CN109479878A - 2-甲氧基苯丙酸化合物在预防和/或治疗植物病害中的应用 - Google Patents

2-甲氧基苯丙酸化合物在预防和/或治疗植物病害中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了2‑甲氧基苯丙酸化合物在预防和/或治疗植物病害中的应用。本发明所述化合物在不影响植物病原菌生长的同时，能够强烈的抑制植物病原菌的毒性因子，显著性地降低植物病原菌的致病性，即在不影响植物病原菌生长的同时，达到了预防和/或治疗植物病原菌引发的植物病害；所述化合物可作为植物病原菌III型分泌系统抑制剂，或制备成为防治相关植物病害的药物，用于预防和/或治疗植物病害，同时还具有降低和延缓植物病原菌对所述化合物抗药性产生的作用，在植物病害的预防和/或治疗方面具有较长的有效使用期限，应用前景广阔。

Description

2-甲氧基苯丙酸化合物在预防和/或治疗植物病害中的应用
技术领域
本发明涉及植物病害防治技术领域，更具体地，涉及2-甲氧基苯丙酸化合物在预防和/或治疗植物病害中的应用。
背景技术
水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）和细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola，Xoc）分别引起水稻白叶枯病和条斑病，是水稻上重要的革兰氏阴性细菌性病害，研发新型有效的病害防治新药物是迫切需要解决的关键问题之一。细菌III型分泌系统（T3SS）是革兰氏阴性病原细菌中的关键毒性因子，已经成为了研发新型药物的理想靶标之一。T3SS是Xoo和Xoc的关键毒性因子，在两个致病变种中高度同源和保守，可以用作新型药物分子设计的靶标。
传统抗生素通常以细菌生存的关键因素为作用靶标，导致细菌抗药性的产生越来越普遍和严重。因此，以细菌的毒性因子为靶标，降低细菌的致病性，而同时又不影响细菌的生长，从而避免了细菌抗药性的产生，已成为抗菌药物研发的新思路和新途径。
天然产物是大自然馈赠给人类的一个宝库，人们从中可以获得医治严重危害人类健康疾病的防治药物、医用及农用抗菌素、开发高效低毒农药以及植物生长激素和其他具有经济价值的物质；而且天然产物对环境友好。例如最近有报道记载了植物酚类衍生物为Pseudomonas aeruginosa 和Erwinia amylovora 的 T3SS 抑制剂（Khokhani et al.，2013；Yamazaki et al.，2012）。因此，从天然产物中筛选的高效细菌毒性因子的抑制剂不仅能够有效的控制细菌引发的病害，同时对于环境也友好，具有极大的研究空间和应用前景，有待于进一步的研究和开发。
发明内容
本发明的目的在于提供2-甲氧基苯丙酸化合物在预防和/或治疗植物病害中的应用。
本发明的另一目的在于提供2-甲氧基苯丙酸化合物在制备预防和/或治疗植物病害药物中的应用。
本发明的再一目的在于提供2-甲氧基苯丙酸化合物作为植物病原菌III型分泌系统抑制剂的应用。
本发明的还一目的在于提供一种植物病原菌III型分泌系统抑制剂。
本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：
2-甲氧基苯丙酸化合物在预防和/或治疗植物病害中的应用。
所述化合物2-甲氧基苯丙酸（即化合物CZ-1）的结构如下所述：
。
本发明所述化合物在不影响植物病原菌生长的同时，能够强烈的抑制植物病原菌的毒性因子，从而显著性地降低植物病原菌的致病性，即在不影响植物病原菌生长的同时，达到了预防和/或治疗植物病原菌引发的植物病害的效果。因此，所述化合物可以作为植物病原菌III型分泌系统抑制剂，或制备成为相关植物病害的药物，用于预防和/或治疗植物病害，同时还具有降低和延缓植物病原菌对所述化合物抗药性产生的作用，在植物病害的预防和/或治疗方面具有较长的有效使用期限，应用前景广阔。
本发明同时还保护2-甲氧基苯丙酸化合物在制备预防和/或治疗植物病害药物中的应用。
优选地，所述植物病害为水稻白叶枯病和/或水稻细菌性条斑病。
优选地，所述水稻白叶枯病的病原菌为水稻白叶枯病菌Xoo；所述水水稻细菌性条斑病的病原菌为水稻细菌性条斑病菌Xoc。
本发明同时还保护2-甲氧基苯丙酸化合物作为植物病原菌III型分泌系统抑制剂的应用。
优选地，所述化合物抑制植物病原菌III型分泌系统中hpa1 基因启动子的表达。
优选地，所述植物病原菌为水稻白叶枯病和/或水稻细菌性条斑病。
本发明同时还保护一种植物病原菌III型分泌系统抑制剂，包含有2-甲氧基苯丙酸或其药学上可接受的盐。
优选地，所述抑制剂的剂型可为粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂、水分散粒剂、悬浮剂、乳油、微乳剂或水剂。
本发明所述2-甲氧基苯丙酸化合物或其药学上可接受的盐或由其制备的药物还可以与其他多种药物混合使用。
优选地，所述2-甲氧基苯丙酸化合物或其药学上可接受的盐或由其制备的药物与一种或多种其他植物杀菌剂或植物生长调节剂混合使用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所述化合物对于水稻白叶枯病菌Xoo和水稻细菌性条斑病菌Xoc的T3SS系统中的hpa1基因启动子具有强烈的抑制作用，同时还不影响上述两种病原菌的正常生长，即所述化合物在不影响植物病原菌生长的同时，能够强烈的抑制植物病原菌的毒性因子，显著性地降低植物病原菌的致病性，即在不影响植物病原菌生长的同时，达到了预防和/或治疗植物病原菌引发的植物病害；所述化合物可作为植物病原菌III型分泌系统抑制剂，或制备成为相关植物病害的药物，用于预防和/或治疗植物病害，同时还具有降低和延缓植物病原菌对所述化合物抗药性产生的作用，在植物病害的预防和/或治疗方面具有较长的有效使用期限，应用前景广阔。
附图说明
图1为PXO99A 在添加了待测化合物的 M210 培养基（A）及 XOM2 培养基（B）中的生长曲线。
图2为化合物CZ-1对烟草上 HR 的影响。
图3为化合物CZ-1的菌落计数。
图4为化合物CZ-1处理后的 PXO99A 菌株（Xoo）在水稻幼苗上产生的water-soaking症状。
图5为化合物CZ-1处理后的 RS105 菌株（Xoc）在水稻幼苗上产生的water-soaking症状。
图6为化合物CZ-1处理后的 PXO99A 菌株在水稻成株叶片上产生的病斑长度实物图。
图7为化合物CZ-1处理后的 PXO99A 菌株在水稻成株叶片上产生的病斑长度。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）及水稻细菌性条斑病（X. oryzae pv. oryzicola，Xoc）引起水稻白叶枯病及水稻细菌性条斑病，是水稻上重要的细菌性病害，研发新型有效的病害防治新药物是迫切需要解决的关键问题之一。 T3SS是 Xoo和Xoc的关键毒性因子，在两个致病变种中高度同源和保守，以T3SS为靶标时，即可以在不影响Xoo和Xoc生长的同时降低其致病性，减少病害的发生，但两种病原菌又不至于对药物产生抗药性，有利于药物的长期有效的使用。
以下实施例为测试合物对水稻白叶枯 T3SS 的抑制作用，供试病原菌种：Xoo野生型菌株PXO99A ，及相应的突变体菌株（hpa1 in PXO99A），主要引发水稻白叶枯病；Xoc野生型菌株RS105。待测化合物用 DMSO 溶解，配制成浓度为200 μM的待测液。
实施例1 测试化合物CZ-1对T3SS系统中hpa1 基因启动子的抑制作用
将突变体菌株（hpa1 inPXO99A）在 PSA 平板上划线活化，2～3天后挑取单菌落置于M210 液体培养基，加入头孢和氨苄，生长至 OD600 约为2.0，按照1:100转接至新鲜的 M210培养基中，生长至 OD600 约为0.6，离心收集菌体，XOM2 培养基洗菌体一次，之后重悬于XOM2 培养基中，加入头孢和氨苄，调节 OD600 至0.3，加入待测化合物至其终浓度为200 μM，等体积 DMSO 作为溶剂对照，于28 ℃、200 r/min条件下处理15 h，每个处理重复3次，离心收集菌体并用0.01 mol/L PBS（pH=7.4）缓冲液重悬菌体，调节OD600约为0.1，流式细胞仪检测 GFP 平均荧光强度（MFI）。
实验结果显示化合物CZ-1对hpa1启动子活性都具有强烈的抑制作用，具体结果见表1。
表1 Xoo中III型分泌系统抑制剂的启动子抑制活性筛选结果
“*”代表与DMSO处理组相比，化合物对于hpa1启动子具有强烈的抑制作用。
从表1中可知，化合物CZ-1对于hpa1启动子都具有强烈的抑制作用，选择这个化合物进行下一步的试验。
实施例2：测试化合物CZ-1对野生型菌株PXO99A 生长的影响
试验过程为：分别测定丰富培养基 M210 和 T3SS 诱导培养基 XOM2 中待测化合物存在条件下 PXO99A的生长曲线。由于 XOM2 是贫瘠培养基，PXO99A在其中几乎不生长，因此补充了0.5%蔗糖作为碳源。将 Xoo野生型菌株 PXO99A在 PSA 平板上划线活化，2～3天后挑取单菌落置于 M210 液体培养基，加入头孢，生长至 OD600 约为2.0，离心收集菌体，无菌水洗菌体一次，之后重悬于 M210 或者 XOM2 中，调节 OD600 为0.1。分别加入200 μM待测化合物，置于96孔板上，等体积 DMSO 作为溶剂对照，每处理设置3个重复。设置温度为28℃，全自动生长曲线仪测定。每1 h读取一次数据，共测定72 h。该试验独立重复3次。
实验结果见图1。其中A为PXO99A 在添加了待测化合物的 M210 培养基中的生长曲线，B为PXO99A 在添加了待测化合物 XOM2 培养基中的生长曲线。结果表明，与 DMSO 对照相比较，在 PXO99A生长的迟缓期、对数期和稳定期，化合物CZ-1在培养基M210或者XOM2中均没有表现出明显抑制PXO99A生长的作用。
因此，选择化合物CZ-1进行后续的试验研究。
实施例3：化合物CZ-1对 PXO99A 在烟草上过敏性反应(HR) 的影响
PXO99A 菌株于 M210 培养基中培养至 OD600 约为2.0，离心收集菌体，无菌水重悬菌体，并调节 OD600 至为0.8，分别加入3个待测化合物，等体积 DMSO 作为对照，28 ℃条件下处理2 h。之后用一个无针头注射器将处理后的PXO99A菌株接种于培养两个月的本氏烟草上，烟草接种后继续置于温室培养，24 h后拍照观察现象。
化合物CZ-1对 PXO99A 在烟草上 HR 的影响结果见图2。从图中可知，化合物CZ-1对处理后的PXO99A在非寄主植物烟草上的HR 有明显的抑制作用。
实施例4：化合物CZ-1的菌落计数
PXO99A 菌株于 M210 培养基中培养至 OD600 约为2.0，按照1:100转接至新鲜的 M210培养基中，生长至 OD600 约为0.6，离心收集菌体，双蒸水重悬，分别加入200 μM 的待测化合物，混合液稀释106倍，对照组为等体积的 DMSO，28 ℃条件下处理2 h。各取100 μL混合液涂到PSA平板上，3～4天后菌落计数。
化合物CZ-1的菌落计数如图3所示。从图3中可知，化合物CZ-1对于PXO99A菌株没有明显的杀菌作用。
实施例5：化合物CZ-1对Xoo和Xoc菌株在水稻上的致病性的影响
水稻品种：感病品种 IR24；Xoo和Xoc菌株在感病水稻叶片上可以产生水渍状的病斑（water-soaking）。
PXO99A和RS105菌株于 M210 培养基中培养至 OD600 约为2.0，离心收集菌体，无菌水重悬菌体，并调节 OD600 至为0.8，分别加入200 μM 的待测化合物，等体积 DMSO 作为溶剂对照组，28 ℃条件下处理2 h。
（1）幼苗接种：用无针头注射器将上述用化合物处理后的PXO99A或RS105菌株分别接种于培养两周的感病水稻品种 IR24 上，每片剑叶的中部接种一个样品，每个样品接种10片叶片，对照组1为接种等量的DMSO（图4中左一），对照组2为接种等量的未经化合物处理的PXO99A和RS105菌株（图4中左二）。接种后继续置于温室培养，72 h后拍照观察叶片上water-soaking症状的发生状况。
结果见图4和图5，其中图4中从左到右分别代表空白接种DMSO、接种未经化合物处理的PXO99A（空白对照组）、接种经DMSO处理的PXO99A（溶剂对照组）、接种经化合物CZ-1处理的PXO99A和接种经化合物TS006处理的PXO99A(阳性对照组)。
图5中从左到右分别代表空白接种DMSO、接种未经化合物处理的RS105（空白对照组）、接种经DMSO处理的RS105（溶剂对照组）、接种经化合物CZ-1处理的RS105和接种经化合物TS006处理的RS105 (阳性对照组)。
结果表明，与空白对照组和溶剂对照组相比，经化合物CZ-1处理后的 PXO99A或RS105菌株在水稻幼苗上所产生的water-soaking 症状具有明显的减轻，其water-soaking症状与阳性对照组相当，表明化合物CZ-1明显降低了PXO99A 和RS105菌株的致病性。
（2）成株接种：在成株水稻上采用剪叶接种法，接种14天后统计病斑的长度。空白对照组为未处理的PXO99A菌株。
结果见图6和图7。图6中从左至右分别代表接种未经化合物处理的PXO99A（空白对照组）、接种经DMSO处理的PXO99A（溶剂对照组）、接种经化合物CZ-1处理的PXO99A和接种经化合物TS006处理的PXO99A(阳性对照组)。
结果表明，与与空白对照组和溶剂对照组相比，经过化合物CZ-1处理后的 PXO99A菌株产生的病斑长度显著性地变短，其water-soaking 症状与阳性对照组相当，表明化合物明显降低了PXO99A 菌株的致病性。
综上，上述实施例均说明本发明所述化合物CZ-1，即化合物2-甲氧基苯丙酸在不影响病原菌PXO99A或RS105的生长的同时，强烈抑制了其T3SS系统的hpa1 基因启动子的表达，从而明显降低了病原菌的致病性，在不影响病原菌生长的同时即可达到预防和/或治疗由病原菌引发的植物病害，从而避免了病原菌抗药性的产生，延长了化合物有效使用期限。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.2-甲氧基苯丙酸化合物在预防和/或治疗植物病害中的应用。
2.2-甲氧基苯丙酸化合物在制备预防和/或治疗植物病害药物中的应用。
3.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述植物病害为水稻白叶枯病和/或水稻细菌性条斑病。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述水稻白叶枯病的病原菌为水稻白叶枯病菌Xanthomonas oryzae pv. oryzae；所述水稻细菌性条斑病的病原菌为水稻细菌性条斑病菌Xanthomonasoryzae pv. oryzicola。
5.2-甲氧基苯丙酸化合物作为植物病原菌III型分泌系统抑制剂的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述化合物抑制植物病原菌III型分泌系统中hpa1 基因启动子的表达。
7.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述植物病原菌为水稻白叶枯病和/或水稻细菌性条斑病。
8.一种植物病原菌III型分泌系统抑制剂，其特征在于，包含有2-甲氧基苯丙酸或其药学上可接受的盐。
9.根据权利要求8所述植物病原菌III型分泌系统抑制剂，其特征在于，所述抑制剂的剂型可为粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂、水分散粒剂、悬浮剂、乳油、微乳剂或水剂。
10.一种农用组合物，其特征在于，包含权利要求8所述植物病原菌III型分泌系统抑制剂，和一种或多种其他植物杀菌剂或植物生长调节剂。
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