CN109536499B - 一种干扰片段及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种用于干扰AQP1基因的转录水平的干扰片段及其应用。干扰片段的序列如下：AQP1 RNAi‑FP：5’‑GCUGUACUCAUCUACGACUTT‑3’；AQP1 RNAi‑RP：5’‑AGUCGUAGAUGAGUACAGCTT‑3’。用于干扰AQP1基因的转录水平，可作为制备减缓卵巢过度刺激综合征对应症状的药物、试剂盒的应用。本发明中本申请人通过设计的干扰片段可以对AQP1基因的转录水平起到显著的抑制作用，使得AQP1基因的表达显著下降，从而达到减缓卵巢过度刺激综合征(OHSS)对应症状的目的，具有重要的市场价值和意义。

Description

一种干扰片段及其应用
【技术领域】
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种干扰片段及其应用。
【背景技术】
卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome,OHSS)是一种用外源性促性腺激素促排卵引起的医源性的自限性疾病，在接受控制性超排卵的病人中，OHSS总的发生率为14％以内，重度约为0.5-2％。随着辅助生育技术的广泛开展，超促排卵药物使用的增加，OHSS的发病有增多的趋势。OHSS能引起体内大量富含蛋白的血浆急性外渗引起腹水、胸水甚至弥漫性水肿，可出现血液浓缩、低血容量，继发肾衰，伴水电解质紊乱、氮质血症以及低血容量休克，甚至血栓形成。临床表现为胃肠道不适、腹水、胸水、少尿、卵巢增大等，严重可危及生命。临床普遍认为OHSS发生与过多卵泡被刺激起来并应用绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)诱发排卵有关，其发生过程设计多种因素参与，目前仍无一种理论能够解释OHSS的所有问题，而且尚无彻底的预防和有效的治本治疗方法。
【发明内容】
针对上述实际存在的问题，我院所项目研究组研究发现在激素作用下，卵巢大量分泌和产生卵泡发育和黄体形成所必需的调节新生血管的血管活性物质，这些血管活性物质作用于卵巢和全身毛细血管的水通道蛋白(AQPs)，导致通透性增加。设计实验中，通过前期的体外HUVEC细胞模型的影响研究发现，添加不同浓度的雌激素E2时，AQP1的表达量随着E2添加量的增加而上升，估测AQP1表达量的提高，细胞膜通透性增加将会促进OHSS的病程发展，因此，课题组提出在通过RNAi干扰AQP1表达，将有利于减缓OHSS对应症状。经过无数试验研究发现了一干扰片段能明显的达到上述的目的。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种干扰片段，用于干扰AQP1基因的转录水平，所述干扰片段的序列如下：
AQP1RNAi-FP：5’-GCUGUACUCAUCUACGACUTT-3’；
AQP1RNAi-RP：5’-AGUCGUAGAUGAGUACAGCTT-3’。
进一步的，如权利要求1所述的干扰片段作为制备干扰AQP1基因的转录水平的药物的应用。
进一步的，权利要求1所述的干扰片段作为制备减缓卵巢过度刺激综合征对应症状的药物、试剂盒的应用。
另一方面，本申请还提供了一种应用权利要求1所述的干扰片段对AQP1基因进行RNA干扰的实验方法，具体包括以下步骤：
(1)、设计好AQP1 siRNA序列，并设计对应的阴性对照siRNA；其中，
AQP1RNAi-FP：5’-GCUGUACUCAUCUACGACUTT-3’，
AQP1RNAi-RP：5’-AGUCGUAGAUGAGUACAGCTT-3’；
(2)、将AQP1 siRNA序列和阴性对照的RNAi干扰序列分装成1OD/管，使用前在3000-4000rpm，离心处理3min；然后加入125μL DEPC H2O重悬，制备终浓度为20μM的储存液；
(3)、将人脐静脉内皮细胞使用完全培养基培养复苏后，经胰酶消化重新种植于6细胞培养板中；在37℃、5％CO2培养过夜后，当镜检细胞在培养板中覆盖率达到85-90％时开始细胞转染处理；
(4)、细胞转染48小时后，使用1×PBS清洗细胞2次，然后使用Trizol试剂抽提转染细胞的总RNA；通过Nano-drop测定RNA含量，RNA OD260/280≈2.0；
(5)、使用RT-qPCR反转录试剂盒对总RNA进行反转录；
(6)、以步骤(5)中得到的反转录产物为模板，使用嵌合法qPCR用premix试剂，通过特异引物序列，以GAPDH内参基因引物对为对照，进行各细胞株AQP1表达的实时定量PCR检测，并按照2-ΔΔCT分析各细胞株AQP1的相对表达量。
进一步说明，在步骤(3)中，所述细胞转染处理的具体步骤如下：
在步骤(3)中，所述细胞转染处理的具体步骤如下：
S1、配置转染试剂：
A：在90.0μL无血清OPTI-MEM培养基中添加2.0μL Lipofectamine 2000(Invotrigen)转染试剂，充分混匀室温静置5min；
B:分别在90.0μL无血清OPTI-MEM培养基中添加5.0μL待转染的AQP1 siRNA、DEPC水和阴性对照siRNA，充分混匀室温静置5min；
S2、将步骤A和B溶液混合均匀，在室温静置20min；
S3、将6细胞培养板中过夜培养基吸出，并用1×PBS清洗细胞2次；然后，每孔添加0.8mL无血清OPTI-MEM培养基；
S4、将S2中调整好的siRNA转染试剂复合物，分别滴到培养板中，37℃，5％CO2培养6小时；
S5、去掉6细胞培养板中含转染试剂复合物的培养基，更换成新鲜的完全培养基继续培养人脐静脉内皮细胞24-48小时。
进一步说明，所述完全培养基为改良的完全培养基，培养基的配方为：MCDB131培养基+20％胎牛血清+50mg/mL内皮生长因子ECGS+100U/mL青霉素+50μg/mL肝素+2mmol谷氨酰胺+100U/mL链霉素。
进一步说明，在步骤(5)中，所述反转录的体系如下：
1)去除基因组DNA反应：
Figure BDA0001901612020000031
按照上述反应体系用量在冰上完成体系配置，并加入总量为1.0μg的总RNA，瞬时离心后，进行DNA消化反应；所述反应程序为：42℃保温2min；4℃保存；
2)反转录反应：
Figure BDA0001901612020000032
反应条件为：在冰浴中完成反应体系配置，使用移液枪轻柔混匀，瞬时离心后，进行反转录；反转录程序为：37℃反转录30min；85℃灭活反转录酶5S；4℃保存。
进一步说明，在步骤(6)中，所述实时定量PCR检测的反应体系为：
Figure BDA0001901612020000041
反应条件为：在冰浴中完成反应体系配置，使用移液枪轻柔混匀，瞬时离心后，进行反转录；反应程序为：95℃预变性30S；95℃变性5S，60℃退火30S，共计40个循环，在退火阶段采集荧光信号；熔解曲线设置为：95℃预变性10sec后从65℃开始，升温速率为0.5℃/步，在65℃至90℃范围内每步升温均采集荧光信号。
进一步说明，在步骤(6)中，所述特异引物序列为：正向：5’-GCCATCCTCTCAGGCATCAC-3’；反向：5’-ACACCATCAGCCAGGTCATTG-3’；GAPDH内参基因引物序列为正向：5’-CAGGGCTGCTTTTAACTCTGG-3’；反向：5’-TGGGTGGAATCATATTGGAACA-3’。
与现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：
本发明中本申请人通过设计的干扰片段可以对AQP1基因的转录水平起到显著的抑制作用，使得AQP1基因的表达显著下降，从而达到减缓卵巢过度刺激综合征(OHSS)对应症状的目的，具有重要的市场价值和意义。
【附图说明】
图1为实时定量PCR扩增曲线图；
图2为实时定量PCR融解曲线图；
图3为荧光定量分析结果图。
【具体实施方式】
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实施例：
1、设计好AQP1 siRNA序列，并设计对应的阴性对照siRNA，然后交由基因公司合成，；其中，
AQP1RNAi序列：
正序列：5’-GCUGUACUCAUCUACGACUTT-3’；
反序列：5’-AGUCGUAGAUGAGUACAGCTT-3’。
2、所有AQP1 siRNA序列和阴性对照的干扰序列分装成1OD/管，使用前3000-4000rpm，离心3min；然后加入125μLDEPC H2O重悬，制备终浓度为20μM的储存液。
3、人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞)使用改良的完全培养基(MCDB131培养基+20％胎牛血清+50mg/mL内皮生长因子ECGS+100U/mL青霉素+50μg/mL肝素+2mmol谷氨酰胺+100U/mL链霉素)培养复苏后，经胰酶消化重新种植于6细胞培养板中；37℃，5％CO2培养过夜后，当镜检细胞在培养板中覆盖率达到85-90％左右时开始细胞转染实验。
针对人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞)进行复苏培养采用的培养基为ECM培养基+5％胎牛血清+1％内皮生长因子ECGS+1％双抗，赛百慷(上海)生物技术股份有限公司购买，发现相比之下HUVEC细胞的有效活数比采用本申请的改良的完全培养基复苏培养后HUVEC细胞的有效活数降低1.25×105个。
4、细胞转染：
4.1配置转染试剂：
A：在90.0μL无血清OPTI-MEM培养基中添加2.0μL Lipofectamine 2000(Invotrigen)转染试剂，充分混匀室温静置5min。
B：分别在90.0μL无血清OPTI-MEM培养基中添加5.0μL待转染的AQP1 siRNA组、空白对照组(用DEPC水代替siRNA)和阴性对照siRNA组，充分混匀室温静置5min。
4.2将5.1的A和B溶液混合均匀，在室温静置20min。
4.3将6细胞培养板中过夜培养基吸出，并用1×PBS清洗细胞2次；然后，每孔添加0.8mL无血清OPTI-MEM培养基。
4.4将5.2中调整好的siRNA转染试剂复合物，分别滴到培养板中，37℃，5％CO2培养数6小时(A、B溶液混合静置后5min内完成后续步骤)。
4.5去掉6细胞培养板中含转染试剂复合物的培养基，更换成新鲜的完全培养基(MCDB131培养基+20％胎牛血清+50mg/mL内皮生长因子ECGS+100U/mL青霉素+50μg/mL肝素+2mmol谷氨酰胺+100U/mL链霉素)继续培养人脐静脉内皮细胞24-48小时。
针对这一步骤，改良的完全培养基替换为培养基的组分为ECM培养基+5％胎牛血清+1％内皮生长因子ECGS+1％双抗，赛百慷(上海)生物技术股份有限公司购买，发现转染细胞的成功率降低3.6％。另外发现，通过试验完成后AQP1 siRNA组中的AQP1相对表达量记录为0.51764，干扰效率相对于空白对照约为63.26％；相比采用本申请的培养基转染后试验完成干扰效率降低了7.76％。
5、转染48小时后，使用1×PBS清洗细胞2次。然后，使用Trizol试剂(Invotrigen)抽提转染细胞的总RNA。通过Nano-drop测定RNA含量，RNA OD260/280≈2.0的可用于后续实验。
6、使用宝生物工程(大连)有限公司的RT-qPCR专用反转录试剂盒(编号RR047A)对总RNA进行反转录。
反转录体系如下：
去除基因组DNA反应
试剂 使用量
5×gDNA Eraser Buffer 2.0μL
gDNA Eraser 1.0μL
Total RNA <sup>＊1</sup>
RNase Free dH <sub>2</sub>O up to 10.0μL
注，＊1表示加入总量为1.0μg的总RNA
按照上述反应体系用量冰上完成体系配置，并加入总量为1.0μg的总RNA，瞬时离心后，进行DNA消化反应。反应程序为：42℃保温2min；4℃保存。
反转录反应
Figure BDA0001901612020000061
Figure BDA0001901612020000071
在冰浴中完成反应体系配置，使用移液枪轻柔混匀，瞬时离心后，进行反转录。反转录程序为：37℃反转录30min；85℃灭活反转录酶5S；4℃保存。
7、以第6步骤中的反转录产物为模板，使用宝生物工程(大连)有限公司的嵌合法qPCR用premix试剂(编号RR820A)，通过特异引物，以GAPDH内参基因为对照，进行各细胞株AQP1表达的实时定量PCR检测(图1、图2)，并按照2-ΔΔCT分析各细胞株AQP1的相对表达量(图3)。
(1)引物序列如下：
Figure BDA0001901612020000072
(2)Real-time PCR反应体系
Figure BDA0001901612020000073
Figure BDA0001901612020000081
在冰浴中完成反应体系配置，使用移液枪轻柔混匀，瞬时离心后，进行反转录。反应程序为：95℃预变性30S；95℃变性5S，60℃退火30S，共计40个循环，在退火阶段采集荧光信号。熔解曲线设置为：95℃预变性10sec后从65℃开始，升温速率为0.5℃/步，在65℃至90℃范围内每步升温均采集荧光信号。
经过Real-time PCR结果分析，实时定量PCR扩增曲线如图1，融解曲线如图2，2-ΔΔCT分析结果如图3，从图3中可见，AQP1 siRNA经转染到人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞后，有效降低了AQP1的转录水平，干扰效率相对于空白对照约为71.02％。
综上所述，使用本发明的特异引物干扰片段对AQP1基因的转录水平具有显著的抑制作用，使得AQP1基因的表达显著下降，从而达到减缓卵巢过度刺激综合征(OHSS)对应症状的目的，具有重要的市场价值和意义。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
Figure BDA0001901612020000091
Figure BDA0001901612020000101
Figure BDA0001901612020000111
序列表
<110> 广西壮族自治区计划生育研究中心
<120> 一种干扰片段及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(ren gong xu lie)
<400> 1
gcuguacuca ucuacgacut t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(ren gong xu lie)
<400> 2
agucguagau gaguacagct t 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(ren gong xu lie)
<400> 3
gccatcctct caggcatcac 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(ren gong xu lie)
<400> 4
acaccatcag ccaggtcatt g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(ren gong xu lie)
<400> 5
cagggctgct tttaactctg g 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(ren gong xu lie)
<400> 6
tgggtggaat catattggaa ca 22

Claims (7)

1.一种干扰片段，其特征在于：用于干扰AQP1基因的转录水平，所述干扰片段的序列如下：
AQP1 RNAi-FP：5’-GCUGUACUCAUCUACGACUTT-3’；
AQP1 RNAi-RP：5’-AGUCGUAGAUGAGUACAGCTT-3’；
应用上述所述的干扰片段对AQP1基因进行RNA干扰的实验方法，
具体包括以下步骤：
(1)、设计好AQP1 siRNA序列，并设计对应的阴性对照siRNA；其中，
AQP1 RNAi-FP：5’-GCUGUACUCAUCUACGACUTT-3’，
AQP1 RNAi-RP：5’-AGUCGUAGAUGAGUACAGCTT-3’；
(2)、将AQP1 siRNA序列和阴性对照的RNAi干扰序列分装成1OD/管，使用前在3000-4000rpm，离心处理3min；然后加入125μL DEPC H2O重悬，制备终浓度为20μM的储存液；
(3)、将人脐静脉内皮细胞使用完全培养基培养复苏后，经胰酶消化重新种植于6细胞培养板中；在37℃、5％CO2培养过夜后，当镜检细胞在培养板中覆盖率达到85-90％时开始细胞转染处理；
(4)、细胞转染48小时后，使用1×PBS清洗细胞2次，然后使用Trizol试剂抽提转染细胞的总RNA；通过Nano-drop测定RNA含量，RNA OD260/280≈2.0；
(5)、使用RT-qPCR反转录试剂盒对总RNA进行反转录；
(6)、以步骤(5)中得到的反转录产物为模板，使用嵌合法qPCR用premix试剂，通过特异引物序列，以GAPDH内参基因引物对为对照，进行各细胞株AQP1表达的实时定量PCR检测，并按照2-ΔΔCT分析各细胞株AQP1的相对表达量；
所述完全培养基为改良的完全培养基，培养基的配方为：MCDB131培养基+20％胎牛血清+50mg/mL内皮生长因子ECGS+100U/mL青霉素+50μg/mL肝素+2mmol谷氨酰胺+100U/mL链霉素。
2.权利要求1所述的干扰片段作为制备干扰AQP1基因的转录水平的药物的应用。
3.权利要求1所述的干扰片段作为制备减缓卵巢过度刺激综合征对应症状的药物、试剂盒的应用。
4.根据权利要求1所述的实验方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述细胞转染处理的具体步骤如下：
S1、配置转染试剂：
A：在90.0μL无血清OPTI-MEM培养基中添加2.0μL Lipofectamine 2000(Invotrigen)转染试剂，充分混匀室温静置5min；
B:分别在90.0μL无血清OPTI-MEM培养基中添加5.0μL待转染的AQP1 siRNA、DEPC水和阴性对照siRNA，充分混匀室温静置5min；
S2、将步骤A和B溶液混合均匀，在室温静置20min；
S3、将6细胞培养板中过夜培养基吸出，并用1×PBS清洗细胞2次；然后，每孔添加0.8mL无血清OPTI-MEM培养基；
S4、将S2中调整好的siRNA转染试剂复合物，分别滴到培养板中，37℃，5％CO2培养6小时；
S5、去掉6细胞培养板中含转染试剂复合物的培养基，更换成新鲜的完全培养基继续培养人脐静脉内皮细胞24-48小时。
5.根据权利要求4所述的实验方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述反转录的体系如下：
1)去除基因组DNA反应：
Figure FDA0003372609970000021
其中，＊1表示加入总量为1.0μg的总RNA
按照上述反应体系用量在冰上完成体系配置，并加入总量为1.0μg的总RNA，瞬时离心后，进行DNA消化反应；所述反应程序为：42℃保温2min；4℃保存；
2)反转录反应：
Figure FDA0003372609970000022
反应条件为：在冰浴中完成反应体系配置，使用移液枪轻柔混匀，瞬时离心后，进行反转录；反转录程序为：37℃反转录30min；85℃灭活反转录酶5S；4℃保存。
6.根据权利要求4所述的实验方法，其特征在于，在步骤(6)中，所述实时定量PCR检测的反应体系为：
Figure FDA0003372609970000031
反应条件为：在冰浴中完成反应体系配置，使用移液枪轻柔混匀，瞬时离心后，进行反转录；反应程序为：95℃预变性30S；95℃变性5S，60℃退火30S，共计40个循环，在退火阶段采集荧光信号；熔解曲线设置为：95℃预变性10sec后从65℃开始，升温速率为0.5℃/步，在65℃至90℃范围内每步升温均采集荧光信号。
7.根据权利要求4所述的实验方法，其特征在于，在步骤(6)中，所述特异引物序列为：正向：5’-GCCATCCTCTCAGGCATCAC-3’；反向：5’-ACACCATCAGCCAGGTCATTG-3’；GAPDH内参基因引物序列为正向：5’-CAGGGCTGCTTTTAACTCTGG-3’；反向：5’-TGGGTGGAATCATATTGGAACA-3’。
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