CN109468321A - 基于黑尾叶蝉actin基因启动子的昆虫细胞外源蛋白表达载体 - Google Patents

基于黑尾叶蝉actin基因启动子的昆虫细胞外源蛋白表达载体 Download PDF

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Abstract

本发明提供基于黑尾叶蝉actin基因启动子的昆虫细胞外源蛋白瞬时表达载体，所述启动子序列如SEQ ID NO.1所示。基于克隆扩增的启动子序列，通过改造pEGFP‑N1载体，成功构建了能够在叶蝉培养细胞系中瞬时表达外源蛋白的质粒载体,Nc_Hr5cyto‑GFP。将优化叶蝉肌动蛋白（Actin）基因的promoter，构建适合于介体叶蝉培养细胞的瞬时表达载体，为研究植物病毒的侵染机制开辟新的技术手段。

Description

基于黑尾叶蝉actin基因启动子的昆虫细胞外源蛋白表达 载体
技术领域
本发明属于生物技术，具体涉及基于黑尾叶蝉actin基因启动子的昆虫细胞外源蛋白瞬时表达载体。
背景技术
由于昆虫介体本身体积小，寿命短，各种器官组织非常精细复杂，而且很多病毒基因组结构复杂，目前尚不易得到侵染性克隆，不能利用反向遗传学的手段进行研究。这导致在昆虫个体中研究病毒基因功能非常困难。昆虫细胞系的出现为研究昆虫病毒提供了有力的平台。到目前为止, 全世界建立的昆虫细胞系有800多株, 分别来源于鳞翅目、双翅目、鞘翅目、蜚蠊目、膜翅目、直翅目、同翅目和半翅目等8个目的170多种昆虫, 然而其中大部分来自鳞翅目和双翅目, 来源于其他目的昆虫细胞系仅占1/10 左右(张寰等，2007)。很多昆虫细胞系已经商业化，例如果蝇的胚胎S2细胞系、草地贪夜蛾细胞 sf9/sf21细胞系和白纹伊蚊C6/36细胞株等。这些细胞系作为模式昆虫平台已广泛应用于研究动植物病毒侵染及其与介体昆虫的互作关系的基础科学研究。适应于植物病毒侵染的蚜虫、叶蝉、粉虱、蓟马和稻飞虱的原代和继代细胞体系也已建立（Adam et al., 1976; Kimura et al.,1988; Hunter et al., 1995; Hunter et al., 2001; Ma et al., 2013）。值得一提的是，近年来，申请人课题组已建立了适应于水稻病毒持久侵染的黑尾叶蝉、电光叶蝉、灰飞虱、白背飞虱及褐飞虱细胞系，成功用于研究水稻病毒的增殖机制与其介体昆虫的互作关系（Wei et al., 2006a, 2007, 2009; Ma et al., 2013; Chen et al., 2015）。
昆虫细胞系优势的发挥，离不开相应表达载体的应用。利用各种转染方法，通过表达载体在昆虫细胞内研究病毒蛋白的细胞定位及其与介体的互作，是深入研究病毒侵染机理必不可少的技术手段。每一种成熟的昆虫细胞系都有一套甚至几套与之相对应的瞬时表达系统，例如适于转染果蝇细胞系S2 的pAc5.1/V5-His/ pMT/BiP/V5 载体系统。高效的瞬时表达载体的开发和应用，能够极大的发挥昆虫细胞系的作用。如在无病毒其他蛋白干扰下研究病毒单个蛋白或者多个蛋白功能在介体细胞中的定位与功能，可深入研究病毒在介体细胞中的侵染机制。大多数瞬时表载体都是利用相应昆虫细胞内源基因的启动子（promoter）来转录目标基因的mRNA。例如pAc5.1/V5-His就是经过扩增优化了果蝇肌动蛋白（Actin） 基因的promoter（Angelichio et al., 1991）。这种载体系统的使用目前大多仅限于动物病毒侵染的细胞系。而适应于转染植物病毒的水稻介体昆虫-叶蝉和飞虱昆虫培养细胞的瞬时表达系统目前还没开发成功，这极大限制了植物病毒在介体细胞内侵染机制的研究。为此，本发明将优化叶蝉肌动蛋白（Actin）基因的promoter，构建适合于介体叶蝉培养细胞的瞬时表达载体，为研究植物病毒的侵染机制开辟新的技术手段。
发明内容
本发明的目的在于提供基于黑尾叶蝉actin基因启动子的昆虫细胞外源蛋白瞬时表达载体。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
黑尾叶蝉actin基因启动子，所述启动子序列如SEQ ID NO.1所示。
含所述的黑尾叶蝉actin基因启动子的昆虫细胞外源蛋白瞬时表达载体。
所述的昆虫细胞外源蛋白瞬时表达载体的构建方法，包括如下步骤：
（1） 瞬时表达载体构建：
以真核表达载体pEGFP-N1作为骨架，利用AseI / Xho I酶切删除已有的CMV的启动子序列；利用改造后的载体中的EcoRI / BamH I酶切位点将扩增的黑尾叶蝉actin基因启动子序列整合到载体中；构建得到以叶蝉Actin基因上游序列为启动子，以SV40病毒ployA区域作为终止子，表达绿色荧光蛋白的叶蝉细胞转染载体Nc_Cyto-GFP载体；
（2）瞬时表达载体优化：
在actin启动子5’段整合Hr5 增强子 (Hr5)序列，得到载体Nc_Hr5cyto-GFP，提高瞬时载体的转录效率。
具体方法如下，利用Nc_Cyto-GFP载体中的EcoRI酶切位点，将质粒线性化，利用引物F-Hr5:ATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCCGCGTAAAACACAATCAAGT及
R-Hr5:AAAAGCTTGGCGGCGTGAATTCACGCGTAGAATTCTACCCGTAA，以pIE1-LUC质粒（GenBank: AF434923.1）为模板，将质粒中的Hr5增强子序列扩增下来，并且通过Gibsonassembly的克隆方法，将Hr5增强子序列整合到Nc_Cyto-GFP载体中，最终构建成应用于黑尾叶蝉细胞表达外源蛋白的载体Nc_Hr5cyto-GFP。
本发明的优点在于：
目前已经已有昆虫培养细胞表达系统例如已经商业化的杆状病毒表达系统和其他质粒载体系统，都无法在黑尾叶蝉培养细胞中瞬时表达外源蛋白，这极大的阻碍了对黑尾叶蝉培养细胞的应用。该发明是目前为止，唯一能够在叶蝉培养细胞中表达外源蛋白的瞬时表达载体。通过我们对黑尾叶蝉actin基因promoter的克隆和质粒转染条件的优化，该载体能够在黑尾叶蝉培养细胞中顺利高效的表达外源蛋白。这为利用黑尾叶蝉培养细胞研究外源蛋白细胞定位和建立新的昆虫细胞蛋白表达系统提供了可能。
附图说明
图1为载体示意图。
图2载体在黑尾叶蝉细胞中的表达情况图。其中1为Nc_Hr5cyto-GFP转染黑尾细胞1天后GFP表达情况； 2为Nc_Hr5cyto-GFP转染黑尾细胞2天后GFP表达情况；3为Nc_Hr5cyto-GFP转染黑尾细胞3天后GFP表达情况。
具体实施方式
实施例1
（1）定位和克隆叶蝉Actin基因的启动子区域
由于叶蝉全基因组序列还没有公布，根据北京大学李毅老师提供的黑尾叶蝉Actin基因的5’端序列信息(GenBank: KU196665.1)，利用Berkeley Drosophila Genome Project预测启动子的核心区域和转录的起始位点。设计引物(F-Nc-cytoactin-EcoRI: GGGGAATTCACGCCGCCAAGCTTTTTCCATAT. R-Nc-cytoactin-BamHI: GGGGGATCCGGTGTTTCAATAAATTAACTGCAA)，通过PCR方法对黑尾叶蝉的基因组DNA进行扩增，回收2000bp条带，即为黑尾叶蝉actin基因启动子序列，序列如SEQ ID NO.1所示。
（2）叶蝉细胞瞬时表达系统的构建
① 瞬时表达载体构建：
以真核表达载体pEGFP-N1作为骨架，利用AseI / Xho I酶切删除已有的CMV的启动子序列，琼脂糖凝胶电泳回收载体片段。利用T4 DNA聚合酶反应将回收片段两端粘性末端补平，琼脂糖凝胶电泳回收T4 DNA聚合酶处理过的DNA片段，利用磷酸激酶PNK处理，将DNA片段两端磷酸化。通过T7 DNA连接酶将PNK酶处理过的片段自连，加入100μl 大肠杆菌感受态细胞中，42℃热解 1min，冰浴5min，加入400μl LB液体培养基，37℃摇床培育1h，取200μl转化后的大肠杆菌培养液涂到含有kan霉素（50mg/ml）的LB固体培养基上，37℃培养箱培养24h。挑选阳性菌落，摇菌扩繁质粒，质粒命名为pEGFP-N1-dCMV。利用EcoRI / BamH I酶切pEGFP-N1-dCMV质粒，琼脂糖凝胶回收载体片段备用。利用EcoRI / BamH I酶切 PCR扩增获得的actin基因启动子序列（序列如SEQ ID NO.1所示），并进行琼脂糖凝胶电泳回收。利用T7 DNA连接酶将改造后的载体叶蝉启动子序列整合到载体中。连接产物加入100μl 大肠杆菌感受态细胞中，42℃热解 1min，冰浴5min，加入400μl LB液体培养基，37℃ 摇床培育1h， 取200μl 转化后的大肠杆菌培养液涂到含有kan霉素的LB固体培养基上，37℃培养箱培养24h。挑选阳性菌落，摇菌扩繁质粒，构建得到以叶蝉Actin基因上游序列为启动子，以SV40病毒ployA区域作为终止子，表达绿色荧光蛋白的叶蝉细胞转染载体Nc_Cyto-GFP载体。
②瞬时表达载体优化：
为了进一步优化叶蝉的Actin promoter。在actin启动子5’段整合Hr5 增强子 (Hr5)序列，得到载体Nc_Hr5cyto-GFP，提高瞬时载体的转录效率。
具体方法如下：
利用Nc_Cyto-GFP载体中的EcoRI酶切位点，将质粒线性化。利用引物（F-Hr5:ATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCCGCGTAAAACACAATCAAGT
R-Hr5:AAAAGCTTGGCGGCGTGAATTCACGCGTAGAATTCTACCCGTAA），以pIE1-LUC质粒（GenBank: AF434923.1）为模板，将Hr5增强子序列扩增下来，并且通过Gibson assembly(Catalog #: E5510S)的克隆方法，将Hr5增强子序列整合到Nc_Cyto-GFP载体中，最终构建成应用于黑尾叶蝉细胞表达外源蛋白的载体Nc_Hr5cyto-GFP。
（3）叶蝉细胞瞬时表达载体转染黑尾叶蝉培养细胞
黑尾叶蝉细胞的实验室培养：
将长成单层的黑尾叶蝉细胞从25℃培养箱中取出，在超净工作台中，吸去瓶内的黑尾叶蝉细胞培养液（黑尾细胞制备和培养方法，参考文献Chen, H., Zheng, L., Jia, D.,Zhang, P., Chen, Q., Liu, Q., et al. (2013). Rice gall dwarf virusexploitstubules to facilitate viral spread among cultured insect vector cells derivedfrom leafhopperRecilia dorsalis. Frontiers in Microbiology 4, 206.），用台式液洗细胞2-3次，加入0.5%胰蛋白酶消化6-7分钟。加入新鲜培养液终止消化，轻轻吹打，制成细胞悬液，将细胞悬液平均分到无菌的玻璃片上，并向每个玻璃片上分别补足适量黑尾叶蝉细胞培养基，将含有叶蝉细胞的无菌玻璃片放入培养皿中，封口膜封闭，送回25°培养箱中，继续进行培养。每天光学显微镜下观察细胞生长状态，带细胞长满80%的玻璃片后，即可进行质粒转染。
载体转染黑尾叶蝉培养细胞：
将2μg Nc_Hr5cyto-GFP质粒加入12.5μl 黑尾叶蝉细胞培养液（无抗生素，无血清）中，混合均匀，静止15 min。同时将4μl 细胞转染试剂Cellfectin II （Thermo FisherScientific）加入12.5μl 黑尾叶蝉细胞培养液（无抗生素，无血清）中，混合均匀，静止15min。将含有Nc_Hr5cyto-GFP质粒和Cellfectin II的黑尾叶蝉细胞培养液混合在一起，搅拌均匀后，室温静止20 min。用含有Nc_Hr5cyto-GFP质粒和Cellfectin II的细胞培养液转染黑尾叶蝉培养细胞。避光转染6小时后，吸掉转染液，加入黑尾叶蝉细胞完全培养液。继续避光培养细胞3天。
共聚焦显微镜观察黑尾细胞中GFP蛋白表达情况：
将质粒转染后培养3天的细胞片取出，吸掉细胞培养液，用PBS缓冲液洗3遍。将细胞培养片，倒置于含有甘油的载玻片上，置于激光共聚焦显微镜下观察。
结果观察与分析：
在质粒转染1天后（1 dpi），大约只有1%的黑尾叶蝉细胞表达绿色荧光蛋白（GFP）。转染后2天，能够表达绿色荧光蛋白的细胞数目增多。在转染后3天表达GFP蛋白的细胞数目达到最大值，大约有10%的转染后的细胞含有GFP蛋白，这说明所构建actin基因启动子的瞬时表达载体能够在黑尾叶蝉培养细胞中成功高效的表达外源蛋白（图 2）。这也是世界上第一例，能够在黑尾叶蝉培养细胞中表达外源蛋白的载体。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 基于黑尾叶蝉actin基因启动子的昆虫细胞外源蛋白表达载体
<130> 5
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2011
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acgccgccaa gctttttcca tatatggtaa agtatgctgt cattggtccc ccccctcccg 60
agtgataggg tgatggaggg ggtaggaaga gctcatagag agagcttggt tataatataa 120
cctgtctgct agtgtgatcc ttagtctagt cgtgctaacc taacggtgca gttgtgtgca 180
tcactttgta tatattaagt tatttattta tgtaagttgg aaaatcatat cctttctagg 240
attaaaaagt gtttgtgctg tgccctatgg attaccaaca gtgataacta gctattgtgg 300
ttgtgtggct tctagtggtg tattcttttt tcccgaagtg gcttaagtgg ttaggattca 360
atatttttat tttttattga cagtaatttt agttattccc tgtagaaata tttactgaaa 420
atttgtaaaa tgtaattctc tgtttattga aattgaatta atcatttttt aattttaata 480
ttaattacct ccattaactt tgagccccaa aactaacagt tcttgctttg gtacagtgtg 540
ccaactgacc ttcaaaatct gtcattattg ttactaaact gacagattac ttttgcgagc 600
ttacattggt tttaaagatg actgggaaat taaatatcca cttatagcct acatgcactt 660
atgatgaaat tatgtaaact gtatacatga ttgcatacac ataagatatc atttctgtgc 720
tttggttaaa gttgtatact tatacctacc taattatata aaactggtta gaaaatatat 780
cctaaaacct cagtgtcaga tatcaatatt ttttattttg tgtatttcta caccagtggc 840
atttttaacg ttttgatggt tttaaagttt tgattaactt aggctttata tatattaacg 900
ctcaaaaccc cagattcaaa taaaaatcct taagttacat aggccttcat gaatcatatc 960
tgtattttgg ttcatatagg cctaggctac ctttgactgt tcaacacatg ttacttacac 1020
atttcattag ttttagtttt ataaccagat ccacgttaaa ctggaatctt cattaatctt 1080
aaacgttttt tataactcga tagtcaacaa attaatagat tttttaccag agacgagatt 1140
tccagtctat tgtaacaaaa attatcgtaa ggcctaccta aataattttt attgagtagt 1200
ttttacactt aaccacagta caccacaatc ttgttaaact tcaacttgca ccaaaatgtc 1260
taacttaaat ttttttgtat aggcctaggc ctatacatta actaacaatt taccctatag 1320
caataataaa ttccaatagc cattatcgag gacagctgtc acttttcatt aaggccctat 1380
ttatgtttgg gcatctcctg agaaaaagtt aattaatatt tgatgtacag gatattggtt 1440
aagcctcctg ttatttgtac cattacttaa accattacat ttcaaaatgt accataaaat 1500
tgtctgcaat ttatttctga agtttcaata ctgtagtcat gtaattgcag taaaatagta 1560
atctaaatat agtctgaagc caatatatat agtcagtttt tatatttggt agtaatatgg 1620
tcagtaagga cttaatcctg ctctattcag atcaaaaatt taaagtttga attattacct 1680
attttagtgc attaccgttc aattgccacc aaacttaaca ttgtagactg attttcttca 1740
tggctttcgt ggcgatttgg agtaattaag cgaatgaatt gtaaaaacta tgtattctgt 1800
tgaaaggcaa ttatgtcgga gtaattaagc gaatgaattg taaaaaacta tgggtattct 1860
gttgaaggca attatgtcgc atcaactgaa atataattat atttttaaat atatttataa 1920
aacttaggtt ttaagttgtt atttaacttg tttaaaaatt ctttattgat ttttttttgc 1980
agttaattta ttgaaacacc atgtgtgacg a 2011
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atctcgagct caagcttcga attccgcgta aaacacaatc aagt 44
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aaaagcttgg cggcgtgaat tcacgcgtag aattctaccc gtaa 44
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggggaattca cgccgccaag ctttttccat at 32
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gggggatccg gtgtttcaat aaattaactg caa 33

Claims (4)

1.黑尾叶蝉actin基因启动子，其特征在于：所述启动子序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种含有权利要求1所述的黑尾叶蝉actin基因启动子的昆虫细胞外源蛋白瞬时表达载体。
3.如权利要求1所述的昆虫细胞外源蛋白瞬时表达载体的构建方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
（1） 瞬时表达载体构建：
以真核表达载体pEGFP-N1作为骨架，利用Ase I / Xho I酶切删除已有的CMV的启动子序列；利用改造后的载体中的EcoRI / BamH I酶切位点将扩增的黑尾叶蝉actin基因启动子序列整合到载体中；构建得到以叶蝉Actin基因上游序列为启动子，以SV40病毒ployA区域作为终止子，表达绿色荧光蛋白的叶蝉细胞转染载体Nc_Cyto-GFP载体；
（2） 瞬时表达载体优化：
在actin启动子5’段整合Hr5 增强子序列，得到载体Nc_Hr5cyto-GFP，提高瞬时载体的转录效率。
4.根据权利要求1所述的昆虫细胞外源蛋白瞬时表达载体的构建方法，其特征在于，步骤（2）具体方法如下，利用Nc_Cyto-GFP载体中的EcoRI酶切位点，将质粒线性化，利用引物F-Hr5:ATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCCGCGTAAAACACAATCAAGT及R-Hr5:AAAAGCTTGGCGGCGTGAATTCACGCGTAGAATTCTACCCGTAA，以pIE1-LUC质粒为模板，将Hr5增强子序列扩增下来，并且通过Gibson assembly的克隆方法，将Hr5增强子序列整合到Nc_Cyto-GFP载体中，最终构建成应用于黑尾叶蝉细胞表达外源蛋白的载体Nc_Hr5cyto-GFP。
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