4.5)，用去离子水定容至1000mL，灭菌后4℃备用。
终止缓冲液(Tris 1M；pH 10-11)：129克Tris加入到750mL去离子水中，去离子水定容至1000mL，高压灭菌后室温下储存备用。
MUB荧光标准物质系列溶液：称取8.8mg MUB溶入1mL 2-甲氧基乙醇和4mL无菌去离子水中，混合均匀，制备成MUB母液；取20μL母液加入无菌去离子水20mL中进一步稀释成10μM MUB校准液，避光4-6℃保存不超过一周备用；取适量10μM MUB校准液加入无菌去离子水依次稀释为1μM，2μM，3μM，4μM，5μM的MUB荧光标准物质溶液。
6.750μM荧光共轭底物(4-MUB-β-D-葡萄糖苷)溶液：称取16.9mg4-MUB-β-D-葡萄糖苷溶入2mL 2-甲氧基乙醇和8mL无菌去离子水中，混合均匀，制备成5mM 4-MUB-β-D-葡萄糖苷母液，不能直接冷冻，否则晶体析出；取一定量4-MUB-β-D-葡萄糖苷母液按照3∶17的比例加入无菌去离子水进一步稀释成750μM 4-MUB-β-D-葡萄糖苷工作液，-20℃冷冻半年内备用。
2、检测凋落物β-葡萄糖苷酶活性的操作步骤：
1)将1g左右的待测凋落物剪碎过2mm筛后，每个样品称取3个0.15g(记录具体数值)分别加入3个2mL离心过滤管(Corning，CA，0.22μm)；加入pH 4.5的600μL培养缓冲液，在4℃下孵育1h后16000×g(4℃)离心30min，用移液枪将酶滤液混合至5mL无菌离心管中，用培养缓冲液调节混合酶滤液体积至4mL制成酶活待测液，放置4℃冰箱保存备用。将制备的酶活待测液吸取1mL放入2mL过滤管，在避光条件下85℃加热2h使酶灭活充分后，使样品冷却至室温，作为灭活酶液。
2)在标曲黑色酶标板上，依次加入100μL已知系列浓度为0μM，1μM，2μM，3μM，4μM，5μM的MUB荧光标准物质溶液，4次重复。
3)将酶活待测液和灭活酶液按照实验序号分别加入2mL深孔联排板中。在待测样品黑色酶标板上，用微量排枪将33.3μL酶活待测液加入样品活性孔(3次重复，图1所示第1-3列，5-7列，9-11列)；用微量排枪将33.3μL灭活酶液加入阴性对照孔(1样1孔，图1所示第4列，8列，12列)；用微量排枪将66.7μL的750μM荧光底物(4-MUB-β-D-葡萄糖苷)工作液加入到上述酶标孔中。在避光22℃的条件下震荡(160rpm)孵育15min。
4)迅速向所有酶标孔(含标曲孔)加入100μL 1M Tris(pH10-11)终止液终止反应。
5)采用多功能酶标仪进行荧光检测，激发光波波长364nm，发射光波波长450nm，滑动宽度为5nm，收集时间为500ms，测定的对应吸光值为A。
6)以MUB荧光标准物质溶液的系列稀释浓度和测定的对应吸光值A绘制出荧光标准曲线，得到斜率b。
7)计算待测样品的稀释因子D＝(200μL*4mL)/(33.3μL*X)
式中：200μL为100μL反应液(33.3μL+66.7μL)加100μL终止液体积，4mL为酶滤液混合后用培养缓冲液调节后的酶活待测液体积，33.3μL为100μL反应液中加入的酶活待测液体积，X为高速离心后酶滤液混合后的体积(每个样品具体数值由滤液质量换算成体积，单位mL，1g为1mL)。
8)计算待测样品的比酶活(pmol/min/g)＝(As-A阴)*D/(b*t*m)
式中：As为样品酶活反应液的吸光值，A阴为样品对应灭火酶液的吸光值，D为稀释因子，b为标曲斜率，t为震荡孵育时间15min，m为3个离心过滤管凋落物的干重(将离心过滤管连同其中的凋落物烘干得到的重量减去离心过滤管的自身重量，得到凋落物的干重；单位g)。
实施例2：枫香纯林与枫香黑松混交林凋落物β-葡萄糖苷酶活性的检测
本实施例所使用的凋落物采自江苏省南京市紫金山(32°04′N，118°50′E)西南麓枫香纯林与枫香黑松混交林。将采集的枫香落叶105℃杀青15min，80℃连续烘干48h，称取20g干重放入300目(0.05mm孔径)15cm*10cm尼龙网袋中。将装有烘干枫香落叶的尼龙网袋分别埋入枫香纯林与枫香黑松混交林中，距树主干1m左右用原表层土壤(0-10cm)覆盖。埋藏一年之后，取出处于半降解的凋落物，去掉土壤泥沙等杂质，处理1为枫香纯林凋落物，处理2为枫香黑松混交林凋落物，各处理3次重复，标准曲线斜率b计算为5.7224，凋落物β-葡萄糖苷酶活性检测的具体方法和步骤同实施例1。
试验结果如下：
由上表数据可以看出，各处理之间酶活结果差异达到显著水平，较小的标准差表明该分析方法结果之间的偏差较小，精确性高，重现性好。
实施例3：赤桉人工林凋落物β-葡萄糖苷酶活性的检测
本实施例所使用的凋落物采自广东省湛江市南方种苗基地(21°27′N，110。11′E)4年生和9年生赤桉人工林。将采集的赤桉落叶105℃杀青15min，80℃连续烘干48h，称取15g干重放入300目(0.05mm孔径)15cm*10cm尼龙网袋中。将装有烘干赤桉落叶的尼龙网袋分别埋入4年生和9年生赤桉人工林中，距树主干1m左右用原表层土壤(0-10cm)覆盖。埋藏4个月之后，取出处于半降解的凋落物，去掉土壤泥沙等杂质，处理1为4年生赤桉人工林凋落物，处理2为9年生赤桉人工林凋落物，各处理3次重复，标准曲线斜率b计算为5.7219，凋落物β-葡萄糖苷酶活性检测的具体方法和步骤同实施例1。试验结果如下：
表中数据同样显示了此分析方法结果较高的精密性和重现性。
Claims (9)
1.一种检测凋落物β-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将培养缓冲液加入剪碎过筛后的待测凋落物，于离心过滤管离心得到酶滤液，将酶滤液进一步稀释制成酶活待测液；
2)将步骤1)中制得的一部分酶活待测液进行加热灭活，制成灭活酶液；
3)配制梯度浓度的MUB荧光标准物质溶液，采用多功能酶标仪进行荧光检测；
4)酶标板的酶标孔中分别加入酶活待测液和灭活酶液，再分别加入含有4-MUB-β-D-葡萄糖苷的荧光底物工作液进行反应，随后加入终止液终止反应；
5)采用多功能酶标仪对步骤4)反应结果进行荧光检测；
6)以MUB荧光标准物质溶液的梯度浓度和测定的对应吸光值A绘制出荧光标准曲线，得到标准曲线斜率b；
7)计算酶活待测液的稀释因子；
8)计算酶活待测液的比酶活。
2.根据权利要求1所述的检测凋落物β-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将待测凋落物剪碎过2mm筛，每个样品称取3个0.15g分别加入3个离心过滤管中，分别加入600μL pH4.5的培养缓冲液，在4℃下孵育1h后，4℃下16000×g离心30min得到酶滤液后并混合，用培养缓冲液调节体积至4mL，制得酶活待测液；
2)将步骤1)制备的酶活待测液吸取1mL放入2mL离心管，在避光条件下85℃加热2h使酶液灭活充分后，使样品冷却至室温；
3)配制梯度浓度的MUB荧光标准物质溶液，采用多功能酶标仪进行荧光检测；
4)在黑色酶标板上，将33.3μL酶活待测液加入样品酶标孔；将33.3μL灭活酶液加入阴性对照酶标孔；将750μM荧光底物工作液，即4-MUB-β-D-葡萄糖苷溶液，按每孔66.7μL加入到所述样品酶标孔和阴性对照酶标孔中；在避光22℃的条件下160rpm震荡孵育反应15min后，迅速向所有酶标孔加入100μLpH10-11的1M Tris终止液终止反应；
5)采用多功能酶标仪对步骤4)反应结果进行荧光检测；
6)以MUB荧光标准物质溶液的梯度浓度和测定的对应吸光值A绘制出荧光标准曲线，得到标准曲线斜率b；
7)计算待测样品的稀释因子D＝(200μL*4mL)/(33.3μL*X)，200μL为100μL的反应液加100μL终止液体积，4mL为培养缓冲液调节混合酶滤液后的酶活待测液体积，33.3μL为100μL反应液中加入的酶活待测液体积，X为混合酶滤液的体积；
8)计算待测样品的比酶活：(As-A阴)*D/(b*t*m)，比酶活单位为pmol/min/g，As为样品酶活反应液的吸光值，A阴为样品对应灭活酶液的吸光值，D为稀释因子，b为标准曲线斜率，t为震荡孵育时间15min，m为3个离心过滤管凋落物的干重，单位为g。
3.根据权利要求1或2所述的检测凋落物β-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于，步骤1)中所述培养缓冲液，其制备方法为：将3.025g Tris、3.9g马来酸、3.5g柠檬酸或3.825g一水柠檬酸、1.56g硼酸和122mL 1M氢氧化钠，用去离子水定容至250mL制备得到通用缓冲液原液；再将100mL所述通用缓冲液原液用盐酸调至pH 4.5，用去离子水定容至1000mL，灭菌后4℃备用。
4.根据权利要求2所述的检测凋落物β-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于，步骤3)中具体为：称取8.8mg MUB溶入1mL 2-甲氧基乙醇和4mL无菌去离子水中，混合均匀，制备成MUB母液；取20μL MUB母液加入无菌去离子水20mL中进一步稀释成10μM MUB校准液，避光4-6℃保存不超过一周备用；取10μM MUB校准液加入无菌去离子水依次稀释为1μM，2μM，3μM，4μM，5μM的MUB荧光标准物质溶液；在黑色酶标板上，依次加入100μL浓度为0μM，1μM，2μM，3μM，4μM，5μM的MUB荧光标准物质溶液，4次重复，再分别加入100μL pH10-11的1M Tris终止液后，采用多功能酶标仪进行荧光检测。
5.根据权利要求2所述的检测凋落物β-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于，步骤4)中所述酶活待测液加入样品酶标孔，是3次重复；所述灭活酶液加入阴性对照酶标孔，是1样1孔。
6.根据权利要求2或4所述的检测凋落物β-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于，所述pH10-11的1M Tris终止液，其制备方法为：将129克Tris加入到750mL去离子水中，再用去离子水定容至1000mL，高压灭菌后室温下储存备用。
7.根据权利要求1或2所述的检测凋落物β-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于，步骤5)中所述荧光检测具体为：激发光波波长364nm，发射光波波长450nm，滑动宽度为5nm，收集时间为500ms，测定的对应吸光值为A。
8.根据权利要求1或2所述的检测凋落物β-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于，所述待测凋落物，其制备方法为：采集森林中构成林分特征树种的枯枝或落叶，经过杀青和烘干后，放入尼龙分解袋中，并将其埋入所述森林中用原表层0-10cm土壤覆盖并轻轻压实，埋藏至预设时间后，取出处于半降解的枯枝或落叶，去掉泥沙杂质，即为待测凋落物。
9.根据权利要求8所述的检测凋落物β-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于，所述待测凋落物，其制备方法为：采集森林中构成林分特征树种的直径为5mm的枯枝，经过105℃杀青15min，80℃连续烘干48h后，称取7～10g放入300目10cm*8cm尼龙分解袋中，并将其埋入所述森林中，即在距离树主干1m用原表层0-10cm土壤覆盖并轻轻压实，埋藏至预设时间后，取出处于半降解的枯枝，去掉泥沙杂质，即为待测凋落物。
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