CN109553697A - 多效破壁低温管线提取食用菌多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多效破壁低温管线提取食用菌多糖的方法：(1)冷冻干燥：选取食用菌新鲜子实体，清洁后置于冷冻干燥机冷冻干燥48h后，粉碎过100目筛；(2)多效破壁：按照重量份，称取冷冻干燥后的干粉1份，加10份水浸润,置于‑20℃冰箱中冷冻处理后,再加5份水,加入每克干粉8‑12U的纤维素酶，每克干粉莱鲍迪甙0.01份，50℃水浴并同时处以超声波处理20‑25min；再次置于‑20℃冰箱中冷冻处理后，40℃水浴并同时处以超声波处理30min；合并破壁滤液减压浓缩；(3)低温管线处理；(4)用2500Da截留分子量的透析袋流水透析12h以去除小分子杂质，冷冻干燥，获得多糖粉末。
Description
技术领域
本发明涉及一种多效破壁低温管线提取食用菌多糖的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
食用菌多糖是一类重要的保健食品。目前，猴头菌多糖、香菇多糖、灵芝多糖、冬虫夏草菌丝多糖、灰树花多糖和姬松茸多糖等食用菌多糖已有研究。作为高分子化合物，食用菌多糖结构较为复杂，它是由10个以上的单糖以糖苷键连接形成。β-(1-3)-D葡聚糖是食用菌多糖中的活性成分，它具有分支，这些活性多糖成分主链都是由β-(1-3)连接的葡萄糖基组成，沿主链随机分布着由β-(1-6)连接的葡萄糖基。研究表明，食用菌中的β-(1-3)-D-葡聚糖对肿瘤细胞具有有效的抑制作用。
食用菌生物活性不仅与多糖分子间的氢键相互作用有关，还受多糖分子质量大小的影响，一般分子量大于50KDa的具有三股螺旋结构的多糖才具有显著的抗肿瘤活性。因此在多糖的分离纯化时应对具有生物活性的大分子量组分进行纯化，更具生物学意义。另一方面，根据多糖分子量与食用菌活性的关系，可以将分子量分布分析也作为食用菌质量标准的主要指标之一，而不仅仅依据样品的多糖含量来评价食用菌或药用菌的质量。食用菌多糖可作为生物免疫调节剂，具有较强的免疫调节作用。主要通过激活巨噬细胞和T细胞等免疫细胞活性；激活网状内皮系统、补体系统和免疫系统；诱导产生IFN(干扰素)、TNF(肿瘤坏死因子)等多种免疫因子；促进细胞中RNA、DNA的蛋白质的合成；提高细胞内环核苷酸(cGMP，cAMP)的含量，作用于人体免疫系统。
本发明旨在提供一种多效破壁低温管线提取食用菌多糖的方法，充分利用生物技术，环保高效破壁，可以在低温环境下高效提取出生物活性高的食用菌多糖，并且尽可能保持活性，以获得最佳保健效果的食用菌多糖。
发明内容
本发明的目的是提供一种多效破壁低温管线提取食用菌多糖的方法，充分利用生物技术，环保高效破壁，可以在低温环境下高效提取出生物活性高的食用菌多糖，并且尽可能保持活性，以获得最佳保健效果的食用菌多糖。
香菇多糖(Lentinan，LNT)香菇多糖是从优质香菇子实体中提取的有效活性成分，是香菇的主要有效成分，是一种宿主免疫增强剂(host defense potentiator，HDP)，临床与药理研究表明，香菇多糖具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能和刺激干扰素形成等作用。香菇多糖是从优质香菇子实体中提取的有效活性成分，香菇多糖中的活性成分是具有分支的β-(1-3)-D-葡聚糖，主链由β-(1-3)-连接的葡萄糖基组成，沿主链随机分布着由β-(1-6)连接的葡萄糖基，呈梳状结构。功能主治：不能手术或复发性胃癌、肝癌、膀胱癌，使用本品能缓解症状，提高病人免疫功能，纠正微量元素失调。
香菇来源相对灵芝便宜，但是香菇多糖的效果比灵芝也差不少，如何从香菇中提取出相对生物活性高的多糖，并且尽可能保持活性，以获得最佳保健效果的多糖是本发明的主题。
甜叶菊糖是从甜菊叶中提取出来的一种高甜度.低热量的非营养型的天然甜味剂。目前，已从甜叶菊糖中发现了八种糖甙，即甜菊甙(slevioside)、莱鲍迪甙(RebaudiosideA、B、C、D、E)，杜尔可甙A(Dul～ide和斯替维伯甙(steviobi～siti)。莱鲍迪甙A的甜度最高，大于蔗糖的300倍，而且味质最好，不含任何不良余味，是一种最为理想的天然甜昧剂，提取制备莱鲍迪甙A含量高的甜菊糖产品是国内外甜菊糖生产工业的研究热点。本申请人对莱鲍迪甙进行了深入的研究，发现其可以运用于高活性香菇多糖的提取分离，而且其价格不算昂贵，有很大的应用意义。
破壁的研究大体可归纳为化学破壁、物理破壁(液体剪切、固体剪切等)和生物破壁(酶解、自溶)。普遍认为多手段破壁可能会破坏多糖结构，不利于提取菌多糖。本发明选择多种手段协同破壁，破壁效果好，虽然多糖得率有所下降，但是在本发明的优化工艺下，多糖的生物活性有显著增强。
本发明所需要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现。
一种多效破壁低温管线提取食用菌多糖的方法，其步骤如下：
(1)冷冻干燥：选取食用菌新鲜子实体，清洁后置于冷冻干燥机冷冻干燥48h后，粉碎过100目筛；
(2)多效破壁：按照重量份，称取冷冻干燥后的干粉1份，加10份水浸润,置于-20℃冰箱中冷冻处理后,再加5份水,加入每克干粉8-12U的纤维素酶，每克干粉莱鲍迪甙0.01份，50℃水浴并同时处以超声波处理20-25min；
再次置于-20℃冰箱中冷冻处理后，40℃水浴并同时处以超声波处理30min；合并破壁滤液减压浓缩；
(3)低温管线处理：将浓缩液再加入每克干粉0.02份的莱鲍迪甙，将其输入金属低温管线中冷却处理，依次保持温度10℃10min，5℃15min，以充分低温处理；
(4)用2500Da截留分子量的透析袋流水透析12h以去除小分子杂质，冷冻干燥，获得多糖粉末。
本发明的优点：
(1)本发明选择多种手段协同破壁，破壁效果好，虽然多糖得率有所下降，但是在本发明的优化工艺下，多糖的生物活性有显著增强。
(2)无有机溶剂加入，无有害杂质。
(3)本发明的目的是制得高生物活性的多糖复合物粉末，无需高度纯化节约成本。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明的具体实施例如以下说明。
实施例1
一种多效破壁低温管线提取食用菌多糖的方法，其步骤如下：
(1)冷冻干燥：选取香菇新鲜子实体，清洁后置于冷冻干燥机冷冻干燥48h后，粉碎过100目筛；
(2)多效破壁：按照重量份，称取冷冻干燥后的干粉100g，加1000g水浸润,置于-20℃冰箱中冷冻处理后,再加500g水,加入每克干粉8U的纤维素酶，每克干粉莱鲍迪甙1g，50℃水浴并同时处以超声波处理25min；
再次置于-20℃冰箱中冷冻处理后，40℃水浴并同时处以超声波处理30min；合并破壁滤液减压浓缩；
(3)低温管线处理：将浓缩液再加入2g莱鲍迪甙，将其输入金属低温管线中冷却处理，依次保持温度10℃10min，5℃15min，以充分低温处理；
(4)用2500Da截留分子量的透析袋流水透析12h以去除小分子杂质，冷冻干燥，获得多糖粉末5.92g。
实施例2：
一种多效破壁低温管线提取食用菌多糖的方法，其步骤如下：
(1)冷冻干燥：选取香菇新鲜子实体，清洁后置于冷冻干燥机冷冻干燥48h后，粉碎过100目筛；
(2)多效破壁：按照重量份，称取冷冻干燥后的干粉100g，加1000g水浸润,置于-20℃冰箱中冷冻处理后,再加500g水,加入每克干粉12U的纤维素酶，每克干粉莱鲍迪甙1g，50℃水浴并同时处以超声波处理20min；
再次置于-20℃冰箱中冷冻处理后，40℃水浴并同时处以超声波处理30min；合并破壁滤液减压浓缩；
(3)低温管线处理：将浓缩液再加入2g的莱鲍迪甙，将其输入金属低温管线中冷却处理，依次保持温度10℃10min，5℃15min，以充分低温处理；
(4)用2500Da截留分子量的透析袋流水透析12h以去除小分子杂质，冷冻干燥，获得多糖粉末5.75g。
实施例3
一种多效破壁低温管线提取食用菌多糖的方法，其步骤如下：
(1)冷冻干燥：选取香菇新鲜子实体，清洁后置于冷冻干燥机冷冻干燥48h后，粉碎过100目筛；
(2)多效破壁：按照重量份，称取冷冻干燥后的干粉100g，加1000g水浸润,置于-20℃冰箱中冷冻处理后,再加500g水,加入每克干粉10U的纤维素酶，每克干粉莱鲍迪甙1g，50℃水浴并同时处以超声波处理25min；
再次置于-20℃冰箱中冷冻处理后，40℃水浴并同时处以超声波处理30min；合并破壁滤液减压浓缩；
(3)低温管线处理：将浓缩液再加入2g的莱鲍迪甙，将其输入金属低温管线中冷却处理，依次保持温度10℃10min，5℃15min，以充分低温处理；
(4)用2500Da截留分子量的透析袋流水透析12h以去除小分子杂质，冷冻干燥，获得多糖粉末6.13g。
实施例4
考察莱鲍迪甙的作用，该实施例不加入莱鲍迪甙。
一种多效破壁低温管线提取食用菌多糖的方法，其步骤如下：
(1)冷冻干燥：选取香菇新鲜子实体，清洁后置于冷冻干燥机冷冻干燥48h后，粉碎过100目筛；
(2)多效破壁：按照重量份，称取冷冻干燥后的干粉100g，加1000g水浸润,置于-20℃冰箱中冷冻处理后,再加500g水,加入每克干粉8U的纤维素酶，50℃水浴并同时处以超声波处理25min；
再次置于-20℃冰箱中冷冻处理后，40℃水浴并同时处以超声波处理30min；合并破壁滤液减压浓缩；
(3)低温管线处理：将浓缩液再加入2g的莱鲍迪甙，将其输入金属低温管线中冷却处理，依次保持温度10℃10min，5℃15min，以充分低温处理；
(4)用2500Da截留分子量的透析袋流水透析12h以去除小分子杂质，冷冻干燥，获得多糖粉末4.25g。
实施例5增强免疫效果测试：
用本发明实施例1-4的制备方法制备得到的多糖粉末，对猪瘟疫苗进行免疫效果试验。
试验分为：空白对照组、疫苗组、口服多糖+疫苗组，每组均采用健康猪10头。
4.1材料和方法
4.1.1材料
本发明口服多糖；动物：30日龄猪仔；猪瘟兔化弱毒疫苗。
4.1.2方法
试验方法：空白对照组。疫苗对照组：疫苗注射。口服多糖组，疫苗注射+每日二次喂入本发明多糖粉末(每公斤体重0.03g)。
4.1.3疫苗抗体水平检测
疫苗免疫前、疫苗免疫后的7天、14天、30天、60天，分别采血分离血清，采用猪瘟抗体检测试剂盒测定，结果如下(log2)：
上表数据表明，本发明制得的香菇多糖粉末具有显著的增强免疫力的效果，并且莱鲍迪甙具有显著的作用。
实施例6
进一步的，发现本发明的多糖粉和岩藻糖混合后具有α-淀粉酶抑制效果，具有应用于糖尿病防治的潜力。
α-淀粉酶抑制能力测定：
40g马铃薯淀粉溶于900mL的0.05mol/L磷酸缓冲液(pH值6.5)中，65℃条件下搅拌30min后定容至1000mL，得到4％的马铃薯淀粉溶液。取1.0g复合多糖粉和4mgα-淀粉酶加入到40mL上述马铃薯淀粉溶液中，37℃水浴震荡1h(120r/min)，4500r/min离心20min，以不加复合多糖粉为空白组，采用还原糖法测定上清液中葡萄糖含量，复合多糖粉对α-淀粉酶抑制能力计算公式为D＝(Ac－As)/Ac×100％
式中D———α-淀粉酶活性抑制能力，％
Ac———空白组的吸光度
As———试验组(添加复合多糖粉)的吸光度
将实施例1得到的多糖按照质量比分别为3:1,2:1,1:1与岩藻糖混合，并且用实施例1的纯香菇多糖和岩藻糖作为对照，加上15倍质量的水配备成溶液，分别在50、100、250MPa微射流压力下均质处理1次，冷冻干燥制得复合多糖粉。
| α-淀粉酶抑制能力 | |
| 3:1 | 16.21 |
| 2:1 | 12.31 |
| 1:1 | 13.18 |
| 纯香菇多糖 | 5.85 |
| 岩藻糖 | 0.21 |
可见，本发明的香菇多糖和岩藻糖混合经过态高压微射流(Dynamic highpressure microfluidization，DHPM)特定的工艺处理改性后，具有显著的协同-淀粉酶抑制效果，具有应用于糖尿病防治的潜力。
综上，本发明的目的是制得高生物活性的多糖复合物粉末，无需高度纯化节约成本。可见，本发明选择多种手段协同破壁，破壁效果好，虽然多糖得率有所下降，但是在本发明的优化工艺下，多糖的生物活性有显著增强。无有机溶剂加入，无有害杂质。并且，发现本发明的多糖粉和岩藻糖混合后具有α-淀粉酶抑制效果，具有应用于糖尿病防治的潜力。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选具体的实施例，若依本发明的构想所作变动，其产生的功能作用，仍未超出说明书所涵盖的精神时，均应在本发明的范围内。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种多效破壁低温管线提取食用菌多糖的方法，其步骤如下：
(1)冷冻干燥：选取食用菌新鲜子实体，清洁后置于冷冻干燥机冷冻干燥；
(2)多效破壁：称取冷冻干燥后的干粉，加水浸润,置于-20℃冰箱中冷冻处理后,再加水,加入纤维素酶，莱鲍迪甙，50℃水浴并同时处以超声波处理20-25min；
再次置于-20℃冰箱中冷冻处理后，40℃水浴并同时处以超声波处理30min；合并破壁滤液减压浓缩；
(3)低温管线处理：将浓缩液再加入莱鲍迪甙，将其输入金属低温管线中冷却处理，充分低温处理；
(4)用2500Da截留分子量的透析袋流水透析以去除小分子杂质，冷冻干燥，获得多糖粉末。
2.权利要求1所述的多效破壁低温管线提取食用菌多糖的方法，其特征在于：
步骤(1)冷冻干燥：选取食用菌新鲜子实体，清洁后置于冷冻干燥机冷冻干燥48h后，粉碎过100目筛。
3.权利要求1或2所述的多效破壁低温管线提取食用菌多糖的方法，其特征在：
(2)多效破壁：按照重量份，称取冷冻干燥后的干粉1份，加10份水浸润,置于-20℃冰箱中冷冻处理后,再加5份水,加入每克干粉8-12U的纤维素酶，每克干粉莱鲍迪甙0.01份，50℃水浴并同时处以超声波处理；
再次置于-20℃冰箱中冷冻处理后，40℃水浴并同时处以超声波处理30min；合并破壁滤液减压浓缩。
4.权利要求3所述的多效破壁低温管线提取食用菌多糖的方法，其特征在：
(2)50℃水浴并同时处以超声波处理20-25min。
5.权利要求1-4任一项所述的多效破壁低温管线提取食用菌多糖的方法，其特征在：
(3)低温管线处理：将浓缩液再加入每克干粉0.02份的莱鲍迪甙，将其输入金属低温管线中冷却处理，依次保持温度10℃10min，5℃15min，以充分低温处理后。
6.权利要求1-5任一项所述的多效破壁低温管线提取食用菌多糖的方法，其特征在：
(4)用2500Da截留分子量的透析袋流水透析12h以去除小分子杂质，冷冻干燥，获得多糖粉末。
7.权利要求1-6任一项所述的多效破壁低温管线提取食用菌多糖的方法，其特征在：
还包括下述步骤：
按照质量比分别为3:1,2:1,1:1与岩藻糖混合，加上15倍质量的水配备成溶液，分别在50、100、250MPa微射流压力下均质处理1次后冷冻干燥。
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