CN109528620B - 一种植物干细胞活性成分及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种植物干细胞活性成分的制备方法，将处于旺盛生长状态的植物干细胞在‑20～‑10℃的条件下，在20～30min内完成冻结，维持冻结状态1～5h，然后在26～30℃的条件下进行解冻，所得液体即为所述植物干细胞活性成分。本发明的方法制备得到的提取物可改善皮肤的代谢机制，不需渗入皮肤内部即可对皮肤起到调整的作用，安全性高，其在抗衰老和抗脱发方面表现出显著的效果，具有广泛的应用前景。而且本发明的培养方法可控性高，可以保证产品的批次稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物的提取利用技术领域，具体涉及一种植物干细胞活性成分及其制备方法。
背景技术
植物细胞中含有多种对人体有益的功效成分，从植物中提取有效成分进行应用历史悠久，如我国传统的中药学。随着科学技术的发展，从植物中提取有效成分进行应用，不论是从提取方法还是应用的领域，均有了长足的发展。从提取方法来看，从传统的水提法，发展到有机溶剂提取法，微波提取法，超声波提取和超临界提取等技术手段，其应用也从传统的疾病治疗拓展到食品、化妆品等各种领域。
但是，以植物植株为对象提取有效成分的过程中存在各种问题。一方面，植物在分化和长期生长的过程中，由于受到各种的外界刺激，会产生应激反应，在应激反应的过程中会产生毒有害物质，这些有害物质对于植物中有效成分发挥相关的功效具有一定的负面影响。另一方面，植物的生长受环境、温度等各种因素的影响，由于其生长环境的不稳定，植物中有效成分的种类和含量也会存在一定的差异，这也会影响其后续的应用。而且，现有技术通常采用有机溶剂对植物中的某一种或某几种有效成分进行提取，这也会对有效成分综合功效的发挥起到一定的限制作用。
植物干细胞是一种尚未分化发育的细胞，具有无限自我更新复制的能力，能分化成特定组织，从而形成植物的茎、叶等重要的器官。正是由于它的这种强大的分化能力，它被广泛地应用到化妆品、药品等技术领域。而且由于植物干细胞通常在光生物反应器中进行培养，与分化发育成正常的植株相比，培养环境稳定，细胞中积累的毒素较少，在应用过程中具有良好的效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物干细胞活性成分的制备方法，其步骤为，将处于旺盛生长状态的植物干细胞在-20～-10℃的条件下，20～30min内完成冻结，维持1～5h，然后在26～30℃的条件下进行解冻，所得液体即为所述植物干细胞活性成分。
植物干细胞中含有各种活性成分，尤其是处于旺盛生长状态的干细胞中活性成分的含量尤为丰富，培养结束后，在20～30min将其迅速地冷冻破壁，在这个时间段内，细胞来不及产生有毒的代谢副产物，即破壁在干细胞在最佳的生长状态下进行，可最大限度地保护植物干细胞中的活性成分，而且，在-20～-10℃的条件下在20～30min内完成冻结，并维持冻结状态1～5h，可使促使冰晶的形成和长大，有利于细胞的充分破壁，进一步的，在温度26～30℃的条件下进行解冻，既可进一步促进有效成分的溶出，还不会导致细胞中有效成分的破坏。
优选的，所述植物干细胞为草莓、苹果或豌豆的干细胞。在本发明所述的制备方法下，上述植物的干细胞更容易被充分破碎，所得的干细胞的活性更高。
更优选的，所述干细胞为苹果干细胞由苹果新生枝条诱导得到。其制备方法详见中国专利CN104711215A。
优选的，冷冻破壁重复数次进行，至破壁充分。对于一些不易破碎的干细胞，通过数次破壁可使破碎更充分。
优选的，所述植物干细胞在液体培养基中悬浮培养至旺盛的生长状态。在上述的培养状态下，植物干细胞生长状态良好且可进行大量的繁殖。
优选的，将所述植物干细胞置于气升光生物反应器中，在温度15～25℃的条件下进行培养；
进一步优选的，在温度17～18℃的条件下进行培养。上述的温度为植物干细胞生长的最适温度，在上述温度条件下，干细胞可产生大量有益的代谢产物。
优选的，培养的过程中将所述植物干细胞在光强1000～3000Lux的条件下光照处理16h，黑暗处理8h，循环进行。在上述的条件下进行培养，可使植物干细胞处于最佳的生长状态，且尤其适用于苹果干细胞。
作为优选的方案，本发明的方法包括如下步骤：
1)将所述植物干细胞置于所述气升式光生物反应器中，在温度17～18℃的条件下进行悬浮培养；
2)培养至所述干细胞在所述反应器的中细胞密度为2.5×105～7.5×107,停止培养，通过过滤将所述干细胞从培养液中分离出来，在-15～-10℃的条件下，在20～30min内完成所述干细胞的冻结，维持冻结状态1～5h，然后在25～30℃的条件下进行解冻。
作为更进一步优选的方案，对于苹果干细胞的培养而言，培养过程中，控制干细胞在光强1000～3000Lux的条件下光照处理16h，黑暗处理8h，循环进行。
本发明对于悬浮培养过程中所使用的培养液没有特别限定，对于不同的植物，选择相应的适宜的培养液即可。
在应用的过程中，为了使用和运输的方便，可将本发明的干细胞活性成分进行冻干后售卖。
本发明的另一个目的是保护本申请所述方法制备得到的植物干细胞活性成分。
本发明的最后一个目的是保护本发明所述干细胞活性成分在制备化妆品和抗脱发产品中的应用。
优选的，所述化妆品为面霜、眼霜等各种抗衰老产品。
本发明具有如下有益效果：
1)本发明首次发现，对植物干细胞中的活性成分进行全部利用，其活性和抗衰老效果均非常优异。
2)本发明的方法对细胞进行破碎的过程中，仅采用冷冻破碎的方法，可以尽可能地保护干细胞中所有活性成分的活性，所得的产品可改善皮肤的代谢机制，不需渗入皮肤内部即可对皮肤起到调整的作用，安全性高，而且其在抗衰老和抗脱发方面表现出显著的效果，具有广泛的应用前景。
3)本发明的方法步骤简单，成本低，制备得到的干细胞活性成分功能强，适于进行大规模地推广。
4)本发明的方法的原料为干细胞，由于其培养条件一般较为可控稳定，因此可以保证产品的批次稳定性。
附图说明
图1为正常培养下细胞干细胞的电镜图；
图2为实施例1制备得到的干细胞活性成分的电镜图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明的实施例中涉及的干细胞采用常规的方法制备得到即可，如苹果干细胞的制备可参考中国专利CN104711215A实施例1～3制备得到；
悬浮培养过程中所使用的营养液为水、无机盐、生长调节物质、维生素、糖类、核苷酸等各种有机物，根据不同的植物种类进行调节。
实施例1
本实施例涉及本发明所述植物干细胞活性成分的制备方法，包括如下步骤：
1)将苹果干细胞接种于液体培养基中，所述培养基为的组成为MS液体培养基+2,4-D 2.0mg/L+BA 1.0mg/L+CH1.0mg/L+AC 1.0mg/L，pH值为6.0，将细胞置于温度17.5℃的条件下进行培养，控制光照强度为1000Lux，光照16h，黑暗处理8h，培养到干细胞的浓度为2×107个/ml，结束培养；
2)将所述干细胞过滤去除水分，然后将其置于温度-15℃的条件下，在约25min时完成冻结，维持冻结状态2h，然后在30℃的条件下进行解冻，所得液体即为所述植物干细胞活性成分。其电镜图见图2，细胞干细胞的电镜图见图1，由图1和图2可知，经过本发明的方法的处理，细胞原有的结构消失，得到性状均一的产品，这也证明本发明的方法实现了细胞地充分破碎。
实施例2
本实施例涉及本发明所述植物干细胞活性成分的制备方法，包括如下步骤：
1)将豌豆干细胞接种于液体培养基中，在温度17℃的条件下进行培养，控制光照强度为2000Lux，光照16h，黑暗处理8h，培养到干细胞的浓度为2.5×106个/ml，结束培养；
2)将所述干细胞过滤去除水分，然后将其置于温度-20℃的条件下，在约20min时完成冻结，维持冻结状态3h，然后在26℃的条件下进行解冻，所得液体即为所述植物干细胞活性成分。
实施例3
本实施例涉及本发明所述植物干细胞活性成分的制备方法，包括如下步骤：
1)将草莓干细胞接种于液体培养基中，在温度17℃的条件下进行培养，控制光照强度为3000Lux，光照16h，黑暗处理8h，培养到干细胞的浓度为5×107个/ml，结束培养；
2)将处于旺盛生长状态的植物干细胞在-10℃的条件下，在约30min时完成冻结，维持冻结状态5h，然后在30℃的条件下进行解冻，所得液体即为所述植物干细胞活性成分。
对比例1
与实施例1相比，其区别在于，在1.5h完成对所述干细胞的冷冻。
对比例2
与实施例1相比，其区别在于，所述步骤1)中，在-80℃下，对所述干细胞进行冷冻破壁。
对比例3
与实施例1相比，其区别在于，细胞解冻在4℃的条件下进行。
对比例4
与实施例1相比，其区别在于，在-80℃下，对所述干细胞进行冷冻破壁，将解冻后所得的液体进行超声波破碎处理。
实验例1
本实施例涉及本发明所述干细胞活性成分的活性检验，其具体步骤如下：
实验对象：实施例1制备得到的干细胞活性成分，对比例1～4制备得到的干细胞活性成分；
实验材料：nctc2544细胞系的角质形成细胞，脂肪肥大细胞
实验步骤：
1、将角质细胞分为五组，分别放入培养皿中进行培养，其中一组培养皿中加入实施例1制备得到的干细胞活性成分，另外四组培养皿中加入对比例1～4制备得到的干细胞活性成分，而且培养皿中均加入角质基础培养液，对角质细胞培养24h，得处理后的角质细胞；
2、将处理后的角质细胞转移到另一个培养皿中，添加基础培养基进行静置培养，然后将角质细胞移出，得到角质细胞分泌物和培养液的混合物，并将实施例1对应的混合标记为a，对比例1标记为b，对比例2标记为c，对比例1记为d，对比例4记为e；
3、将脂肪肥大细胞分五组，分别添加到a、b、c、d和e中进行培养，22h后，分别收集五个培养皿中的培养液和细胞分泌物的混合液，并测定其甘油释放量。
实验结果：实施例1的甘油释放量是对比例1的2.5倍，是对比例2的的4.2倍，是对比例3的2.7倍，是对比例4的3.1的。
人体皮肤的结构包括表皮层和真皮层，角质细胞是表皮层的重要组成部分，脂肪肥大细胞位于真皮层之下，由以上结果可知，经过本发明所述干细胞分泌物处理后，角质细胞的代谢发生变化，其分泌物可影响脂肪肥大细胞的代谢。这也可从侧面证明，本发明所述的细胞干细胞活性成分可在不深入皮肤的情况下对皮肤的代谢产生影响，具有更高的安全性，推测其可能对皮肤神经系统的调控产生的作用。经推测，对比例1中由于冷冻时间持续较长，导致冷冻过程中干细胞产生了有害的代谢产物，因此导致其效果不明显，对比例2冷冻时温度过低，不利于冰晶的形成，没有对细胞进行充分地破壁，其效果不明显，对比例3在细胞解冻的过程中温度较低，不利于内容物的溶出，因此其效果不明显，对比例4中的超声对有效成分起到了一定的破坏作用，其效果也较差。
实验例2
本实验例涉及本发明所述的细胞活性成分在皮肤抗衰老方面的研究。
实验样品：样品1(实施例1制备得到的干细胞活性成分0.1％+透明质酸0.1％)，样品2，(对比例4制备得到的干细胞活性成分0.1％+透明质酸0.1％)
实验方法：采用VISIA、SOFT皮肤检测仪的检测结果，评价本发明所述活性成分的活性及安全性，受试者自行清洁面部，使用样品1和2，每天一次，共2周。
实验仪器：VISIA和SOFT皮肤检测仪
实验方法：将60例受试者进行面部皮肤涂抹，根据左右侧面部分成实验组和对照组，右侧面部使用样品1，左侧面部使用样品2。并在使用前对皮肤后通过VISIA对受试者的面部皮肤进行毛孔、皱纹、皮肤纹理、斑点、色素沉着的定量评估。
使用SOFT皮肤检测仪检测治疗部位以下指标，记录检测结果：皮肤含水量、皮肤pH值、皮肤油脂、皮肤弹性。
实验结果：
1)VISIA检测通过VISIA对受试者的面部皮肤进行毛孔、皱纹、皮肤纹理、斑点、色素沉着的定量评估，共计4次检测：第0天(W0)，第5天(W1)，第10天(W2)，第15天(W3)，其结果见表1
表1
2)SOFT皮肤检测仪检测使用SOFT皮肤检测仪检测治疗部位以下指标，记录检测结果如表2：
表2
3)在第10天(W2)和第15天(W3)，由受试者针对自己的皮肤改善情况，从皮肤水润度、毛孔、细纹、光泽度、色斑、整体满意度这6个指标进行自我评分，评分范围0-10分，分值越高，满意度越高。0分为无改善；1-4分为轻度改善；5-7分为明显改善；8-10分为显著改善。结果见表3：
表3
实验例3
本实验例涉及本发明所述产品的抗脱发实验，具体操作如下：
实验对象：在32位具有秃发迹象的志愿者身上做临床研究。
实验样品：被测试的产品是在室温条件下配制0.1％实施例1制备得到的细胞活性成分的丁二醇水溶液，另一组配制0.1％对比例4制备得到的细胞活性成分的丁二醇水溶液。
实验方法：抗脱发的研究植物干细胞活性成分人体试验头发密度是通过测定单位面积上的头发数量来衡量的。我们仍然通过前面提到的那组志愿者的临床研究来确定头发密度。头发密度的提高比例(A)(指处理前和处理后之间的差别)被确定下来并将志愿者分成4类：下降:A≤0；轻微的提高:0≤A<20％；较好的提高:20％≤A<40％；非常好的提高:A≥40％。
实验结果：用实施例1的植物干细胞活性处理过的志愿者中有82％的人的毛发密度有提高，有45％具“较好的提高”和“非常好的提高”。
用对比例4的植物干细胞活性处理过的志愿者中有40％的人的毛发密度有提高，有18％具“较好的提高”和“非常好的提高”
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (3)
1.一种植物干细胞活性成分的制备方法，其特征在于，由以下步骤组成：
1)将所述植物干细胞置于气升式光生物反应器中，在温度17～18℃的条件下进行悬浮培养；培养的过程中将所述植物干细胞在光强1000～3000Lux的条件下光照处理16h，黑暗处理8h，循环进行；
2)培养至所述干细胞在所述反应器的中细胞密度为2.5×105～7.5×107，停止培养，通过过滤将所述干细胞从培养液中分离出来，在-15～-10℃的条件下，在20～30min内完成所述干细胞的冻结，维持冻结状态1～5h，然后在26～30℃的条件下进行解冻；
所述植物干细胞为草莓、苹果或豌豆的干细胞。
2.权利要求1所述方法制备得到的植物干细胞活性成分。
3.权利要求2所述干细胞活性成分在制备化妆品和抗脱发产品中的应用。
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