CN109477785A - 具有光学均衡的流式细胞仪 - Google Patents
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Abstract
本公开的方面包括用于产生具有强度分布是预定的两个或更多个角度偏转的激光束的输出激光束(例如，用于辐照流动流中的样品)的方法。还描述了用于实践主题方法的系统，所述系统具有激光器、声光装置、射频发生器和控制器，所述控制器用于调整射频驱动信号的振幅以产生具有预定强度分布的角度偏转的激光束的输出激光束。
Description
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求于2016年9月13日提交的美国临时专利申请序列号62/393,976的申请日的优先权，将所述申请的公开内容通过引用并入本文。
引言
生物流体中分析物的表征已成为医学诊断和评估患者整体健康的不可或缺的部分。特别地，生理流体(例如，血液或血液衍生产品)中分析物的检测可能是重要的，其中结果可能在各种疾病状况下在患者的治疗方案中起重要作用。
流式细胞术是众所周知的技术，其常规用于细胞计数、细胞分选、生物标志物检测等。流式细胞仪通常包括用于接收流体样品(如血液样品)的样品储器和含有鞘液的鞘储器。流式细胞仪将流体样品中的粒子(包括细胞)作为细胞流运送到流动池，同时还将鞘液引导至流动池。在流动池内，在细胞流周围形成液体鞘，以在细胞流上产生基本均匀的速度。流动池使流内的细胞流体动力学地聚焦以穿过流动池中的光源的中心。在流式细胞术系统中，用激光辐射照射流过流动池的粒子(通常是细胞)，并且检测和分析响应于这种照射而从粒子发出的辐射(例如，荧光和/或散射辐射)。然而，传统的流式细胞术系统存在许多缺点。例如，在传统的流式细胞术系统中，在高样品流速下使用较宽的核心流通常导致分辨率降低，例如由于被照射粒子的光学响应不均匀。在这样的传统系统中，为了改善这个问题，使用具有高斯分布的较宽激光光斑来确保粒子的准均匀照射。尽管如此，与使用较慢的样品流速(即，较窄的核心流)相比，通常实现的分辨率较低。
发明内容
本发明总体上涉及用于流式细胞术的方法和系统，并且更具体地说，涉及用于数字地产生强度变化的激发光束和/或编码粒子在激发光束内的激发位置的方法和系统。本公开的方面包括用于产生具有强度分布是预定的两个或更多个角度偏转的激光束的输出激光束(例如，用于辐照流动流中的样品)的方法。根据某些实施方案的方法包括用激光器辐照声光装置；向声光装置施加射频驱动信号以产生角度偏转的激光束；并调整一个或多个射频驱动信号的振幅以产生具有强度分布是预定的角度偏转的激光束的输出激光束。方法还包括用具有角度偏转的激光束的输出激光束辐照流动流中的样品，并检测来自流动流中的样品的光。还描述了用于实践主题方法的系统，所述系统具有激光器、声光装置、射频发生器和控制器，所述控制器用于调整射频驱动信号的振幅以产生具有预定强度分布的角度偏转的激光束的输出激光束。还提供了具有声光装置(例如，声光偏转器)和被配置成在流动流中传送样品的流动池的套件。
在一个方面，公开了用于产生用于在流式细胞术系统中使用的激发光束的方法，所述方法包括向声光装置(例如，声光偏转器)中引入激光束；向声光装置施加多个射频信号，以便产生多个角度偏转的光束(其可以部分重叠)，共同形成输出激发光束；并调整射频信号的振幅，使得输出激发光束呈现出所需的强度分布，例如特征在于沿光束的一个维度(如水平维度)的所需强度变化的强度分布。
例如，激发光束沿其水平维度可以呈现出这样的强度变化，其特征在于从光束中心到其每个水平边缘的强度增加。在一些这样的实施方案中，光束中心处的光束强度相对于其任何水平边缘处的光束强度的变化值在约0.1％至约99％的范围内。在一些实施方案中，这种变化可以是线性的；而在其他实施方案中，它可以是非线性的。在一些实施方案中，沿垂直维度的光束强度分布可以是高斯分布。
在一些实施方案中，射频信号的振幅在约0.1伏至约40伏的范围内。在一些实施方案中，射频信号跨越约1MHz至约250MHz的频率范围。此外，在一些实施方案中，射频信号以约0.1MHz至约4MHz范围内的频率彼此分开。
在一些实施方案中，这样调整射频信号的振幅，使得偏转光束随着光束的偏转角度从中心光束增加而呈现出渐增的强度。
在相关方面，公开了流式细胞术系统，其包括多个粒子可以流过的流动池；用于产生激光束的激光器；接收激光束的声光偏转器；以及至少一个射频发生器，所述至少一个射频发生器用于向声光偏转器施加多个射频信号，以便产生多个角度偏转的光束(其可以部分重叠)，共同形成用于照射流过流动池的多个粒子的输出激发光束。控制器联接至射频发生器，用于调整所述射频信号的振幅，以便沿至少一个维度(例如，水平维度)向所述激发光束赋予强度分布。
所述系统还可以包括检测系统，用于检测响应于激发光束的照射而从被照射的粒子发出的辐射。可以这样配置强度分布，使得在其不同位置处与光束相互作用的等效粒子产生均匀信号。举例来说，在一些实施方案中，光束强度变化的特征在于从光束中心到其每个水平边缘的强度增加。在一些这样的实施方案中，光束中心处的光束强度相对于任何水平边缘处的光束强度的变化值在约0.1％至约99％的范围内(例如，至少约50％)。在一些实施方案中，光束在垂直维度上呈现出高斯强度分布。
可以调整射频信号的功率，以便获得所需的光束强度变化(例如，沿水平维度)。在一些实施方案中，控制器可以通过将那些信号的振幅在约0.1伏至约40伏的范围内进行调整来调整射频信号的功率。此外，在一些实施方案中，控制器可以控制射频发生器，以便产生多个射频信号，其以约0.1MHz至约4MHz范围内的频率彼此分开。
可以使用一个或多个激发光学器件将激发光束输送到样品流过的流动池中。举例来说，此类激发光学器件可以包括至少一个透镜，用于将激发光束聚焦到流动池中。此外，检测系统可以包括至少一个检测器和一个或多个检测光学器件，所述至少一个检测器和一个或多个检测光学器件相对于激发光束的传播方向以90度角定位，用于传输从穿过流动池的被照射的粒子(例如，细胞)发出的辐射到达检测器。
在相关方面，公开了用于调整激发光束在流式细胞术系统中的强度分布的方法，所述方法包括向声光装置(例如，声光偏转器)中引入激光束，向声光装置施加多个射频信号以产生多个角度分开的输出光束，并调整射频信号的功率以获得所述角度分开的输出光束的所需强度。角度分开的输出光束可以相对于彼此这样布置，以便共同形成用于照射流过流式细胞术系统的流动池的多个粒子的激发光束。在一些实施方案中，这样调整射频信号的功率，使得激发光束在其每个水平边缘处相对于其中心呈现出更高的强度。举例来说，沿光束的水平维度的强度变化的范围可以从约0.1％至约99％。
在一些实施方案中，射频信号的振幅在约0.1伏至约40伏的范围内变化，以调整射频信号的功率。此外，在一些实施方案中，射频信号在频率上彼此分开约0.1MHz至约4MHz范围内的值。
在相关方面，公开了流式细胞术系统，其包括多个粒子可以流过的流动池；用于产生激光束的激光器；接收激光束的声光装置；以及至少一个射频发生器，所述至少一个射频发生器用于向声光装置施加多个射频信号，以便产生由射频信号在频率上分开的多个角度偏转的子光束，并共同形成射频移位的激光束。所述系统还可以包括分束器，用于将射频移位的激光束分裂成一对射频移位的分裂激光束，使得每个分裂光束包括由射频信号在频率上分开的多个角度偏转的子光束；以及至少一个光学器件，用于水平反转一对激光束中的一个激光束。所述系统还包括光学组合器，用于将水平反转的光束与所述一对光束中的另一光束组合，使得水平反转的光束中的每个子光束至少部分地与所述一对光束中的另一光束中的至少一个子光束重叠，以便产生用于在粒子流过流动池时照射粒子的激发光束。所述系统还可以包括至少一个检测器，用于检测响应于来自激发光束的激发而从一个或多个粒子发出的前向散射辐射并产生检测信号。此外，所述系统可以包括相对于激发光束的传播方向沿90度方向布置的检测系统，以检测在相对于前向散射方向的正交方向上从粒子发出的辐射。
上述系统还可以包括分析器，用于接收检测信号并提供检测信号的频率解复用，以便确定一个或多个拍频，其中每个拍频对应于所述激发光束中的一对子光束(例如，一对部分重叠的子光束)之间的频率差。分析器可以将拍频与跨激发光束的空间位置相关联。此外，分析器可以基于跨激发光束的与信号的频率成分中存在的拍频相关联的空间位置来标准化检测信号(例如，前向散射信号)的强度。
所述系统还可以包括联接至射频发生器的控制器，用于调整射频信号的功率，以便调整子光束的强度，使得射频移位的光束的强度沿水平维度变化。在一些实施方案中，射频信号可以在频率上相对于彼此移位约10MHz至约250MHz范围内的频率。
在另一个方面，公开了调整激发光束在流式细胞仪中的空间位置的方法，所述方法包括向声光偏转器中引入激光束；向所述声光偏转器施加多个射频信号，以便产生多个角度偏转的光束(其可以部分重叠)，共同形成输出激发光束；向流动池中引入激发光束以与流过流动池的样品流相互作用；监测通过检测响应于与激发光束的相互作用从样品发出的辐射而产生的信号以检测样品流中的空间漂移(如果有的话)；并调整射频信号，以便调整激发光束在流动池中的空间位置，以便补偿检测到的样品流中的漂移。在一些实施方案中，调整射频信号的频率，以便引起激发光束的空间位置的移位。
在另一个方面，公开了调整激发光束在流式细胞仪中的宽度的方法，所述方法包括向声光偏转器中引入激光束；向所述声光偏转器施加多个射频信号，以便产生多个角度偏转的光束(其可以部分重叠)，共同形成输出激发光束；并调整所述射频信号的数量，以便调整所述激发光束的宽度。
附图说明
当结合附图阅读时，从以下具体实施方式可以最好地理解本发明。附图中包括以下附图：
图1示意性地描绘了根据本发明的实施方案的流式细胞术系统。
图2示意性地描绘了由RF发生器产生的用于施加到图1的系统的声光偏转器上的多个RF驱动信号。
图3示意性地描绘了响应于图2中所示的RF驱动信号向声光偏转器的施加而产生的多个子光束。
图4示意性地描绘了由图3中描绘的子光束共同形成的激发光束的假设强度变化。
图5示意性地描绘了穿过由图3中所示的子光束产生的激发光束的不同部分从而暴露于不同的激发强度的两个示例性粒子。
图6A是表示从穿过沿水平和垂直方向具有高斯强度分布的激发光束的粒子检测到的假设辐射强度的示意图。
图6B示意性地描绘了根据本发明实施方案的随粒子沿假设激发光束的水平位置变化的基本均匀的光学灵敏度。
图7示意性地描绘了根据本发明的另一个实施方案的流式细胞仪。
图8A示意性地示出了根据本发明的实施方案的激发光束。
图8B示意性地描绘了用于形成图8A中描绘的激发光束的假设驱动信号。
图9A示意性地示出了相对于图8A中描绘的激发光束具有更宽宽度的激发光束。
图9B示意性地描绘了用于形成图9A中描绘的激发光束的假设驱动信号。
图10A示意性地描绘了相对于图9A中描绘的激发光束具有更宽宽度的激发光束。
图10B示意性地描绘了用于形成图10A中描绘的激发光束的假设驱动信号。
图11示意性地描绘了在本发明的各种实施方案中使用的分析器的示例性实现方式。
图12示意性地描绘了在本发明的各种实施方案中使用的控制器的示例性实现方式。
图13示意性地描绘了根据本发明的另一个实施方案的流式细胞仪。
图14A示意性地描绘了在图13的流式细胞仪系统中共同形成光束的多个子光束。
图14B示出了通过分裂图14A中描绘的光束而获得的两个光束中的一个光束。
图14C示出了通过分裂图14B中描绘的光束而获得的两个光束中的另一个光束。
图14D示出了图14C中描绘的光束的水平反转形式。
图15示意性地呈现出由两组子光束叠加形成的激发光束。
具体实施方式
本公开的方面包括用于产生具有强度分布是预定的两个或更多个角度偏转的激光束的输出激光束(例如，用于辐照流动流中的样品)的方法。根据某些实施方案的方法包括用激光器辐照声光装置；向声光装置施加射频驱动信号以产生角度偏转的激光束；并调整一个或多个射频驱动信号的振幅以产生具有强度分布是预定的角度偏转的激光束的输出激光束。方法还包括用具有角度偏转的激光束的输出激光束辐照流动流中的样品，并检测来自流动流中的样品的光。还描述了用于实践主题方法的系统，所述系统具有激光器、声光装置、射频发生器和控制器，所述控制器用于调整射频驱动信号的振幅以产生具有预定强度分布的角度偏转的激光束的输出激光束。还提供了具有声光装置(例如，声光偏转器)和被配置成在流动流中传送样品的流动池的套件。
在更详细地描述本发明之前，应理解本发明不限于所描述的特定实施方案，因为这些实施方案可以变化。还应理解本文所用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，而并不旨在是限制性的，因为本发明的范围将仅由所附权利要求限定。
在提供值的范围的情况下，应理解除非上下文另外清晰地指示，该范围的上限和下限与在该陈述范围内的任何其他所陈述或中间值之间的每个中间值(直到下限的第十个单位)均被涵盖在本发明之内。这些较小范围的上限和下限可以被独立地包括在所述较小的范围内，并且也被涵盖在本发明之内，受所陈述范围内任何特别排除的限值的限制。在所陈述范围包括一个或两个限值的情况下，排除了那些被包括的限值的任一个或两个的范围也被包括在本发明之内。
除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然类似于或等同于本文描述的那些的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试中，现在将对代表性的说明性方法和材料进行描述。
在本说明书中引用的所有出版物和专利都通过引用并入本文，就好像每个单独的出版物或专利被确切地且单独地指示为通过引用并入，并且通过引用并入本文从而结合引用的出版物披露和描述所述方法和/或材料。任何出版物的引用内容是针对在申请日之前的公开内容，并且不应理解为承认因为先前发明而本发明不能获得比这些出版物更早的申请日。此外，所提供的公开日期可能与实际公开日期不同，实际公开日期可能需要独立地证实。
应注意，如在本文以及在所附权利要求中所用的，单数形式“一个/一种(a/an)”以及“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另外清晰地指示。还应注意，权利要求可以撰写成排除任何任选的要素。因此，此陈述旨在用作使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语如“单独”、“仅”等或使用“否定型”限定的前提基础。
如对于本领域技术人员将显而易见的，阅读本公开时，本文描述和说明的单独实施方案中的每一个均具有离散的组成部分和特征，所述组成部分和特征可以在不背离本发明的范围或精神的情况下易于与任何其他一些实施方案的特征分离或组合。可以按照所叙述的事件的顺序或按照逻辑上可行的任何其他顺序来执行任何所叙述的方法。
如上所综述，本公开提供了用于产生具有强度分布是预定的两个或更多个角度偏转的激光束的输出激光束(例如，用于辐照流动流中的样品)的方法。在进一步描述本公开的实施方案中，首先更详细地描述用于产生具有两个或更多个角度偏转的激光束的输出激光束并调整每个角度偏转的激光束的振幅的方法。接下来，还描述了用于实践主题方法的系统，所述系统具有激光器、声光装置、射频发生器和控制器，所述控制器用于调整射频驱动信号的振幅以产生具有预定强度分布的角度偏转的激光束的输出激光束。还提供了具有声光装置和被配置成在流动流中传送样品的流动池的套件。
用于产生具有强度分布是预定的角度偏转的激光束的输出激光束的方法
本公开的方面包括用于产生具有强度分布是预定的两个或更多个角度偏转的激光束的输出激光束(例如，用于辐照流动流中的样品)的方法。在实践根据实施方案的方法中，用激光器辐照声光装置，同时向声光装置施加射频驱动信号以产生角度偏转的激光束，并调整一个或多个射频驱动信号的振幅以产生包含具有预定强度分布的角度偏转的激光束的输出激光束。输出激光束中的每个角度偏转的激光束具有基于每个所施加的射频驱动信号的振幅的强度。术语“角度偏转的激光束”在本文中以其传统含义使用，指的是通过由所施加的射频驱动信号产生的声光装置中的声波与来自激光器的光束的相互作用以产生具有光学频率移位和传播角度偏转的一个或多个子光束而产生的激光束。
在实施方案中，方法包括用激光器辐照声光装置。感兴趣的激光器可以包括脉冲激光器或连续波激光器。主题方法中使用的激光器的类型和数量可以变化，并且可以是气体激光器，如氦氖激光器、氩激光器、氪激光器、氙激光器、氮激光器、CO2激光器、CO激光器、氩氟(ArF)准分子激光器、氪氟(KrF)准分子激光器、氙氯(XeCl)准分子激光器或氙氟(XeF)准分子激光器或其组合。在其他情况下，所述方法包括用染料激光器(如芪、香豆素或罗丹明激光器)辐照声光装置。在又其他情况下，方法包括用金属蒸汽激光器(如氦镉(HeCd)激光器、氦汞(HeHg)激光器、氦硒(HeSe)激光器、氦银(HeAg)激光器、锶激光器、氖铜(NeCu)激光器、铜激光器或金激光器及其组合)辐照声光装置。在仍其他情况下，方法包括用固态激光器(如红宝石激光器、Nd:YAG激光器、NdCrYAG激光器、Er:YAG激光器、Nd:YLF激光器、Nd:YVO4激光器、Nd:YCa4O(BO3)3激光器、Nd:YCOB激光器、钛蓝宝石激光器、铥YAG激光器、镱YAG激光器、三氧化二镱激光器或掺铈激光器及其组合)辐照声光装置。在仍其他情况下，方法包括用半导体二极管激光器、光泵浦半导体激光器(OPSL)或任何上述激光器的倍频或三倍频实现方式辐照声光装置。
取决于在输出激光束(例如，用于在辐照流动流中的样品中使用)中产生的所需光的波长，激光可以具有从200nm至1500nm(如从250nm至1250nm、如从300nm至1000nm、如从350nm至900nm并且包括从400nm至800nm)变化的特定波长。可以用一个或多个激光器(如2个或更多个激光器、如3个或更多个激光器、如4个或更多个激光器、如5个或更多个激光器并且包括10个或更多个激光器)辐照声光装置。激光器可以包括激光器的类型的任何组合。例如，在一些实施方案中，所述方法包括用激光器阵列(如具有一个或多个气体激光器、一个或多个染料激光器和一个或多个固态激光器的阵列)辐照声光装置。
在采用多于一个激光器的情况下，可以用激光器同时地或顺序地或其组合地辐照声光装置。例如，可以用每个激光器同时地辐照声光装置。在其他实施方案中，用每个激光器顺序地辐照声光装置。在采用多于一个激光器顺序地辐照声光装置的情况下，每个激光器辐照声光装置的时间可以独立地是0.001微秒或更长时间(如0.01微秒或更长时间、如0.1微秒或更长时间、如1微秒或更长时间、如5微秒或更长时间、如10微秒或更长时间、如30微秒或更长时间并且包括60微秒或更长时间)。例如，方法可以包括用激光器辐照声光装置持续范围从0.001微秒至100微秒(如从0.01微秒至75微秒、如从0.1微秒至50微秒、如从1微秒至25微秒并且包括从5微秒至10微秒)的时间。在用两个或更多个激光器顺序地辐照声光装置的实施方案中，每个激光器辐照声光装置的持续时间可以相同或不同。
每个激光器辐照之间的时间段也可以变化，根据需要，独立地由0.001微秒或更长时间(如0.01微秒或更长时间、如0.1微秒或更长时间、如1微秒或更长时间、如5微秒或更长时间、如10微秒或更长时间、如15微秒或更长时间、如30微秒或更长时间并且包括60微秒或更长时间)的延迟分开。例如，每个光源辐照之间的时间段的范围可以从0.001微秒至60微秒(如从0.01微秒至50微秒、如从0.1微秒至35微秒、如从1微秒至25微秒并且包括从5微秒至10微秒)。在某些实施方案中，每个激光器辐照之间的时间段是10微秒。在声光装置被多于两个(即，3个或更多个)激光器顺序地辐照的实施方案中，每个激光器辐照之间的延迟可以相同或不同。
可以连续地或以离散的间隔辐照声光装置。在某些情况下，方法包括用激光器连续地辐照声光装置。在其他情况下，用激光器以离散的间隔辐照声光装置，如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒并且包括每1000毫秒或一些其他间隔辐照一次。
取决于激光器，可以从如0.01mm或更远、如0.05mm或更远、如0.1mm或更远、如0.5mm或更远、如1mm或更远、如2.5mm或更远、如5mm或更远、如10mm或更远、如15mm或更远、如25mm或更远并且包括50mm或更远变化的距离辐照声光装置。此外，角度或辐照也可以变化，范围从10°至90°(如从15°至85°、如从20°至80°、如从25°至75°并且包括从30°至60°，例如以90°角)。
在实施方案中，方法包括向声光装置施加射频驱动信号以产生角度偏转的激光束，并调整一个或多个射频驱动信号的振幅以产生包含具有预定强度分布的角度偏转的激光束的输出激光束。可以向声光装置施加两个或更多个射频驱动信号(如3个或更多个射频驱动信号、如4个或更多个射频驱动信号、如5个或更多个射频驱动信号、如6个或更多个射频驱动信号、如7个或更多个射频驱动信号、如8个或更多个射频驱动信号、如9个或更多个射频驱动信号、如10个或更多个射频驱动信号、如15个或更多个射频驱动信号、如25个或更多个射频驱动信号、如50个或更多个射频驱动信号并且包括100个或更多个射频驱动信号)，以产生具有所需数量的角度偏转的激光束的输出激光束。
由射频驱动信号产生的角度偏转的激光束各自具有基于所施加的射频驱动信号的振幅的强度。在实施方案中，方法包括施加射频驱动信号，其具有足以产生具有所需强度的角度偏转的激光束的振幅。在一些实施方案中，每个所施加的射频驱动信号独立地具有从约0.001V至约500V(如从约0.005V至约400V、如从约0.01V至约300V、如从约0.05V至约200V、如从约0.1V至约100V、如从约0.5V至约75V、如从约1V至50V、如从约2V至40V、如从3V至约30V并且包括从约5V至约25V)的振幅。在一些实施方案中，每个所施加的射频驱动信号具有从约0.001MHz至约500MHz(如从约0.005MHz至约400MHz、如从约0.01MHz至约300MHz、如从约0.05MHz至约200MHz、如从约0.1MHz至约100MHz、如从约0.5MHz至约90MHz、如从约1MHz至约75MHz、如从约2MHz至约70MHz、如从约3MHz至约65MHz、如从约4MHz至约60MHz并且包括从约5MHz至约50MHz)的频率。
如上所综述，来自声光装置的输出激光束包括角度偏转的激光束，每个角度偏转的激光束具有基于所施加的射频驱动信号的振幅的强度。在一些实施方案中，方法包括以足以产生具有角度偏转的激光束的输出激光束的方式向声光装置施加射频驱动信号，所述角度偏转的激光束具有所需强度分布。取决于输出激光器中角度偏转的激光束的数量，可以调整两个或多个角度偏转的激光束以具有相同的强度，如其中3个或更多个角度偏转的激光束具有相同的强度，如其中4个或更多个角度偏转的激光束具有相同的强度，如其中5个或更多个角度偏转的激光束具有相同的强度，如其中6个或更多个角度偏转的激光束具有相同的强度，如其中7个或更多个角度偏转的激光束具有相同的强度，如其中8个或更多个角度偏转的激光束具有相同的强度，如其中9个或更多个角度偏转的激光束具有相同的强度，如其中10个或更多个角度偏转的激光束具有相同的强度，并且包括其中25个或更多个角度偏转的激光束具有相同的强度。在其他实施方案中，输出激光器中具有不同强度的角度偏转的激光束的数量可以变化，如其中2个或更多个角度偏转的激光束具有不同的强度，如其中3个或更多个角度偏转的激光束具有不同的强度，如其中4个或更多个角度偏转的激光束具有不同的强度，如其中5个或更多个角度偏转的激光束具有不同的强度，如其中6个或更多个角度偏转的激光束具有不同的强度，如其中7个或更多个角度偏转的激光束具有不同的强度，如其中8个或更多个角度偏转的激光束具有不同的强度，如其中9个或更多个角度偏转的激光束具有不同的强度，如其中10个或更多个角度偏转的激光束具有不同的强度，并且包括其中25个或更多个角度偏转的激光束具有不同的强度。
在一些情况下，输出激光束中角度偏转的激光束的强度分布包括沿水平轴线从输出激光束的边缘到中心渐增的强度。在这些情况下，沿水平轴线，输出光束中心处的角度偏转的激光束的强度的范围可以是输出激光束边缘处的角度偏转的激光束的强度的从0.1％至约99％，如从0.5％至约95％、如从1％至约90％、如从约2％至约85％、如从约3％至约80％、如从约4％至约75％、如从约5％至约70％、如从约6％至约65％、如从约7％至约60％、如从约8％至约55％，并且包括沿水平轴线，输出激光束边缘处的角度偏转的激光束的强度的从约10％至约50％。在其他情况下，输出激光束中角度偏转的激光束的强度分布包括沿水平轴线从输出激光束的边缘到中心渐增的强度。在这些情况下，沿水平轴线，输出光束边缘处的角度偏转的激光束的强度的范围可以是输出激光束中心处的角度偏转的激光束的强度的从0.1％至约99％，如从0.5％至约95％、如从1％至约90％、如从约2％至约85％、如从约3％至约80％、如从约4％至约75％、如从约5％至约70％、如从约6％至约65％、如从约7％至约60％、如从约8％至约55％，并且包括沿水平轴线，输出激光束中心处的角度偏转的激光束的强度的从约10％至约50％。在仍其他情况下，输出激光束中角度偏转的激光束的强度分布包括沿输出激光束的水平轴线的高斯分布。在又其他情况下，输出激光束中角度偏转的激光束的强度分布包括沿水平轴线的顶帽强度分布。
在实施方案中，输出激光束中的角度偏转的激光束在空间上分开。取决于所施加的射频驱动信号和输出激光束的所需辐射分布，角度偏转的激光束可以分开0.001μm或更远(如0.005μm或更远、如0.01μm或更远、如0.05μm或更远、如0.1μm或更远、如0.5μm或更远、如1μm或更远、如5μm或更远、如10μm或更远、如100μm或更远、如500μm或更远、如1000μm或更远并且包括5000μm或更远)。在一些实施方案中，角度偏转的激光束沿输出激光束的水平轴线例如与相邻的角度偏转的激光束重叠。相邻的角度偏转的激光束之间的重叠(如束斑的重叠)可以是0.001μm或更多的重叠(如0.005μm或更多的重叠、如0.01μm或更多的重叠、如0.05μm或更多的重叠、如0.1μm或更多的重叠、如0.5μm或更多的重叠、如1μm或更多的重叠、如5μm或更多的重叠、如10μm或更多的重叠并且包括100μm或更多的重叠)。
在某些实施方案中，方法包括调整输出激光束的空间宽度，如沿输出激光束的水平轴线调整输出激光束的空间宽度。取决于所需输出激光束的大小，输出激光束的空间宽度可以增加0.001μm或更多(如0.005μm或更多、如0.01μm或更多、如0.05μm或更多、如0.1μm或更多、如0.5μm或更多、如1μm或更多、如5μm或更多、如10μm或更多、如100μm或更多、如500μm或更多、如1000μm或更多并且包括5000μm或更多)。在其他实施方案中，方法包括将输出激光束的空间宽度减小0.001μm或更多(如0.005μm或更多、如0.01μm或更多、如0.05μm或更多、如0.1μm或更多、如0.5μm或更多、如1μm或更多、如5μm或更多、如10μm或更多、如100μm或更多、如500μm或更多、如1000μm或更多并且包括5000μm或更多)。
为了调整输出激光束的空间宽度，在某些实施方案中，方法包括增加或减少在用激光器辐照期间施加到声光装置上的射频驱动信号的数量。在一些实施方案中，通过减少输出激光束中角度偏转的激光束的数量(如通过将角度偏转的激光束的数量减少1或更多，如2或更多、如3或更多、如5或更多、如10或更多、如25或更多并且包括100或更多)来减小输出激光束的空间宽度。在这些实施方案中，方法包括将所施加的射频驱动信号的数量减少1或更多(如2或更多、如3或更多、如5或更多、如10或更多、如25或更多并且包括100或更多)。在其他实施方案中，通过增加输出激光束中角度偏转的激光束的数量(如通过将角度偏转的激光束的数量增加1或更多，如2或更多、如3或更多、如5或更多、如10或更多、如25或更多并且包括100或更多)来增加输出激光束的空间宽度。在这些实施方案中，方法包括将所施加的射频驱动信号的数量增加1或更多(如2或更多、如3或更多、如5或更多、如10或更多、如25或更多并且包括100或更多)。
在某些实施方案中，方法包括将输出激光束分裂成第一分裂激光束和第二分裂激光束，所述第一分裂激光束具有来自输出激光束的第一组角度偏转的激光束，所述第二分裂激光束具有来自输出激光束的第二组角度偏转的激光束。在一些实施方案中，第一分裂激光束和第二分裂激光束是相同的，并且包括具有相同强度分布的相同数量的角度偏转的激光束。任何方便的光学调整设计(protocol)都可以用于分裂输出激光束，如分色镜或分束器。在这些实施方案中，方法还可以包括反转分裂激光束之一(即，第一分裂激光束或第二分裂激光束)，并光学地组合激光束以产生组合的输出激光束，其中反转的分裂激光束的角度偏转的激光束与非反转的分裂激光束的角度偏转的激光束重叠。任何方便的光学调整设计都可以用于反转分裂激光束，包括但不限于透镜、反射镜、棱镜(例如，道威棱镜)以及其他光学反转设计。如下面详细地描述的，当反转的分裂激光束与非反转的分裂激光束组合时，每个重叠的角度偏转的激光束产生拍频，其是重叠的角度偏转的激光束的频率之间的差。
在一些实施方案中，方法包括用输出激光束(或上述组合的输出激光束)辐照流动流中的样品(例如，在流式细胞仪中)。在一些实施方案中，样品是生物样品。术语“生物样品”以其传统含义使用，指的是整个生物体、植物、真菌或动物组织、细胞或组成部分的子集，其在某些情况下可以在血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、支气管肺泡灌洗液、羊水、羊膜脐带血、尿液、阴道液和精液中发现。因此，“生物样品”指的是天然生物体或其组织的子集以及从生物体或其组织的子集制备的匀浆、裂解物或提取物，包括但不限于例如血浆，血清，脊髓液，淋巴液，皮肤、呼吸道、胃肠道、心血管道和泌尿生殖道的切片，泪液，唾液，乳汁，血细胞，肿瘤，器官。生物样品可以是任何类型的有机组织，包括健康和患病组织(例如，癌性的、恶性的、坏死的等)。在某些实施方案中，生物样品是液体样品，如血液或其衍生物(例如，血浆)或其他生物液体样品(例如，泪液、尿液、精液等)，其中在一些情况下样品是血液样品，包括全血，如从静脉穿刺或手指针刺获得的血液(其中在测定之前血液可以与或可以不与任何试剂(如防腐剂、抗凝血剂等)组合)。
在某些实施方案中，样品来源是“哺乳动物(mammal或mammalian)”，其中这些术语广泛用于描述属于哺乳动物纲的生物体，包括食肉动物目(例如，狗和猫)、啮齿目(例如，小鼠、豚鼠和大鼠)和灵长目(例如，人、黑猩猩和猴子)。在一些情况下，受试者是人。所述方法可以应用于从两种性别且处于任何发育阶段(即，新生儿、婴儿、幼年、青少年、成人)的人类受试者获得的样品，其中在某些实施方案中，人类受试者是幼年、青少年或成人受试者。虽然本发明可以应用于来自人类受试者的样品，但是应理解，所述方法也可以在来自其他动物受试者(即，“非人受试者”)(如但不限于鸟、小鼠、大鼠、狗、猫、牲畜和马)的样品上进行。
在某些实施方案中，生物样品含有细胞。可以存在于样品中的细胞包括真核细胞(例如，哺乳动物细胞)和/或原核细胞(例如，细菌细胞或古细菌细胞)。样品可以从体外来源(例如，来自培养中生长的实验室细胞的细胞悬浮液)或从体内来源(例如，哺乳动物受试者、人类受试者等)获得。在一些实施方案中，细胞样品从体外来源获得。体外来源包括但不限于原核(例如，细菌、古细菌)细胞培养物、含有原核和/或真核(例如，哺乳动物、protest、真菌等)细胞的环境样品、真核细胞培养物(例如，已建立的细胞系的培养物、已知或购买的细胞系的培养物、永生化细胞系的培养物、原代细胞的培养物、实验室酵母的培养物等)、组织培养物等。
在生物样品包括细胞的情况下，本公开的方法可以包括表征细胞的组分，如细胞片段、片段化细胞膜、细胞器、死细胞或裂解细胞。在一些实施方案中，方法包括表征细胞的细胞外囊泡。表征细胞的细胞外囊泡可以包括鉴定细胞中细胞外囊泡的类型或确定细胞中细胞外囊泡的大小。
可以连续地或以离散的间隔辐照流动流中的样品。在一些情况下，方法包括用光源连续地辐照流动流中的样品。在其他情况下，用光源以离散的间隔辐照流动流中的样品，如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒并且包括每1000毫秒或一些其他间隔辐照一次。
取决于光源，可以从如0.01mm或更远、如0.05mm或更远、如0.1mm或更远、如0.5mm或更远、如1mm或更远、如2.5mm或更远、如5mm或更远、如10mm或更远、如15mm或更远、如25mm或更远并且包括50mm或更远变化的距离辐照流动流中的样品。此外，角度或辐照也可以变化，范围从10°至90°(如从15°至85°、如从20°至80°、如从25°至75°并且包括从30°至60°，例如以90°角)。
流动流的流速可以变化(例如，取决于光的强度)，并且可以是1uL/min或更高(如2uL/min或更高、如3uL/min或更高、如5uL/min或更高、如10uL/min或更高、如25uL/min或更高、如50uL/min或更高、如75uL/min或更高、如100uL/min或更高、如250uL/min或更高、如500uL/min或更高、如750uL/min或更高并且包括1000uL/min或更高)。在某些实施方案中，主题方法中的流动流的流速范围从1uL/min至500uL/min(如从1uL/min至250uL/min、如从1uL/min至100uL/min、如从2uL/min至90uL/min、如从3uL/min至80uL/min、如从4uL/min至70uL/min、如从5uL/min至60uL/min并且包括从10uL/min至50uL/min)。在某些实施方案中，流动流的流速从5uL/min至6uL/min。
方法还包括检测来自流动流中的样品的光。检测到的光可以是侧向散射光、前向散射光、发射光或其组合。合适的光检测设计包括但不限于光学传感器或光电探测器，如有源像素传感器(APS)、雪崩光电二极管、图像传感器、电荷耦合装置(CCD)、增强型电荷耦合装置(ICCD)、发光二极管、光子计数器、辐射热测量计、热电探测器、光敏电阻、光伏电池、光电二极管、光电倍增管、光电晶体管、量子点光电导体或光电二极管及其组合以及其他光电探测器。在某些实施方案中，用电荷耦合装置(CCD)、半导体电荷耦合装置(CCD)、有源像素传感器(APS)、互补型金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器或N型金属氧化物半导体(NMOS)图像传感器测量来自粒子分选模块的样品询问区处的经辐照的流动流的光。在某些实施方案中，用电荷耦合装置(CCD)测量光。
在一些实施方案中，直接从流动流中的样品检测光(例如，前向散射光、侧向散射光、发射光等)。在其他实施方案中，来自流动流中的样品的光传播到具有一个或多个光学调整组件的检测器。“光学调整”意指根据需要改变来自流动流中的样品的光。例如，可以用光学调整组件来改变来自流中的样品的光的光束路径、方向、焦点或准直。在一些情况下，调整从流动流中的样品收集的光的尺寸，如将尺寸增加5％或更多(如10％或更多、如25％或更多、如50％或更多，并且包括将尺寸增加75％或更多)，或使光聚焦以减小光尺寸(如5％或更多、如10％或更多、如25％或更多、如50％或更多，并且包括将尺寸减小75％或更多)。在其他情况下，光学调整包括使光准直。术语“准直”以其传统含义使用，指的是光学地调整光传播的共线性或减小光偏离公用传播轴线的发散性。在一些情况下，准直包括缩小光束的空间截面。在某些实施方案中，光学调整组件是波长分离器。术语“波长分离器”在本文中以其传统含义使用，指的是用于将多色光分离成其分量波长的光学设计。根据某些实施方案，波长分离可以包括选择性地通过或阻挡多色光的特定波长或波长范围。感兴趣的波长分离设计包括但不限于有色玻璃、带通滤波器、干涉滤波器、分色镜、衍射光栅、单色器及其组合以及其他波长分离设计。在一些实施方案中，波长分离器是光学滤波器。例如，光学滤波器可以是具有范围从2nm至100nm(如从3nm至95nm、如从5nm至95nm、如从10nm至90nm、如从12nm至85nm、如从15nm至80nm)的最小带宽的带通滤波器，并且包括具有范围从20nm至50nm的最小带宽的带通滤波器。
在某些实施方案中，检测器在空间中与流动流中的样品分开地定位，并且来自流动流中的样品的光通过光学中继系统(如用光纤或自由空间光中继系统)传播到检测器。例如，光学中继系统可以是光纤光中继束，并且光通过光纤光中继束传送到检测器。可以采用任何光纤光中继系统将光传播到检测器。在某些实施方案中，用于将光传播到检测器的合适的光纤光中继系统包括但不限于光纤光中继系统，如美国专利号6,809,804中描述的那些，将所述专利的公开内容通过引用并入本文。在其他实施方案中，光学中继系统是自由空间光中继系统。短语“自由空间光中继”在本文中以其传统含义使用，指的是采用一个或多个光学组件的配置以通过自由空间将光引导至检测器的光传播。在某些实施方案中，自由空间光中继系统包括具有近端和远端的壳体，近端联接至检测器。自由空间中继系统可以包括不同光学调整组件的任何组合，如透镜、反射镜、狭缝、针孔、波长分离器中的一种或多种或其组合。例如，在一些实施方案中，感兴趣的自由空间光中继系统包括一个或多个聚焦透镜。在其他实施方案中，主题自由空间光中继系统包括一个或多个反射镜。在又其他实施方案中，自由空间光中继系统包括准直透镜。在某些实施方案中，用于将光传播到检测器的合适的自由空间光中继系统包括但不限于光中继系统，如美国专利号7,643,142、7,728,974和8,223,445中描述的那些，将所述专利的公开内容通过引用并入本文。
根据某些实施方案的方法还包括在一个或多个波长下(如在2个或更多个波长下、如在5个或更多个不同波长下、如在10个或更多个不同波长下、如在25个或更多个不同波长下、如在50个或更多个不同波长下、如在100个或更多个不同波长下、如在200个或更多个不同波长下、如在300个或更多个不同波长下)测量来自流动流中的样品的光，并且包括在400个或更多个不同波长下测量由流动流中的样品发射的光。在一些实施方案中，方法包括测量在一定波长范围(例如，200nm-1000nm)内收集的光。例如，方法可以包括在200nm-1000nm的一个或多个波长范围内收集光谱。在又其他实施方案中，方法包括测量在一个或多个特定波长下收集的光。例如，可以在450nm、518nm、519nm、561nm、578nm、605nm、607nm、625nm、650nm、660nm、667nm、670nm、668nm、695nm、710nm、723nm、780nm、785nm、647nm、617nm中的一个或多个及其任何组合处测量所收集的光。在某些实施方案中，方法包括测量对应于某些荧光团的荧光峰值波长的光的波长。
可以连续地或以离散的间隔测量所收集的光。在一些情况下，方法包括连续地测量光。在其他情况下，以离散的间隔测量光，如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒并且包括每1000毫秒或一些其他间隔测量一次。
在主题方法期间可以测量一次或多次(如2次或更多次、如3次或更多次、如5次或更多次并且包括10次或更多次)所收集的光。在某些实施方案中，测量2次或更多次光传播，其中某些情况下的数据被平均。
在某些实施方案中，方法还包括如用计算机进行数据采集、分析和记录，其中多个数据通道在样品穿过系统的检测区时记录来自样品的数据。在这些实施方案中，分析可以包括对细胞或细胞的组分(细胞外囊泡)进行分类和计数，使得每种组分作为一组数字化参数值存在。可以将主题系统设置成在所选参数上触发，以便将感兴趣的粒子与背景和噪声区分开。“触发”指的是用于检测参数的预设阈值，并且可以用作用于检测感兴趣的组分通过检测区的通道的手段。检测到超过所选参数阈值的事件会触发采集样品组分的数据。对于介质中导致低于阈值的响应的被测组分，不采集数据。
用于产生具有强度分布是预定的角度偏转的激光束的输出激光束的系统
如上所综述，本公开的方面包括配置用于产生具有强度分布是预定的两个或更多个角度偏转的激光束的输出激光束(例如，用于辐照流动流中的样品)的系统。在实施方案中，系统包括被配置成在流动流中传送样品的流动池、激光器、被配置成向声光装置施加射频驱动信号以产生角度偏转的激光束的射频发生器和具有带存储器的处理器的控制器，所述存储器可操作地联接至处理器，使得存储器具有存储在其上的指令，所述指令当由处理器执行时使得处理器调整一个或多个射频驱动信号的振幅，以产生具有强度分布是所需的角度偏转的激光束的输出激光束。
在实施方案中，主题系统包括一个或多个激光器。感兴趣的激光器可以包括脉冲激光器或连续波激光器。主题方法中使用的激光器的类型和数量可以变化，并且可以是气体激光器，如氦氖激光器、氩激光器、氪激光器、氙激光器、氮激光器、CO2激光器、CO激光器、氩氟(ArF)准分子激光器、氪氟(KrF)准分子激光器、氙氯(XeCl)准分子激光器或氙氟(XeF)准分子激光器或其组合。在其他情况下，所述方法包括用染料激光器(如芪、香豆素或罗丹明激光器)辐照声光装置。在又其他情况下，方法包括用金属蒸汽激光器(如氦镉(HeCd)激光器、氦汞(HeHg)激光器、氦硒(HeSe)激光器、氦银(HeAg)激光器、锶激光器、氖铜(NeCu)激光器、铜激光器或金激光器及其组合)辐照声光装置。在仍其他情况下，方法包括用固态激光器(如红宝石激光器、Nd:YAG激光器、NdCrYAG激光器、Er:YAG激光器、Nd:YLF激光器、Nd:YVO4激光器、Nd:YCa4O(BO3)3激光器、Nd:YCOB激光器、钛蓝宝石激光器、铥YAG激光器、镱YAG激光器、三氧化二镱激光器或掺铈激光器及其组合)辐照声光装置。在仍其他情况下，方法包括用半导体二极管激光器、光泵浦半导体激光器(OPSL)或任何上述激光器的倍频或三倍频实现方式辐照声光装置。
声光装置可以是被配置成使用所施加的声波来使激光频移的任何方便的声光设计。在某些实施方案中，声光装置是声光偏转器。主题系统中的声光装置被配置成从来自激光器的光和所施加的射频驱动信号产生角度偏转的激光束。可以用任何合适的射频驱动信号源(如直接数字频率合成器(DDS)、任意波形发生器(AWG)或电脉冲发生器)向声光装置施加射频驱动信号。
在实施方案中，控制器被配置成向声光装置施加射频驱动信号以在输出激光束中产生所需数量的角度偏转的激光束，如被配置成施加3个或更多个射频驱动信号(如4个或更多个射频驱动信号、如5个或更多个射频驱动信号、如6个或更多个射频驱动信号、如7个或更多个射频驱动信号、如8个或更多个射频驱动信号、如9个或更多个射频驱动信号、如10个或更多个射频驱动信号、如15个或更多个射频驱动信号、如25个或更多个射频驱动信号、如50个或更多个射频驱动信号)，并且包括被配置成施加100个或更多个射频驱动信号。
为了产生角度偏转的激光束在输出激光束中的强度分布，控制器被配置成施加具有如从约0.001V至约500V、如从约0.005V至约400V、如从约0.01V至约300V、如从约0.05V至约200V、如从约0.1V至约100V、如从约0.5V至约75V、如从约1V至50V、如从约2V至40V、如从3V至约30V并且包括从约5V至约25V变化的振幅的射频驱动信号。在一些实施方案中，每个所施加的射频驱动信号具有从约0.001MHz至约500MHz(如从约0.005MHz至约400MHz、如从约0.01MHz至约300MHz、如从约0.05MHz至约200MHz、如从约0.1MHz至约100MHz、如从约0.5MHz至约90MHz、如从约1MHz至约75MHz、如从约2MHz至约70MHz、如从约3MHz至约65MHz、如从约4MHz至约60MHz并且包括从约5MHz至约50MHz)的频率。
在某些实施方案中，控制器具有带存储器的处理器，所述存储器可操作地联接至处理器，使得存储器包括存储在其上的指令，所述指令当由处理器执行时使得处理器产生具有强度分布是所需的角度偏转的激光束的输出激光束。例如，存储器可以包括产生具有相同强度的两个或更多个(如3个或更多个、如4个或更多个、如5个或更多个、如10个或更多个、如25个或更多个、如50个或更多个)角度偏转的激光束的指令，并且包括存储器可以包括产生具有相同强度的100个或更多个角度偏转的激光束的指令。在其他实施方案中，存储器可以包括产生具有不同强度的两个或更多个(如3个或更多个、如4个或更多个、如5个或更多个、如10个或更多个、如25个或更多个、如50个或更多个)角度偏转的激光束的指令，并且包括存储器可以包括产生具有不同强度的100个或更多个角度偏转的激光束的指令。
在某些实施方案中，控制器具有带存储器的处理器，所述存储器可操作地联接至处理器，使得存储器包括存储在其上的指令，所述指令当由处理器执行时使得处理器产生这样的输出激光束，所述输出激光束沿水平轴线从输出激光束的边缘到中心具有渐增的强度。在这些情况下，沿水平轴线，输出光束中心处的角度偏转的激光束的强度的范围可以是输出激光束边缘处的角度偏转的激光束的强度的从0.1％至约99％，如从0.5％至约95％、如从1％至约90％、如从约2％至约85％、如从约3％至约80％、如从约4％至约75％、如从约5％至约70％、如从约6％至约65％、如从约7％至约60％、如从约8％至约55％，并且包括沿水平轴线，输出激光束边缘处的角度偏转的激光束的强度的从约10％至约50％。在其他实施方案中，控制器具有带存储器的处理器，所述存储器可操作地联接至处理器，使得存储器包括存储在其上的指令，所述指令当由处理器执行时使得处理器产生这样的输出激光束，所述输出激光束沿水平轴线从输出激光束的边缘到中心具有渐增的强度。在这些情况下，沿水平轴线，输出光束边缘处的角度偏转的激光束的强度的范围可以是输出激光束中心处的角度偏转的激光束的强度的从0.1％至约99％，如从0.5％至约95％、如从1％至约90％、如从约2％至约85％、如从约3％至约80％、如从约4％至约75％、如从约5％至约70％、如从约6％至约65％、如从约7％至约60％、如从约8％至约55％，并且包括沿水平轴线，输出激光束中心处的角度偏转的激光束的强度的从约10％至约50％。在又其他实施方案中，控制器具有带存储器的处理器，所述存储器可操作地联接至处理器，使得存储器包括存储在其上的指令，所述指令当由处理器执行时使得处理器产生这样的输出激光束，所述输出激光束具有沿水平轴线具有高斯分布的强度分布。在仍其他实施方案中，控制器具有带存储器的处理器，所述存储器可操作地联接至处理器，使得存储器包括存储在其上的指令，所述指令当由处理器执行时使得处理器产生沿水平轴线具有顶帽强度分布的输出激光束。
在实施方案中，系统被配置成在输出激光束中产生在空间上分开的角度偏转的激光束。取决于所施加的射频驱动信号和输出激光束的所需辐射分布，角度偏转的激光束可以分开0.001μm或更远(如0.005μm或更远、如0.01μm或更远、如0.05μm或更远、如0.1μm或更远、如0.5μm或更远、如1μm或更远、如5μm或更远、如10μm或更远、如100μm或更远、如500μm或更远、如1000μm或更远并且包括5000μm或更远)。在一些实施方案中，系统被配置成在输出激光束中产生这样的角度偏转的激光束，所述角度偏转的激光束沿输出激光束的水平轴线例如与相邻的角度偏转的激光束重叠。相邻的角度偏转的激光束之间的重叠(如束斑的重叠)可以是0.001μm或更多的重叠(如0.005μm或更多的重叠、如0.01μm或更多的重叠、如0.05μm或更多的重叠、如0.1μm或更多的重叠、如0.5μm或更多的重叠、如1μm或更多的重叠、如5μm或更多的重叠、如10μm或更多的重叠并且包括100μm或更多的重叠)。
在一些实施方案中，系统包括被配置成在流动流中传送样品的流动池。可以采用将流体样品传送到样品询问区的任何方便的流动池，其中在一些实施方案中，流动池包括限定纵向轴线的近端圆柱形部分和终止在具有横向于纵向轴线的孔口的平坦表面的远端截头圆锥形部分。近端圆柱形部分的长度(如沿纵向轴线测量的)可以变化，范围从1mm至15mm(如从1.5mm至12.5mm、如从2mm至10mm、如从3mm至9mm并且包括从4mm至8mm)。远端截头圆锥形部分的长度(如沿纵向轴线测量的)也可以变化，范围从1mm至10mm(如从2mm至9mm、如从3mm至8mm并且包括从4mm至7mm)。在一些实施方案中，流通池喷嘴室的直径可以变化，范围从1mm至10mm(如从2mm至9mm、如从3mm至8mm并且包括从4mm至7mm)。
在某些情况下，流动池不包括圆柱形部分，并且整个流动池内室是截头圆锥形的。在这些实施方案中，截头圆锥形内室的长度(如沿横向于喷嘴孔口的纵向轴线测量的)的范围可以从1mm至15mm(如从1.5mm至12.5mm、如从2mm至10mm、如从3mm至9mm并且包括从4mm至8mm)。截头圆锥形内室的近端部分的直径的范围可以从1mm至10mm(如从2mm至9mm、如从3mm至8mm并且包括从4mm至7mm)。
在一些实施方案中，样品流动流从流动池的远端处的孔口流出。取决于流动流的所需特性，流动池孔口可以是任何合适的形状，其中感兴趣的截面形状包括但不限于：直线截面形状，例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等；曲线截面形状，例如圆、椭圆；以及不规则形状，例如抛物线底部连接到平面顶部。在某些实施方案中，感兴趣的流动池具有圆形孔口。在一些实施方案中，喷嘴孔口的大小可以变化，范围从1μm至20000μm(如从2μm至17500μm、如从5μm至15000μm、如从10μm至12500μm、如从15μm至10000μm、如从25μm至7500μm、如从50μm至5000μm、如从75μm至1000μm、如从100μm至750μm并且包括从150μm至500μm)。在某些实施方案中，喷嘴孔口是100μm。
在一些实施方案中，流动池包括被配置成向流动池提供样品的样品注射端口。在实施方案中，样品注射系统被配置成向流动池内室提供合适的样品流。取决于流动流的所需特性，通过样品注射端口向流动池室输送样品的速率可以是1μL/min或更高(如2μL/min或更高、如3μL/min或更高、如5μL/min或更高、如10μL/min或更高、如15μL/min或更高、如25μL/min或更高、如50μL/min或更高并且包括100μL/min或更高)，其中在一些情况下，通过样品注射端口向流动池室输送样品的速率是1μL/sec或更高(如2μL/sec或更高、如3μL/sec或更高、如5μL/sec或更高、如10μL/sec或更高、如15μL/sec或更高、如25μL/sec或更高、如50μL/sec或更高并且包括100μL/sec或更高)。
样品注射端口可以是被定位在内室壁中的孔口，或者可以是被定位在内室近端处的导管。在样品注射端口是被定位在内室壁中的孔口的情况下，样品注射端口孔口可以是任何合适的形状，其中感兴趣的截面形状包括但不限于：直线截面形状，例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等；曲线截面形状，例如圆、椭圆等；以及不规则形状，例如抛物线底部连接到平面顶部。在某些实施方案中，样品注射端口具有圆形孔口。在某些情况下，样品注射端口孔口的大小可以根据形状而变化，具有范围从0.1mm至5.0mm(例如0.2至3.0mm、例如0.5mm至2.5mm、如从0.75mm至2.25mm、如从1mm至2mm并且包括从1.25mm至1.75mm，例如1.5mm)的开口。
在某些情况下，样品注射端口是被定位在流动池内室的近端处的导管。例如，样品注射端口可以是被定位成使样品注射端口的孔口与流动池孔口对齐的导管。在样品注射端口是被定位成与流动池孔口对齐的导管的情况下，样品注射管的截面形状可以是任何合适的形状，其中感兴趣的截面形状包括但不限于：直线截面形状，例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等；曲线截面形状，例如圆、椭圆；以及不规则形状，例如抛物线底部连接到平面顶部。导管的孔口可以根据形状而变化，具有范围从0.1mm至5.0mm(例如0.2至3.0mm、例如0.5mm至2.5mm、如从0.75mm至2.25mm、如从1mm至2mm并且包括从1.25mm至1.75mm，例如1.5mm)的开口。样品注射端口的尖端的形状可以与样品注射管的截面形状相同或不同。例如，样品注射端口的孔口可以包括斜尖，其具有范围从1°至10°(如从2°至9°、如从3°至8°、如从4°至7°)的斜角并且包括5°的斜角。
在一些实施方案中，流动池还包括被配置成向流动池提供鞘液的鞘液注射端口。在实施方案中，鞘液注射系统被配置成向流动池内室提供鞘液流，例如与样品结合以产生围绕样品流动流的鞘液的层压流动流。取决于流动流的所需特性，通过向流动池室输送鞘液的速率可以是25μL/sec或更高(如50μL/sec或更高、如75μL/sec或更高、如100μL/sec或更高、如250μL/sec或更高、如500μL/sec或更高、如750μL/sec或更高、如1000μL/sec或更高并且包括2500μL/sec或更高)。
在一些实施方案中，鞘液注射端口是被定位在内室壁中的孔口。鞘液注射端口孔口可以是任何合适的形状，其中感兴趣的截面形状包括但不限于：直线截面形状，例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等；曲线截面形状，例如圆、椭圆；以及不规则形状，例如抛物线底部连接到平面顶部。在某些情况下，样品注射端口孔口的大小可以根据形状而变化，具有范围从0.1mm至5.0mm(例如0.2至3.0mm、例如0.5mm至2.5mm、如从0.75mm至2.25mm、如从1mm至2mm并且包括从1.25mm至1.75mm，例如1.5mm)的开口。
在一些实施方案中，系统还包括与流动池流体连通的泵，以传送流动流通过流动池。可以采用任何方便的流体泵设计来控制流动流流过流动池。在某些情况下，系统包括蠕动泵，如具有脉冲阻尼器的蠕动泵。主题系统中的泵被配置成以适合于检测来自流动流中的样品的光的速率输送流体通过流动池。在一些情况下，流动池中的样品流的速率是1μL/min(微升/分钟)或更高(如2μL/min或更高、如3μL/min或更高、如5μL/min或更高、如10μL/min或更高、如25μL/min或更高、如50μL/min或更高、如75μL/min或更高、如100μL/min或更高、如250μL/min或更高、如500μL/min或更高、如750μL/min或更高并且包括1000μL/min或更高)。例如，系统可以包括泵，其被配置成使样品以范围从1μL/min至500μL/min(如从1uL/min至250uL/min、如从1uL/min至100uL/min、如从2μL/min至90μL/min、如从3μL/min至80μL/min、如从4μL/min至70μL/min、如从5μL/min至60μL/min并且包括从10μL/min至50μL/min)的速率流过流动池。在某些实施方案中，流动流的流速从5μL/min至6μL/min。
系统还包括用于检测来自流动流中的样品的光(例如，在流式细胞仪中)的一个或多个检测器。检测器可以被配置成检测侧向散射光、前向散射光、发射光或其组合。合适的光检测设计包括但不限于光学传感器或光电探测器，如有源像素传感器(APS)、雪崩光电二极管、图像传感器、电荷耦合装置(CCD)、增强型电荷耦合装置(ICCD)、发光二极管、光子计数器、辐射热测量计、热电探测器、光敏电阻、光伏电池、光电二极管、光电倍增管、光电晶体管、量子点光电导体或光电二极管及其组合以及其他光电探测器。在某些实施方案中，用电荷耦合装置(CCD)、半导体电荷耦合装置(CCD)、有源像素传感器(APS)、互补型金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器或N型金属氧化物半导体(NMOS)图像传感器测量来自粒子分选模块的样品询问区处的经辐照的流动流的光。在某些实施方案中，用电荷耦合装置(CCD)测量光。
系统还可以包括一个或多个光学调整组件。例如，系统可以包括透镜、反射镜、准直器、波长分离器(如有色玻璃)、带通滤波器、干涉滤波器、分色镜、衍射光栅、单色器等。在某些实施方案中，系统包括分束器和光学反相器，如用于沿水平轴线反转如上所述的输出激光束。在某些实施方案中，检测器在空间中与流动流中的样品分开地定位，并且来自流动流中的样品的光通过光学中继系统(如用光纤或自由空间光中继系统)传播到检测器。例如，光学中继系统可以是光纤光中继束，并且光通过光纤光中继束传送到检测器。可以采用任何光纤光中继系统将光传播到检测器。在某些实施方案中，用于将光传播到检测器的合适的光纤光中继系统包括但不限于光纤光中继系统，如美国专利号6,809,804中描述的那些，将所述专利的公开内容通过引用并入本文。在其他实施方案中，光学中继系统是自由空间光中继系统。短语“自由空间光中继”在本文中以其传统含义使用，指的是采用一个或多个光学组件的配置以通过自由空间将光引导至检测器的光传播。在某些实施方案中，自由空间光中继系统包括具有近端和远端的壳体，近端联接至检测器。自由空间中继系统可以包括不同光学调整组件的任何组合，如透镜、反射镜、狭缝、针孔、波长分离器中的一种或多种或其组合。例如，在一些实施方案中，感兴趣的自由空间光中继系统包括一个或多个聚焦透镜。在其他实施方案中，主题自由空间光中继系统包括一个或多个反射镜。在又其他实施方案中，自由空间光中继系统包括准直透镜。在某些实施方案中，用于将光传播到检测器的合适的自由空间光中继系统包括但不限于光中继系统，如美国专利号7,643,142、7,728,974和8,223,445中描述的那些，将所述专利的公开内容通过引用并入本文。
在某些实施方案中，主题系统是采用上述系统来产生具有强度分布是预定的两个或更多个角度偏转的激光束的输出激光束(例如，用于辐照流动流中的样品)的流式细胞术系统。用于分析样品的合适的流式细胞术系统和方法包括但不限于以下文献中描述的那些：Ormerod(编),Flow Cytometry:A Practical Approach,Oxford Univ.Press(1997)；Jaroszeski等人(编),Flow Cytometry Protocols,Methods in Molecular Biology第91期,Humana Press(1997)；Practical Flow Cytometry,第3版,Wiley-Liss(1995)；Virgo等人(2012)Ann Clin Biochem.1月；49(pt 1):17-28；Linden等人,Semin ThromHemost.2004年10月；30(5):502-11；Alison等人J Pathol,2010年12月；222(4):335-344；和Herbig等人(2007)Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.24(3):203-255；将所述文献的公开内容通过引用并入本文。在某些情况下，感兴趣的流式细胞术系统包括BDBiosciences FACSCantoTM流式细胞仪、BD Biosciences FACSVantageTM、BD BiosciencesFACSortTM、BD Biosciences FACSCountTM、BD Biosciences FACScanTM、和BD BiosciencesFACSCaliburTM系统、BD Biosciences InfluxTM细胞分选仪、BD Biosciences JazzTM细胞分选仪和BD Biosciences AriaTM细胞分选仪等。
在某些实施方案中，主题系统是这样的流式细胞仪系统，其并入了以下美国专利号中描述的流式细胞仪的一个或多个组件：3,960,449、4,347,935、4,667,830、4,704,891、4,770,992、5,030,002、5,040,890、5,047,321、5,245,318、5,317,162、5,464,581、5,483,469、5,602,039、5,620,842、5,627,040、5,643,796、5,700,692、6,372,506、6,809,804、6,813,017、6,821,740、7,129,505、7,201,875、7,544,326、8,140,300、8,233,146、8,753,573、8,975,595、9,092,034、9,095,494和9,097,640；将所述专利的公开内容通过引用并入本文。
如上所综述，本发明总体上涉及用于进行流式细胞术的方法和系统。如下面更详细地讨论的(特别是参考图1至图15)，在一些实施方案中，响应于向偏转器施加多个射频信号，使用声光偏转器来产生多个子光束，其共同形成激发光束。可以调整所施加的射频信号，以便改变子光束的某些特性，并且因此改变所得激发光束的相应特性。例如，如下面更详细地讨论的，可以调整射频信号的功率，以便沿其水平维度改变激发光束的强度。例如，可以使用这种变化来确保来自穿过光束的不同部分的等效粒子的基本均匀的光学响应。在一些实施方案中，可以调整所施加的信号的频率以使激发光束在空间上移动，以便跟踪流过流式细胞仪的流动池的样品流。
图1示意性地描绘了根据本发明的实施方案的流式细胞术系统10，其包括用于产生激光束LB的激光源12。举例来说，激光束的频率可以在约1000THz至约300THz的范围内，但是也可以采用其他频率。激光束的光束直径(例如，当采用高斯激光束时的束腰)可以例如在约0.1mm至约10mm的范围内。在不丧失一般性的情况下，在这个实施方案中，假定激光器在TEM00模式下操作以产生高斯光束。在其他实施方案中，可以采用其他光束强度分布。
反射镜14将激光辐射引导至声光偏转器16。在控制器20的控制下操作的射频(RF)发生器18(例如，直接数字频率合成器)可以向声光偏转器16同时施加多个射频驱动信号，以便产生可以共同形成激发光束的多个角度分开的子光束。驱动信号可以相对于彼此频移在约10MHz至约250MHz范围内(例如，在约50MHz至约150MHz范围内)的频率。在一些实施方案中，相邻的驱动信号之间的射频移位可以在约0.1MHz至约4MHz的范围内。在许多实施方案中，RF驱动信号在频率上等间隔，并且因此在本文称为RF频率梳。
举例来说，如图2示意性地所示，RF发生器可以向声光偏转器施加多个驱动信号RF1、…、RF8。激光束与每个RF驱动信号的相互作用可以导致激光束衍射成多个衍射级。如图1所示，在这个实施方案中，声光偏转器被这样配置，使得对于每个驱动信号，对应于-1衍射级的子光束朝向会聚透镜22传播(相应的零级子光束被光束挡板捕获)。
与驱动信号相关联的子光束在角度上彼此分开，并且在一些情况下部分地重叠。例如，图3示意性地描绘了多个这样的子光束BL1、…、BL9，每个子光束与图2中所示的驱动信号RF1、…、RF8之一相关联。在这个实施例中，相邻的子光束在空间上部分地重叠，并且子光束共同形成激发光束24，如图1所示，其在一个维度上具有细长的范围，所述维度在这个实施方案中被假定为水平方向。举例来说，光束沿水平方向相对于垂直方向的范围的比率(例如，基于半最大强度下的全宽度)可以大于约4。
每个子光束相对于激光束(LB)的频率频移对应于与该子光束相关联的驱动信号的RF频率的偏移频率。此外，子光束的强度可以基于驱动信号的电功率而变化。例如，图2中所示的驱动信号示出了驱动信号RF1和RF8的最大功率以及驱动信号RF5的最小功率。更具体地，在这个实施例中，驱动信号的功率从RF1的功率线性地减小到RF5的功率并且从RF5线性地增加到RF8。驱动信号功率的这种变化导致沿水平方向由那些驱动信号产生的子光束强度的相应变化。此类变化沿水平方向叠加在激光束的初始强度分布上，以提供沿水平维度呈现出所需强度变化的激发光束。
例如，参考图4，在这个实施方案中，图3中示意性地示出的子光束BL1、…、BL9的强度沿水平方向(由标记为HD的虚线示意性地示出)从子光束BL1的最大强度线性地变化到子光束BL5的最小强度，并且从子光束BL5的强度线性地增加到子光束BL9的强度。在这个实施例中，子光束强度的这种变化产生强度变化的激发束，其在其水平边缘处具有比在其中心处更高的强度。在这个实施例中，子光束沿垂直方向(由实线VD描绘)可以具有高斯强度分布，但是也可以使用其他强度分布。
控制器20可以调整施加到声光偏转器16上的驱动信号的功率(通过调节它们的幅度)，以便获得跨所得激发光束的水平维度的各种不同的强度变化。在一些情况下，如上述实施例，控制器20可以调整驱动信号的振幅(并且因此调整与每个驱动信号相关联的功率)，使得激发光束在其水平边缘处具有最大强度并且在其中心处具有最小强度。在其他实施方案中，可以调整驱动信号的振幅，以获得跨激发光束的水平维度的其他强度分布。例如，在一些情况下，跨激发光束的强度变化可以通过振荡变化来表征。在一些实施方案中，施加到声光偏转器上的RF信号的振幅可以在约0.1伏至约40伏的范围内变化。在一些实施方案中，驱动信号振幅的变化(并且因此驱动信号功率的变化)可以产生沿激发光束的至少一个维度(在这个实施方案中选择为水平维度)的在约0.1％至约99％范围内(例如，在约5％至约90％范围内、或在约10％至约80％范围内、或在约20％至约70％范围内)的最大光强变化。因此，激发光束沿水平维度的特定所需强度分布可以通过改变与施加到声光偏转器上的不同驱动信号相关联的电功率来数字地“拨入”。
如下面更详细地讨论的，在一些实施方案中，这种强度变化允许流过激发光束的边缘的粒子(例如，细胞)的更大激发，以抵消响应于激发而从那些粒子发出的辐射(例如，荧光发射)的较低收集效率，以便在流动池中在比使用传统的高斯或平顶分布激发激光光斑可能的空间范围更大的空间范围内检测来自被照射的等效粒子的基本均匀的光学响应。
再次参考图1，在这个实施方案中，激发光束24被会聚透镜22聚焦到流动池26中，以照射流过流动池的多个粒子。在这个示例性实施方案中，假定粒子沿垂直方向流出图的平面。被照射的粒子可以发射辐射(例如，通过荧光和/或散射)，其可以被检测和分析，如下面更详细地讨论的。
在这个实施方案中，前向散射辐射被透镜28聚焦到光电探测器30上并被检测。没有散射地穿过流动池的激发光束被光束挡板34捕获。带通滤波器32被放置在光电探测器30的前面，以允许激发激光波长的传输并拒绝其他波长。分析器36可以接收由光电探测器30产生的信号，并且可以处理那些信号以产生例如来自样品的前向散射信号。
在与前向散射方向正交的方向上，从粒子发出的辐射(例如，荧光和/或散射辐射)可以通过物镜38收集并经由透镜40聚焦到多模光纤42上，所述多模光纤从近端(PE)延伸到远端(DE)。更具体地，光纤42的近端(PE)被定位在透镜40的焦平面附近，以便有效地接收辐射(例如，散射和/或荧光辐射)。联接至光纤42的远端(DE)的出耦合(outcoupling)透镜44使离开光纤的辐射准直。
然后通过多个光电倍增管46、48、50和52检测经准直的辐射。更具体地，分色镜54将一部分辐射反射到光电倍增管46上并允许另一部分辐射通过下游分色镜56，下游分色镜56又将接收到的一部分辐射反射到光电倍增管50上并允许另一部分辐射通过另一个分色镜58，分色镜58又将接收到的一部分辐射反射到光电倍增管48上并允许其余辐射通过光电倍增管53。在这个实施方案中，多个带通滤波器46a、48a、50a和52a被分别放置在光电倍增管46、48、50和52的前面。
可以针对各种不同目的来选择带通滤波器。例如，在一些实施方案中，至少一个带通滤波器可以允许传输激光激发波长同时拒绝其他波长，以便于获得来自样品的侧向散射信号。此外，在一些实施方案中，可以选择一个或多个带通滤波器以允许荧光团通过荧光辐射，同时基本上阻挡其他辐射。在一些情况下，使用不同的带通滤波器(每个带通滤波器允许传输对应于不同荧光团的荧光辐射)，以便允许同时检测由与流过流动池的样品相关联的多个荧光团发射的荧光辐射。光电倍增管46、48、50和52响应于检测到入射在其上的辐射而产生信号。分析器36接收这些信号并处理它们以产生例如来自样品的侧向散射和/或荧光数据。例如，可以通过分析每个光电倍增管输出的电子脉冲的高度、宽度和面积来创建此数据。
举例来说，激发光束可以激发与流过流动池的样品相关联的一个或多个荧光团。样品可以包括例如夹带有多个细胞的流动的流体。在一些情况下，可以用一种或多种荧光标志物(荧光团)来标记细胞。荧光标志物的一些实例包括但不限于荧光蛋白(例如，GFP、YFP、RFP)、用荧光团(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白(APC))标记的抗体、核酸染色剂(例如，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、SYTO16、碘化丙啶(PI))、细胞膜染色剂(例如，FMI-43)和细胞功能染料(例如，Fluo-4、Indo-1)。在其他情况下，细胞中存在的内源荧光团可以用于引发来自细胞的荧光辐射。此类外源或内源荧光团响应于照射辐射而经历电子激发并发射荧光辐射(通常以比激发频率低的频率)，其被收集和分析。
如上所述，在这个实施方案中，激发光束沿其水平维度呈现出这样的强度变化，其特征在于光束边缘处的强度较高，而光束中心处的强度较低。因此，穿过激发光束的不同部分的粒子暴露于不同的激发强度。例如，如图5示意性地所示，穿过光束水平边缘的粒子A(例如，细胞)暴露于比穿过光束中心的粒子B更高的辐射强度。在一些实施方案中，这种强度变化可以被设计成基本上补偿与从穿过激发光束的边缘而不是它的中心的粒子发出的辐射相关联的较低的收集效率，例如在正交方向上(在一些情况下也被描述为“90度收集几何结构”)。此外，在一些情况下，这种强度变化可以改善由于例如光束边缘处的较低光束强度引起的粒子的不均匀激发。例如，在激发光束在水平方向上呈现出高斯强度分布的传统系统中，穿过光束的水平边缘的粒子暴露于较低的辐射强度。这又可以导致响应于与激发光束的相互作用而从这些粒子发出的较低强度的辐射(例如，散射和/或荧光辐射)。此外，从粒子发出的辐射的收集效率通常是不均匀的，其特征在于从穿过光束边缘的那些粒子发出的辐射的收集效率较低。这些因素可以导致随粒子穿过光束的水平位置(在本文称为z位置)变化的不均匀的光学灵敏度。
举例来说，图6A示意性地描绘了表示随粒子沿光束的水平位置变化的来自穿过激发光束的粒子的检测到的辐射的假设强度的曲线图，所述激发光束的特征在于沿水平方向的高斯强度分布。所述曲线图示出了不均匀的光学灵敏度，其特征在于相对于穿过光束的水平边缘的粒子，对于穿过光束中心的粒子灵敏度更高。相反，图6B示出了在使用例如如图2中所示的RF梳调整激发光束的强度之后从粒子检测到的假设辐射强度。图6B描绘了随粒子的水平激发位置变化的基本均匀的光学灵敏度。特别地，光束水平边缘处的较高强度可以补偿检测从穿过光束的水平边缘的那些粒子发出的辐射的较低的检测效率。例如，在一些实施方案中，对于穿过激发光束的不同部分的等效粒子，光学检测灵敏度可以变化小于约0.1％。
在一些实施方案中，不是在正交检测臂中使用多模光纤，可以使用从样品发出的辐射的自由空间传播来将辐射引导至光电倍增管。举例来说，图7示意性地描绘了根据这样的实施方案的流式细胞术系统10'，其类似于上面讨论的流式细胞术系统10，除了它采用自由空间光学检测在正交方向上从样品发出的辐射。更具体地，在这个实施方案中，物镜38收集从穿过激发光束的样品发出的辐射(例如，荧光和/或散射辐射)，并且透镜100通过反射镜102的反射将光束聚焦到针孔104上。透镜106使从针孔出来的光束准直，并且经准直的光束以上面所讨论的方式被引导至光电倍增管46、48、50和52。与前面的实施方案类似，前向散射辐射可以被透镜28聚焦到光电探测器30上。分析器36可以接收由光电探测器30和光电倍增管46、48、50和52产生的信号，并如上面所讨论分析那些信号。
在另一个方面，可以调整施加到声光偏转器上的RF驱动信号，以便改变激发光束的水平范围(宽度)。举例来说，控制器20可以改变施加到声光偏转器上的驱动信号的数量，以便加宽或缩短光束的水平范围。使用可变宽度RF频率梳激发不同的流速下的样品核心流，激发光束(激光光斑)可以集中在样品核心上而不会通过将其扩散到更大的区域来浪费激光功率以适应高样品流速和较大样品核心，正如在传统系统中所做的那样。
通过说明，图8A示出了通过向声光偏转器16施加三个RF驱动信号(在图8B中示意性地描绘)而产生的激发光束200(在本文也称为激光光斑)。激光光斑的宽度相对较小，因此适合于照射相对较窄的核心样品流，例如以相对较慢的样品流速流过流动池的核心样品流，例如以约1微升/分钟至约10微升/分钟范围内的速率，空间范围为约2微米直径至约10微米直径。
相反，图9A示出了通过向声光偏转器同时施加六个RF驱动信号(如图9B示意性地所示)而产生的激光光斑300，因此产生较宽的激光光斑(即，具有较大水平范围的激发光束)。这个激光束更适合于照射较宽的核心样品流，例如与通过流动池的样品的中等流速相关联的核心样品流，例如流速在约10微升/分钟至约50微升/分钟的范围内。图10A示出了与高样品流速(例如，流速在约50微升/分钟至约1000微升/分钟的范围内)相关联并具有较宽宽度的核心流。在这种情况下，通过向声光偏转器16施加十一个RF驱动信号(在图10B中示意性地示出)来产生用于照射核心流的激光光斑400，从而具有更接近地匹配样品流的宽度的更大水平范围。
以这种方式，使用驱动信号调整激发光束的大小(并且特别是其水平范围)允许使激发光束适应通过流动池的样品的不同流速。在一些实施方案中，激发光束的宽度可以变化至少约1000％(即，从最小值到最大值变化10倍)，例如在约200％至约500％的范围内。这种自适应照射使得能够使用较低功率的激光器以在需要时在较小的样品核心上实现较高的照射强度，从而减少了根据本教导的实施方案的流式细胞仪中对高功率激光器的需求。
此外，在每个这些实施例中，能以上面讨论的方式调整所施加的RF驱动信号的功率，以便调制激发光束的强度，使得它在其水平边缘处相对于其中心具有更大的强度。
在另一个方面，RF驱动信号可以用于调整激光激发光斑的空间位置以跟踪样品核心流。例如，参考图1或图7中的任何一个，如果样品核心流在流过流动池时在空间上随时间漂移，则分析器36可以通过例如荧光灵敏度或分辨率的损失来检测此类漂移。在这种情况下，控制器20可以从分析器接收指示核心流漂移的信号。控制器又可以使RF发生器调整驱动信号的绝对频率，例如通过直接数字地调整节频率或通过扫描RF梳发生器的时钟频率，以便使子光束在空间上移动并且因此使激发激光光斑在空间上移动以跟踪样品核心流。
参考图1和图7，控制器20和分析器36可以使用已知的组件和技术以各种不同的方式实现。例如，控制器和分析器中的任何一个可以使用本领域已知的技术并根据本教导以硬件、固件和/或软件实现。举例来说，图11示意性地描绘了分析器36的这种实现方式，其中模数转换器400接收由光电探测器30和/或一个或多个光电倍增管46、48、50和52产生的信号。信号可以存储在例如永久存储器402中。中央处理器(CPU)404可以控制分析器的操作。分析器还包括ROM(只读存储器)406和RAM(随机存取存储器)408。通信总线410便于分析器的各个组件之间的通信，包括CPU 404和其他组件之间的通信。可以使用存储器模块来存储用于分析所接收信号的指令。例如，在一些实施方案中，用于处理所接收数据的指令可以存储在ROM 406中。CPU可以采用那些指令对数字化的接收信号进行操作，以产生例如从样品检测到的信号的高度、宽度和面积测量值。CPU可以提供永久存储器402中的已处理信号的存储。另外，在一些实施方案中，可以采用现场可编程门阵列(FPGA)代替CPU来执行这些计算。
通过进一步说明，图12示意性地描绘了控制器20的示例性实现方式。在这种实现方式中，控制器20包括通信接口500，用于与RF发生器18通信以向发生器发送命令并从其接收数据。控制器还可以通过通信接口与分析器通信。举例来说，如上面所讨论，在一些情况下，控制器可以响应于从样品检测到的荧光辐射强度的变化从分析器接收指令，以使RF发生器改变驱动信号以使激光光斑在空间上移动，从而跟踪样品流。
控制器20还包括控制控制器、RAM 504、ROM 506和永久存储器508的操作的中央处理器(CPU)502。通信总线510便于控制器的不同组件之间的通信。在这种实现方式中，控制器还包括图形用户界面(GUI)512，其允许用户与控制器交互，例如配置控制器以指示RF发生器向声光偏转器施加所需模式的驱动信号。在一些实施方案中，用于由控制器执行某些任务的指令数据(例如，指示分析器响应于荧光强度的变化而改变驱动信号)可以存储在ROM506中，其可以被CPU访问。
在另一个方面，公开了当粒子与激光激发光束相互作用时采用粒子位置的拍频编码的方法和系统。粒子位置的这种频率编码可以与均衡的RF频率梳一起使用，以实现例如前向散射信号的均衡。
举例来说，图13示意性地描绘了根据本教导的另一个实施方案的流式细胞术系统600，其包括用于产生激光辐射束LB的激光器601，激光辐射束LB通过反射镜602反射被声光偏转器604接收。在控制器608的控制下操作的RF梳发生器606可以向声光偏转器施加RF驱动信号。如在前面的实施方案中那样，RF发生器606可以向声光偏转器同时施加多个RF驱动信号，以便产生多个子光束，例如每个子光束对应于激光束与由一个驱动信号产生的射频振荡的相互作用的-1衍射级。
图14A示意性地描绘了这样的多个子光束B1、…、B9，它们在空间上部分地重叠，并且共同形成激光激发光束610(图13中所示)。与前面的实施方案类似，可以调整RF驱动信号的功率，以便向形成激发光束的子光束赋予强度变化。举例来说，在这个实施方案中，RF驱动信号可以具有上面结合前一实施方案讨论的图10B中示意性地示出的RF功率的变化，这可以导致沿水平维度跨激光激发光束的强度变化。
每个子光束B1、…、B9具有相对于激发光束LB的光学频率移位与该子光束相关联的驱动信号的频率的光学频率。因此，子光束B1、…、B9可以分别具有光学频率f1、…、f9，每个光学频率相对于激光束LB的频率(f0)移位RF梳间距。因此，子光束B1、…、B9相对于彼此频移RF梳的频率间距，例如在约10MHz至约250MHz范围内(例如在约50MHz至约150MHz范围内、或在约0.1MHz至约4MHz范围内)的频移。在这种情况下，子光束之间的最大光学频移是f9-f1。
分束器612接收由多个子光束B1、…、B9组成的激发光束610，并且将所述光束分裂成两个传播光束611和612，每个传播光束是较低强度的光束612的拷贝。如图14B和图14C所示，光束611和612中的每一个分别包括多个子光束C1、…、C9和D1、…、D9，每个子光束沿水平维度显示出与子光束B1、…、B9的强度变化相对应的强度变化。此外，光束C1、…、C9和D1、…、D9具有对应于子光束B1、…、B9的光学频率的光学频率f1、…、f9。
光束612被反射镜614反射并被道威棱镜616接收。光束612通过道威棱镜616导致光束的水平反转。换句话说，道威棱镜616水平地反转光束612以产生经水平反转的光束618，其中子光束D1、…、D9的排序在空间上反转，如图14D所示，使得子光束D9形成经反转的光束618的左水平边缘，并且子光束D1形成经反转的光束的右边缘。经反转的光束618传播到光束组合器620，其将经反转的光束618与光束611组合，如下面所讨论。
特别地，光束611传播到反射镜622，其将光束611反射到光束组合器620上。光束611被光束组合器620反射，以叠加在穿过光束组合器620的经反转的光束611上，以形成组合激发光束624。这样配置光束组合器，使得光束611和618彼此叠加，使得形成两个光束的子光束在组合激发光束624中基本上成对地对准。更具体地，在组合激发光束624中，子光束D9、D8、D7、D6、D5、D4、D3、D2和D1分别叠加在子光束C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8和C9上。
会聚透镜626将组合激发光束聚焦到流动池628中，以便激发流过流动池的多个粒子(例如，细胞)。可以收集和分析响应于激发光束从粒子发出的辐射(例如，散射和/或荧光辐射)，如下面更详细地讨论的。
当粒子穿过通过两个子光束叠加形成的激发光束的一部分时，它暴露于光束的电场的叠加。因此，由粒子发射的辐射呈现出与那些子光束的光学频率之间的差相对应的拍频。举例来说并参考图15，由穿过激发光束的左水平边缘(其通过子光束D9和C1的叠加形成)的粒子A发射的辐射将呈现出与子光束D9和C1的频率之间的差相对应的拍频，即拍频为f9–f1。由穿过通过子光束D5和C5的叠加形成的激发光束中心的另一个粒子B发射的辐射将呈现出消失的拍频，当D5和C5的频率相同时。以这种方式，通过与由那些粒子发射的辐射相关联的RF拍频来编码粒子穿过激发光束的位置。如下面更详细地讨论的，在一些实施方案中，粒子位置的这种编码可以用于相对于光束强度的变化(例如，跨其水平方向)标准化由那些粒子发射的检测到的辐射的强度。
与前一实施方案类似，在这个实施方案中，激发光束的强度跨其水平维度变化，其中在其水平边缘处强度最大，而在其中心处强度最小。这种强度的变化可以补偿例如从穿过激发光束的水平边缘的那些粒子发射的辐射的较低检测效率。
再次参考图13，响应于它们与激发光束的相互作用，在正向方向上从粒子散射的辐射被透镜630聚焦到光电探测器632上。设置在光电探测器632前面的带通滤波器634允许激发波长的传输，同时阻挡不需要的波长。
在与正向方向正交的方向上从粒子发射的辐射(例如，散射和/或荧光辐射)被物镜636收集并被会聚透镜638聚焦到多模光纤640的近端(PE)上。出耦合透镜642使离开光纤640的辐射准直，并且多个分色镜644、646和648以上面结合前一实施方案讨论的方式将经准直的辐射分配到多个光电倍增管650、652、654和656上。此外，与前一实施方案类似，多个带通滤波器650a、652a、654a和656a分别设置在光电倍增管650、652、654和656的前面。可以选择带通滤波器以允许特定辐射波长通过光电倍增管，同时阻挡其他波长。
分析器660接收由光电探测器632和光电倍增器650、652、654和656产生的信号。分析器可以通过确定检测到的信号的频率成分来解码这些信号的RF编码。可以使用用于确定检测到的信号的频率成分的各种方法。此类合适方法的一些实例包括但不限于傅立叶变换、锁定检测、滤波、I/Q解调、零差检测和外差检测。
举例来说，可以将检测到的信号(例如，由光电探测器或一个光电倍增管检测到的信号)数字化，并且可以选择数字化信号的适当部分用于分析。可以执行所选数据的快速傅立叶变换(FFT)以确定检测到的信号的频率分量。在一些这样的实施方案中，FFT的仓(bin)可以对应于选择用于数据采集的频率。例如，对于256MHz采样速率，256个样品可以产生彼此分开1MHz(例如从DC到128MHz)的频率仓。FFT分析提供与检测到的信号中存在的拍频相对应的频率。可以例如通过获得该频率分量的实分量和虚分量的平方和的平方根来计算FFT数据中存在的每个频率分量的振幅的度量。
从检测到的信号中提取的每个拍频可以与从穿过通过具有等于该拍频的频率差的两个子光束的叠加形成的光束的一部分的粒子发射的辐射相关联。因此，检测到的信号的每个频率分量可以与沿激发光束的特定位置相关。当穿过流动池的粒子相同时，拍频振幅的变化可以指示沿激发光束的强度变化和/或辐射检测系统的效率相对于由流过光束的不同部分的粒子发射的辐射的差异。因此，可以利用拍频的振幅来计算地补偿此类变化，以便计算标准化的检测信号。使用由检测到的拍频编码的粒子的位置的知识结合该位置处的激发光束的光强的知识，可以通过将检测到的信号除以比例因子(例如，在标准化数据的查找表中)来标准化检测到的信号的强度。这个查找表可以通过在多个水平位置中测量当均匀参考粒子流过光束时来自流动的均匀参考粒子的信号强度来校准。可选地，可以通过相对于激发光束移动流动池而跨光束机械地扫描窄核心流(例如，宽度小于5微米)，使得穿过激发光束的粒子的横向位置是已知的，并且可以测量信号强度以用于校准目的。
这个实施方案中的控制器和分析器可以例如以上面结合前一实施方案中的控制器和分析器所讨论的方式实现。
计算机控制系统
本公开的方面还包括用于实践主题方法的计算机控制系统，其中所述系统还包括用于系统的完全自动化或部分自动化的一个或多个计算机，以便实施本文所述的方法。在一些实施方案中，系统包括计算机，所述计算机具有其上存储有计算机程序的计算机可读存储介质，其中该计算机程序当加载在计算机上时包括如下指令：用激光器辐照声光装置，同时向声光装置施加射频驱动信号以产生角度偏转的激光束，并调整一个或多个射频驱动信号的振幅以产生包含具有预定强度分布的角度偏转的激光束的输出激光束。输出激光束中的每个角度偏转的激光束具有基于每个所施加的射频驱动信号的振幅的强度。
在实施方案中，系统包括输入模块、处理模块和输出模块。在一些实施方案中，主题系统可以包括输入模块，使得关于以下项的参数或信息：声光装置(例如，声光偏转器)、激光器、射频驱动信号源(例如，直接数字合成器)、样品、所应用光源的强度和波长(离散或范围)、流动池直径、光通道数、检测区域数、光源辐照的持续时间、不同光源的数量、光源到流动通道的距离、任何光学调整组件的焦距、流动通道介质的折射率(如鞘液)、任何波长分离器的存在、波长分离器的特性(包括带通宽度、不透明度、光栅间距)以及光检测器的特性和灵敏度。
在处理模块执行了主题方法的一个或多个步骤之后，输出模块例如通过在监测器上显示或通过打印报告将结果传送给用户。
主题系统可以包括硬件和软件组件二者，其中硬件组件可以采用一个或多个平台的形式(例如，以服务器的形式)，使得功能元件，即执行系统的特定任务(如管理信息输入和输出、处理信息等)的那些元件可以通过在系统呈现的一个或多个计算机平台上和跨越所述一个或多个计算机平台执行软件应用程序来执行。
系统可包括显示器和操作员输入装置。操作员输入装置可以是例如键盘、鼠标等。处理模块包括处理器，所述处理器可以访问存储器，所述存储器上存储有执行主题方法的步骤的指令，所述步骤例如：用激光器辐照声光装置，同时向声光装置施加射频驱动信号以产生角度偏转的激光束，并调整一个或多个射频驱动信号的振幅以产生包含具有预定强度分布的角度偏转的激光束的输出激光束。
处理模块可包括操作系统、图形用户界面(GUI)控制器、系统存储器、存储器存储装置和输入-输出控制器、高速缓存存储器、数据备份单元以及许多其他装置。处理器可以是可商购的处理器，或可以是可用或将变得可用的其他处理器之一。处理器执行操作系统，并且操作系统以熟知的方式与固件和硬件接合，并且有助于该处理器协调和执行可以用各种编程语言来编写的不同计算机程序的功能，这些编程语言如Java、Perl、C++、其他高级或低级语言以及其组合，如本领域中已知的。操作系统通常与处理器配合来协调和执行计算机的其他组件的功能。操作系统还提供调度、输入-输出控制、文件和数据管理、存储器管理、以及通信控制和相关服务，所有这些都符合已知技术。
系统存储器可以是各种已知或未来的存储器存储装置中的任何一种。示例包括任何常用的可获得的随机存取存储器(RAM)、磁介质(例如驻留硬盘或磁带)、光学介质(例如读写光盘)、闪存装置或其他存储器存储装置。存储器存储装置可以是各种已知或未来的装置中的任何一种，包括压缩盘驱动器、磁带驱动器、可移动硬盘驱动器或软盘驱动器。这种类型的存储器存储装置通常从程序存储介质(未示出)读取和/或向其写入，所述程序存储介质例如分别是压缩盘、磁带、可移动硬盘或软盘。可以将这些程序存储介质中的任何一个或者现在正在使用的或者后期可以开发的其他程序存储介质认为是计算机程序产品。将理解，这些程序存储介质通常存储计算机软件程序和/或数据。计算机软件程序，也称为计算机控制逻辑，通常存储在与存储器存储装置结合使用的系统存储器和/或程序存储装置中。
在一些实施方案中，描述了一种计算机程序产品，包括计算机可用介质，所述计算机可用介质中存储有控制逻辑(计算机软件程序，包括程序代码)。当控制逻辑由处理器计算机执行时，使得处理器执行本文描述的功能。在其他实施方案中，一些功能主要在硬件中实施，例如，使用硬件状态机。为了执行本文描述的功能的硬件状态机实现对于相关领域技术人员将是清楚的。
存储器可以是在其中处理器可以存储和检索数据的任何合适的装置，例如磁性、光学或固态存储装置(包括磁盘或光盘或磁带或RAM，或任何其他合适的固定或便携装置)。处理器可以包括通用数字微处理器，其适当地从携带必要程序代码的计算机可读介质被编程。编程可以通过通信通道远程提供给处理器，或者先前使用与存储器相关的那些装置中的任一种保存在计算机程序产品(如存储器)或其他便携或固定计算机可读存储介质中。例如，磁盘或光盘可以进行编程，并且可以由磁盘写入器/读取器读取。本发明的系统还包括例如以计算机程序产品的形式(用于实践上述方法的算法)的编程。根据本发明的编程可以记录在计算机可读介质上，例如可以由计算机直接读取和访问的任何介质。此类介质包括但不限于：磁存储介质，例如软盘、硬盘存储介质和磁带；光存储介质，例如CD-ROM；电子存储介质，例如RAM和ROM；便携式闪存驱动器；和这些类别的混合物，如磁/光存储介质。
处理器还可以访问通信通道以与远程位置的用户通信。远程位置意味着用户不直接与系统接触，并将输入信息从外部装置(例如连接到广域网(“WAN”)、电话网络、卫星网络或任何其他合适的通信通道的计算机(包括移动电话，即智能手机))转发至输入管理器。
在一些实施方案中，根据本公开的系统可以被配置为包括通信接口。在一些实施方案中，通信接口包括用于与网络和/或另一装置通信的接收器和/或发送器。通信接口可以被配置成用于有线或无线通信，包括但不限于频率(RF)通信(例如，射频识别(RFID)、Zigbee通信协议、WiFi、红外、无线通用串行总线(USB)、超宽带(UWB)、通信协议和蜂窝通信(例如码分多址(CDMA)或用于移动通信的全球系统(GSM))。
在一个实施方案中，通信接口被配置成包括一个或多个通信端口，例如物理端口或接口，诸如USB端口、RS-232端口或任何其他合适的电连接端口，以允许主题系统与其他外部装置(例如计算机终端(例如，在医生办公室或医院环境中)，其被配置成用于类似的补充数据通信)之间的数据通信。
在一个实施方案中，通信接口配置成用于红外通信、通信或任何其他合适的无线通信协议，以使得在管理健康病症例如HIV、AIDS或贫血的治疗中主题系统能够与其他装置通信，所述其他装置例如计算机终端和/或网络、支持通信的移动电话、个人数字助理、或用户可结合使用的任何其他通信装置。
在一个实施方案中，通信接口被配置成利用因特网协议(IP)通过蜂窝电话网络、短消息服务(SMS)、到局域网(LAN)(其与因特网连接)上的个人计算机(PC)的无线连接、或经WiFi热点到因特网的WiFi连接来提供用于数据传输的连接。
在一个实施方案中，主题系统被配置成经由通信接口例如使用诸如802.11或RF协议或IrDA红外协议的通用标准与服务器装置无线地通信。服务器装置可以是另一种便携装置，例如智能电话、个人数字助理(PDA)或笔记本电脑；或更大的装置，例如台式计算机、用具等。在一些实施方案中，服务器装置具有显示器(例如液晶显示器(LCD))以及输入装置(例如按钮、键盘、鼠标、或者触摸屏)。
在一些实施方案中，通信接口被配置成使用上文所述的通信协议和/或机制中的一个或多个自动或半自动地将存储在主题系统中的数据(例如，在任选的数据存储单元中)与网络或服务器装置进行通信。
输出控制器可以包括用于各种已知显示装置中的任何一种的控制器，用于向用户(无论是人还是机器，无论是本地还是远程)呈现信息。如果显示装置之一提供视觉信息，则此信息通常可以在逻辑上和/或物理上组织为图像元素阵列。图形用户界面(GUI)控制器可以包括用于在系统与用户之间提供图形输入和输出接口以及用于处理用户输入的各种已知或未来的软件程序中的任何一种。计算机的功能元件可以通过系统总线相互通信。这些通信中的一些可以使用网络或其他类型的远程通信在替代实施方案中完成。输出管理器还可以根据已知技术将处理模块产生的信息提供给远程位置的用户，例如通过因特网、电话或卫星网络。输出管理器的数据呈现可以根据各种已知技术实现。作为一些示例，数据可以包括SQL、HTML或XML文档、电子邮件或其他文件、或者其他形式的数据。数据可以包括互联网URL地址，这样使得用户可以从远程来源中检索另外的SQL、HTML、XML或其他文档或数据。存在于主题系统中的一个或多个平台可以是任何类型的已知计算机平台或将来要开发的类型，但它们典型地是通常称为服务器的一类计算机。然而，它们也可以是主机计算机、工作站或其他计算机类型。它们可以通过任何已知或未来类型的电缆或其他通信系统(包括无线系统)连接，无论是联网还是其他方式。它们可以位于一处，也可以是物理上分开的。可以在任何计算机平台上采用各种操作系统，可能取决于所选择的计算机平台的类型和/或制造。适当的操作系统包括WindowsWindows XP、Windows 7、Windows 8、iOS、SunSolaris、Linux、OS/400、Compaq Tru64Unix、SGIIRIX、Siemens Reliant Unix等。
套件
本发明的方面还包括套件，其中套件包括如本文所述的以下项中的一者或多者：被配置成在流动流中传送样品的流动池、声光装置和光学调整组件(例如，分束器、诸如道威棱镜的光束反相器)。在一些实施方案中，套件还包括激光器。在某些情况下，套件可包括一种或多种测定组分(例如，标记的试剂、缓冲液等，例如上文所述)。在一些情况下，套件可以进一步包括样品收集装置，例如，根据需要，被配置成刺穿皮肤以获得全血样品的柳叶刀或针、移液管等。主题套件还可包括废物收集容器。
在一些实施方案中，套件包括流体化合物，如消化酶组合物或缓冲溶液。实例缓冲液可以包括但不限于PBS(磷酸盐)缓冲液、乙酸盐缓冲液、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)缓冲液、3-{[三(羟甲基)甲基]氨基}丙磺酸(TAPS)缓冲液、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、三(羟甲基)甲胺(Tris)缓冲液、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)缓冲液、3-[N-三(羟甲基)甲基氨基]-2-羟基丙磺酸(TAPSO)缓冲液、4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液、2-{[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TES)缓冲液、哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲液、二甲胂酸(二甲胂酸盐)缓冲液、盐水柠檬酸钠(SSC)缓冲液、2(R)-2-(甲基氨基)琥珀酸(琥珀酸)缓冲液、磷酸钾缓冲液、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)缓冲液、以及其他类型的缓冲溶液。在某些情况下，流体组合物是细胞计数级溶液。
在再其他实施方案中，套件包括标记试剂组合物。例如，标记试剂组合物可以是荧光团、发色团、酶、氧化还原标记、放射性标记、声学标记、拉曼(SERS)标签、质量标签、同位素标签、磁粒子、微粒子或纳米粒子、或其组合。在一些情况下，标记试剂包括标记的生物分子(例如多肽、核酸和多糖)，其被荧光团、发色团、酶、氧化还原标记、放射性标记、声学标记、拉曼(SERS)标签、质量标签、同位素标签、磁粒子、微粒子或纳米粒子、或其组合标记。
套件的各种测定组分可以存在于单独的容器中，或者可以将它们中的一些或全部预先组合。例如，在一些情况下，套件的一个或多个组件，例如每个检测器存在于密封袋例如无菌箔袋或封套中。
除了上述组件之外，主题套件还可以包括(在某些实施方案中)用于实践主题方法的说明书。这些说明书能以各种形式存在于主题套件中，其中的一种或多种可以存在于套件中。这些说明书可以存在的一种形式是作为打印在合适的介质或基片(例如，在其上打印信息的一张或多张纸)上、打印在套件的包装中、打印在包装插页等中的信息。这些指令的又另一种形式是其上已经记录了信息的计算机可读介质，例如软磁盘、光盘(CD)、便携式闪存驱动器等。这些指令可以存在的又另一种形式是可以在远离的地方经由因特网来获取信息的网址。
实用性
用于产生具有强度分布是预定的两个或更多个角度偏转的激光束(例如，用于辐照流动流中的样品)的输出激光束的主题方法、系统和计算机系统可用于需要分析并分选流体介质中样品(例如生物样品)中的粒子组分的各种应用中。本发明的实施方案可用于需要提供样品组成、细胞分选准确性和增强的亚粒子检测的改进分析的用途。
本发明的实施方案还可用于其中可能需要从生物样品制备的细胞用于研究、实验室测试或用于治疗的应用中。在一些实施方案中，主题方法和装置可以协助获得从靶流体或组织生物样品制备的单个细胞。例如，主题方法和系统协助从流体或组织样品中获得细胞，以用作癌症等疾病的研究或诊断样本。同样地，主题方法和系统可以协助从有待用于治疗的流体或组织样品中获得细胞。与传统的流式细胞术系统相比，本公开的方法和装置允许以提高的效率和低成本检测和收集来自生物样品(例如器官、组织、组织碎片、流体)的细胞。
尽管有附加条款，但本文所述的公开内容也由以下条款限定：
1.一种用于产生激发光束以用于在流式细胞术系统中使用的方法，其包括：
向声光装置中引入激光束，
向所述声光装置施加多个射频信号，以便产生多个部分重叠的角度偏转的光束，共同形成输出激发光束，并且
调整所述射频信号的振幅，使得所述输出激发光束呈现出所需的强度分布。
2.如条款1所述的方法，其中所述声光装置是声光偏转器。
3.如条款1所述的方法，其中所述强度分布的特征在于沿光束的水平维度的强度变化。
4.如条款3所述的方法，其中所述光束强度变化的特征在于从光束中心到其每个水平边缘的强度增加。
5.如条款4所述的方法，其中光束中心处的光束强度相对于各个所述水平边缘处的光束强度的变化值在约0.1％至约99％的范围内。
6.如条款3所述的方法，其中所述强度分布呈现出沿光束的垂直维度的高斯强度分布。
7.如条款3所述的方法，其中所述射频信号的振幅在约0.1伏至约40伏的范围内。
8.如条款1所述的方法，其中所述射频信号跨越约1MHz至约250MHz的频率范围。
9.如条款8所述的方法，其中所述射频信号以约0.1MHz至约4MHz范围内的频率彼此分开。
10.如条款1所述的方法，其中这样调整所述射频信号的振幅，使得偏转光束随着光束的偏转角度远离中心光束增加而呈现出渐增的强度。
11.一种流式细胞术系统，其包括：
流动池，多个粒子可以流过所述流动池，
激光器，其用于产生激光束，
声光装置，其接收所述激光束，
至少一个射频发生器，其用于向所述声光装置施加多个射频信号，以便产生多个部分重叠的角度偏转的光束，共同形成输出激发光束，以照射流过所述流动池的多个粒子，
控制器，其联接至所述至少一个射频发生器，用于调整所述射频信号的功率以便向所述激发光束赋予强度分布，所述强度分布的特征在于沿光束的至少一个维度的强度变化。
12.如条款11所述的流式细胞术系统，其还包括检测系统，所述检测系统用于检测响应于所述激发光束的照射从所述被照射的粒子发出的辐射。
13.如条款12所述的流式细胞术系统，其中可以这样配置所述强度分布，使得在其不同位置处与光束相互作用的等效粒子产生均匀信号。
14.如条款11所述的流式细胞术系统，其中所述强度分布的特征在于沿所述光束的水平维度的强度变化。
15.如条款14所述的流式细胞术系统，其中所述光束强度变化的特征在于从光束中心到其每个水平边缘的强度增加。
16.如条款14所述的流式细胞术系统，其中光束中心处的光束强度相对于各个所述水平边缘处的光束强度变化至少约50％。
17.如条款14所述的流式细胞术系统，其中所述强度分布呈现出沿光束的垂直维度的高斯强度分布。
18.如条款11所述的流式细胞术系统，其中所述控制器这样调整所述射频信号的功率，使得偏转光束随着光束的偏转角度远离中心光束增加而呈现出渐增的强度。
19.如条款11所述的流式细胞术系统，其中所述控制器通过将射频信号的振幅在约0.1伏至约40伏的范围内进行调整来调整射频信号的功率。
20.如条款11所述的流式细胞术系统，其中所述控制器控制所述射频发生器，以便产生多个射频信号，其以约0.1MHz至约4MHz范围内的频率彼此分开。
21.如条款11所述的流式细胞术系统，其还包括用于将所述激发光束输送到所述流动池的一个或多个激发光学器件。
22.如条款21所述的流式细胞术系统，其中所述一个或多个激发光学器件包括用于将所述激发光束聚焦到所述被照射的细胞上的至少一个透镜。
23.如条款21所述的流式细胞术系统，其中检测系统包括至少一个检测器和一个或多个检测光学器件，所述至少一个检测器和一个或多个检测光学器件相对于激发光束的传播方向以90度定位，以便响应于对所述检测器的照射而传输从被照射的细胞发出的辐射。
24.如条款11所述的流式细胞术系统，其中所述粒子包括多个细胞。
25.一种用于调整激发光束在流式细胞术系统中的强度分布的方法，其包括：
向声光装置中引入激光束，
向所述声光装置施加多个射频信号，以产生多个角度分开的输出光束，
调整所述射频信号的振幅，以获得所述角度分开的输出光束的所需强度。
26.如条款25所述的方法，其中所述声光装置是声光偏转器。
27.如条款25所述的方法，其中调整振幅的步骤包括将所述射频信号的rms振幅在约0.1伏至约40伏的范围内进行改变。
28.如条款25所述的方法，其中所述射频信号以约0.1MHz至约4MHz范围内的频率值分开。
29.如条款25所述的方法，其中所述角度分开的输出光束相对于彼此这样布置，以便共同形成用于照射流过所述流式细胞术系统的流动池的多个粒子的激发光束。
30.如条款29所述的方法，其中这样调整所述振幅，使得所述激发光束在其每个边缘处相对于其中心呈现出更高的强度。
31.如条款30所述的方法，其中在光束的每个边缘与中心之间的所述强度变化为至少约50％。
32.一种流式细胞术系统，其包括：
流动池，多个粒子可以流过所述流动池，
激光器，其用于产生激光束，
声光装置，其接收所述激光束，
至少一个射频发生器，其用于向所述声光装置施加多个射频信号，以产生多个角度偏转的子光束，所述多个角度偏转的子光束在频率上被所述射频信号分开并共同形成射频移位的激光束，
分束器，其用于将所述射频移位的激光束分裂成一对射频移位的分裂激光束，使得每个分裂光束包括由所述射频信号在频率上分开的多个角度偏转的子光束，
至少一个光学器件，其用于水平反转所述一对激光束中的一个激光束，
光学组合器，其用于将所述水平反转的光束与所述一对光束中的另一光束组合，使得水平反转的光束中的每个子光束至少部分地与所述一对光束中的另一光束中的至少一个子光束重叠，以便产生用于在粒子流过流动池时照射所述粒子的激发光束。
33.如条款32所述的流式细胞术系统，其还包括至少一个检测器，所述至少一个检测器用于检测响应于来自所述激发光束的激发从一个或多个所述粒子发出的前向散射辐射并产生检测信号。
34.如条款33所述的流式细胞术系统，其还包括分析器，所述分析器用于接收所述检测信号并提供检测信号的频率解复用，以便确定一个或多个拍频，其中每个拍频对应于所述激发光束中的一对至少部分重叠的子光束之间的频率差。
35.如条款34所述的流式细胞术系统，其中所述分析器进一步将所述一个或多个拍频与跨激发光束的空间位置相关联。
36.如条款35所述的流式细胞术系统，其中所述分析器基于激发光束中与检测到的前向散射信号的频率成分中存在的拍频相关联的空间位置来标准化所述前向散射信号的强度。
37.如条款32所述的流式细胞术系统，其还包括联接至所述至少一个射频发生器的控制器，用于调整所述射频信号的振幅，以便调整所述子光束的强度，使得所述射频调制的光束的强度沿水平维度变化。
38.如条款37所述的流式细胞术系统，其中所述射频信号在频率上相对于彼此以约10MHz至约250MHz范围内的频率移位。
39.一种调整激发光束在流式细胞仪中的空间位置的方法，其包括：
向声光偏转器中引入激光束，
向所述声光偏转器施加多个射频信号，以便产生多个部分重叠的角度偏转的光束，共同形成输出激发光束，
向流动池中引入激发光束以与流过流动池的样品流相互作用，
监测通过检测响应于与激发光束的相互作用从样品发出的辐射而产生的信号以检测样品流中的空间漂移(如果有的话)，
调整所述射频信号，以便调整激发光束在流动池中的空间位置，以便补偿检测到的样品流中的漂移。
40.如条款39所述的方法，其中调整射频信号的步骤包括调整所述射频信号的频率。
41.一种调整激发光束在流式细胞仪中的宽度的方法，其包括：
向声光偏转器中引入激光束，
向所述声光偏转器施加多个射频信号，以便产生多个部分重叠的角度偏转的光束，共同形成输出激发光束，并且
调整所述射频信号的数量，以便调整所述激发光束的宽度。
42.一种方法，其包括：
用激光器辐照声光装置；并且
向所述声光装置施加第一射频驱动信号和第二射频驱动信号，以产生第一角度偏转的激光束和第二角度偏转的激光束，
其中所述第一角度偏转的激光束具有基于施加的所述第一射频驱动信号的振幅的强度，并且所述第二角度偏转的激光束具有基于施加的所述第二射频驱动信号的振幅的强度；并且
调整所述第一射频驱动信号和所述第二射频驱动信号中的一者或多者的振幅以产生这样的输出激光束，所述输出激光束包括具有第一强度的所述第一角度偏转的激光束和具有第二强度的所述第二角度偏转的激光束。
43.如条款42所述的方法，其中所述方法包括向所述声光装置施加多个射频驱动信号以产生多个角度偏转的激光束，其中每个角度偏转的激光束具有基于施加的每个射频驱动信号的强度。
44.如条款42-43中任一项所述的方法，其中所述声光装置是声光偏转器。
45.如条款42-44中任一项所述的方法，其中所述角度偏转的激光束在空间上是分开的。
46.如条款45所述的方法，其中所述角度偏转的激光束至少部分地重叠。
47.如条款45-46中任一项所述的方法，其中所述角度偏转的激光束沿输出激光束中的水平轴线对齐。
48.如条款42-47中任一项所述的方法，其中输出激光束中的角度偏转的激光束中的两个或更多个具有相同的强度。
49.如条款42-47中任一项所述的方法，其中输出激光束中的角度偏转的激光束中的两个或更多个具有不同的强度。
50.如条款42-47中任一项所述的方法，其中输出激光束中的角度偏转的激光束沿水平轴线具有预定的强度分布。
51.如条款50所述的方法，其中所述强度分布包括沿水平轴线从输出激光束的中心到边缘渐增的强度。
52.如条款51所述的方法，其中沿水平轴线，在输出光束中心处的角度偏转的激光束的强度是在输出激光束边缘处的角度偏转的激光束的强度的从0.1％至约99％。
53.如条款50所述的方法，其中所述强度分布包括沿水平轴线从输出激光束的边缘到中心渐增的强度。
54.如条款50所述的方法，其中所述强度分布包括沿输出激光束的水平轴线的高斯分布。
55.如条款50所述的方法，其中输出激光束沿水平轴线具有顶帽强度分布。
56.如条款50所述的方法，其中输出激光束的每个角度偏转的激光束具有基本相同的强度。
57.如条款50所述的方法，其中所述强度分布包括沿水平轴线从输出激光束的第一边缘到输出激光束的第二边缘渐增的强度。
58.如条款50-57中任一项所述的方法，其中所述强度分布包括沿输出激光束的垂直轴线的高斯分布。
59.如条款42-58中任一项所述的方法，其中每个射频驱动信号独立地为从约1MHz至约250MHz。
60.如条款42-58中任一项所述的方法，其中每个射频驱动信号具有独立地为从约0.1伏至约40伏的振幅。
61.如条款42-60中任一项所述的方法，其还包括调整输出激光束的空间宽度。
62.如条款61所述的方法，其中调整输出激光束的空间宽度包括通过减少施加的射频驱动信号的数量来减小输出激光束的空间宽度。
63.如条款62所述的方法，其中调整输出激光束的空间宽度包括通过增加施加的射频驱动信号的数量来增加输出激光束的空间宽度。
64.如条款61-63中任一项所述的方法，其还包括：
用所述输出激光束辐照流动流中的样品；并且
检测来自所述流动流中的所述样品的光。
65.如条款64所述的方法，其还包括在一个或多个波长下测量检测到的光。
66.如条款64-65中任一项所述的方法，其中检测到的光是前向散射光、侧向散射光、透射光、发射光或其组合。
67.如条款64-66中任一项所述的方法，其还包括监测检测到的来自所述流动流中的所述样品的光，以检测所述输出激光束的空间漂移。
68.如条款67所述的方法，其还包括在检测到空间漂移时调整输出激光束在流动流上的空间位置。
69.如条款68所述的方法，其中调整空间位置包括调整所施加的射频驱动信号的频率。
70.如条款42-69中任一项所述的方法，其还包括从输出激光束产生第一分裂激光束和第二分裂激光束，所述第一分裂激光束包括第一组角度偏转的激光束，所述第二分裂激光束包括第二组角度偏转的激光束。
71.如条款70所述的方法，其中所述第一分裂激光束和所述第二分裂激光束包括一组相同的角度偏转的激光束。
72.如条款71所述的方法，其中所述角度偏转的激光束在数量、振幅和频率中的一个或多个方面是相同的。
73.如条款70-72中任一项所述的方法，其还包括：
反转所述第一分裂激光束；并且
将经反转的第一分裂激光束与所述第二分裂激光束在光学上组合以产生组合的输出激光束，
其中所述第一组角度偏转的激光束被反转并与所述第二组角度偏转的激光束重叠。
74.如条款70-73中任一项所述的方法，其还包括：
用组合的输出激光束辐照流动流中的样品；并且
检测来自所述流动流中的所述样品的光。
75.如条款74所述的方法，其还包括在一个或多个波长下测量检测到的光。
76.如条款74-75中任一项所述的方法，其中检测到的光是前向散射光、侧向散射光、透射光、发射光或其组合。
77.一种系统，其包括：
激光器；
声光装置；
射频发生器，其被配置成向所述声光装置施加第一射频驱动信号和第二射频驱动信号，以产生第一角度偏转的激光束和第二角度偏转的激光束，
其中所述第一角度偏转的激光束具有基于施加的所述第一射频驱动信号的振幅的强度，并且所述第二角度偏转的激光束具有基于施加的所述第二射频驱动信号的振幅的强度；并且
控制器，其包括带存储器的处理器，所述存储器可操作地联接至所述处理器，其中所述存储器包含存储在其上的指令，所述指令当由所述处理器执行时使得所述处理器调整所述第一射频驱动信号和所述第二射频驱动信号中的一者或多者的振幅以产生这样的输出激光束，所述输出激光束包括具有第一强度的所述第一角度偏转的激光束和具有第二强度的所述第二角度偏转的激光束。
78.如条款77所述的系统，其中所述射频发生器被配置成向所述声光装置施加多个射频驱动信号以产生多个角度偏转的激光束，其中每个角度偏转的激光束具有基于施加的每个射频驱动信号的强度。
79.如条款77-78中任一项所述的系统，其中所述声光装置是声光偏转器。
80.如条款77-79中任一项所述的系统，其中所述角度偏转的激光束在空间上是分开的。
81.如条款80所述的系统，其中所述角度偏转的激光束至少部分地重叠。
82.如条款77-81中任一项所述的系统，其中所述角度偏转的激光束沿输出激光束中的水平轴线对齐。
83.如条款77-81中任一项所述的系统，其中输出激光束中的角度偏转的激光束中的两个或更多个具有相同的强度。
84.如条款77-81中任一项所述的系统，其中输出激光束中的角度偏转的激光束中的两个或更多个具有不同的强度。
85.如条款77-81中任一项所述的系统，其中输出激光束中的角度偏转的激光束沿水平轴线具有预定的强度分布。
86.如条款85所述的系统，其中所述强度分布包括沿水平轴线从输出激光束的中心到边缘渐增的强度。
87.如条款86所述的系统，其中沿水平轴线，在输出光束中心处的角度偏转的激光束的强度是在输出激光束边缘处的角度偏转的激光束的强度的从0.1％至约99％。
88.如条款85所述的系统，其中所述强度分布包括沿水平轴线从输出激光束的边缘到中心渐增的强度。
89.如条款85所述的系统，其中所述强度分布包括沿输出激光束的水平轴线的高斯分布。
90.如条款85所述的系统，其中输出激光束沿水平轴线具有顶帽强度分布。
91.如条款85所述的系统，其中输出激光束的每个角度偏转的激光束具有基本相同的强度。
92.如条款85所述的系统，其中所述强度分布包括沿水平轴线从输出激光束的第一边缘到输出激光束的第二边缘渐增的强度。
93.如条款85-92中任一项所述的系统，其中所述强度分布包括沿输出激光束的垂直轴线的高斯分布。
94.如条款77-93中任一项所述的系统，其中每个射频驱动信号独立地为从约1MHz至约250MHz。
95.如条款77-94中任一项所述的系统，其中每个射频驱动信号具有独立地为从约0.1伏至约40伏的振幅。
96.如条款77-95中任一项所述的系统，其中存储器包括存储在其上的指令，所述指令当由处理器执行时使得处理器调整输出激光束的空间宽度。
97.如条款96所述的系统，其中调整输出激光束的空间宽度包括通过减少施加的射频驱动信号的数量来减小输出激光束的空间宽度。
98.如条款96所述的系统，其中调整输出激光束的空间宽度包括通过增加施加的射频驱动信号的数量来增加输出激光束的空间宽度。
99.如条款77-98中任一项所述的系统，其还包括：
流动池，其被配置为在流动流中传送样品；以及
检测器，其用于检测来自所述流动流中的所述样品的光。
100.如条款99所述的系统，其中所述检测器被配置成在一个或多个波长下测量检测到的光。
101.如条款99-100中任一项所述的系统，其中检测到的光是前向散射光、侧向散射光、透射光、发射光或其组合。
102.如条款99-101中任一项所述的系统，其中存储器包括存储在其上的指令，所述指令当由处理器执行时使得处理器监测检测到的来自流动流中的样品的光，以检测输出激光束的空间漂移。
103.如条款102所述的系统，其中存储器包括存储在其上的指令，所述指令当由处理器执行时使得处理器在检测到空间漂移时调整输出激光束在流动流上的空间位置。
104.如条款103所述的系统，其中存储器包括存储在其上的指令，所述指令当由处理器执行时使得处理器调整所施加的射频驱动信号的频率。
105.如条款77-104中任一项所述的系统，其还包括用于从输出激光束产生第一分裂激光束和第二分裂激光束的分束器，所述第一分裂激光束包括第一组角度偏转的激光束，所述第二分裂激光束包括第二组角度偏转的激光束。
106.如条款105所述的系统，其中所述第一分裂激光束和所述第二分裂激光束包括一组相同的角度偏转的激光束。
107.如条款106所述的系统，其中所述角度偏转的激光束在数量、振幅和频率中的一个或多个方面是相同的。
108.如条款105-107中任一项所述的系统，其还包括：
第一光学调整组件，其用于反转所述第一分裂激光束；以及
第二光学调整组件，其用于将经反转的第一分裂激光束与所述第二分裂激光束在光学上组合以产生组合的输出激光束，
其中所述第一组角度偏转的激光束被反转并与所述第二组角度偏转的激光束重叠。
虽然前述发明已经通过说明和举例的方式出于清楚理解的目的进行了相当详细的描述，但是本领域普通技术人员根据本公开传授的内容很容易明白可以在不背离所附权利要求的精神或范围的情况下对其进行某些改变和修改。
因此，前述内容仅说明了本发明的原理。将了解的是本领域技术人员将能够设计不同的安排，这些不同的安排虽然没有在此明确地描述或显示，但体现本发明的原理并且被包括在其精神和范围之内。另外，在此叙述的所有实例和条件性语言原则上旨在帮助读者理解本发明的原理，而不限于这些具体叙述的实例和条件。此外，本文叙述本发明的原理、方面和实施方案及其具体实施例的所有陈述旨在涵盖其结构等效物和功能等效物两者。另外，预期此类等效物包括当前已知的等效物以及将来开发的等效物两者，即所开发的执行相同功能的任何要素，而不考虑结构。因此，本发明的范围不旨在受限于本文示出和描述的示例性实施方案。相反地，本发明的范围和精神由所附权利要求书体现。
Claims (15)
1.一种方法，其包括：
用激光器辐照声光装置；并且
向所述声光装置施加第一射频驱动信号和第二射频驱动信号，以产生第一角度偏转的激光束和第二角度偏转的激光束，其中所述第一角度偏转的激光束具有基于施加的所述第一射频驱动信号的振幅的强度，并且所述第二角度偏转的激光束具有基于施加的所述第二射频驱动信号的振幅的强度；并且
调整所述第一射频驱动信号和所述第二射频驱动信号中的一者或多者的振幅以产生这样的输出激光束，所述输出激光束包括具有第一强度的所述第一角度偏转的激光束和具有第二强度的所述第二角度偏转的激光束。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括向所述声光装置施加多个射频驱动信号以产生多个角度偏转的激光束，其中每个角度偏转的激光束具有基于施加的每个射频驱动信号的强度。
3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述角度偏转的激光束在空间上分开并至少部分地重叠。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在所述输出激光束中的所述角度偏转的激光束具有预定的强度分布，所述预定的强度分布包括沿水平轴线从所述输出激光束的中心到边缘渐增的强度。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中每个射频驱动信号独立地为从约1MHz至约250MHz，并且每个射频驱动信号具有独立地从约0.1伏至约40伏的振幅。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其还包括调整所述输出激光束的空间宽度。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其还包括：
用所述输出激光束辐照流动流中的样品；并且
检测来自所述流动流中的所述样品的光。
8.如权利要求7所述的方法，其还包括监测检测到的来自所述流动流中的所述样品的光，以检测所述输出激光束的空间漂移。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其还包括：
从所述输出激光束产生第一分裂激光束和第二分裂激光束，所述第一分裂激光束包括第一组角度偏转的激光束，所述第二分裂激光束包括第二组角度偏转的激光束；
反转所述第一分裂激光束；并且
将经反转的第一分裂激光束与所述第二分裂激光束在光学上组合以产生组合的输出激光束，
其中所述第一组角度偏转的激光束被反转并与所述第二组角度偏转的激光束重叠。
10.一种系统，其包括：
激光器；
声光装置；和
射频发生器，其被配置成向所述声光装置施加第一射频驱动信号和第二射频驱动信号，以产生第一角度偏转的激光束和第二角度偏转的激光束，其中所述第一角度偏转的激光束具有基于施加的所述第一射频驱动信号的振幅的强度，并且所述第二角度偏转的激光束具有基于施加的所述第二射频驱动信号的振幅的强度；以及
控制器，其包括带存储器的处理器，所述存储器可操作地联接至所述处理器，其中所述存储器包含存储在其上的指令，所述指令当由所述处理器执行时使得所述处理器调整所述第一射频驱动信号和所述第二射频驱动信号中的一者或多者的振幅以产生这样的输出激光束，所述输出激光束包括具有第一强度的所述第一角度偏转的激光束和具有第二强度的所述第二角度偏转的激光束。
11.如权利要求10所述的系统，其中所述声光装置是声光偏转器。
12.如权利要求10-11中任一项所述的系统，其中所述控制器被配置成在所述输出激光束中产生具有预定的强度分布的角度偏转的激光束，所述预定的强度分布包括沿水平轴线从所述输出激光束的中心到边缘渐增的强度。
13.如权利要求10-12中任一项所述的系统，其还包括：
流动池，其被配置成在流动流中传送样品；以及
检测器，其用于检测来自所述流动流中的所述样品的光。
14.如权利要求10-13中任一项所述的系统，其还包括：
分束器，其用于从所述输出激光束产生第一分裂激光束和第二分裂激光束，所述第一分裂激光束包括第一组角度偏转的激光束，所述第二分裂激光束包括第二组角度偏转的激光束；
第一光学调整组件，其用于反转所述第一分裂激光束；以及
第二光学调整组件，其用于将经反转的第一分裂激光束与所述第二分裂激光束在光学上组合以产生组合的输出激光束，
其中所述第一组角度偏转的激光束被反转并与所述第二组角度偏转的激光束重叠。
15.如权利要求1-14中任一项所述的系统，其中所述存储器包含存储在其上的指令，所述指令当由所述处理器执行时使得所述处理器：
a)调整所述输出激光束的空间宽度；或
b)使得所述处理器监测检测到的来自所述流动流中的所述样品的光，以检测所述输出激光束的空间漂移，并且当检测到空间漂移时通过调整所施加的射频驱动信号的频率来调整所述输出激光束在所述流动流上的空间位置。
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