CN109234218A - 一种摩氏假单胞菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及假单胞菌技术领域，特别涉及一种摩氏假单胞菌(Pseudomonas mosselii)菌。其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018534。其对稻曲病、稻瘟病、恶苗病和白叶枯病具有抑菌效果。

Description

一种摩氏假单胞菌及其应用
技术领域
本发明涉及假单胞菌技术领域，特别涉及一种摩氏假单胞菌(Pseudomonasmosselii)菌。
背景技术
真菌病害严重危及全球粮食安全，植物病害中有70％-80％是病原真菌的侵染所导致。稻瘟病、纹枯病和白叶枯病是水稻的三大主要病害。而水稻稻曲病是稻绿核菌(Ustilaginoidea virens)侵染稻谷引起的真菌病害，发生于水稻开花后至乳熟期。该病分布广泛，在亚洲、美洲、非洲和欧洲等地稻区都有发生，稻曲病除了导致水稻产量减少外，其产生的毒素(稻绿核菌素)对人畜安全及农田生态环境产生严重隐患。
近年来随着水稻品种更新加快、调运频繁、施肥水平提高以及水稻的大规模种植，稻曲病渐趋加重逐渐由次要病害上升到主要病害，特别是优质稻和杂交稻被侵染的情况增多，影响我国中晚稻比重较大。国内外主要采用化学农药对其进行防治,但常因降雨等环境原因造成防治效果不佳、同时也带来环境污染、农药残留和病原菌产生抗药性等诸多问题。
目前,利用拮抗微生物防治植物病害的研究进展较快,而利用拮抗菌防治水稻稻曲病的报道还比较少。筛选新的具有病原真菌拮抗作用的细菌仍然具有重要的科学价值和实用价值。
发明内容
本发明针对现有技术的不足之处，结合我国的种植资源，从杭州市中国水稻研究所富阳基地水稻种植区域内分离得到了众多细菌菌株，并对这些细菌的16S rDNA和病原真菌拮抗能力等进行检测分析，旨在获得高效广谱的生防菌，以期为植物真菌病害的防治提供材料。
因此，本发明提供了一种摩氏假单胞菌(Pseudomonas mosselii)，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018534。
一种如本发明的摩氏假单胞菌CCTCC NO：M2018534的应用。
在一个具体实施方式中，所述摩氏假单胞菌用于防治稻绿核菌(Ustilaginoideavirens)(也可以称之为稻曲病原菌)、稻瘟病原菌(Magnaporthe oryzae)、恶苗病原菌(Fusarium moniliforme)和白叶枯原菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)所引起的病害中的至少一种。
在一个具体实施方式中，所述摩氏假单胞菌用于防治稻曲病。
在一个具体实施方式中，所述摩氏假单胞菌用于保护植物；所述植物主要指的是农作物；所述农作物可以为水稻。
一种对本发明的摩氏假单胞菌CCTCC NO：M2018534进行遗传改良后得到的工程菌。其中，由于该工程菌是以本发明的摩氏假单胞菌CCTCC NO：M2018534为靶标，而且采取的手段一般是向其中转入和/或敲除特定的基因和/或序列等，因此，该工程菌仍然为摩氏假单胞菌。另外，该工程菌可以为提高了对上述病害活性的工程菌。还可以为兼具其他病虫害活性和/或被赋予了其他有益特性的工程菌株。
一种如本发明的工程菌的应用。
在一个具体实施方式中，所述工程菌用于防治稻绿核菌(Ustilaginoideavirens)、稻瘟病原菌(Magnaporthe oryzae)、恶苗病原菌(Fusarium moniliforme)和白叶枯病原菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)所引起的病害中的至少一种。
在一个具体实施方式中，所述工程菌用于防治稻曲病。
在一个具体实施方式中，所述工程菌用于保护植物；所述植物主要指的是农作物；所述农作物可以为水稻。
一种包含如本发明的摩氏假单胞菌的组合物。其中的摩氏假单胞菌可以包括本发明的野生菌株CCTCC NO：M2018534，也可以包括对本发明的野生菌株CCTCC NO：M2018534进行遗传改良后得到的工程菌。所述组合物可以为固态形式，也可以为液态形式。所述组合物还可以包含与本发明的摩氏假单胞菌具有增效作用的其他物质，该其他物质可以是微生物来源抑菌活性物质，也可以是抑菌化合物。所述组合物进一步可以包括与本发明的摩氏假单胞菌相配合的辅剂、增稠剂和/或分散剂，例如所述辅剂可以选自棉子油、蓖麻油、桐油、液体石蜡、豆油、A1、A2、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二丁酯等；增稠剂有膨润土、硬脂酸铝、QH凝胶、龙胶粉、F1、黄原胶等：分散剂有拉开粉、NNO、LFS、B1、碳黑等。
一种如本发明的组合物的应用。
一种如本发明所述的组合物在防治稻绿核菌(Ustilaginoidea virens)、稻瘟病原菌(Magnaporthe oryzae)、恶苗病原菌(Fusarium moniliforme)和白叶枯病原菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)所引起的病害中的至少一种的应用。
在一个具体实施方式中，所述组合物用于防治稻曲病。
一种如本发明所述的组合物在保护植物中的应用；所述植物主要指的是农作物；所述农作物可以为水稻。
一种包含如本发明的摩氏假单胞菌的农药制剂。其中的摩氏假单胞菌可以包括本发明的野生菌株CCTCC NO：M2018534，也可以包括对本发明的野生菌株CCTCC NO：M2018534进行遗传改良后得到的工程菌。所述农药制剂可以为固态形式，也可以为液态形式。所述农药制剂还可以包含与本发明的摩氏假单胞菌具有增效作用的其他物质，该其他物质可以是微生物来源抑菌活性物质，也可以是抑菌化合物。所述农药制剂进一步可以包括与本发明的摩氏假单胞菌相配合的辅剂、增稠剂和/或分散剂，例如所述辅剂可以选自棉子油、蓖麻油、桐油、液体石蜡、豆油、A1、A2、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二丁酯等；增稠剂有膨润土、硬脂酸铝、QH凝胶、龙胶粉、F1、黄原胶等：分散剂有拉开粉、NNO、LFS、B1、碳黑等。
一种如本发明的农药制剂的应用。
一种如本发明所述的农药制剂在防治稻绿核菌(Ustilaginoidea virens)、稻瘟病原菌(Magnaporthe oryzae)、恶苗病原菌(Fusarium moniliforme)和白叶枯病原菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)所引起的病害中的至少一种的应用。
在一个具体实施方式中，所述农药制剂用于防治稻曲病。
一种如本发明所述的农药制剂在保护植物中的应用；所述植物主要指的是农作物；所述农作物可以为水稻。
在本发明中，术语“保护”的意思是通过预防和/或治疗靶标生物产生的病虫害等，从而使靶标生物免于或减轻遭受所述病虫害的为害。例如通过使用所述摩氏假单胞菌预防和/或治疗水稻的稻曲病。
本发明的有益效果：
本发明的摩氏假单胞菌同时对稻绿核菌、稻瘟病原菌、恶苗病原菌和白叶枯病原菌并具有非常好的抑菌效果，因此，可以将其用于保护植物免于这些病害的为害。特别是该摩氏假单胞菌对稻曲病原菌以及白叶枯病原菌具有非常优秀的抑菌效果。因而，本发明的摩氏假单胞菌极具实用价值。
附图说明
图1为利用对峙培养法测得的JP2-207对稻曲病原菌的抑制效果图。其中，A为空白对照，B为JP2-207的抑菌实验。
图2为利用对峙培养法测得的JP2-207对稻瘟病原菌的抑制效果图。其中，A为空白对照，B为JP2-207的抑菌实验。
图3为利用对峙培养法测得的JP2-207对恶苗病原菌的抑制效果图。其中，A为空白对照，B为JP2-207的抑菌实验。
图4为利用抑菌圈法测得的JP2-207对白叶枯病原菌的抑制效果图。
图5为JP2-207的16S rDNA构建的系统发育树。
菌种保藏
本发明筛选的一株细菌被定名为JP2-207，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018534，保藏日期为2018年8月13日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；邮编：430072。其系统分类为摩氏假单胞菌(Pseudomonas mosselii)。即该菌株为摩氏假单胞菌(Pseudomonas mosselii)JP2-207。
具体实施方式
以下通过优选的实施例的形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不构成对本发明的限制。
病原菌：4种供试病原真菌稻曲病原菌(Ustilaginoidea oryzae)hwd-2、稻瘟病原菌(Magnaporthe oryzae)guy11、恶苗病原菌(Fusarium moniliforme)EM-1-10和白叶枯原菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)zhe173由本实验室保藏。
LB液体培养基配方：胰蛋白胨10克，酵母粉5克，NaCl 10克，蒸馏水1000ml，pH7.2。常规灭菌后使用。若为固体培养基，在灭菌前向其中添加琼脂15克/升。
PDA固体培养基配方：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15克，蒸馏水1000ml，自然pH。常规灭菌后使用。
PSA固体培养基配方：马铃薯200克，蔗糖16克，琼脂15克，蒸馏水1000毫升，自然pH。常规灭菌后使用。
XBZ培养基：马铃薯300克，硝酸钙0.5克，磷酸氢二钠2.0克，蔗糖15克，蛋白胨5克，蒸馏水1000ml，自然pH。常规灭菌后使用。若为固体培养基，在灭菌前向其中添加琼脂15克/升。
相对抑菌率(％)＝[(对照菌落半径－处理菌落半径)/对照菌落半]×100％
实施例
1、菌株的分离与纯化
从中国水稻研究所富阳基地水稻种植区域内随机选取5个点挖取水稻根，将根系上的浮土轻轻用流水冲洗干净，与根系紧密附着的土壤用超声震荡的方式将其洗下，洗下的土壤悬浮液梯度稀释后涂于LB培养皿上，将培养皿置于28℃恒温培养箱内，每当菌落长出后，挑取不同形态菌落在新鲜LB培养基平板上进行划线纯化，然后再挑取单菌落于LB固体斜面4℃短期保存供活性测定使用。
纯化的单菌落接种于LB液体，经28℃过夜震荡培养后，将菌液与40％甘油等体积混合后置－80℃长期保存。
在众多分离得到的菌株中，经活性测定获得了一株对稻曲病和稻瘟病具有优良抑菌效果的菌株，将其命名为JP2-207。
2、菌株JP2-207的抑菌谱
1)采用平板对峙法。
一方面，将稻曲病原菌hwd-2提前在PSA固体培养基上于28℃下培养10天进行活化。
另一方面，将供试菌株JP2-207于LB平板上活化后，挑取单菌落接种2ml LB液体培养基，28℃ 200rpm震荡培养11小时，然后取5μl培养液滴加于PSA培养基中心点两侧，距中心2.5cm，同时将活化好的病原菌hwd-2用6mm打孔器沿着菌丝边缘打取一个菌饼，然后将菌饼的菌丝面朝下，接种到已经接种有供试菌JP2-207的PSA培养基的中央。接种三个平板作为重复。
以不接供试菌JP2-207而只接种病原菌hwd-2的平板为对照。接种三个平板作为重复。
在28℃下进行对峙培养，在第13天观察并记录，抑菌情况见图1。
结果显示，JP2-207对稻曲病源真菌hwd-2表现出明显抑制作用。受JP2-207抑制的病原真菌在PSA平板上的生长半径分别为0.5cm，0.65cm和0.65cm。对照病原真菌在PSA平板上的生长半径分别为1.2cm，1.25cm和1.3cm。
根据相对抑菌率公式计算相对抑菌率，得到JP2-207对病源真菌hwd-2的相对抑菌率为55％。
2)采用平板对峙法。
一方面，将稻瘟病原菌guy11提前在PDA固体培养基上于28℃下培养7天进行活化。
另一方面，将供试菌株JP2-207于LB平板上活化后，挑取单菌落接种2ml LB液体培养基，28℃ 200rpm震荡培养11小时，然后用无菌牙签蘸取适量菌液后划线接种PDA培养基中心点两侧，距中心2.5cm；同时将活化好的病原菌guy11用6mm打孔器沿着菌丝边缘打取一个菌饼，然后将菌饼的菌丝面朝下，接种到已经接种供试菌JP2-207的PDA培养基中央。接种三个平板作为重复。
以不接供试菌JP2-207而只接种病原真菌guy11的平板为对照。接种三个平板作为重复。
在28℃进行对峙培养，在第6天观察并记录，抑菌情况见图2。
结果显示，JP2-207对水稻稻瘟病原菌guy11表现出明显抑制作用。受JP2-207抑制的病原真菌在PDA平板上的生长半径分别为0.5cm，0.6cm和0.6cm，对照病原真菌在PSA平板上的生长半径分别为1.65cm，1.65cm和1.7cm。
根据相对抑菌率公式计算相对抑菌率，得到JP2-207对水稻稻瘟病原菌guy11的相对抑菌率为66.7％。
3)采用平板对峙法。
一方面，将水稻恶苗病原菌EM-1-10提前在PDA固体培养基上于28℃下培养5天进行活化。活化好的恶苗病原菌用6mm打孔器沿着菌丝边缘打菌饼备用。
另一方面，将供试菌株JP2-207于LB平板上活化后，挑取单菌落接种2ml LB液体培养基，28℃200rpm震荡培养11小时，然后用无菌牙签蘸取适量菌液后划线接种PDA培养基中心点两侧，距中心2.5cm，同时将活化好的恶苗病原菌EM-1-10用6mm打孔器沿着菌丝边缘打取一个菌饼，然后将菌饼的菌丝面朝下，接种到已经接种供试菌JP2-207的PDA培养基中央。接种三个平板作为重复。
以不接供试菌而只接种病原真菌EM-1-10的平板为对照。接种三个平板作为重复。
在28℃进行对峙培养，在第6天观察并记录，抑菌情况见图3。
JP2-207对水稻恶苗病原菌EM-1-10表现出明显抑制作用。受JP2-207抑制的病原真菌在PDA平板上的生长半径分别为1.6cm，1.6cm和1.5cm，对照病原真菌在PDA平板上的生长半径分别为2.2cm，2.15cm和2.2cm。
根据相对抑菌率公式计算相对抑菌率，得到JP2-207对水稻恶苗病原菌EM-1-10的相对抑菌率为28.3％。
4)采用抑菌圈法。
一方面，将白叶枯病原真菌zhe173提前在固体XBZ培养基上于28℃下培养2天进行活化。将活化好的zhe173挑单菌落接种于液体XBZ培养基中培养，于28℃200rpm震荡培养48小时。
另一方面，将供试菌株JP2-207于LB平板上活化后，挑取单菌落接种2ml LB液体培养基，28℃200rpm震荡培养11小时。
从震荡培养48小时的病原真菌zhe173取600ml均匀涂布于XBZ固体平板上；同时在涂布有病原真菌zhe173的XBZ固体培养基的中央孔中滴加5μl培养11小时的JP2-207菌液。接种三个平板作为重复。
于28℃正置培养2天后，观察JP2-207产生的抑菌圈大小(图4)，并记录。
JP2-207对水稻百叶枯病原菌zhe173表现出明显抑制作用。抑菌圈直径大小分别为3cm，3.1cm和2.9cm。
3.菌株JP2-207的16S rDNA测序及序列分析
将供试菌株JP2-207在LB平板活化后，挑取单菌落接种于LB液体培养基，28℃200rpm震荡培养12小时，收集菌体，使用DNAiso Reagent(Takara)进行基因组提取。用细菌16S rDNA通用引物：27F(SEQ ID No.1)和1492R(SEQ ID No.2)扩增JP2-207的16S rDNA序列。50μl的反应体系包括：10×PCR缓冲液5μl，2.5mM dNTP 4μl，20μM 27F1μl，20μM 1492R1μl，5IU的TaqDNA聚合酶0.25μl，DNA模板(50ng/μl，采用Nanodrop测得)1μl，ddH2O补充至50μl。PCR扩增条件：94℃3min预变性，94℃45sec，58℃45sec，72℃90sec，共30个循环，72℃10min延伸。得到的约1500bp的片段，经试剂盒纯化进行TA克隆，转化大肠杆菌得到的克隆子。经过菌液PCR验证正确后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，所得序列为1409bp(SEQ ID No.3所示)。
将SEQ ID No.3提交至EzBioCloud网站进行同源性比对，结果发现SEQ ID No.3与摩氏假单胞菌(Pseudomonas mosselii)CIP 105259T的16S rDNA同源性为100％。采用MEGA6.0构建系统发育树(图5)，16S rDNA系统发育分析也显示JP2-207与摩氏假单胞菌(P.mosselii)CIP 105259T聚在同一个分支上。基于以上结果，将JP2-207定名为摩氏假单胞菌(P.mosselii)JP2-207。
序列表
<110> 中国水稻研究所
<120> 一种摩氏假单胞菌及其应用
<130> LHA1860770
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(non)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(non)
<400> 2
cggttacctt gttacgactt 20
<210> 3
<211> 1409
<212> DNA
<213> 摩氏假单胞菌(Pseudomonas mosselii)
<400> 3
acacatgcaa gtcgagcgga tgacgggagc ttgctccttg attcagcggc ggacgggtga 60
taatgcctag gaatctgcct ggtagtgggg gacaacgttt cgaaaggaac gctaataccg 120
catacgtcct acgggagaaa gcaggggacc ttcgggcctt gcgctatcag atgagcctag 180
gtcggattag ctagtaggtg aggtaatggc tcacctaggc gacgatccgt aactggtctg 240
agaggatgat cagtcacact ggaactgaga cacggtccag actcctacgg gaggcagcag 300
tggggaatat tggacaatgg gcgaaagcct gatccagcca tgccgcgtgt gtgaagaagg 360
tcttcggatt gtaaagcact ttaagttggg aggaagggca gtaagttaat accttgctgt 420
tttgacgtta ccgacagaat aagcaccggc taactctgtg ccagcagccg cggtaataca 480
gagggtgcaa gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg cgcgtaggtg gttcgttaag 540
ttggatgtga aagccccggg ctcaacctgg gaactgcatc caaaactggc gagctagagt 600
atggtagagg gtggtggaat ttcctgtgta gcggtgaaat gcgtagatat aggaaggaac 660
accagtggcg aaggcgacca cctggactga tactgacact gaggtgcgaa agcgtgggga 720
gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgtcaact agccgttgga 780
atccttgaga ttttagtggc gcagctaacg cattaagttg accgcctggg gagtacggcc 840
gcaaggttaa aactcaaatg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 900
aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gccttgacat gcagagaact ttccagagat 960
ggattggtgc cttcgggaac tctgacacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg 1020
tgagatgttg ggttaagtcc cgtaacgagc gcaacccttg tccttagtta ccagcacgtt 1080
atggtgggca ctctaaggag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca 1140
agtcatcatg gcccttacgg cctgggctac acacgtgcta caatggtcgg tacagagggt 1200
tgccaagccg cgaggtggag ctaatctcac aaaaccgatc gtagtccgga tcgcagtctg 1260
caactcgact gcgtgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcaa atcagaatgt tgcggtgaat 1320
acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagtgggttg caccagaagt 1380
agctagtcta accttcggga ggacggtac 1409

Claims (10)

1.一种摩氏假单胞菌(Pseudomonas mosselii)，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018534。
2.一种对权利要求1所述的摩氏假单胞菌进行遗传改良后得到的工程菌。
3.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1所述的摩氏假单胞菌和/或如权利要求2所述的工程菌。
4.一种农药制剂，所述农药制剂包含如权利要求1所述的摩氏假单胞菌和/或如权利要求2所述的工程菌。
5.如权利要求1所述的摩氏假单胞菌、如权利要求2所述的工程菌、如权利要求3所述的组合物以及如权利要求4所述的农药制剂中的至少一种的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述摩氏假单胞菌用于防治稻绿核菌(Ustilaginoidea virens)、稻瘟病原菌(Magnaporthe oryzae)、恶苗病原菌(Fusariummoniliforme)和白叶枯病原菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)所引起的病害中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述摩氏假单胞菌用于防治稻曲病。
8.根据权利要求5至7中任意一项所述的应用，其特征在于，所述摩氏假单胞菌用于保护植物。
9.根据权利要求8的应用，其特征在于，所述植物为农作物。
10.根据权利要求9的应用，其特征在于，所述农作物为水稻。
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