CN101792761A - 一种诱导增强型组织特异性启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。从水稻(Oryza Sativa L.)中分离并克隆了一种水稻抗褐飞虱基因的启动子(BPHP，即Bph14 Promoter)，其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，控制水稻抗褐飞虱基因在维管束组织特异表达，并能被褐飞虱取食诱导增强表达。启动子含有BS1EGCCR的顺式作用元件，使基因在植物维管束组织特异表达，同时还具有WRKY类转录因子结合的防御相关应答顺式作用元件，在褐飞虱取食或病原菌侵染时能增加基因表达。本发明可以作为维管束组织特异性表达的启动子使用，作为褐飞虱和病原菌诱导增强型启动子使用。

Description

一种诱导增强型组织特异性启动子及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种水稻抗褐飞虱基因启动子的分离鉴定和应用。该启动子被命名为BPHP(即Bph14 Promoter)，是维管束组织特异表达启动子，同时还受褐飞虱取食诱导增强表达。将其应用于研究基因在维管束组织的表达。特别是将其用于研究重要作物抗刺吸式害虫基因的遗传转化，达到提高植物抗虫性的目的。

背景技术

水稻是一种重要的粮食作物，世界上有超过一半的人以其为主食。但近几十年来水稻受到大面积的病虫危害，使水稻生产受到威胁。褐飞虱是我国水稻生产中的主要害虫，其成虫和若虫以口针刺吸水稻汁液，引起黄叶或枯死，导致减产或绝收。据中国农业年鉴记载，1966、1969、1973、1977、1983和2003年全国性大发生，1987、1991、2005、2006和2007年全国性特大发生，褐飞虱危害面积达到水稻总面积的50％以上，给我国水稻生产造成了严重的损失。由于褐飞虱的危害多发生在水稻成熟灌浆期，此时大量使用杀虫剂，对稻谷的污染也是非常严重的问题。利用抗褐飞虱基因培育抗虫水稻品种是褐飞虱综合防治中最为经济有效的方法。

水稻抗褐飞虱基因的研究始于上世纪70年代初。至今已命名了19个主效抗虫基因(具体综述见Zhang QF，2007 Strategies for developing greensuper rice.Proc.Natl Acad.Sci.USA.104，16402-16409)。其中，Mudgo、CO22和MTU15三份材料的抗性受到一个显性基因的控制，该基因被命名为Bph1，而另一个与Bph1紧密连锁的隐性基因bph2控制着ASD7的抗性。2001年黄臻和王布那等从药用野生稻(O.officinalis)的一个转育系中鉴定出两个新的显性抗褐飞虱基因Bph14和Bph15(Wang BN等，2001 Mappingof two new brown planthopper resistance genes from wild rice.Chinese.Sci.Bull.46，1092-1095，Huang Z等，2001Identification and mapping of twobrown planthopper resistance genes in rice.Theor.Appl.Genet.102，929-934)。带有褐飞虱基因的水稻，在褐飞虱取食水稻韧皮部汁液时，能在筛板形成胼胝质的堆积，抑制褐飞虱的取食和生长发育，从而达到抗虫的目的(HaoPY等，2008 Herbivore-induced callose deposition on the sieve plates of rice：an important mechanism for host resistance.Plant Physiol 146：1810-1820)。但是，至今仅克隆到一个水稻的抗褐飞虱基因Bph14。因此，关于抗褐飞虱基因启动子的功能，如是否存在表达特异性，是否受褐飞虱取食诱导等等，均不清楚。

本发明是鉴定了一个水稻抗褐飞虱基因的启动子。该启动子具有维管束组织表达的特异性，同时受褐飞虱取食诱导增强表达。通过启动子活性分析，将该启动子用于抗虫基因在水稻中的表达，从而有效的提高了水稻的抗虫性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有维管束组织表达特异性的植物内源启动子。

本发明的另一目的在于提供该启动子在制备转基因植物以及提高植物抗虫和/或抗病活性中的应用。

本发明启动子来源于抗褐飞虱水稻的基因组。通过分离水稻抗褐飞虱基因(Bph14)的启动子(BPHP，即Bph14 Promoter)，经研究发现，该启动子具有维管束组织特异性，同时还受褐飞虱取食诱导增强表达。

本发明启动子的核苷酸序列如SEQ.ID.No.1所示，序列全长2000个碱基。根据植株顺式调控元件数据库(PLACE)的搜索，本发明所提供的启动子区域含有多个组织特异性及植物防御相关顺式作用元件(如图1所示)。其中在18-23，25-30，1625-1630碱基位含有维管束表达相关的应答元件BS1EGCCR，在847-851，1080-1084，1869-1873和46-50，162-166，912-916，1196-1200位碱基含有WRKY类转录因子结合的防御相关应答顺式作用元件。

本发明技术人员应当理解根据SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，对其替换、缺失或增加一个或几个核苷酸，获得具有相同功能的核苷酸序列，例如，在非应答原件或作用原件，替换一个或几个碱基。本领域技术人员还可以根据SEQ ID No.1的序列获得具有控制基因维管束组织特异表达的DNA功能片段。因此，本发明所述的启动子还包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经替换、缺失或增加一个或几个核苷酸，且具有相同功能的核苷酸序列；以及由SEQ ID No.1产生的具有控制基因维管束组织特异表达的DNA功能片段。这种功能片段可以是能受褐飞虱取食或病原菌侵染诱导，增强基因表达。

本领域技术人员可以将本发明启动子用于构建组织特异表达的表达载体。此外还可以将目的基因可操作地连接到本发明的启动子之下，构建得到表达盒，进一步可将该表达盒导入植物表达载体，获得组织特异表达的重组表达载体。因此，本发明还包括由上述启动子构建的表达盒，以及含有上述表达载体或表达盒的表达载体或重组载体。

本发明启动子可以用于制备转基因植物。比如，通过农杆菌介导、基因枪法以及花粉管通道等方式获得转基因植物。从而可以通过引入抗虫、抗病等基因，培育出抗虫、抗病植物，提高植物抗虫和/或抗病活性。

在本发明实施例中，利用所述启动子BPHP构建成得到植物表达载体pCAMBIA1391z-BPHP(如图2所示)，通过农杆菌介导的遗传转化方法将所述载体转化水稻品种，可以在植物的维管束组织观察到报告基因GUS的表达(如图3所示)。

通过定量PCR技术，检测水稻抗褐飞虱基因Bph14受褐飞虱取食时的相对表达量，可以看到随着褐飞虱取食时间的增加，Bph14的表达量逐渐升高(如图4所示)。

本发明的优点和效果：

1.本发明的启动子为维管束组织特异表达，可以用于基因在维管束组织特异表达的研究。

2.刺吸式昆虫取食植物维管束汁液，而本发明的启动子为维管束组织特异表达，并受虫取食而增强表达。可以通过遗传转化培育抗刺吸式昆虫植物材料。

附图说明

图1.启动子序列，下划线序列为扩展启动子所用的引物序列，方框标识的碱基是维管束表达相关的应答元件BS1EGCCR，WRKY类转录因子结合的防御相关应答顺式作用元件下划线显示。

图2.表达载体pCAMBIA1391z-BPHP的物理图谱，该载体含有潮霉素抗性筛选基因，启动子被融合到GUS基因5’端非翻译区。

图3.GUS活性检测，图a、c、e分别为水稻根、叶鞘和叶片，图b、d、f分别为为根、叶鞘和叶片的横切面，图中蓝色为GUS在根、叶鞘和叶片的维管束区特异表达。标尺长度为100μm。

图4.定量PCR检测Bph14受褐飞虱取食的相对表达量。数据显示Bph14的表达量随褐飞虱取食时间的增加而增强。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：启动子的分离和鉴定

在克隆水稻抗褐飞虱基因Bph14时，发明人对该基因所在的抗虫水稻的基因组BAC克隆进行了测序，并用Bph14的cDNA序列搜索该区段的基因组序列，并选取该基因的转录起始位点上游2kb的范围作为候选启动子区域进行PCR扩增。设计引物：F(gaattctccacccgccgctcctgccc)和R(tctagatggaaggatcccctagagca)，下划线表示添加的限制性酶切位点。首先利用引物以水稻基因组DNA(CTAB法抽提，Zhang QF等，1992，Geneticdiversity and differentiation of indica and japonica rice detected by RFLPanaysis.Theor.Appl.Genet.83，495-499)为模板进行扩增，反应条件是：94℃2min；94℃15sec，58℃30sec，72℃2min，30个循环；72℃5min)。PCR产物回收后连入pGEM-T载体上，连接反应：PCR产物1μl，pGEM-T0.5μl，1U T4ligase，5×buffer 2μl，总10μl体积，4℃连接过夜；连接产物与大肠杆菌DH10B混匀，42℃热激90s，加400μl LB，复苏45分钟，取200μl涂于含氨苄霉素的LA平板，37℃，过夜。筛选阳性克隆并测序。结果证实扩增序列为预期的启动子序列。将该序列输入PLACE数据库，即给出了该启动子包含多个维管束组织特异性及防御相关应答顺式作用元件(图1)。

实施例2：启动子表达活性鉴定

本发明的实施方案就是构建启动子的GUS基因表达载体并转化到水稻品种，GUS显色及组织切片观察该启动子的组织特异表达活性。具体操作如下：

首先将实施例1中获得的含启动子的T载体扩大培养，抽提质粒，用EcoRI和XbaI酶切，反应体系总体积20μl：含启动子的T载体约5μl(1μg)、1×反应缓冲液、EcoRI和XbaI各0.5U，混匀后37℃酶切过夜，琼脂糖凝胶电泳回收所需片段。pCAMBIA1391z载体酶切体系同上，试剂盒纯化回收。将启动子片段连入pCAMBIA1391z载体，反应体系同上。通过酶切验证阳性克隆后电转农杆菌EHA105。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(Hiei等，1994，Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediatedby Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.PlantJournal 6：271-282)将基因组载体导入水稻品种。

将获得的转基因阳性植株的根、叶鞘和叶片分别进行GUS活性染色(Lagarde D等，1996，Tissue-specific expression of Arabidopsis AKT1 geneis consistent with a role in K⁺ nutrition.Plant J.9，195-203)。染色后材料在体视镜观察拍照后，用FAA固定，切片后在显微镜下观察(Hao PY等，2008Herbivore-induced callose deposition on the sieve plates of rice：an importantmechanism for host resistance.Plant Physiol 146：1810-1820)。

观察结果表明，主要在水稻根、叶鞘和叶片的维管束组织显示为蓝色(图3)。表明BPHP为维管束组织特异性表达的启动子。

实施例3：水稻抗褐飞虱基因Bph14受褐飞虱取食诱导增强表达

以含Bph14基因的抗褐飞虱水稻品种为材料。将种子播到直径9cm的塑料杯中。在4叶期，按每株植株8头虫，接入2-3龄的褐飞虱若虫，处理3、6、12、24、48、72和96小时。所有处理及未处理的对照在同一时间取样。用Invitrogen的TRIzol提取叶鞘的总RNA，再用Fermentas的RevertAid^TM first strand cDNA synthesis kit反转合成cDNA第一链。用ABIPRISM 7300对不同时间处理的材料的抗褐飞虱基因Bph14进行PCR检测。PCR的10ul反应体系加入了0.15ul的EvrGreen，反应条件是：94℃ 2min；94℃ 5sec，58℃ 10sec，72℃ 10sec，40个循环。以未处理材料的Bph14的表达量为1，对褐飞虱处理其他时间段材料的Bph14的表达量进行相对定量的计算(Lagarde D等，1996，Tissue-specific expression of Arabidopsis AKT1gene is consistent with a role in K⁺ nutrition.Plant J.9，195-203)。相对定量结果显示，Bph14的表达量随褐飞虱取食时间的延长而增强(图4)。

序列表

<110>武汉大学

<120>一种诱导增强型组织特异性启动子及其应用

<130>

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>2000

<212>DNA

<213>Oryza sativa

<400>1

tccacccgcc gctcctgccc gctgcccgct gcccgccggc ctccctgact gaagaagaga  60

agagagaaat taaagagaag agaaggagaa gaaaagagaa gagaagaaaa aaagatgtgt  120

agctgacatg tgggccccat gtactttttt attttttttg ctgactagaa tgccacgtca  180

gcgaaaccac ccatatatac tgtcatagga ccttgagtgc atagtttgtg tgagtttagg  240

gatacacatt tctcgttttg tagttaaggg acctcgtaaa aatctcgctg ttaagttgag  300

agacccctcc ggtgaactta ttcccccaaa tattttctcc atgctctggg ctcaaacgca  360

ctcttggatg ggccgtgtaa tctacaccat ttctggccca atccaacgaa ggtagctcca  420

gactcctaac tccgccgccg catgcccaat cctcgccggc cgccgctgcc atctcccttc  480

ccccaccgcc accgtcgcct tctccgttcc cccaacaaag gctcagtagc agcagccgcg  540

gcgcggagag cagaggcctt ggagggcctg cagaggagcg cccgcgtcga cgaagacgac  600

atcagcaggc agtggacatg gcgactgcga atgctatcgc cgacgtggga gcttcaggcg  660

aggatgcgtg gccttcatca gctgctgctc ccttacctgc tctggtttgt cattgtgttg  720

gttcgtggtt tggggatatc aggatgggga aggggaatgg gtttcgtgcc atgttgttct  780

attgtgcaat ttgatgttct cttgtcgaat ttcatggtga ttcaatctgc atctgtgtta  840

ttggttgtca agcaaacatt ttatttcttt cgagatgggt gtttcatctg aaattggtgt  900

gtctgatgat gtgaccttgt gcaaatcatt gtttcatttt cttctattcc acagagattt  960

ttttgtttag agtttattct accatcttct taccttttga atgctatgca ccacagattt  1020

ctgattttta cacattcaat cacagtgccg acccttggcg aatttaaaat tttctcaccg  1080

tcaaaattta atcaaacatc tgatctaaca gtagtagcgc cagcacggct ggtatttaag  1140

gcagaaagaa aggttgcgag ggcgaggagt tggtgatgat ctgccggtcg tgtcgtgact  1200

ttaggctata aaagatagct gtttggatta acccaaccaa tgaagcgaat catcgatggc  1260

cgatagcgag attatatcca actaatgaag agaatcaact ttaatctttt gtgagctaca  1320

agtttcgtgg tgaaggcata tactaatacc accatcatgg ctgcagcgaa tcaacgagat  1380

gcatttgtct tgcacatttc ccaccggata ctttgccatc catggcttta tctcctccat  1440

gattgtatcc ccttcttcct caacaaggaa cgatcgatca ttgtttgctt ctttctctga  1500

cgacactttg gtgcaagtga aaggctcttt cctggaactc gtcccgtgag ctccttcctg  1560

gctacatcct ccttaattcc ttgccgattt ccggcttcgt cttcactatc gtcagttcat  1620

ttctcccgct ctgcctgaga gtccagtttc ttggagatag tcgccggctt gctctctctc  1680

tctctctccc ttctcatcgc cagctccagc tcacaatccg agcttacgtg gtggaatcgc  1740

tatcgccacc tctcggaaga ttattgtact ttgccttgcc tacttcttga gtccgatcaa  1800

acacatccat catgcatctg tttgtacttg cattcagcca aacacttcca gtttaactcc  1860

gtccgcaagt caatacttgc attcaatttc catttcctac aaaagcagct gctcagactc  1920

ttgccttctc cacccagcaa tcgtgtttcc ttccctgtat cctgcgcgtg tgttcttagc  1980

tgctctaggg gatccttcca                                              2000

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gaattctcca cccgccgctc ctgccc    26

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tctagatgga aggatcccct agagca    26

Claims (7)

1.一种维管束组织特异表达启动子BPHP，其为：1)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；2)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经替换、缺失或增加一个或几个核苷酸，且具有相同功能的核苷酸序列；或3)由SEQ ID No.1产生的具有控制基因在维管束组织特异表达的DNA功能片段。

2.含有权利要求1所述启动子构建的表达盒。

3.含有权利要求1所述启动子的植物表达载体。

4.如权利要求3所述的表达载体，其为pCAMBIA1391z-BPHP。

5.权利要求1或2所述的启动子BPHP制备转基因植物中的应用。

6.权利要求1所述的启动子BPHP在培育抗虫、抗病植物中的应用。

7.权利要求1所述的启动子在提高植物抗虫和/或抗病活性中的应用。

Images