CN109485716A - 一种经修饰的生长分化因子及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种经修饰的生长分化因子及其制备方法与用途。本发明提供的经修饰的生长分化因子是以甲氧基聚乙二醇‑丙醛为修饰剂，对生长分化因子11蛋白的N末端进行特异修饰，经修饰反应，分离纯化，最终收集洗脱液获得。本发明获得的经甲氧基聚乙二醇‑丙醛修饰后的生长分化因子，可以用于抗衰老和改善心脑血管系统，具有稳定性好，半衰期显著增长，促进生长分化因子对细胞凋亡的抑制作用，提高其对内皮细胞的保护作用。

Description

一种经修饰的生长分化因子及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种经修饰的生长分化因子及其制备方法与应用。
背景技术
生长分化因子11(Growth differentiation factor 11，GDF11)也称为骨形态发生蛋白11(Bone morphogenetic protein 11，BMP11)，属于转化生长因子-β(Transforminggrowth factor-β，TGF-β)超家族，作为一种新的生长分化因子于1999年被首次报道。在早期胚胎发育中，GDF11通过负性调节作用，参与包括骨骼、肾脏、胰腺、视网膜、嗅神经等组织器官的形成和分化，是胚胎正常发育不可或缺的分子。近年来研究发现，GDF11有明显的改善大脑认知、逆转心肌肥厚、改善脑血管系统、改善骨骼肌代谢等功能，显示出GDF11广泛的生物学活性和潜在的应用价值。
生长分化因子11作为一个新发现的生长分化因子，具有广泛的生物学活性和潜在的应用价值。在早期胚胎发育中，GDF11通过负性调节作用，参与包括骨骼、肾脏、胰腺、视网膜、嗅神经等组织器官的形成和分化，是胚胎正常发育不可或缺的分子。另外近年来研究发现，GDF11有明显的改善大脑认知、逆转心肌肥厚、改善脑血管系统、改善骨骼肌代谢等功能，显示出GDF11广泛的生物学活性。特别是其抗衰老和改善心脑血管系统方面，可广泛应用于生物医药、精细化工等诸多领域。
GDF11基因位于人染色体12q13.2上。编码一个具有407个氨基酸的蛋白质，可分为信号肽、N端前肽和C端成熟肽三部分。该蛋白在内质网中由信号肽酶水解除去信号肽，然后在高尔基体中由枯草蛋白酶样原蛋白转化酶(SPCs)家族的furin蛋白酶再次切割，形成以非共价键的方式结合的N端前肽和C端成熟肽复合体。最后经过BMP1/Tolloid样蛋白水解酶的剪切，形成具有活性的GDF11蛋白。GDF11单体有109氨基酸，7个半胱氨酸残基中6个位于一个被称为半胱氨酸结(cystein knot)的结构，形成3个分子内二硫键，而第73位半胱氨酸残基参与形成分子间二硫键，将两个单体连接形成同源二聚体。
GDF11参与诱导脏胎组织的形成、骨骼模式的确立，在肾脏发育、牙齿的形成、肤腺的发育中发挥着重耍的作用。同时，它也与衰老导致的器官功能障碍、人类的疾病的发生发展有关：(1)GDF11可通过激活TGF-β/Smad2及PI3K-AKT-FoxO1信号通路改善糖尿病小鼠糖脂代谢，抑制胰高血糖素的释放，保护胰岛B细胞功能，减少B细胞凋亡。(2)GDF11可降低血中炎性因子和血脂水平，改善内皮依赖性舒张功能障碍，减少血管内皮细胞调亡。具有改善高脂饮食引起的血管内皮功能障碍、动脉粥样硬化和PA诱导的内皮细胞调亡的作用，在防治动脉粥样硬化方面具有良好的临床应用前景。(3)GDF11对脑缺血损伤具有治疗和预防作用。具有减少皮层缺血体积，改善恢复动物运动能力的功能。
随着生物技术的发展，蛋白类生物药物因其高活性、强特异性、生物功能明确、低毒性等优势正越来越广泛地被开发和应用。然而，诸如半衰期短、稳定性差、水溶性差、存在免疫原性、肾清除速率快等问题却限制了其进一步发展。
聚乙二醇修饰又称PEG化(PEGylation)，是将聚乙二醇聚合物连接到一些生物分子(比如肽，蛋白质和抗体片段)上的过程，旨在改善上述蛋白药物的问题。
常见的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是由重复的氧乙烯基组成的直链或具有支链的聚醚，有2个末端羟基，其分子式为H-(O-CH2-CH2)n-CH2-CH2-OH，可由环氧乙烷开环聚合而成。PEG虽然是一种聚合物，但其特殊的线性原子排列方式使其具有其他同系物所没有的一些性质。PEG可在被其修饰的药物分子周围产生空间屏障，保持蛋白活性，降低免疫原性，延长体内半衰期，增加药物分子量，降低肾脏清除率。
蛋白质进行PEG修饰之后，使得蛋白质的分子量增大，空间结构发生改变。当修饰后的蛋白质分子量达到或超出肾小球滤过作用的阈值时，蛋白质随血液循环进入肾脏后就可以逃避肾小球滤过作用，因而可以在血液循环中停留更长的时间。另一方面，蛋白质进行化学修饰后，空间结构发生改变。修饰剂作为一种屏障，将蛋白质表面的抗原决定簇掩盖起来，使得蛋白质分子不能与各种细胞表面受体结合，不被机体的免疫系统识别，避免了相应抗体的产生，这是化学修饰降低药用蛋白免疫原性的基本原理。
蛋白经过PEG修饰后，性质会有多方面的改变。同时，蛋白经修饰后,其生物活性会降低。影响因素有多种，主要取决于PEG化程度、PEG化位点及修饰蛋白构象和电荷的影响等。所以有必要建立PEG修饰最优方案，以实现蛋白药物生物活性的保留、一般性能的改善、产品毒性减少，反应后产品的高回收率等。最优方案筛选应考虑如下因素：
修饰剂的选择：修饰剂的选择应综合考虑修饰剂的水解稳定性及反应活性、修饰剂与蛋白质氨基酸残基之间反应专一性、修饰位点、修饰剂与蛋白质连接键的稳定性、毒性、抗原性、修饰后是否需要进一步分离、是否适于建立快速方便的分析方法、修饰剂是否能够简便快速地合成或购买等因素。
修饰反应的pH值：pH值是PEG修饰蛋白的一个重要的因素，因为它决定了具有潜在反应能力的功能基所处的可反应和不可反应的离子状态。一般情况下，增加pH可以提高反应速率，降低pH值会减小反应速率。同时控制合适的pH值可以对蛋白中氨基酸残基进行特异性修饰，使修饰专一性提高，从而提高收得率，降低分离难度，减少生产成本。
药物与PEG的摩尔比：通常情况下，随着PEG和蛋白的摩尔比增加，修饰蛋白的相对分子质量也会增加，蛋白的修饰率会提高，但修饰的不均一度也会增加，生物活性保留会下降，故必须控制合适的比例，使蛋白修饰率最高，同时也尽可能保留蛋白的生物活性。
反应温度：蛋白药物对温度的稳定性较差，要使蛋白药物修饰后仍然保留高的生物活性，反应必须在蛋白的耐受温度下进行。而同时温度也决定反应速率，影响修饰的均一性。对于巯基的修饰来说，温度可以影响到活性巯基的微环境，仔细选择温度可以降低活性，防止一些竞争基团的反应。
PEG分子量：增加PEG的分子量可以延长药物的半衰期。而且支链的PEG比直链的更具有优势，因为支链的PEG可以减缓在肾小球中的滤过。
偶联的PEG分子数：增加偶联的分子数等于增加PEG的分子量，因而也会延长半衰期。但是偶联分子数增加后，修饰不均一性也会增加。
药物浓度：药物浓度的增加增大了药物分子和聚乙二醇分子碰撞的机会，能提高反应速率。但浓度增大的同时也增加了药物形成多聚体的机会，产物的均一性会减小，所以必须兼顾二者的平衡。
反应时间：随着时间的增加，产物的修饰率会增加，但产物的不均一性也会增加。
以上这些因素对PEG修饰的影响对于不同的蛋白有所不同，要根据蛋白本身特点，同时考虑修饰后的目的，修饰的程度、修饰位点的选择、产业化难易程度及生产成本等因素，通过单因子及正交实验确定最优反应工艺。
修饰后蛋白比未修饰蛋白更加有效。一般认为，经PEG修饰后，大多数蛋白质免疫原性降低，循环半衰期延长，溶解性增加，耐蛋白酶水解，生物利用度提高，毒性降低，热稳定性及机械稳定性增加，等电点、电泳行为、动力学性质等改变。另外，修饰作用还体现在体内活性提高，而体外活性降低。一般与PEG偶合的蛋白质，与未修饰的相比，其物理学性质会发生改变，这些改变的性质包括构象，空间位阻，静电结合性，疏水性等。与受体连接的亲和力经常受到这些物理化学性质的变化的影响而降低。而修饰后蛋白在生物体内循环半衰期延长这一特性在体外活性检测不能被体现，故而修饰后蛋白体外活性降低。PEG修饰对蛋白质药物体外活性的影响，具体到不同的蛋白质，影响的差异很大，需进行系统研究。
中国专利申请CN107325168A公开了一种经修饰的生长分化因子及其制备方法和应用，该生长分化因子是经标签多肽、血浆蛋白或血浆蛋白片段修饰的生长分化因子。该发明制得的经修饰的生长分化因子虽然具有延长体内半衰期，增强记忆力的作用，但是这种修饰后的生长分化因子导致蛋白质在体外的半衰期显著降低，生物活性不能全部体现，效果不稳定的缺点。
发明内容
针对生长分化因子11(GDF11)的血浆半衰期较短，且生物活性低的问题，本发明的目的在于提供一种经修饰的GDF11。本发明提供的经修饰的GDF11，可以显著增加血浆的半衰期，增强生物活性，还可以广泛用于抑制细胞凋亡等生物医药领域。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种经修饰的生长分化因子，由甲氧基聚乙二醇-丙醛(mPEG-ALD)对来源于哺乳动物的天然生长分化因子11蛋白的N末端特异修饰所得。
所述经修饰的生长分化因子(PEG-rhGDF11)的制备方法，具体操作如下：
S1、取生长分化因子11溶液于磷酸盐缓冲液中，于300-500r/min搅拌5-10min至完全溶解，得混合物I；
S2、向步骤S1所得的混合物I中添加甲氧基聚乙二醇-丙醛，于4℃条件下反应10-15h，加入甘氨酸终止反应，得粗反应物；
S3、将步骤S2所得的粗反应物采用Superdex 200分子筛，以含有浓度为160mmol/L氯化钠溶液的磷酸盐缓冲液为流动相柱层析，收集各洗脱峰，得洗脱液；
S4、将步骤S3收集的洗脱液减压，浓缩，干燥，即得。
优选地，所述步骤S1中的生长分化因子11溶液的浓度为1mg/mL，制备方法为：称取20mg的生长分化因子11溶于20mL的水，搅拌至完全溶解，即得。
优选地，所述步骤S1中的磷酸盐缓冲液的pH值为7.2-7.6，浓度为50mmol/L。
优选地，所述步骤S2中加入的甲氧基聚乙二醇-丙醛质量与生长分化因子11的质量相同。
优选地，所述步骤S3中的含有浓度为160mmol/L氯化钠溶液的磷酸盐缓冲液的pH值为6.8-7.2，浓度为40mmol/L。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物由经修饰的GDF11与药学上可接受的药物载体组成；所述药学上可接受的药物载体为注射用水。
本发明提供的药物组合物中，还包括药用辅料及药学上可接受的盐；所述药用辅料包括聚乙二醇，脂质体，壳聚糖，海藻酸钠及戊二醛交联蛋白；所述药学上可接受的盐为氯甲双磷酸二钠。
所述药物组合物的制备方法为：
a.将注射用水加热至70℃，加入PEG-rhGDF11，在300r/min下离心10min至完全溶解，得混合物I；
b.向步骤a所得的混合物I中加入聚乙二醇，脂质体，壳聚糖，海藻酸钠，戊二醛交联蛋白，温度维持70℃，在500r/min下离心15min至完全溶解，得混合物II；
c.向步骤b所得的混合物II中加入氯甲双磷酸二钠，500r/min下搅拌10min，至完全溶解，降温至30℃，即得。
本发明还提供了PEG-rhGDF11在制备抑制细胞凋亡的生物药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明提供的PEG-rhGDF11，是经醇化修饰的，体内体外均可以表现出极高的生物活性；
(2)本发明提供的PEG-rhGDF11，修饰过程简单，条件温和，并且修饰过程中不会引进其他的活性集团，与氨基可以形成稳定连接；
(3)本发明提供的PEG-rhGDF11，修饰过程是在低pH值条件下进行，因此在对N末端特异性修饰过程中，对蛋白质的活性影响较小，便于对产物的纯化和鉴定；
(4)本发明提供的PEG-rhGDF11，纯度大于90％，还可以显著增长血浆的半衰期，提高细胞的抗凋亡活性。
附图说明
图1为用mPEG-ALD修饰GDF11的反应过程图；
图2为GDF11或PEG-rhGDF11对棕榈酸诱导内皮细胞凋亡的影响结果图；
图3为GDF11或PEG-rhGDF11在37℃下的稳定性对比图；
图4为GDF11或PEG-rhGDF11在SD大鼠中的半衰期对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。
实施例1一种经修饰的生长分化因子
所述经修饰的生长分化因子，由甲氧基聚乙二醇-丙醛(mPEG-ALD)对来源于哺乳动物的天然生长分化因子11蛋白的N末端特异修饰所得。
所述经修饰的生长分化因子(PEG-rhGDF11)的制备方法为：
S1、取浓度为1mg/mL的生长分化因子11溶液于pH值为7.2，浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液中，于300/min搅拌5min至完全溶解，得混合物I；
S2、向步骤S1所得的混合物I中添加与生长分化因子11相同质量的mPEG-ALD，于4℃条件下反应10h，加入甘氨酸终止反应，得粗反应物；
S3、将步骤S2所得的粗反应物采用Superdex 200分子筛，以含有浓度为160mmol/L氯化钠溶液的浓度为40mmol/L，pH值为6.8的磷酸盐缓冲液为流动相柱层析，收集各洗脱峰，得洗脱液；
S4、将步骤S3收集的洗脱液减压，浓缩，干燥，即得。
实施例2一种经修饰的生长分化因子
所述经修饰的生长分化因子，由甲氧基聚乙二醇-丙醛(mPEG-ALD)对来源于哺乳动物的天然生长分化因子11蛋白的N末端特异修饰所得。
所述经修饰的生长分化因子(PEG-rhGDF11)的制备方法为：
S1、取浓度为1mg/mL的生长分化因子11溶液于pH值为7.6，浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液中，于500r/min搅拌10min至完全溶解，得混合物I；
S2、向步骤S1所得的混合物I中添加与生长分化因子11相同质量的mPEG-ALD，于4℃条件下反应15h，加入甘氨酸终止反应，得粗反应物；
S3、将步骤S2所得的粗反应物采用Superdex 200分子筛，以含有浓度为160mmol/L氯化钠溶液的浓度为40mmol/L，pH值为7.2的磷酸盐缓冲液为流动相柱层析，收集各洗脱峰，得洗脱液；
S4、将步骤S3收集的洗脱液减压，浓缩，干燥，即得。
实施例3一种经修饰的生长分化因子
所述经修饰的生长分化因子，由甲氧基聚乙二醇-丙醛(mPEG-ALD)对来源于哺乳动物的天然生长分化因子11蛋白的N末端特异修饰所得。
所述经修饰的生长分化因子(PEG-rhGDF11)的制备方法为：
S1、取浓度为1mg/mL的生长分化因子11溶液于pH值为7.4，浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液中，于400r/min搅拌8min至完全溶解，得混合物I；
S2、向步骤S1所得的混合物I中添加与生长分化因子11相同质量的聚乙二醇活性酯，于4℃条件下反应13h，加入甘氨酸终止反应，得粗反应物；
S3、将步骤S2所得的粗反应物采用Superdex 200分子筛，以含有浓度为160mmol/L氯化钠溶液的浓度为40mmol/L，pH值为7.0的磷酸盐缓冲液为流动相柱层析，收集各洗脱峰，得洗脱液；
S4、将步骤S3收集的洗脱液减压，浓缩，干燥，即得。
实施例4一种药物组合物
所述药物组合物包括PEG-rhGDF110.15g，注射用水500mL，聚乙二醇1.2g，脂质体1.7g，壳聚糖1.5g，海藻酸钠3.8g，戊二醛交联蛋白0.5g，氯甲双磷酸二钠2.1g。
所述药物组合物的制备方法为：
a.将注射用水加热至70℃，加入PEG-rhGDF11，在300r/min下离心10min至完全溶解，得混合物I；
b.向步骤a所得的混合物I中加入聚乙二醇，脂质体，壳聚糖，海藻酸钠及戊二醛交联蛋白，温度维持在70℃，在500r/min下离心15min至完全溶解，得混合物II；
c.向步骤b所得的混合物II中加入氯甲双磷酸二钠，500r/min下搅拌10min，至完全溶解，降温至30℃，即得。
试验例一抗细胞凋亡性试验
1.试验样品：小鼠主动脉内皮细胞；实施例3获得的PEG-rhGDF11；未经修饰的GDF11；含胎牛血清的培养基。
2.试验方法：将小鼠内皮细胞分成3组，经PBS洗涤后，置于含有胎牛血清的培养基中培养10天，然后利用TUNEL法检测细胞凋亡率。3组细胞培养过程中的区别如表1。
表1 3组培养基的区别组分
实验组 GDF11因子 PEG-rhGDF11因子 棕榈酸(PA)
试验例1组 + - +
试验例2组 - + +
对照组 - - +
注：“+”代表加入该物质；“-”代表未加入该物质。
3.试验结果：结果表明，经PEG衍生化修饰后的GDF11因子对对鼠主动脉内皮细胞具有保护作用，可以显著减少PA引起的细胞凋亡，具体结果见图2。
试验例二稳定性检测试验
1.试验样品：实施例3获得的PEG-rhGDF11；未经修饰的GDF11。
2.试验方法：将试验样品经公司合成后分别置于37℃的水浴中处理，观察蛋白质的凝集情况，并从第二天到第五天依次测定蛋白质的保存率。
3.试验结果：结果发现，未经PEG衍生物修饰的GDF11很快就出现了凝集现象，第二天时，蛋白质的保存率为46.7±3.4％，而经过PEG衍生物修饰的GDF11则具有很好的稳定性，第2天时的蛋白保存率为92.3±0.9％，并且在第5天时其蛋白保存率仍有80.4±2.5％。表明PEG修饰后可以明显提高rhGDF11的稳定性。具体结果见图3。
试验例三药代动力学分析
1.试验样品：实施例3获得的PEG-rhGDF11；未经修饰的GDF11；SD大鼠。
2.试验方法：对SD大鼠进行皮下注射给药处理，于不同时间点采集血样并进行特异性检测。
3.试验结果：结果显示，GDF11标准蛋白在注射4h后到达峰值11.2±0.6ng/mL，至8.5h到达半衰期，而PEG-rhGDF11注射在8h后到达峰值14.3±0.94ng/mL，至31.7h到达半衰期，对比GDF11，PEG-rhGDF11的半衰期延长了3.7倍，增加了其在血液中存留的时间。经皮下注射后两种药物的药代动力学结果对比见表2，不同时间段的半衰期的具体试验结果见图4。
样品 t<sub>max</sub>/h AUC/ng*h*mL<sup>-1</sup> CL/mL*h<sup>-1</sup>*kg<sup>-1</sup> half-life/h
GDF11 4 17.4 83.4 8.5
PEG-rhGDF11 8 164.5 3.42 31.7
注：tmax代表达峰时间，指给药后达到药峰浓度所需的时间；AUC代表曲线下面积，指血药浓度曲线对时间轴所包围的面积；CL代表清除率，指单位时间内从体内清楚的药物表观分布容积数；half-life代表生物半衰期，指药物效应下降一半的时间。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.一种经修饰的生长分化因子，其特征在于，由甲氧基聚乙二醇-丙醛对来源于哺乳动物的天然生长分化因子11蛋白的N末端特异修饰所得。
2.一种如权利要求1所述的经修饰的生长分化因子的制备方法，其特征在于，操作步骤如下：
S1、取生长分化因子11溶液于磷酸盐缓冲液中，于300-500r/min搅拌5-10min至完全溶解，得混合物I；
S2、向步骤S1所得的混合物I中添加甲氧基聚乙二醇-丙醛，于4℃条件下反应10-15h，加入甘氨酸终止反应，得粗反应物；
S3、将步骤S2所得的粗反应物采用Superdex 200分子筛，以含有浓度为160mmol/L氯化钠溶液的磷酸盐缓冲液为流动相柱层析，收集各洗脱峰，得洗脱液；
S4、将步骤S3收集的洗脱液减压，浓缩，干燥，即得。
3.如权利要求2所述的经修饰的生长分化因子的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的生长分化因子11溶液的浓度为1mg/mL，制备方法为：称取20mg的生长分化因子11溶于20mL的水，搅拌至完全溶解，即得。
4.如权利要求2所述的经修饰的生长分化因子的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的磷酸盐缓冲液的pH值为7.2-7.6，浓度为50mmol/L。
5.如权利要求2所述的经修饰的生长分化因子的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中加入的甲氧基聚乙二醇-丙醛质量与生长分化因子11的质量相同。
6.如权利要求2所述的经修饰的生长分化因子的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中的含有浓度为160mmol/L氯化钠溶液的磷酸盐缓冲液的pH值为6.8-7.2，浓度为40mmol/L。
7.一种药物组合物，其特征在于，由权利要求1所述的经修饰的生长分化因子与药学上可接受的药物载体组成。
8.如权利要求1所述的经修饰的生长分化因子，在制备抑制细胞凋亡的生物药物中的应用。
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