CN109550531A - 一种磁性尺寸依赖的微流控芯片 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种磁性尺寸依赖的微流控芯片，包括盖片和基片，盖片和基片密封连接，盖片下表面上开设有磁泳分离结构和尺寸分选沟道，磁泳分离结构用于分离出磁性‑目标复合物，尺寸分选沟道用于分离捕获不同尺寸的磁性微球。该微流控芯片结构简单，易于制作，成本低廉，且不需要移动外部磁铁，就能在微腔中完成全部的检测步骤，提高了检测效率和准确性。

Description

一种磁性尺寸依赖的微流控芯片

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种磁性尺寸依赖的微流控芯片。

背景技术

量子点具有独特又优越的光学性能，如消光系数大，量子产率高，激发光谱宽，发射光谱窄，亮度比传统的荧光染料高10-100倍，光稳定性比传统的荧光染料高100-1000倍等特点，目前已被广泛应用于生物荧光标记，为多种待检测物的即时检测和分型提供了重要的工具。

中国专利《基于磁微粒化学发光的多目标物定量检测的微流控芯片》(CN105259164B)公开了一种微流控芯片，该微流控芯片通过以一定速度移动外部磁铁，使样本与酶标抗体充分反应，通过磁铁的磁场力将不同磁性粒复合物按照一定顺序先后释放，采用光探测器以一定的方式采集发光信号，并以一定方式输出检测结果，从而实现同一样本中多目标分析物的定量检测。但这种微流控芯片的通道加工难度大，检测方式复杂，利用磁场分离磁性微球，无法保证质量相近的磁性微球准确分离，或者相同标记物的磁性微球质量相同，受到的磁场力作用相同，也无法准确分离。

发明内容

为了解决上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种磁性尺寸依赖的微流控芯片，该微流控芯片结构简单，易于制作，成本低廉，且不需要移动外部磁铁，就能在微腔中完成全部的检测步骤，提高了检测效率和准确性。

实现本发明上述目的所采用的技术方案为：

一种磁性尺寸依赖的微流控芯片，包括盖片和基片，盖片位于基片的正上方，盖片和基片密封连接，盖片下表面上开设有磁泳分离结构和捕获不同尺寸磁性微球的尺寸分选沟道，磁泳分离结构包括缓冲液移动通道、样品移动通道、汇合通道、捕获通道和废液排出通道，缓冲液移动通道和样品移动通道在汇合通道处的一端汇合，废液排出通道和捕获通道的一端在汇合通道的另一端汇合，捕获通道的另一端与尺寸分选沟道入口连通，盖片上设有磁铁，磁铁位于汇合通道的上方，且磁铁位于汇合通道在盖片上表面上的投影的一侧，捕获通道朝向靠近磁铁的方向延伸，废液排出通道朝向远离磁铁的方向延伸，盖片上设有缓冲液注入口、样品注入口、第一排出口和第二排出口，缓冲液注入口与缓冲液移动通道连通，样品注入口与样品移动通道连通，第一排出口与废液排出通道连通，第二排出口与尺寸分选沟道出口连通。

所述的尺寸分选沟道底部水平，尺寸分选沟道顶部呈台阶状，尺寸分选沟道顶部的高度自其入口到其出口的方向依次下降。

所述的尺寸分选沟道顶部为三级台阶结构，尺寸分选沟道从其入口到其出口的方向依次为第一级尺寸捕获段、第二级尺寸捕获段和尺寸分选沟道出口。

所述的缓冲液移动通道由平直缓冲液通道段和折弯缓冲液通道段构成，样品移动通道由平直样品通道段和折弯样品通道段构成，平直缓冲液通道段的一端与缓冲液注入口连通，另一端与折弯缓冲液通道段的一端连通，平直样品通道段的一端与样品注入口连通，另一端与折弯样品通道段的一端连通，折弯缓冲液通道段和折弯样品通道段的另一端汇合于汇合通道的一端，折弯缓冲液通道、折弯样品通道和汇合通道连接后的整体结构呈Y型，捕获通道由平直捕获通道段和折弯捕获通道段构成，废液排出通道由平直废液通道段和折弯废液通道段构成，平直捕获通道段的一端与折弯捕获通道段的一端连通，另一端与尺寸分选沟道入口连通，平直废液通道段的一端与折弯废液通道段的一端连通，另一端与第一排出口连通，折弯捕获通道段和折弯废液通道段的另一端汇合于汇合通道的另一端，折弯捕获通道段、折弯废液通道段和汇合通道连接后的整体结构呈Y型。

平直缓冲液通道段平行于平直样品通道段，平直捕获通道段平行于平直废液通道段，平直缓冲液通道、汇合通道和平直捕获通道段中的两两相互平行，平直缓冲液通道段与平直样品通道段之间的距离等于平直捕获通道段与平直废液通道段之间的距离。

所述的磁铁呈方形，磁铁S极与N极的连线平行于汇合通道。

本发明的磁性尺寸依赖的微流控芯片的工作原理如下：

先将不同抗体修饰的磁性微球与包含待检测物质的复杂样品进行反应，形成磁性-目标复合物，然后将磁性-目标复合物通过样品移动通道注入，同时缓冲液移动通道注入缓冲液，磁性-目标复合物在通过汇合通道时，由于磁铁的吸附作用，磁性-目标复合物流向尺寸分选区，尺寸分选区为高度不同的阶梯结构，导致尺寸不同的微球卡在不同的位置，然后通入抗体修饰的量子点与磁性-目标复合物反应，通过倒置荧光显微镜进行荧光信号采集，最终实现复杂样品中多种待测物的同时检测。

与现有技术相比，本发明的有益效果和优点在于：

1、本发明的微流控芯片通过磁泳分离区和尺寸分选区，结合修饰不同抗体的不同尺寸的磁性微球，实现对多种待测物质的复杂样品进行同时检测，该微流控芯片具有以下优点：①试剂用量少，降低了检测的成本；②集成程度高，减少人工接触，提高了检测人员的人身安全；③通过磁性尺寸分选，能够同时检测多种标志物，提高了检测效率；④操作简单，只需要把样品依次通入芯片，就能在微腔中完成多种标志物的检测。

2、本发明的微流控芯片可以利用磁性和尺寸的双模态设计，实现复杂样品中多种待测物的同时检测。

3、本发明的微流控芯片通过磁泳分离技术，使结合多种疾病靶标物的不同尺寸磁性微球，流向尺寸分离区进行分离，可以同时直接快速的检测多种待检测物，如禽流感病毒有多种亚型，可以通过本发明的微流控芯片直接针对禽流感病毒的多种亚型进行检测鉴定，这对于控制禽流感病毒的传播和分型至关重要。

附图说明

图1为磁性尺寸依赖的微流控芯片的分解结构示意图。

图2为图1的俯视图。

图3为尺寸分选沟道的结构示意图。

其中，1-盖片、2-基片、3-缓冲液移动通道、4-样品移动通道、5-汇合通道、6-捕获通道、7-废液排出通道、8-尺寸分选沟道、9-磁铁、10-缓冲液注入口、11-样品注入口、12-第一排出口、13-第二排出口、14-第一级尺寸捕获段、15-第二级尺寸捕获段、16-尺寸分选沟道出口、17-平直缓冲液通道段、18-折弯缓冲液通道段、19-平直样品通道段、20-折弯样品通道段、21-平直捕获通道段、22-折弯捕获通道段、23-平直废液通道段、24-折弯废液通道段。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行详细说明。

本发明提供的磁性尺寸依赖的微流控芯片的结构示意图如图1和图2所示，包括盖片1和基片2，盖片1位于基片2的正上方，盖片1和基片2密封连接。

如图2所示，盖片1下表面上设有磁泳分离结构，磁泳分离结构包括缓冲液移动通道3、样品移动通道4、汇合通道5、捕获通道6和废液排出通道7。本实施例中，缓冲液移动通道、样品移动通道、汇合通道、捕获通道和废液排出通道均为方形通道，缓冲液移动通道、样品移动通道、汇合通道、捕获通道和废液排出通道的宽度均为1mm，汇合通道的长度为25mm。

盖片上设有缓冲液注入口10、样品注入口11、第一排出口12和第二排出口13。

缓冲液移动通道3由平直缓冲液通道段17和折弯缓冲液通道段18构成，样品移动通道4由平直样品通道段19和折弯样品通道段20构成。平直缓冲液通道段17的一端与缓冲液注入口10连通，平直缓冲液通道段17的另一端与折弯缓冲液通道段18的一端连通，平直样品通道段19的一端与样品注入口11连通，平直样品通道段19的另一端与折弯样品通道段20的一端连通。折弯缓冲液通道段18和折弯样品通道段20的另一端汇合于汇合通道5的一端，折弯缓冲液通道18和折弯样品通道20和汇合通道5连接后的整体结构呈Y型，平直缓冲液通道段17平行于平直样品通道段19。

捕获通道由平直捕获通道段21和折弯捕获通道段22构成，废液排出通道由平直废液通道段23和折弯废液通道段24构成。平直捕获通道段21的一端与折弯捕获通道段22的一端连通，平直捕获通道段21的另一端与第一级尺寸捕获段14入口连通，平直废液通道段23的一端与折弯废液通道段24的一端连通，平直废液通道段23的另一端与第一排出口12连通。折弯捕获通道段22和折弯废液通道段24的另一端汇合于汇合通道5的另一端，折弯捕获通道段22和折弯废液通道段24和汇合通道5连接后的整体结构呈Y型，平直捕获通道段21平行于平直废液通道段23。

平直缓冲液通道17、汇合通道5和平直捕获通道段21中的两两相互平行，平直缓冲液通道段17与平直样品通道段19之间的距离等于平直捕获通道段21与平直废液通道段23之间的距离。折弯捕获通道段22朝向靠近磁铁的方向折弯，折弯废液通道段24朝向远离磁铁的方向折弯。

如图3所示，尺寸分选沟道8底部水平，尺寸分选沟道8顶部为三级台阶结构，尺寸分选沟道8从其入口到其出口的方向依次为第一级尺寸捕获段14、第二级尺寸捕获段15和尺寸分选沟道出口16，第一级尺寸捕获段14、第二级尺寸捕获段15和尺寸分选沟道出口16的高度依次降低。本实施例中，第一级尺寸捕获段的高度为40μm，第二级尺寸捕获段的高度为7μm，尺寸分选沟道出口的高度为4μm。

磁铁9呈长方形，磁铁9固定于盖片1上，磁铁9位于汇合通道5的上方，且磁铁9位于汇合通道5在盖片1上表面上的投影的一侧，磁铁9S极与N极的连线平行于汇合通道5。

上述的磁性尺寸依赖的微流控芯片的制备方法为：

1、取三片普通的光学玻璃片，先将三片光学玻璃的两面覆膜，然后将三片光学玻璃的光滑侧面上的覆膜去除一半，再用刻蚀液刻蚀三片光学玻璃的覆膜侧面上未覆膜的部分，三片光学玻璃的刻蚀时间分别为10min、20min和30min，刻蚀完后用精雕机测量三片光学玻璃的平均刻蚀深度，再计算出三片光学玻璃的平均刻蚀速度，根据平均刻蚀速度可计算出第一级尺寸捕获段、第二级尺寸捕获段和尺寸分选沟道出口的刻蚀时间，第一级尺寸捕获段、第二级尺寸捕获段和尺寸分选沟道出口的刻蚀时间分别为T₁、T₂、T₃；

2、取两片尺寸完全相同的光学玻璃片，分别作为基片和盖片，将盖片两面进行覆膜，在盖片光滑的一面上选取磁泳分离结构、第一级尺寸捕获段、第二级尺寸捕获段和尺寸分选沟道出口在其上的垂直投影区域，并用微加工激光系统刻出轮廓，用于去除覆膜；

3、去除缓冲液移动通道、样品移动通道、汇合通道、捕获通道、废液排出通道和第一级尺寸捕获段在盖片覆膜表面上的垂直投影区域上的覆膜，并用刻蚀液刻开始刻蚀，刻蚀时间为T₁，刻蚀完成后，得到磁泳分离结构和部分第一级尺寸捕获段；

4、去除第二级尺寸捕获段在盖片覆膜表面上的垂直投影区域上的覆膜，并用刻蚀液刻开始刻蚀，刻蚀时间为T₂，刻蚀完成后，得到部分第二级尺寸捕获段；

5、去除尺寸分选沟道出口在盖片覆膜表面上的垂直投影区域上的覆膜，并用刻蚀液刻开始刻蚀，刻蚀时间为T₃，刻蚀完成后，得到尺寸分选沟道出口，此时，获得尺寸分选沟道，即磁泳分离结构、第一级尺寸捕获段沟道刻蚀时间为T₁+T₂+T₃，第二级尺寸捕获段沟道刻蚀时间为T₂+T₃；

6、去除盖片上的全部覆膜，用精雕CNC雕刻机刻出缓冲液注入口、样品注入口、第一排出口、第二排出口和磁铁放置位的空槽；

7、将盖片开设有磁泳分离结构和尺寸分选沟道的表面和基片的光滑表面在去离子水中进行键合，然后置于微控数显电热板上烘干两小时，再置于马弗炉中高温烧结24小时以上，基底和盖片熔合成为一体，得到所述的磁性尺寸依赖的微流控芯片。

试验一、本发明的磁性尺寸依赖的微流控芯片捕获分离禽流感病毒蛋白的试验

1、实验内容：

1.1、修饰有特定禽流感抗体的磁球制备：

取100μL 1％(w/v)8-9μm的Affimag SLE磁性微球和100μL 1％(w/v)4.8μm的Affimag SLE磁性微球，分别用PBS溶液(pH 6.8)洗涤三遍，以去除杂质，减少其对偶联的影响。称取1mg EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和0.5mg NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，分别溶于100μL的PBS溶液(pH 6.8)中，配制成10mg/mL的EDC溶液和5mg/mL的NHS溶液，取EDC溶液和NHS溶液各50μL配置成100μL的混合液，并配置两份混合液，将两种尺寸的Affimag SLE磁性微球分别溶于两份混合液中，混合均匀后置于摇床上(37℃，150rpm)活化30min，因磁球尺寸较大，容易沉积，每10min手摇一次。活化完成后，将磁珠混合液置于磁力架上3～5min，吸去上层清液，用PBS溶液(pH 7.2)洗涤三遍，以去除未反应的EDC和NHS，再加入100μL PBS溶液(pH 7.2)，向含8-9μm磁球的混合液中加入2μg H7N9抗体，向含4.8μm磁球的混合液中加入2μg H9N2抗体，在涡旋仪上混合均匀，置于摇床上(37℃，150rpm)孵育4h，每30min手摇一次，即得到两份含修饰有禽流感抗体的磁球的样品，存放在4℃冰箱中备用。

1.2、生物素化的禽流感特定单克隆抗体的制备

称取1mg Sulfo-NHS-LC-Biotin，溶于900μL超声水中，配成约900μL/mg的生物素溶液。取10μL H7N9抗体和10μL H9N2抗体，加入到270μL配制好的生物素溶液中，在涡旋仪上混匀后，置于摇床上(37℃，150rpm)反应2h，每半小时手摇一次。其后，过量未反应的生物素和反应的副产物通过NAP-5脱盐柱除去。过NAP-5脱盐柱的方法为：先用10mL超声水清洗NAP-5脱盐柱，洗掉NAP-5脱盐柱中的保护溶液，流干，再加入280μL的混合液，流干，用EP管分别接取柱中流出的液体，将接出的样品编号，保存于-20℃冰箱中。

1.3、在微流控芯片中进行磁性尺寸分选检测禽流感病毒蛋白

首先用超声水通入通道排出气体，再用0.1g/mL BSA溶液封闭通道，流速2μL/min,30min后，用超声水洗1min，同时放置永久磁铁，取已修饰好的两种磁球样品各5μL混合后注入，流速0.5μL/min,通入PBS溶液对样品注入口、样品移动通道和汇合通道进行清洗，除去未被捕获的磁珠，通入禽流感病毒蛋白样品，流速0.1μL/min，通入生物素化的禽流感特定单克隆抗体，流速0.1μL/min，通入PBS溶液，洗去过量的抗体，通入SA-QDs溶液，浓度0.01μmol/L，流速0.1μL/min，通入PBS溶液，洗去未连接上的SA-QDs，荧光信号检测。

2、实验结果

将芯片置于倒置荧光显微镜上观察，使用CCD分别拍摄8-9μm磁珠卡在第一级台阶处，4.8μm磁珠卡在第二级台阶处的荧光图片，然后使用IPP软件对荧光强度进行定量分析，进而测定病毒的浓度。

Claims (6)

1.一种磁性尺寸依赖的微流控芯片，包括盖片和基片，盖片位于基片的正上方，盖片和基片密封连接，其特征在于：盖片下表面上开设有磁泳分离结构和捕获不同尺寸磁性微球的尺寸分选沟道，磁泳分离结构包括缓冲液移动通道、样品移动通道、汇合通道、捕获通道和废液排出通道，缓冲液移动通道和样品移动通道在汇合通道处的一端汇合，废液排出通道和捕获通道的一端在汇合通道的另一端汇合，捕获通道的另一端与尺寸分选沟道入口连通，盖片上设有磁铁，磁铁位于汇合通道的上方，且磁铁位于汇合通道在盖片上表面上的投影的一侧，捕获通道朝向靠近磁铁的方向延伸，废液排出通道朝向远离磁铁的方向延伸，盖片上设有缓冲液注入口、样品注入口、第一排出口和第二排出口，缓冲液注入口与缓冲液移动通道连通，样品注入口与样品移动通道连通，第一排出口与废液排出通道连通，第二排出口与尺寸分选沟道出口连通。

2.根据权利要求1所述的磁性尺寸依赖的微流控芯片，其特征在于：所述的尺寸分选沟道底部水平，尺寸分选沟道顶部呈台阶状，尺寸分选沟道顶部的高度自其入口到其出口的方向依次下降。

3.根据权利要求2所述的磁性尺寸依赖的微流控芯片，其特征在于：所述的尺寸分选沟道顶部为三级台阶结构，尺寸分选沟道从其入口到其出口的方向依次为第一级尺寸捕获段、第二级尺寸捕获段和尺寸分选沟道出口。

4.根据权利要求1所述的磁性尺寸依赖的微流控芯片，其特征在于：所述的缓冲液移动通道由平直缓冲液通道段和折弯缓冲液通道段构成，样品移动通道由平直样品通道段和折弯样品通道段构成，平直缓冲液通道段的一端与缓冲液注入口连通，另一端与折弯缓冲液通道段的一端连通，平直样品通道段的一端与样品注入口连通，另一端与折弯样品通道段的一端连通，折弯缓冲液通道段和折弯样品通道段的另一端汇合于汇合通道的一端，折弯缓冲液通道、折弯样品通道和汇合通道连接后的整体结构呈Y型，捕获通道由平直捕获通道段和折弯捕获通道段构成，废液排出通道由平直废液通道段和折弯废液通道段构成，平直捕获通道段的一端与折弯捕获通道段的一端连通，另一端与尺寸分选沟道入口连通，平直废液通道段的一端与折弯废液通道段的一端连通，另一端与第一排出口连通，折弯捕获通道段和折弯废液通道段的另一端汇合于汇合通道的另一端，折弯捕获通道段、折弯废液通道段和汇合通道连接后的整体结构呈Y型。

5.根据权利要求4所述的磁性尺寸依赖的微流控芯片，其特征在于：平直缓冲液通道段平行于平直样品通道段，平直捕获通道段平行于平直废液通道段，平直缓冲液通道、汇合通道和平直捕获通道段中的两两相互平行，平直缓冲液通道段与平直样品通道段之间的距离等于平直捕获通道段与平直废液通道段之间的距离。

6.根据权利要求5所述的磁性尺寸依赖的微流控芯片，其特征在于：所述的磁铁呈方形，磁铁S极与N极的连线平行于汇合通道。