CN109540838B - 一种快速检测发酵乳中酸度的方法 - Google Patents

一种快速检测发酵乳中酸度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速检测发酵乳中酸度的方法，包括以下步骤：(1)采集发酵乳作为定标集样品，对定标集样品进行分析检测，得出定标集样品的酸度实测值，建立基础数据库；同步对定标集样品进行近红外光谱扫描，录制定标集样品的近红外光谱数据，建立近红外光谱数据库；将酸度基础数据库与近红外光谱数据库进行对应，建立酸度定标模型；(2)采用交叉验证法对酸度定标模型进行内部验证；(3)将待测发酵乳样品进行近红外光谱扫描，获得近红外光谱数据，将近红外光谱数据导入酸度定标模型，获得待测发酵乳样品的酸度预测值。该方法具有快速、高效、准确、成本低、不污染环境等优点，能满足发酵乳产品在线质量检验的高效性和及时性要求。

Description

一种快速检测发酵乳中酸度的方法
技术领域
本发明属于食品质量与安全检测，具体涉及一种快速检测发酵乳中酸度的方法，更涉及一种基于近红外光谱技术实现发酵乳中酸度快速检测的方法。
背景技术
发酵乳是指以生牛(羊)乳或乳粉为原料，经杀菌、发酵后制成的pH值降低的产品。发酵乳被认为是乳酸菌传递到人体内的最理想载体。发酵乳中含有的乳糖、半乳糖、乳酸、乳酸菌增殖因子及活性乳酸菌等物质，具有缓解乳糖不耐症、抗氧化、维持肠道菌群正常平衡、防治腹泻、增强免疫、降低胆固醇等促进人体健康作用。
乳酸菌代谢产酸是发酵乳酸度升高的原因。酸度是发酵乳在生产过程中作为发酵终点的判定标准之一，适宜的酸度值可以赋予发酵乳良好的凝固状态。酸度是影响发酵乳的营养价值、感官品质和风味等因素的基础和原因，GB 19302-2010《食品安全国家标准发酵乳》中规定，酸度应≥70.0°T。因此，酸度控制是企业最为关注的问题之一。
目前发酵乳常见的酸度检测方法有两种：
(1)酚酞指示剂法：以酚酞作为指示剂，用0.1000mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至中性，消耗氢氧化钠溶液的体积数，经计算确定试样的酸度。其主要缺点是对检测人员技术要求较高，难以避免人为操作引起的误差，如检测人员对滴定终点的判定带来的误差。
(2)电位滴定仪法：中和100g试样至pH为8.3所消耗的0.1000mol/L氢氧化钠体积，经计算确定其酸度。电位滴定仪法比酚酞指示剂法减少了人为操作引起的误差，且避免待滴定溶液本身自带颜色对读数的干扰，但仍不能排除CO2对滴定结果的影响，滴定过程中需要向锥形瓶吹氮气，防止溶液吸收空气中的CO2，操作较为复杂，对检测设备要求较高，成本也较高。
两种分析方法都存在耗时长、不能及时指导生产的缺点，单个样品检测时间和结果计算需要20～30min，容易造成监控数据滞后现象，难以起到过程控制的作用。为满足企业生产需要，在如何保证分析结果准确度的同时提高检测速度已成为新的重要课题。
因此，研究建立一种能够快速、准确、简便、省时、省力的酸度检测方法对于现实具有重要的意义。
近红外光谱方法(Near infrared reflection spectroscopy，NIRS)是利用有机物中含有C-H、N-H、O-H、C-C等基团的倍频与合频吸收，这些基团的基频以漫反射(或透射)方式获得在近红外区的吸收光谱，通过逐步多元线性回归法(Stepwise Multiple LinearRegression，SMLR)、偏最小二乘法(Partial Least Squares，PLS)、主成分回归法(Principal Component Regression，PCR)等现代化学和计量学的手段，建立物质光谱与待测成分含量间的线性或非线性模型，从而实现用物质近红外光谱信息对待测成分含量的快速计量。
因此，近红外光谱技术具有快速、无损、高效、成本低等优点，利用近红外光谱技术建立快速检测发酵乳中酸度的方法具有重要意义和应用前景。但能否将近红外光谱方法用于检测发酵乳中酸度中并能达到在线检测的高效性和及时性要求尚未可知。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测发酵乳中酸度的方法，该方法具有快速、高效、准确、成本低、不污染环境等优点，能满足发酵乳产品在线质量检验的高效性和及时性要求。
本申请发明人经过研究发现，发酵乳的酸度主要来源于乳酸菌的代谢产物乳酸等有机酸，其酸度值与有机酸的含量呈正比。有机酸含有多个O-H、C-H基团，近红外光谱区与有机酸中含氢基团(O-H、C-H)振动的合频和各级倍频的吸收区一致，通过扫描样品的近红外光谱，样品对不同频率的近红外光选择性吸收，透射出来的近红外光线就携带有机物组分和结构的信息。通过检测器分析透射或反射光线的光密度，就可以确定该组分的含量。因此研究使用近红外光谱法快速检测发酵乳中的酸度值具有可行性，可以为今后发酵乳中酸度的快速检测提供理论依据。
鉴于此，本申请发明人尝试使用相应的NIR化学计量学软件，建立含量-光谱对应的NIR定标。录制未知样品的NIR谱，调用NIR定标，进而定量发酵乳中的酸度。
进一步的，本发明提供的一种快速检测发酵乳中酸度的方法，包括以下步骤：
(1)建立发酵乳中酸度定标模型：
采集发酵乳作为定标集样品，采用常规方法对定标集样品进行分析检测，得出定标集样品的酸度实测值，建立基础数据库；
同步对定标集样品进行近红外光谱扫描，录制定标集样品的近红外光谱数据，建立近红外光谱数据库；
将所述定标集样品的酸度基础数据库与所述近红外光谱数据库进行一一对应，建立酸度定标模型；
(2)采用交叉验证法对该定标模型进行内部验证；
(3)待测发酵乳样品的检测：将待测发酵乳样品进行近红外光谱扫描，获得待测发酵乳样品的近红外光谱数据，将数据导入步骤(1)中建立的酸度定标模型，获得待测发酵乳样品的酸度预测值。
在该快速检测发酵乳中酸度的方法中：
优选的，步骤(1)中所述常规方法是按照中国国家标准GB 5009.239-2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》，采用电位滴定法对定标集样品进行分析检测。
优选的，步骤(1)中对定标集样品进行近红外光谱扫描时，采用的近红外光谱仪为Thermo ANTARISⅡ，配制InGaAs检测器，透射采样模块、Result 3数据采集软件和TQAnalyst 8数据分析软件。
优选的，采用Result 3数据采集软件采集时，以积分球漫透射方式和空气为背景，设置分辨率8cm-1，扫描范围4000～10000cm-1，扫描次数为32。
由于发酵乳样品的粘度大，考虑到弃样的后处理方便，以及聚乙烯的NIR光谱吸收峰较少，干扰少，优选的，步骤(1)中对定标集样品进行近红外光谱扫描时，所述定标集样品采用聚乙烯密封袋采样，采样后密封并应在15min内采集近红外光谱数据，防止乳酸菌数在常温下发生变化而影响酸度。
由于发酵乳样品是半固体状态，具有流动性，与固体样品的采集数据方法不同，本发明在采集发酵乳近红外光谱信息时，需要对透射采样模块进行改进，本发明中所述的透射采样模块优选采用凹字形压块，所述定标集样品采用聚乙烯密封袋采样后密封，置于所述近红外光谱仪的积分球漫透射光孔上，然后采用凹字形压块压紧，其中凹字形压块的凹槽部正对聚乙烯密封袋，所述凹字形压块中的凹槽的深度为3mm，录制定标集样品的近红外光谱数据。
采用该透射采样模块采样，可以使发酵乳采集条件以及密封袋厚度保持一致。
具体的，该透漫射采样模块可以是不锈钢材质，“[”型，长10cm×宽3cm×高3cm，反射凹面经镜面抛光处理，凹面深度3mm。采集方法可以使得样品厚度一致。
优选的，步骤(1)中对定标集样品进行近红外光谱扫描时，在温度为(23±2)℃、湿度为(50±5)％的恒温恒湿室中进行。
发酵乳原始光谱数据因采集环境和测试条件，如光谱仪器状态、检测环境温度、样品状态、检测参数等因素硬性，导致光谱信息存在差异性和光谱数据的不稳定性。而且样品中不同成分也会互相干扰，导致谱线重叠，低含量成分光谱峰被高含量成分光谱峰掩盖等问题。因此，在建模时候，需要考虑多种因素。
建立乳酸菌数模型时，设定的建模条件通常包括：
(1)化学计量学方法：逐步多元线性回归法(Stepwise Multiple LinearRegression，SMLR)、偏最小二乘法(Partial Least Squares，PLS)、主成分回归法(Principal Component Regression，PCR)等；
(2)光程类型(Pathlength Type)：恒定光程(Constant)、多元散射校正(Multiplicative Signal Correction，MSC)、标准正态变量变换(Standard NormalVariate，SNV)等；
(3)数据格式(Data Format)：原始光谱(Spectrum)、一阶导数(Firstderivative，1st Der)、二阶导数(Second derivative，2nd Der)；
(4)平滑类型(Smoothing)：不光滑(No Smoothing，NS)、卷积平滑滤波(Savizky-Golay Filter数据点为7，3项式平滑滤波，S-G)、Norris导数平滑滤波(Norris derivativefilter，ND)等；
(5)建模波段范围：4000～10000cm-1。
本发明研究了建模方法的有效选择，比较不同预处理方法的评价指标，通过优化光谱预处理和波段，对光谱信息的采集方法进行改良，解决光谱噪音的滤除等方法，提高了分辨率和灵敏度，最终成功建立高效快速准确的酸度定标模型。
即本申请发明人经过进一步的实验，发现以下条件建立模型时，获得的发酵乳中酸度的预测值与真实值更加接近。
优选的，步骤(1)中建立酸度定标模型时，采用偏最小二乘法，经过savitzky-golay filter数据点为7，3项式平滑滤波处理，并结合一阶导数和标准正态变量变换(SNV)对近红外光谱的数据进行处理。
优选的，步骤(1)中建立酸度定标模型时，选取波段为5569-5716cm-1、5724-6403cm-1、7197-7506cm-1范围内的光谱数据建立模型。
因此，本发明通过采用多元分析，利用特定波长短提取有效信息、运用校正技术等方法，成功提取有效信息，解决了信号提取困难、测量灵敏度低难题，可以建立快速准确的酸度定标模型。
步骤(2)中采用交叉验证法对该定标模型进行内部验证，交叉验证法的原理为：假设定标集有n个样品，可以每次从中取出m(m＝1,2.3,…)个样品，作为临时验证集，以其余的(n-m)个样品作为校正集进行建模，然后对这m个样品进行预测，如此循环，则分别得到n个样品的交叉预测值，再以交叉预测值与标准值作相关图，同样类似的可以计算校正集交互验证的根均方误差(RMSECV)和相关系数(Rcv)。
优选的，优选的，步骤(1)中采用主成分分析-马氏距离方法剔除发酵乳中异常样品数据，获得定标集样品，提高近红外光谱定量分析的可靠性；步骤(1)中所述发酵乳为含活乳酸菌的发酵乳，所述定标集样品包括校正集样品和验证集样品；步骤(2)中采用交叉验证法对所述的酸度定标模型进行验证时，从定标集样品中取出85％的样品作为校正集样品进行建模，以剩余的15％的样品作为验证集样品进行验证。
作为本发明的一种优选的实施方式，所述定标集样品为67批次，其中校正集(Calibration)样品为57批次，验证集(Validation)样品为10批次。
选择具有代表性的样品作为定标集样品，如选择不同风味、黏度、颜色、添加物、乳酸菌数含量等发酵乳样品，尽量保证样品的酸度在(50～109)°T建模范围内分布均匀。
因此，本发明研究了采用近红外光谱快速检测发酵乳中酸度的方法，该方法利用具有代表性的发酵乳样品构成定标集样品，采用电位滴定仪法对定标集样品的酸度进行分析检测，建立基础数据库；并采用近红外光谱仪在设定的建模条件下采集其近红外光谱信息，建立近红外光谱数据库；将所述定标集样品的酸度基础数据库与所述近红外光谱数据库进行一一对应，采用PLS法建立发酵乳中酸度的定标模型；采用交叉验证法对该定标模型进行内部验证；取待测样品，对其进行近红外光谱分析，将光谱数据导入定标模型，得出待测样品的酸度。该方法具有快速、高效、准确、成本低、不污染环境等优点，能满足发酵乳产品在线质量检验的高效性和及时性要求。
本申请将上述近红外光谱方法直接应用于发酵乳中酸度检测时，在建模过程中遇到以下的困难：
(1)发酵乳中含有丰富的氨基酸、脂肪酸、乳酸等有机酸。牛(羊)奶经过发酵后，部分乳糖转化为乳酸，酪蛋白被分解成短肽和游离氨基酸，发酵乳中脂肪直径较小，所含短链脂肪酸和必需脂肪酸较多。这些酸性物质构成了发酵乳的酸度。发酵乳成分复杂，包含蛋白质、脂肪、乳糖、乳酸、盐分、食品添加剂等物质，构成酸度的物质在发酵乳中所占含量较低。因此，利用近红外光谱技术对发酵乳中酸度的定量分析并不是对单一物质的分析检测，而是对低含量的多种成分的组合进行综合分析。不同品牌不同口味的发酵乳还会添加果蔬或谷物，导致发酵乳的颗粒大小、黏度、颜色存在很大差异。因此，发酵乳的近红外光谱重叠严重、数据量大且提取困难，光谱吸收值之间存在共线性问题，大大增加了近红外光谱分析的难度。
本发明通过收集各种类型样品，样品类型包括不同风味、黏度、颜色、添加物、酸度等，选择具有代表性的样品作为定标集样品，尽量保证样品的酸度在50～109°T建模范围内分布均匀，且采用主成分分析-马氏距离方法剔除次异常数据，选择有效样品，提高模型的预测准确度。同时采用多元分析，利用特定波长短提取有效信息、运用校正技术等方法，成功提取有效信息，解决了信号提取困难、测量灵敏度低难题，建立快速准确的酸度定标模型。
(2)发酵乳原始光谱数据因采集环境和测试条件，如光谱仪器状态、检测环境温度、样品状态、检测参数等因素硬性，导致光谱信息存在差异性和光谱数据的不稳定性。而且样品中不同成分也会互相干扰，导致谱线重叠，低含量成分光谱峰被高含量成分光谱峰掩盖等问题。本发明研究了建模方法的有效选择，比较不同预处理方法的评价指标，通过优化光谱预处理和波段，对光谱信息的采集方法进行改良，解决光谱噪音的滤除等方法，提高了分辨率和灵敏度，最终成功建立高效快速准确的酸度定标模型。
(3)由于发酵乳是浑浊黏稠的半固体，样品的颗粒度不均匀会引起散射，当样品组成发生变化，其吸收系数和散射系数也随之变化，产生较大的散射误差，导致建模的准确性不高。本发明通过积分球漫透射的方式，同时采用凹字形透射采样模块采样，可以使发酵乳采集条件以及样品的厚度保持一致，改变了近红外光的传输特性，大大增加了信号强度，改良了近红外吸收光谱采集形式，成功建立定标模型。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)操作简单、快速、高效：无需样品预处理，可直接扫描样品获取光谱信息，通过建立的定标模型可在1min内得到分析结果；
(2)环保无污染，成本低：近红外光谱分析可以实现对样品的无损分析，不消耗任何试剂，可大幅度降低检测成本，且不污染环境，属于绿色分析技术；
(3)可用于在线检测：可实现发酵乳生产流水线上的实时分析与控制。
(4)因此，本发明方法结果表明，使用近红外透射光谱快速测定发酵乳中的酸度是可行的，为今后发酵乳中酸度的快速检测提供了理论依据。
附图说明
图1是本发明实施例2中发酵乳中酸度的NIR透射光谱图；
图2是本发明实施例2中发酵乳中酸度定标模型中预测值和真实值的相关性关系；
图3是本发明实施例2中发酵乳中酸度定标模型中预测值和真实值的相对误差；
图4是本发明实施例2中发酵乳中酸度定标模型的十字交叉验证图(Crossvalidation)。
具体实施方式
以下通过具体实施例来说明本发明中的发酵乳中酸度值的检测方法：
实施例1
本实施例提供的快速检测发酵乳中酸度的方法，包括以下步骤：
1仪器和材料
1.1仪器与设备
分析天平(感量0.001g)：ML204/02 Mettler Toledo；
电位滴定仪(精度0.01PH，附电磁搅拌器)：785DMP Metrohm；
近红外光谱仪Thermo ANTARIS Ⅱ：InGaAs检测器，安装Result 3数据采集软件和TQ Analyst 8数据分析软件。
1.2材料
材料：聚乙烯密实袋规格(7cm×5cm)；
样品：含活乳酸菌发酵乳样品71批次；
试剂：氢氧化钠(分析纯)，天津市致远化学试剂有限公司，酚酞，天津市天新精细化工开发中心；
2电位滴定法测定酸度
采集具有代表性的发酵乳样品构成用于建模的定标集样品，所有发酵乳样品均为含活乳酸菌的发酵乳，按照中国国家标准GB 5009.239-2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》，采用电位滴定仪法测定所述定标集样品的酸度，构成所述定标集样品的酸度化学测定值。其具体检验方法和计算方法如下：
2.1检验方法
实验前先校正仪器。然后称取10g(精确到0.001g)已混匀的试样，置于150mL锥形瓶中，加20mL新煮沸冷却至室温的水，混匀，插入电极，放入一枚转子，置于电磁搅拌器上，开始搅拌，用氢氧化钠标准(0.1000mol/L)滴定溶液滴定。开始时滴定速度可稍快，当样液pH＝8.0后，放慢滴定速度，每次滴加半滴溶液直至pH＝8.3为其终点。记录消耗的氢氧化钠标准滴定溶液毫升数(V1)，代入下列公式(1)中进行计算。按上述步骤同时做空白试验。用相应体积的蒸馏水做空白实验，读取耗用氢氧化钠标准溶液的毫升数(V0)。空白所消耗的氢氧化钠的体积应不小于零，否则应重新制备和使用符合要求的蒸馏水。
2.2结果计算
Figure BDA0001956675050000081
式中：
X——试样的酸度，单位为度(°T)；
c——氢氧化钠标准溶液的摩尔浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；
V1——滴定时所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升(mL)；
V0——空白实验所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升(mL)；
100——100g试样；
m——试样的质量，单位为克(g)；
0.1——酸度理论定义氢氧化钠的摩尔浓度，单位为摩尔每升(mol/L)。
以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
3近红外光谱信息采集
采用近红外光谱仪在设定的建模条件下采集定标集样品的近红外光谱信息，构成所述定标集样品的近红外波段光谱信息，建立近红外光谱数据库。
3.1取样方法
使用聚乙烯密封袋(7cm×5cm)采样12g-15g，采样后密封并应在15min内完成检测，防止乳酸菌数在常温下发生变化而影响酸度。
3.2采集方法
检测前开机预热30min，以空气为参比，扣除背景，性能测试后进行光谱扫描。测试过程环境温湿度控制在(23±2)℃，(50±5)％范围内。采用Result 3数据采集；采样方式：积分球漫透射；分辨率：8cm-1；波长范围：4000～10000cm-1；扫描次数：32次；信号增益：1X。
取均匀样品装进聚乙烯密实袋，密封后平铺于积分球漫透射光孔上，录制NIR谱。采用自制透漫射采样模块：不锈钢材质，“[”型，长10cm×宽3cm×高3cm，反射凹面经镜面抛光处理，凹面深度3mm。
测试过程在温度(23±2)℃、湿度(50±5)％的恒温恒湿室中进行。每个样品重复测定2次，取其平均光谱。采集的光谱数据用TQ Analyst 8数据分析软件进行处理和计算。
采用聚乙烯密实袋装样原因：样品的粘度大、弃样的后处理方便，聚乙烯的NIR光谱吸收峰较少，干扰少。
4定标模型的评价指标
为保证模型的预测结果与使用标准方法获得的实测值具有较好的一致性，本发明在模型建立和验证过程中使用的评价指标如下：
校正集根均方误差(Root Mean Square Error of Calibration，RMSEC)和预测集根均方误差(Root Mean Square Error of Prediction，RMSEP)：
Figure BDA0001956675050000091
校正集交互验证的根均方误差(Root Mean Square Error of CrossValidation，RMSECV)：
Figure BDA0001956675050000092
相关系数R：
Figure BDA0001956675050000093
式中：n表示样本数；yi表示第i个样品使用电位滴定法获得的实测值；
Figure BDA0001956675050000101
表示第i个样品的近红外预测值；
Figure BDA0001956675050000102
表示样品使用电位滴定法获得的实测值的平均值。RMSEC、RMSEP和RMSECV分别表示校正集、预测集样品和内部交叉验证时预测值和实测值偏离的大小，其值越小，表示所建模型的预测精度越大，且RMSEC、RMSEP和RMSECV之间的差异越小，模型的预测效果就越好。相关系数R表示样品参数指标的实测值和近红外预测值之间的相关程度，其值越接近于1，说明实测值与近红外预测值之间的相关程度越好。理想状态条件下，相关系数R的值为1，均方根误差为0。
5建立模型的方法
5.1样品选择
定标集样品包括校正集样品和验证集样品，校正集样品主要用于仪器上分析模型的建立，验证集样品用来验证分析模型的效果。样品选择一般遵循以下两个要求：(1)样品数量要足够，这样才能建立光谱信息与酸度之间的定量关系；(2)样品要有代表性，尽量分布均匀，且要避免共线性现象。在选择定标集样品时，要对可能存在的异常样品进行剔除，以提高模型的预测性能。本发明采用采用主成分分析-马氏距离方法剔除异常数据。
5.2化学计量学方法选择
近红外光谱有其自身的缺点，如谱带较宽，重叠严重，样品中不同成分的迭加，都会造成分析过程中的干扰。借助合适的化学计量学方法，可以降低干扰，提高信噪比，有助于提升模型精度和稳定性。在近红外光谱技术分析中经常采用的化学计量学方法有：逐步多元线性回归法(SMLR)、偏最小二乘法(PLS)、主成分回归法(PCR)等。本发明在建模过程中，以校正集根均方误差RMSEC及其相关系数Rc，预测集根均方误差RMSEP及其相关系数Rp为评价指标，对不同NIR分析方法比较，最终确定PLS为最佳处理方法。
5.3光谱数据预处理
近红外仪器的随机噪声和仪器偏差，以及样品背景、散射光等干扰，都会导致光谱偏移或漂移。如果直接使用原始光谱建立模型，会影响模型的准确度和精度。适当的光谱预处理能提高模型的预测性能。本发明以校正集根均方误差RMSEC及其相关系数Rc，预测集根均方误差RMSEP及其相关系数Rp为评价指标，比较了(1)光程类型：恒定光程、多元散射校正(MSC)、标准正态变量变换(SNV)；(2)数据格式：原始光谱、一阶导数(1st Der)、二阶导数(2nd Der)；(3)平滑类型：不光滑(NS)、卷积平滑滤波(S-G)、Norris导数平滑滤波(ND)等三种光谱预处理方法，最终确定“SNV+1st Der+S-G”为最佳处理方法。
5.4建模波段选择
通过观察发酵乳近红外原始光谱曲线，可以发现相似的规律：光谱性状具有相似性，但不同样品由于组成、性状存在差异，光谱图稍有不同，其吸收峰位置的差异性不显著。在近红外定量分析中，波长优化可以简化模型，剔除不相关或者非线性变量，提高模型的预测能力和稳定性。获得近红外波段光谱信息中的波段范围为4000-10000cm-1。根据线性相关系数和NIR的吸光度，不断优化波段范围，最终选择定量光谱区间段为5569-5716cm-1、5724-6403cm-1、7197-7506cm-1。
6采用交叉验证法对定标模型进行内部验证
本实施例以定标集样品的85％作为校正集样品，定标集样品的15％作为验证集样品进行交叉验证。
8待测发酵乳样品的检测
取待测样品，对其进行近红外光谱分析，获得待测样品的近红外波段光谱信息，将光谱数据导入定标模型，得出待测样品中酸度预测值。
实施例2
本实施提供的快速检测发酵乳中酸度的方法，包括以下步骤：
(1)建立发酵乳中酸度定标模型：
采集发酵乳作为定标集样品，采用常规方法对定标集样品进行分析检测，得出定标集样品的酸度，建立基础数据库；
同步对定标集样品进行近红外光谱扫描，录制定标集样品的近红外光谱数据，建立近红外光谱数据库；
将所述定标集样品的酸度基础数据库与所述近红外光谱数据库进行一一对应，建立酸度定标模型；
(2)采用交叉验证法对该定标模型进行内部验证；
(3)待测发酵乳样品的检测：将待测发酵乳样品进行近红外光谱扫描，获得待测发酵乳样品的近红外光谱数据，将数据导入步骤(1)中建立的酸度定标模型，获得待测发酵乳样品的酸度预测值。
具体实施过程如下：
1实验部分
1.1材料和仪器
含活乳酸菌发酵乳样品共71批次，由国家食品产品质量监督检验中心(广东)提供。
电位滴定仪785DMP Metrohm：精度0.01PH，附电磁搅拌器。
近红外光谱仪Thermo ANTARIS Ⅱ：InGaAs检测器，安装Result 3数据采集软件和TQ Analyst 8数据分析软件。
1.2电位滴定法测定样品中酸度
按照中国国家标准GB 5009.239-2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》，采用电位滴定法对校正样品集进行分析检测时同实施例1。
1.3采集发酵乳样品近红外光谱信息
ANTARIS Ⅱ仪器采用Result 3操作系统采集光谱，智能透射方式，以积分球漫透射方式和空气为背景，设置分辨率8cm-1，扫描范围4000～10000cm-1，扫描次数为32。使用聚乙烯密封袋(7cm×5cm)采样12g-15g，采样后密封并应在15min内录制NIR光谱，防止乳酸菌数在常温下发生变化而影响酸度，每个样品重复测定2次，取其平均光谱。测试过程在温度(23±2)℃、湿度(50±5)％的恒温恒湿室中进行。采集的光谱数据用TQ Analyst 8数据分析软件进行处理和计算。
1.4建立模型
将所述定标集样品的酸度基础数据库与所述近红外光谱数据库进行一一对应，以RMSEC、RMSEP、RMSECV及其相关系数Rc、Rp、Rcv为评价指标，通过剔除异常数据、选择化学计量学方法、光程类型、数据格式、平滑类型等光谱数据预处理、建模波段优化等步骤，建立酸度定标模型，并采用交叉验证法对定标模型进行内部验证。
2结果与讨论
发酵乳中的酸度值主要取决于代谢产物有机酸的含量，有机酸含有多个C-H、O-H基团，基频振动400～4000cm-1的合频和倍频在近红外光谱区4000～12800cm-1有吸收，因此研究使用近红外光谱法快速检测发酵乳中的酸度值。
2.1剔除异常数据
采用主成分分析-马氏距离方法剔除4批次异常数据，提高近红外光谱定量分析的可靠性，以剩余的67批次样品进行建模。NIR透射光谱叠加谱如图1所示。
2.2化学计量学方法选择
以RMSEC、RMSEP及其相关系数Rc、Rp为评价指标，比较SMLR、PLS、PCR三种分析方法，结果如表1～2所示。由表1～2可知，PLS建模方法的RMSEC、RMSEP最小，Rc、Rp最接近1，故PLS为最佳处理方法。
表1 SMLR、PLS、PCR建模方法的RESEC和Rc
Figure BDA0001956675050000131
表2 SMLR、PLS、PCR建模方法的RESEP和Rp
Figure BDA0001956675050000132
2.3光谱数据预处理
以RMSEC、RMSEP及其相关系数Rc、Rp为评价指标，对恒定光程、MSC、SNV、一阶导数(S-G)、二阶导数(S-G)、一阶导数+MSC(S-G)、二阶导数+MSC(S-G)、一阶导数+SNV(S-G)、二阶导数+SNV(S-G)分析方法比较，结果如表3～4所示。综合考虑RMSEC、RMSEP及其相关系数Rc、Rp，一阶导数+SNV(S-G)为最佳预处理方法。
表3近红外光谱数据预处理方法的RESEC和Rc
预处理方法 RMSEC R<sub>c</sub>
恒定光程 4.91 0.8733
MSC 4.92 0.8730
SNV 4.33 0.9032
一阶导数(S-G) 3.48 0.9385
二阶导数(S-G) 5.53 0.8365
一阶导数+MSC(S-G) 3.26 0.9462
二阶导数+MSC(S-G) 2.73 0.9627
一阶导数+SNV(S-G) 3.27 0.9462
二阶导数+SNV(S-G) 2.73 0.9627
表4近红外光谱数据预处理方法的RESEP和Rp
预处理方法 RMSEP R<sub>p</sub>
恒定光程 8.13 0.7524
MSC 7.96 0.7557
SNV 5.33 0.8909
一阶导数(S-G) 4.42 0.9208
二阶导数(S-G) 10.7 0.4881
一阶导数+MSC(S-G) 4.39 0.9223
二阶导数+MSC(S-G) 11.6 0.3220
一阶导数+SNV(S-G) 4.39 0.9225
二阶导数+SNV(S-G) 11.6 0.3175
2.4建模波段选择
在近红外定量分析中，波长优化可以简化模型，剔除不相关或者非线性变量，提高模型的预测能力和稳定性。获得近红外波段光谱信息中的波段范围为4000-10000cm-1。根据线性相关系数和NIR的吸光度，不断优化波段范围，最终选择定量光谱区间段为5569-5716cm-1、5724-6403cm-1、7197-7506cm-1。
2.5采用交叉验证法对定标模型进行内部验证
以定标集样品中的57批次作为校正集(Calibration)样品，另外的10批次作为验证集(Validation)样品，进行多变量建立酸度的定标模型，酸度预测值和真实值的相关性关系如图2所示。从图2中可以看出，校正集和预测集中实际测定值和模型预测值之间的相关系数都达到了0.92以上，RMSEC与RMSEP的值很接近，说明相关性好，精确度高。
模型的预测值和真实值的相对误差如图3所示，十字交叉验证图(Crossvalidation)如图4所示。由图3-4可知定标模型的相关系数Rc值>0.94，说明模型相关性好，RMSEC和RMSEP数值相近，说明样品代表性好，样品信息提取充分；RMSEP和RMSECV数值相近，说明建模样品与验证样品都具有代表性，模型信息拟合充分，模型预测性好。
3独立样品预测
从图2～4可知，经过剔除异常数据、化学计量学方法优选、光谱数据预处理、光谱波段优化等步骤建立的酸度定标模型，定量误差参数RMSEC、RMSEP、RMSECV满足要求，模型预测性能良好，可用于实际样品检测。为进一步说明模型的可行性，本发明利用独立样品对近红外的准确性进行了考察。
准备10个含活乳酸菌发酵乳样品，按照1.2电位滴定法测定样品中酸度的实测值，按1.3采集其近红外光谱信息，将光谱数据导入定标模型，得出样品的酸度预测值，同时将定标模型预测值和电位滴定法实测值对比，分析其误差是否在允许范围内，要求两种方法的相对误差不超过10％，具体结果见表5。
表5发酵乳样品的酸度定标模型预测值和电位滴定法测定值比较(°T)
样品序号 化学测定值 模型预测值 绝对偏差 相对误差(％)
1 78.4 76.9 1.5 1.91
2 65.6 69.6 4.0 6.10
3 96.3 89.9 6.4 6.65
4 57.6 61.0 3.4 5.90
5 69.5 71.9 2.4 3.45
6 105.0 112.1 7.1 6.76
7 58.2 61.9 3.7 6.36
8 84.7 81.5 3.2 3.78
9 75.6 78.2 2.6 3.44
10 91.4 87.1 4.3 4.70
由表5可知，10组数据的相对误差都在10％以内，均在允许范围内。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种快速检测发酵乳中酸度的方法，其特征是包括以下步骤：
(1)建立发酵乳中酸度定标模型：
采集发酵乳作为定标集样品，采用常规方法对定标集样品进行分析检测，得出定标集样品的酸度实测值，建立基础数据库；
同步对定标集样品进行近红外光谱扫描，录制定标集样品的近红外光谱数据，建立近红外光谱数据库；
将所述定标集样品的酸度基础数据库与所述近红外光谱数据库进行一一对应，建立酸度定标模型；
(2)采用交叉验证法对该定标模型进行内部验证；
(3)待测发酵乳样品的检测：将待测发酵乳样品进行近红外光谱扫描，获得待测发酵乳样品的近红外光谱数据，将数据导入步骤(1)中建立的酸度定标模型，获得待测发酵乳样品的酸度预测值；
步骤(1)中所述常规方法是按照中国国家标准GB 5009.239-2016 《食品安全国家标准食品酸度的测定》，采用电位滴定法对定标集样品进行分析检测；
步骤(1)中对定标集样品进行近红外光谱扫描时，采用的近红外光谱仪为ThermoANTARIS Ⅱ，配制InGaAs检测器，透射采样模块、Result 3数据采集软件和TQ Analyst 8数据分析软件；
采用Result 3数据采集软件采集时，以积分球漫透射方式和空气为背景，设置分辨率8cm-1，扫描范围4000～10000cm-1，扫描次数为32；
步骤(1)中对定标集样品进行近红外光谱扫描时，所述定标集样品采用聚乙烯密封袋采样，采样后密封并应在15min内采集近红外光谱数据，防止乳酸菌数在常温下发生变化而影响酸度；
所述的透射采样模块为凹字形压块，所述定标集样品采用聚乙烯密封袋采样后密封，置于所述近红外光谱仪的积分球漫透射光孔上，然后采用凹字形压块压紧，其中凹字形压块的凹槽部正对聚乙烯密封袋，所述凹字形压块中的凹槽的深度为3mm，录制定标集样品的近红外光谱数据；
步骤(1)中建立酸度定标模型时，采用偏最小二乘法，经过savitzky-golay filter数据点为7，3项式平滑滤波处理，并结合一阶导数和标准正态变量变换对近红外光谱的数据进行处理；
步骤(1)中建立酸度定标模型时，选取波段为5569-5716cm-1、5724-6403cm-1、7197-7506cm -1 范围内的光谱数据建立模型；
步骤(1)中采用主成分分析-马氏距离方法剔除发酵乳中异常样品数据，获得定标集样品，提高近红外光谱定量分析的可靠性。
2.根据权利要求1所述的快速检测发酵乳中酸度的方法，其特征是：步骤(1)中对定标集样品进行近红外光谱扫描时，在温度为(23±2)℃、湿度为(50±5)％的恒温恒湿室中进行。
3.根据权利要求1所述的快速检测发酵乳中酸度的方法，其特征是：步骤(1)中所述发酵乳为含活乳酸菌的发酵乳，所述定标集样品包括校正集样品和验证集样品；步骤(2)中采用交叉验证法对所述的酸度定标模型进行内部验证时，从定标集样品中取出85％的样品作为校正集样品进行建模，以剩余的15％的样品作为验证集样品进行验证。
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