CN109541055A - 一种生物碱类化合物在线富集与分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物碱类物质的在线富集与分析方法，包括以下步骤：A、使第一流动相携带样品经过弱阳离子吸附柱，将样品中的生物碱类物质和中性物质吸附在该柱内，其余组分随第一流动相排出；B、改用第二流动相流过该吸附柱所吸附的中性物质被洗脱而随该第二流动相排出并丢弃，生物碱类物质仍保留在该吸附柱内；C、改用第三流动相流过该吸附柱，将所述生物碱类物质洗脱并用稀释相稀释后进入第一收集柱内，其中生物碱类物质被吸附在该第一收集柱内，第三流动相则排出，如此积累直至该第一收集柱内吸附有足够的生物碱类物质；D、改向所述第一收集柱内供应第四流动相，将所积累的生物碱类物质洗脱出来，并随第四流动相进入分析色谱柱进行分析。

Description

一种生物碱类化合物在线富集与分析方法

技术领域

本发明涉及分析化学领域，具体涉及一种生物碱类化合物的在线富集与分析方法。

背景技术

随着人们对实际样品研究日益深入，常常面对诸多复杂多变的基质，这个样品分析带来诸多困难，如何排除基质干扰及非目标成分的干扰成为分析技术研究的热点。通常的研究者预先使用液液萃取，固相萃取等手段预先去掉样品中的基质及非目标成分，然后再行色谱分析，虽然能有效的实现样品中目标物的分析，但是分析过程通常需要大量的人工操作，除了增加研究者负担外，也容易引入不可控的误差。因此发展全自动在线样品处理及分析系统成为发展的新趋势。

烟草中具有包括烟碱、降烟碱、新烟碱、烟草特有亚硝胺等各种生物碱类物质，实践中需要对这些生物碱类物质进行分析。但烟草中的化学成分多达6000 多种，除了上述生物碱类物质之外，还含有诸如酮类、醛类、醚类和酯类等中性物质，以诸如咖啡酸、绿原酸的酸性物质。在常规的色谱分析中，这些中性物质和酸性物质会干扰生物碱类物质的分析，因此有必要设法排除它们的干扰。

另外，有些特定的生物碱类物质的含量是痕量级的，在常规色谱分析中，这些痕量级物质随样品中的大量溶剂以及输送样品的流动相共同进入色谱柱中后，其对应的色谱峰跟溶剂或流动相对应的色谱峰相比过于微弱，也影响分析精度。

本发明旨在解决上述问题。

发明内容

本发明提供了一种生物碱类物质的在线分析方法，该方法包括以下步骤：

A、用水含量不低于80％的第一流动相携带样品经过吸附柱15，该吸附柱15 为弱阳离子吸附柱，将样品中的生物碱类物质和中性物质吸附在柱内，样品中其余组分随第一流动相排出并丢弃；然后，

B、停止供应第一流动相，并使甲醇含量不低于80％的第二流动相流过吸附柱15，使得吸附柱15内所吸附的中性物质被洗脱而随该第二流动相排出并丢弃，生物碱类物质仍保留在该吸附柱15内；然后，

C、停止供应第二流动相，并使包含酸性有机溶剂的第三流动相流过该吸附柱15，将所述生物碱类物质洗脱，并随第三流动相一起被稀释相稀释后进入第一收集柱21内，该第一收集柱21为反相捕集柱，其中生物碱类物质被吸附在该第一收集柱21内，第三流动相则排出并丢弃；如此积累，直至该第一收集柱 21内吸附有足够的生物碱类物质；

D、停止供应第三流动相和稀释相，并向所述第一收集柱21内供应第四流动相(可选自水或乙腈，且可选地可以向其中添加0.01wt％的三乙胺)，将所积累的生物碱类物质洗脱出来，并随第四流动相进入分析色谱柱20，进行分析。

优选地，设置第二收集柱22，用于与第一收集柱21交替操作，即第一收集柱进行步骤D的时候，第二收集柱22进行步骤C，第一收集柱21进行步骤C的时候，第二收集柱22进行步骤D。

优选地，通过十通阀17来实现第二收集柱22与第一收集柱21的交替操作。

其中，该样品中含有有包括烟碱、降烟碱、新烟碱、烟草特有亚硝胺在内的各种生物碱类物质，以及诸如酮类、醛类、醚类和酯类等中性物质，以及少量诸如咖啡酸、绿原酸等、酸性物质。

本发明的有益效果：

1、通过步骤A和B，将对生物碱类物质的色谱分析有干扰的中性物质和酸性物质提前排除掉，使得它们彻底不进入分析色谱柱。

2、通过步骤C和D，将生物碱类物质在捕集柱内富集到其量足够分析后再进入色谱柱，有利于提高分析精度。

3、设置四通阀16、十通阀17以及相应管路设置，使得第一收集柱21和第二收集柱22交替在线操作，提高分析效率。

附图说明

图1是本发明的方法所使用的在线富集和分析系统的结构的示意图，其中第一收集器21正在执行步骤C而第二收集柱22正在执行步骤D。

图2是本发明的方法所使用的在线富集和分析系统的结构的示意图，其中第一收集器21正在执行步骤D而第二收集柱22正在执行步骤C。

图3是本发明的方法得到的色谱图。

图4为经本系统在线前处理后分析所得谱图。

图中附图标记如下：

10、进样器；11、第一泵；12-第二泵；13、第三泵；14-第四泵；15、吸附柱；16、四通阀；17、十通阀；18、色谱检测器；19、第一废液池；20、分析色谱柱；21、第一收集柱；22、第二收集柱；23、第二废液池；24-第五泵；

A1、第一出口；A2-第二出口；A3-第三出口；A4-第四出口；

B1、第一端口、B2、第二端口、B3、第三端口、B4、第四端口、B5、第五端口、B6、第六端口、B7、第七端口、B8、第八端口、B9、第九端口；B10、第十端口。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

需要说明的是，当元件被称为“固定于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

烟草样品5g，经50％甲醇(添加1％氨水)20ml超声提取30min，过滤并定容至20ml，储存于冰箱待进样。过0.4μm有机膜后等待进样。该样品中溶解有包括烟碱、降烟碱、新烟碱、烟草特有亚硝胺在内的各种生物碱类物质，以及诸如酮类、醛类、醚类和酯类等中性物质，以及少量诸如咖啡酸、绿原酸等、酸性物质。

请参阅图1，本发明的方法包括以下步骤：

A、将样品从进样器10注入，同时用第一泵11供应体积比为90/10的水/ 甲醇混合物并使其携带样品经过吸附柱15，该吸附柱15为弱阳离子吸附柱(规格为10cm(长度)×4.6mm(内径))，将样品中的生物碱类物质和中性物质吸附在该柱内，样品中其余组分诸如酸性物质等随该第一流动相经四通阀16的 A1和A4出口排出至第一废液池19；然后，

B、关闭第一泵11，停止供应第一流动相，并开启第二泵12供应体积比为 90/10的甲醇/水混合物的第二流动相流过吸附柱15，使得吸附柱15内所吸附的中性物质被洗脱而随该第二流动相经四通阀16的A1和A4出口排出至第一废液池19，生物碱类物质仍保留在该吸附柱15内；然后，

C、关闭第二泵，停止供应第二流动相，并开启第三泵13以甲酸的甲醇溶液(1wt％-5wt％)作为第三流动相流过该吸附柱15，将所述生物碱类物质洗脱，并随第三流动相经四通阀16的A1和A2出口流出，同时开启第五泵24供应稀释相(例如为5wt％-10wt％的甲醇水溶液)去稀释该流出的第三流动相，二者再依次经图1所示的B1-B10-21-B3-B2-B7-B6的顺序流动并排出到第二废液池23；其中第一收集柱21为反相捕集柱，其中生物碱类物质被吸附在该第一收集柱21 内，如此积累，直至该第一收集柱21内吸附有足够的生物碱类物质；

D、关闭第三泵13停止供应第三流动相，关闭第五泵24停止供应稀释相，并开启第四泵14以供应第四流动相(可以为水或乙腈，并可选地还含有0.01wt％的三乙胺)，如图2所示依次经B4-B3-21-B10-B9-20的路径流动，在流经所述第一收集柱21内将所积累的生物碱类物质洗脱出来，并随第四流动相进入分析色谱柱20，进行分析。

本实施例中设置了第二收集柱22，用于与第一收集柱21交替操作，即第一收集柱进行步骤D的时候，第二收集柱22进行步骤C，第一收集柱21进行步骤 C的时候，第二收集柱22进行步骤D。由此实现在线切换，以交替方式实现整体连续工作。具体切换过程如图1和图2所示。

实施例

为了更好说明本方法效果，我们对烟草样品分别采用传统提取方法和本法方法进行了对比分析。

样品制备：

烟草样品5g，经50％甲醇(添加1％氨水)20ml超声提取30min，过滤并定容至20ml，储存于冰箱待进样。

所得样品分别直接进液相色谱分析，和采用本系统进行分析。

分析条件如下：

直接色谱分析条件

进样体积：10μl，

流动相：水(+0.01％三乙胺)，乙腈(+0.01％三乙胺)，

流速：1ml/min，

梯度：0～2min，10％乙腈；2～15min，10-80％乙腈；15～16.5min，80％乙腈；16.5～18min，80-10％乙腈

检测波长：280nm，

采用本发明方法如下：

进样体积为：40μl，

第一流动相

流动相：水含量不低于80％的甲醇水溶液

流速：0.2ml/min

洗脱时间：5min。

第二流动相

流动相：甲醇含量不低于80％的甲醇水溶液

流速：0.2ml/min

洗脱时间：5min。

第三流动相

流动相：含1％甲酸的甲醇溶液

流速：0.2ml/min

洗脱时间：5min。

稀释流动相

流动相：含水量不少于90％甲醇溶液。

流速：0.5ml/min。

第四流动相

流动相：水(+0.01％三乙胺)，乙腈(+0.01％三乙胺)，

流速：1ml/min，

检测波长220nm，

梯度：0～2min，10％乙腈；2～15min，10-80％乙腈；15～16.5min，80％乙腈；16.5～18min，80-10％乙腈。

图3为未经前处理直接进样分析得到的谱图，图4为经本系统在线前处理后分析所得谱图，经本发明方法处理后谱较未处理变得非常干净，由于烟草中主要含有烟碱，因此，最终谱图得到的色谱峰主要为烟碱。本发明使得烟草中烟碱分析在不增加前处理时间基础上能更准确的分析。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (4)

1.一种生物碱类物质的在线富集与分析方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

A、用水含量不低于80％的甲醇水溶液为第一流动相携带样品经过吸附柱(15)，该吸附柱(15)为弱阳离子吸附柱，将样品中的生物碱类物质和中性物质吸附在该柱内，样品中其余组分随第一流动相排出并丢弃；然后，

B、停止供应第一流动相，并使甲醇含量不低于80％的第二流动相流过吸附柱(15)，使得吸附柱(15)内所吸附的中性物质被洗脱而随该第二流动相排出并丢弃，生物碱类物质仍保留在该吸附柱内；然后，

C、停止供应第二流动相，并使包含酸性有机溶剂的第三流动相流过该吸附柱，将所述生物碱类物质洗脱，并随第三流动相一起被稀释相稀释后进入第一收集柱(21)内，该第一收集柱(21)为反相捕集柱，其中生物碱类物质被吸附在该第一收集柱(21)内，第三流动相则排出并丢弃；如此积累，直至该第一收集柱(21)内吸附有足够的生物碱类物质；

D、停止供应第三流动相和稀释相，并向所述第一收集柱(21)内供应第四流动相，将所积累的生物碱类物质洗脱出来，并随第四流动相进入分析色谱柱(20)，进行分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，设置第二收集柱(22)，用于与第一收集柱(21)交替操作，即第一收集柱(21)进行步骤D的时候，第二收集柱(22)进行步骤C，第一收集柱(21)进行步骤C的时候，第二收集柱(22)进行步骤D。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，通过十通阀(17)来实现第二收集柱(22)与第一收集柱(21)的交替操作。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物碱类物质包括烟碱、降烟碱、新烟碱、烟草特有亚硝胺，所述中性物质包括酮类、醛类、醚类和酯类物质，所述酸性物质包括咖啡酸、绿原酸。