CN109536421B

CN109536421B - 用于水质净化的复合菌剂的制备方法

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Publication number: CN109536421B
Application number: CN201910008404.8A
Authority: CN
Inventors: 刘秋; 张美娇; 于基成; 袁烽皓
Original assignee: Dalian Minzu University
Current assignee: Dalian Minzu University
Priority date: 2019-01-04
Filing date: 2019-01-04
Publication date: 2021-04-02
Anticipated expiration: 2039-01-04
Also published as: CN109536421A

Abstract

本发明属于微生物环保领域，特别涉及一种用于水质净化的复合菌剂的制备方法。本发明将植物乳杆菌与西姆芽孢杆菌按一定比例混合制备复合菌剂，具有优异降解效果。在接种量8％时，氨氮盐降解率为88.57％、亚硝酸盐氮降解率为97.87％、硝酸盐氮降解率为92.37％，能够显著降低水产养殖中氨氮、亚硝酸盐氮及硝酸盐氮等污染因子含量，有效的改善养殖环境，减少资源浪费。

Description

用于水质净化的复合菌剂的制备方法

技术领域

本发明属于微生物环保领域，特别涉及一种用于水质净化的复合菌剂的制备方法。

背景技术

随着水产养殖规模化、集约化及精养技术的发展，水体水质净化已成为水产养殖业中一个关键的问题。目前，在生产实践中对鱼类病害的防治主要采用施用抗生素或在饵料中添加抗生素的方法，不可避免导致抗生素残留问题，这也是目前水产品中抗生素超标事件频发的主要原因，严重影响了食品安全。此外，如何提高饵料营养利用率也是水产养殖业所面临的重要课题。由于某些微生物具有拮抗活性和水体净化作用而广泛应用于食品、药品、环境等领域。因此，通过微生物技术，在饵料中添加某些益生菌或通过向水体中投放环境净化微生物菌剂逐渐成为研究者和养殖业关注的热点。目前复合菌净化水质的研究主要集中在淡水养殖方面，赵亮等在河蟹养殖中施用光合细菌比对照组氨氮和硝酸盐氮分别降低了41.5％和41.4％一定程度改善了养殖水体水质，因此，本领域亟需一类高降解率的复合菌剂。

发明内容

为弥补现有技术的不足，本发明提供一种用于水质净化的复合菌剂的制备方法。本发明方法制备的复合菌剂可有效降低养殖水体中氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮等影响水质的含氮化合物含量，改善养殖水体水质。

本发明采用如下技术方案：用于水质净化的复合菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：

S1.活化菌株

配置LB和MRS固体培养基，制作成斜面以及平板，分别将植物乳杆菌株与西姆芽孢杆菌株用竹签在斜面上划线，30℃培养，3～7d培养结束后，均放在4℃中保存备用；

S2.扩繁菌株

分别将活化后的植物乳杆菌株与西姆芽孢杆菌株用竹签挑取，按5-8％的接种量接种于LB或MRS液体培养基中，30℃恒温摇床培养24h，得到植物乳杆菌株与西姆芽孢杆菌液；

S3.菌悬液的制备

将植物乳杆菌与西姆芽孢杆菌液按(1-2)：1的体积比倒于离心管中，10000r/min10min离心，用无菌水将其混匀，配置成分布均匀的菌悬液，显微镜活菌计数，使其活菌数为10⁹cfu/mL。

所述步骤S1中植物乳杆菌株与西姆芽孢杆菌株于-80℃保存。

所述LB培养基(g/L)：蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g，酵母提取物5.0g。灭菌前pH为7.2。

所述MRS培养基(g/L)：牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，蛋白胨10.0g，葡萄糖20.0g，K₂HPO₄2.0g，K₂HPO₄5.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄·4H₂O 0.05g，吐温801.0g，柠檬酸三铵2.0g。灭菌前pH为6.2～6.6。

优选的，接种量为8％。优选的，植物乳杆菌与西姆芽孢杆菌配比为2:1。

本发明同时请求保护上述方法制备的复合菌剂在水质净化中的应用。将上述方法制备的复合菌剂加入的待净化的水体中，对水中氨氮盐的降解率在第7d达到最高，亚硝酸盐氮的降解率在第3天即达到最高降解率，在第10天时对水中硝酸盐氮的降解率达到最高。

本发明将植物乳杆菌与西姆芽孢杆菌按一定配比混合制备复合菌剂，具有优异降解效果。在接种量8％时，氨氮盐降解率为88.57％、亚硝酸盐氮降解率为97.87％、硝酸盐氮降解率为92.37％，能够显著降低水产养殖中氨氮、亚硝酸盐氮及硝酸盐氮等污染因子含量。有效的改善养殖环境，减少资源浪费。

附图说明

图1氨氮盐的降解率；

图2亚硝酸盐氮的降解率；

图3硝酸盐氮的降解率；

图4复合菌剂对水体中氨氮盐的降解作用；

图5复合菌剂对水体中亚硝酸盐氮的降解作用；

图6复合菌剂对水体中硝酸盐氮的降解作用。

其中，P1为单菌株植物乳杆菌；S1为单菌株西姆芽孢杆菌，P1:S11:1为配比为1:1的植物乳杆菌与西姆芽孢杆菌复合菌；P1:S11:2配比为1:2的植物乳杆菌与西姆芽孢杆菌复合菌；P1:S12:1配比为2:1的植物乳杆菌与西姆芽孢杆菌复合菌。

具体实施方式

下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从化学公司购买。

下述实施例中，P1表示植物乳杆菌；S1表示西姆芽孢杆菌。该菌株均市售可得。本发明的西姆芽孢杆菌(Bacillus siamensis)购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为ACCC 06497。植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 1.568。

下述实施例中，模拟水环境的设计的具体方法为：

取已养殖锦鲤鱼一周的污水，每个三角瓶加入150mL。每150mL污水加入0.1g锦鲤鱼饲料。此为模拟水环境。

各盐含量对照组均以不接种的模拟水环境为对照。

实施例1

(1)活化菌株

配置LB和MRS固体培养基，制作成斜面以及平板，于-80℃冰箱中取出实验菌株植物乳杆菌与西姆芽孢杆菌的甘油管自然解冻，用竹签在斜面上划线，30℃培养，3～7d培养结束后，均放在4℃冰箱中保存备用。

(2)扩繁菌株

将活化后的实验菌株用竹签挑取，按接种量8％接种于LB或MRS液体培养基中，30℃恒温摇床培养24h，得到植物乳杆菌株与西姆芽孢杆菌液；

(3)菌悬液的制备

将植物乳杆菌与西姆芽孢杆菌液按2:1的比例倒于离心管中，10000r/min 10min离心，用无菌水将其混匀，配置成分布均匀的菌悬液，显微镜活菌计数，使其活菌数为10⁹cfu/mL。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于植物乳杆菌与西姆芽孢杆菌以1:1的配比混匀，配制成复合菌剂悬液。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于植物乳杆菌与西姆芽孢杆菌以1:2的配比混匀，配制成复合菌剂悬液。

实施例4接种量及复合菌剂配比对氨氮盐降解率的影响氨氮盐的测定(纳氏试剂光度计法)

(1)标准曲线的测定

a.吸取0,50,100,300,500,700和1000μL铵标准使用液于试管中，加双蒸水至5mL,混匀；

b.依次加100μL酒石酸钾钠和150μL纳氏试剂，混匀；

c.静置10min，在波长420nm下测定吸光度(玻璃比色皿)，以双蒸水作为空白调零。

(2)样品测定

a.取水样5mL,依次加100μL酒石酸钾钠和150μL纳氏试剂，混匀；

b.静置10min，在波长420nm下测定吸光度(玻璃比色皿)，以双蒸水作为空白调零(加试剂)

c.从吸光度中对应的量可得样品中氨氮的含量。

记录每日模拟养殖水环境中盐浓度，由于渔业养殖时每周进行换水，为对比不同接种量对氨氮盐的降解率的影响，下述实验均采取第七日降解率作为比较组，其结果如表1所示：

表1氨氮盐的降解率(％)

表1结果表明8％接种量的氨氮盐降解率在53.97％-88.57％之间，而3％与5％接种量的降解率分别在17.56％-41.65％、-8.13％-44.70％，可见8％接种量降解效果好于其他接种量。

在选取最佳接种量8％的基础上，比较不同配比的复合菌剂对氨氮盐的降解效率的影响，记录每日模拟养殖水环境中氨氮盐的浓度，其结果如图1所示，由图1可知，通过连续10d的测定结果表明。复合菌剂P1:S1为2:1对氨氮盐的降解效率好于其他配比复合菌剂，降解效果优于单菌剂，且在第10d达到最高降解率(88.57％)。

实施例5接种量及复合菌剂配比对亚硝酸盐氮降解率的影响亚硝酸盐氮的测定(N-(1-萘基)—乙二胺光度法)

(1)标准曲线的测定

a.吸取0,50,100,300,500,700和1000μL亚硝酸盐氮标准使用液于试管中，加双蒸水至5mL,混匀；

b.加100μL亚硝酸盐显色剂，混匀；

c.静置20min，于波长540nm下测定吸光度(玻璃比色皿)，以蒸馏水作为空白调零(加试剂)。

(2)样品测定

a.样5mL，加100μL亚硝酸盐显色剂，混匀；

b.静置20min，于波长540nm下测定吸光度(玻璃比色皿)，以蒸馏水作为空白调零(加试剂)；

c.从吸光度中对应的量可得样品中亚硝酸盐的含量。

表2亚硝酸盐氮的降解率(％)

从表2可知，高接种量(8％)复合菌剂对亚硝酸盐氮的降解率效果要明显优于低接种量，且也好于单个菌株的降解效果，且高接种量的西姆芽孢杆菌的降解率效果也好于单个菌株的植物乳杆菌。

由图2可知，单菌株和复合菌剂对亚硝酸盐氮的降解率在前2-7d之间均没有明显差异，但在第7-8d时。单菌株的降解效率开始呈下降趋势。在第8d时明显低于复合菌，且复合菌种2:1的比例为最佳。因此若要保持长期的水质净化效果，还应采取复合菌剂，其降解效率表现出稳定持久的效果。

实施例6接种量及复合菌剂配比对硝酸盐氮降解率的影响硝酸盐氮的测定(紫外分光光度法)

(1)标准曲线的测定

a.吸取0，12.5，25，50，75和100μL硝酸盐氮标准贮备液于试管中，加双蒸水至5mL,混匀；

b.加100μLHCI溶液，10μL氨基磺酸溶液混匀；

c.于波长220nm和275nm下测定吸光度(石英比色皿)；以蒸馏水作为空白调零(加试剂)；

d.A校＝A220-A275

(2)样品测定

a.取水样5mL,加100μLHCI溶液，10μL氨基磺酸溶液混匀；

b.于波长220nm和275nm下测定吸光度(石英比色皿)；以蒸馏水作为空白调零(加试剂)；

c.根据测得的吸光度值从所作标准曲线算得水样的硝酸盐氮含量。

表3硝酸盐氮的降解率(％)

由表3的结果可知，复合菌剂对硝酸盐氮的降解率效果与亚硝酸盐氮的降解率效果表现同样的趋势，在高接种量(8％)时表现出对硝酸盐氮的高降解效率。

由图3可知，随着培养时间的延长，单菌株和复合菌对硝酸盐氮的降解效率均有所增加。在第10d时达到最大，然后保持在高降解率水平。

应用例

以模拟养殖水环境为研究环境，考察两种菌剂及其复合菌剂对水体的协同净化作用。

记录每日模拟养殖水环境中盐浓度考察达到最佳降解率的时间，氨氮盐、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮选择P1:S12:1组。由图4可知，复合菌剂P1:S12:1对氨氮盐的降解率在第7d即达到最高降解率88.57％；由图5可知，复合菌剂P1:S12:1对亚硝酸盐氮的降解率在第3d即达到最高降解率97.87％，然后持续稳定在95％左右。由图6可知，复合菌在第10d时对硝酸盐氮的降解率达到最高92.37％，但在第8d后已基本持续稳定在94％左右。因此，植物乳杆菌与西姆芽孢杆菌复合菌剂具有显著的净化水质的作用。

以上实施例及应用例结果表明，接种量为8％时氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮的降解效果优于其他接种量；植物乳杆菌与西姆芽孢杆菌配比为2:1时，具有最优降解效果；氨氮盐、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮分别在7d、4d、10d达到峰值，最佳降解时间可持续4-7d；pH值在实验期间无显著性差异，即接种菌剂对水体的pH无明显影响。可见，本发明方法制备的复合菌剂在水体中一定时间内可有效降低养殖水体中氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮等影响水质的含氮化合物含量，改善养殖水体水质。

以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造披露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。

Claims

1.用于水质净化的复合菌剂的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

S1. 活化菌株

配置 LB 和 MRS 固体培养基，制作成斜面以及平板，分别将植物乳杆菌株与西姆芽孢杆菌株用竹签在斜面上划线， 30℃培养， 3~7d 培养结束后，均放在 4℃中保存备用；所述西姆芽孢杆菌（Bacillus siamensis），保藏编号为 ACCC 06497；植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum），保藏编号为 CGMCC 1.568；

S2. 扩繁菌株

分别将活化后的植物乳杆菌株与西姆芽孢杆菌株用竹签挑取，按 5-8%的接种量接种于LB 或 MRS 液体培养基中， 30℃恒温摇床培养 24h，得到植物乳杆菌株与西姆芽孢杆菌液；

S3. 菌悬液的制备

将植物乳杆菌与西姆芽孢杆菌按（1-2）： 1 的比例倒于离心管中， 10000r/min 10min离心，用无菌水将其混匀，配置成分布均匀的菌悬液，显微镜活菌计数，使其活菌数为10⁹cfu/mL。

2.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，所述步骤 S1 中植物乳杆菌株与西姆芽孢杆菌株于-80℃保存。

3.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，接种量为 8%。

4.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，植物乳杆菌与西姆芽孢杆菌配比为2:1。

5.如权利要求 1 所述方法制备的复合菌剂在水质净化中的应用。