CN109456988A

CN109456988A - 变体硫酯酶及使用方法

Info

Publication number: CN109456988A
Application number: CN201811287276.7A
Authority: CN
Inventors: D·戴维斯
Original assignee: Kirbyn Biotech Corp
Current assignee: Kirbyn Biotech Corp; Corbion Biotech Inc
Priority date: 2013-01-29
Filing date: 2014-01-29
Publication date: 2019-03-12
Also published as: JP2016508717A; CN105164252A; EP2951294A1; US20140215654A1; AU2014212439A1; CA2899209A1; WO2014120829A1; BR112015017920A8; US9567615B2; KR20150113973A; BR112015017920A2; CN105164252B; MX2015009730A

Abstract

本发明涉及变体硫酯酶以及其在植物中的用途，例如，以增加酶活性并促进中链长度脂肪酸(例如8至14个碳)的增加的生产并处于所希望的比率。在此进一步披露的是通过生产新颖的甘油三酯油、随后将这些油进行化学修饰来生产可再生化学品的方法。还披露了包含脂肪酸链长度为C8、C10、C12或C14的油并且作为在此所描述的方法中的原料是有用的。

Description

变体硫酯酶及使用方法

本申请是申请日为2014年1月29日的、发明名称为“变体硫酯酶及使用方法”的中国专利申请201480018889.4(PCT/US2014/013676)的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请按35U.S.C.§119(e)要求2013年1月29日提交的美国临时申请号61/758,223的权益，并且是2013年3月12日提交的美国申请号13/797,733 的一个部分继续申请，出于所有目的将这两个文献通过引用以其全文结合在此。

领域

本发明涉及变体酰基-ACP硫酯酶以及其在产油细胞中的用途，例如以增加对某些酰基-ACP底物的酶活性并且促进增加具有所希望的脂肪酸谱的油的产生。

背景

当今，显著地除了通过微生物发酵商业生产ω-3脂肪酸用于在婴幼儿配方奶粉及营养补充剂中使用之外，脂肪和脂肪酸主要来自植物和动物来源。然而，在使用重组微藻商业生产定制油的方向上正取得进展。参见PCT公开案WO 2008/151149、WO 2010/06032、WO 2011/150410、WO 2011/150411、以及国际专利申请PCT/US 12/23696。

用于在产油生物中生产所希望的脂肪酸谱的一种方法是引入酰基-ACP硫酯酶转基因；例如来自产生所希望的脂肪酸的植物的转基因。

通过终止脂肪酸生物合成，该酰基-酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶(TE) 在功能性地决定了该脂肪酸最终产品的长度和同一性(萨拉斯(Salas)等人， (2002)《生物化学与生物物理集刊》(Archives of Biochemistry and Biophysics)403:25-34)。基于氨基酸序列比对，这些植物TE已经显示集群至两个家族：FatA，其显示显著的对于18:1-ACP的偏爱，它对于18:0-和 16:0-ACP具有较小活性；和FatB，其主要水解具有在8-16个碳之间变化的链长度的饱和酰基-ACP(尔克(Voelker)，在《基因工程》(Genetic Engineering)第18卷，由塞特洛(Setlow)JK，编辑纽约，纳姆出版社 (Plenum Press)；1996:111-133中；吉娜斯基(Ginalski)，等人，核酸研究(Nucl.Acids Res.)(2003)31:3291-3292；以及琼斯(Jones)，等人， (1995)《植物细胞》(Plant Cell)7:359-371)。FatB TE具有一个保守的疏水性18-氨基酸结构域(法茨乔蒂(Facciotti)和袁(Yuan)(1998)《欧洲脂质科学与技术杂志》(European Journal of Lipid Science and Technology) 100:167-172)，以及一个在C-末端催化结构域中的保守的Asn-His-Cys催化三联体(布拉蒂(Blatti)，等人，《公共科学图书馆·综合》(PLoS ONE) (2012)7(9):e42949.doi:10.1371以及迈尔(Mayer)和尚克林(Shanklin)，《BMC植物生物学》(BMC Plant Biology)(2007)7:1-11)。迈尔(Mayer) 和尚克林(Shanklin)，《BMC植物生物学》(BMC Plant Biology)(2007) 7:1-11，鉴定以包含Cys-His-Asn催化三联体的C-末端热狗式折叠(hot dog fold)为特征的C-末端保守的酰基-ACP硫酯酶催化结构域。该保守的酰基- ACP TE催化结构域是良好表征的并且已经被指定为保守结构域登录号 pfam01643。该热狗折叠也是良好表征的并且已经被指定为保守的结构域登录号cd03440并且属于指定为保守的结构域登录号cl00509的热狗超家族的一部分。

概述

在一个方面，提供了编码变体酰基-ACP硫酯酶的核酸分子，该核酸分子包括C-末端催化结构域和N-末端疏水结构域以及特异性结构域，其中该疏水结构域和/或该特异性结构域中的一个或多个与该催化结构域是异源的。通常，以该5′到3′方向阅读，N-末端疏水结构域、特异性结构域和催化结构域可操作地连接。在不同实施例中，这些结构域中的一个或多个可彼此邻接。

在一些实施例中，该核酸分子编码一种包括以下项的变体酰基-酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶(TE)：

i)来自一种C10:0酰基-ACP偏好型TE的特异性结构域和来自一种 C12:0酰基-ACP偏好型TE的催化结构域；

ii)来自一种C12:0酰基-ACP偏好型TE的特异性结构域和来自一种 C14:0酰基-ACP偏好型TE的催化结构域；

iii)来自一种C14:0酰基-ACP偏好型TE的特异性结构域和来自一种 C12:0酰基-ACP偏好型TE的催化结构域；

iv)来自一种C12:0酰基-ACP偏好型TE的特异性结构域和来自一种 C10:0酰基-ACP偏好型TE的催化结构域；

v)来自一种C10:0酰基-ACP偏好型TE的特异性结构域和来自一种 C8:0酰基-ACP偏好型TE的催化结构域；和/或

vi)来自一种C8:0酰基-ACP偏好型TE的特异性结构域和来自一种 C10:0酰基-ACP偏好型TE的催化结构域。

在一些实施例中，该核酸编码一种包括以下项的特异性结构域：

a)一种酰基-ACP-TE的对应于选自下组的氨基酸序列的氨基酸残基，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:43的氨基酸残基125-163；SEQ ID NO:44 的氨基酸残基125-163；SEQID NO:45的氨基酸残基152-190；SEQ ID NO:46 的氨基酸残基139-177；SEQ ID NO:47的氨基酸残基117-155；SEQ ID NO:60 的氨基酸残基158-196；以及SEQ ID NO:61的氨基酸残基156-194；

b)一种基序，该基序包括氨基酸序列 SI(V/L/E)(A/T)(V/L)MN(H/Y/M/I)(L/M/V/F)QE(T/A)(A/S/T)(L/I)N(H/Q)(A/V/C) (K/E/R)(S/I/T/N/C)(V/L/A/T/I/N)G(L/I)(L/S/M)(G/L/D/N/E)(D/N/E)G(F/L)G(T/E/ R/S/A)(T/S)(L/P/R)(E/G)M(S/Y/F/C/T)(K/R/L)(R/K/N/M)(D/G/N)L(M/I/F)；和/ 或

c)与选自下组的氨基酸序列至少60％的序列一致性，例如至少65％、 70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列一致性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:43的氨基酸残基125-163；SEQ ID NO:44 的氨基酸残基125-163；SEQ ID NO:45的氨基酸残基152-190；SEQ ID NO:46 的氨基酸残基139-177；SEQ ID NO:47的氨基酸残基117-155；SEQ ID NO:60的氨基酸残基158-196；以及SEQ ID NO:61的氨基酸残基156-194。

在一些实施例中，该核酸编码一种特异性结构域，该特异性结构域促进、增加和/或优选具有改变的脂肪酸谱的甘油三酯的生产并且包括：

a)一种基序，该基序包括氨基酸序列 SI(V/L/E)(A/T)(V/L)MN(H/Y/M/I)(L/M/V/F)QE(T/A)(A/S/T)(L/I)N(H/Q)(A/V/C) (K/E/R)(S/I/T/N/C)TGI(L/S/M)L(D/N/E)G(F/L)G(T/E/R/S/A)(T/S)L(E/G)M(S/Y/ F/C/T)K(R/K/N/M)(D/G/N)L(M/I/F)WV(V/L)I(K/R)(M/T)(Q/H)(I/V)K；

b)与SEQ ID NO:61的氨基酸残基156-203至少60％的序列一致性，例如至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、 87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％的序列一致性，其中在或对应于位置166处的氨基酸残基是谷氨酰胺；在或对应于位置175处的氨基酸残基是苏氨酸；在或对应于位置177处的氨基酸残基是异亮氨酸；在或对应于位置179处的氨基酸残基是亮氨酸；在或对应于位置186处的氨基酸残基是亮氨酸；在或对应于位置190处的氨基酸残基是赖氨酸；在或对应于位置198处的氨基酸是异亮氨酸并且在或对应于位置203处的氨基酸是赖氨酸；和/或

c)SEQ ID NO:61。

在一些实施例中，该核酸编码一种特异性结构域，该特异性结构域促进、增加和/或优选C12:0脂肪酸的生产并且包括：

a)一种基序，该基序包括氨基酸序列 SIL(A/T)(V/L)MN(H/Y/M/I)MQE(T/A)T(L/I)N(H/Q)(A/V/C)(K/E/R)(S/I/T/N/C)( V/L/A/T/I/N)G(L/I)(L/S/M)(G/L/D/N/E)(D/N/E)G(F/L)G(T/E/R/S/A)(T/S)(L/P/R)( E/G)M(S/Y/F/C/T)(K/R/L)(R/K/N/M)(D/G/N)LM；

b)与选自下组的氨基酸序列至少60％的序列一致性，例如至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列一致性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:43的氨基酸残基125-163和SEQ ID NO:44 的氨基酸残基125-163；其中在或对应于位置127处的氨基酸残基是亮氨酸，在或对应于位置133处的氨基酸残基是甲硫氨酸，在或对应于位置137处的氨基酸残基是苏氨酸并且在或对应于位置163处的氨基酸残基是甲硫氨酸；和/或

c)SEQ ID NO:43。

在一些实施例中，该核酸编码一种特异性结构域，该特异性结构域促进、增加和/或优选C14:0脂肪酸的生产并且包括：

a)一种基序，该基序包括氨基酸序列 SIV(A/T)(V/L)MN(H/Y/M/I)LQE(T/A)A(L/I)N(H/Q)(A/V/C)(K/E/R)(S/I/T/N/C)( V/L/A/T/I/N)G(L/I)(L/S/M)(G/L/D/N/E)(D/N/E)G(F/L)G(T/E/R/S/A)(T/S)(L/P/R)( E/G)M(S/Y/F/C/T)(K/R/L)(R/K/N/M)(D/G/N)LI；

b)与选自下组的氨基酸序列至少60％的序列一致性，例如至少65％、 70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列一致性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:43的氨基酸残基125-163和SEQ ID NO:44 的氨基酸残基125-163；其中在或对应于位置127处的氨基酸残基是缬氨酸，在或对应于位置133处的氨基酸残基是亮氨酸，在或对应于位置137处的氨基酸残基是丙氨酸并且在或对应于位置163处的氨基酸残基是异亮氨酸；和/ 或

c)SEQ ID NO:44。

在一些实施例中，该核酸编码一种特异性结构域，该特异性结构域促进、增加和/或优选C18:0-C:10脂肪酸的生产并且包括：

a)一种基序，该基序包括氨基酸序列 SI(E/M)(T/A)(L/V)MN(H/Y)(L/V)Q(E/D)(T/A)(S/A)(L/I/R)N(H/Q)(C/A)(K/E)S(T /V/L/I/A)G(I/L)L(L/N/D/H/G)DGFG(R/E)(T/S)(L/P)(E/G)M(C/S)(K/T)(R/N)DL；

b)与选自下组的氨基酸序列至少60％的序列一致性，例如至少65％、 70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列一致性，该组由以下项组成：氨基酸残基156-193SEQID NO:61；其中在或对应于位置163处的氨基酸残基是酪氨酸，或者在或对应于位置186处的氨基酸残基是脯氨酸；和/或

c)SEQ ID NO:84。

在一些实施例中，该核酸编码一种特异性结构域，该特异性结构域与选自下组的氨基酸序列包括至少60％的序列一致性，例如至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列一致性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:43的氨基酸残基91-163和SEQID NO:44的氨基酸残基91-163，并且其中在或对应于位置91处的氨基酸残基是天冬酰胺，在或对应于位置92处的氨基酸是脯氨酸并且氨基酸位置102是脯氨酸。

在一些实施例中，该核酸编码一种特异性结构域，该特异性结构域与选自下组的氨基酸序列包括至少60％的序列一致性，例如至少65％、70％、 75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列一致性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:43的氨基酸残基91-163和SEQID NO:44的氨基酸残基91-163，并且其中在或对应于位置91处的氨基酸残基是天冬酰胺，在或对应于位置92处的氨基酸是脯氨酸，氨基酸位置102是脯氨酸，在或对应于位置127处的氨基酸残基是缬氨酸，在或对应于位置133处的氨基酸残基是亮氨酸，在或对应于位置137处的氨基酸残基是丙氨酸并且在或对应于位置163处的氨基酸残基是异亮氨酸。

在一些实施例中，该核酸编码一种特异性结构域，该特异性结构域与选自下组的氨基酸序列包括至少60％的序列一致性，例如至少65％、70％、 75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列一致性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:43的氨基酸残基91-163和SEQID NO:44的氨基酸残基91-163，并且其中在或对应于位置91处的氨基酸残基是天冬酰胺，在或对应于位置92处的氨基酸是脯氨酸，氨基酸位置102是脯氨酸，在或对应于位置127处的氨基酸残基是亮氨酸，在或对应于位置133处的氨基酸残基是甲硫氨酸，在或对应于位置137处的氨基酸残基是苏氨酸并且在或对应于位置163处的氨基酸残基是甲硫氨酸。

在一些实施例中，该核酸编码一种包括以下项的疏水结构域：

a)一种酰基-ACP-TE的对应于选自下组的氨基酸序列的氨基酸残基，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:43的氨基酸残基61-77；SEQ ID NO:44的氨基酸残基61-77；SEQ IDNO:45的氨基酸残基85-101；SEQ ID NO:46的氨基酸残基78-95；SEQ ID NO:47的氨基酸残基50-66；SEQ ID NO:60的氨基酸残基91-107；以及SEQ ID NO:61的氨基酸残基90-106；

b)一种基序，该基序包括氨基酸序列 (P/H)(G/D/V)(W/L)(S/N)(M/R/V)(P/L/S)(L/F)(E/A/T/S)(L/A/K)(I/V)TT(I/V)F(S/L /V/G)(A/K/V)(A/P)；

c)与选自下组的氨基酸序列至少60％的序列一致性，例如至少65％、 70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列一致性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:43的氨基酸残基61-77；SEQ ID NO:44的氨基酸残基61-77；SEQ ID NO:45的氨基酸残基85-101；SEQID NO:46的氨基酸残基78-95；SEQ ID NO:47的氨基酸残基50-66；SEQ ID NO:60的氨基酸残基91-107；以及SEQ ID NO:61的氨基酸残基90-106；和/或

d)SEQ ID NO:43的氨基酸残基61-77；SEQ ID NO:44的氨基酸残基 61-77；SEQ IDNO:45的氨基酸残基85-101；SEQ ID NO:46的氨基酸残基78- 95；SEQ ID NO:47的氨基酸残基50-66；SEQ ID NO:60的氨基酸残基91-107；和/或SEQ ID NO:61的氨基酸残基90-106。在一些实施例中，该核酸编码一种包括N-末端亮氨酸残基的疏水结构域。

在一些实施例中，该核酸进一步编码一种编码质体转运肽的N-末端序列。在一些实施例中，该质体转运肽包括一种来自原壳小球藻硬脂酰ACP去饱和酶(SAD)蛋白的转运肽子序列。在一些实施例中，该质体转运肽包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少60％的序列一致性，例如至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、 86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％的序列一致性，该组由以下各项组成： MATASTFSAFNARCGDLRRSAGSGPRRPARPLPVRGRA、 SGPRRPARPLPVR、SGPRRPARPLPVRAAIASEVPVATTSPR、 RPARPLPVRGRA、RPARPLPVRAAIASEVPVATTSPR、 RCGDLRRSAGSGPRRPARPLPVRGRA、 RCGDLRRSAGSGPRRPARPLPVRAAIASEVPVATTSPR、PARPLPVR、 PARPLPVRAAIASEVPVATTSPR、RRPARPLPVR、以及RRPARPLPVRAAIASEVPVATTSPR。在一些实施例中，该质体转运肽包括一种选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成： MATASTFSAFNARCGDLRRSAGSGPRRPARPLPVRGRA，SGPRRPARPLPVR，SGPRRPARPLPVRAAIASEVPVATTSPR， RPARPLPVRGRA，RPARPLPVRAAIASEVPVATTSPR， RCGDLRRSAGSGPRRPARPLPVRGRA， RCGDLRRSAGSGPRRPARPLPVRAAIASEVPVATTSPR，PARPLPVR， PARPLPVRAAIASEVPVATTSPR，RRPARPLPVR，以及RRPARPLPVRAAIASEVPVATTSPR。

在一些实施例中，该核酸进一步编码定位至疏水结构域的N-末端的接头结构域。

在一些实施例中，该核酸编码一种包括以下项的接头结构域：

a)从对应于选自下组的残基的酰基-ACP-TE子序列的C-末端延伸的至少5个氨基酸残基，例如至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、 34、35、36、37、38、39或40个残基，该组由以下各项组成：SEQ IDNO:43的氨基酸残基43-59；SEQ ID NO:44的氨基酸残基43-59；SEQ ID NO:45的氨基酸残基49-83；SEQ ID NO:46的氨基酸残基53-77；SEQ ID NO:47的氨基酸残基15-48；SEQ ID NO:60的氨基酸残基57-89；以及SEQ ID NO:61的氨基酸残基56-88；

b)从一种酰基-ACP-TE子序列的C-末端延伸的至少5个氨基酸残基，例如至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39或40个残基，该酰基-ACP-TE子序列与选自下组的氨基酸序列包括至少 60％的序列一致性，例如至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、 84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％的序列一致性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:43 的氨基酸残基43-59；SEQ ID NO:44的氨基酸残基43-59；SEQ ID NO:45的氨基酸残基49-83；SEQ ID NO:46的氨基酸残基53-77；SEQ IDNO:47的氨基酸残基15-48；SEQ ID NO:60的氨基酸残基57-89；以及SEQ ID NO:61的氨基酸残基56-88；

c)从一种选自下组的酰基-ACP-TE子序列的C-末端延伸的至少5个氨基酸残基，例如、至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39或40个残基，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:43的氨基酸残基43-59；SEQ ID NO:44的氨基酸残基43-59；SEQ ID NO:45的氨基酸残基49-83；SEQ ID NO:46的氨基酸残基53-77；SEQ ID NO:47的氨基酸残基15-48；SEQ ID NO:60的氨基酸残基57-89；以及SEQ ID NO:61的氨基酸残基56-88；和/或

d)一个选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:37、 SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41以及SEQ ID NO:42。

在一些实施例中，该核酸编码一种包括一种氨基酸序列的变体酰基- ACP-TE，该氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少60％的序列一致性，例如至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、 87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％的序列一致性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:3、SEQID NO:5、 SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15；SEQID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:28；SEQID NO:30、SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51；SEQID NO:53； SEQ ID NO:55；SEQ ID NO:57以及SEQ ID NO:59。在一些实施例中，该核酸编码一种包括选自下组的氨基酸序列的变体酰基-ACP-TE，该组由以下各项组成：SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、 SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26；SEQ IDNO:28；SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:49、 SEQID NO:51；SEQ ID NO:53；SEQ ID NO:55；SEQ ID NO:57以及SEQ ID NO:59。

在不同实施例中，该核酸序列包括针对在藻类宿主细胞中改进的表达的密码子偏倚。

在一个另外的方面中，提供了包括如以上和在此所述的核酸的表达盒。

在另一个方面中，提供了包括如以上和在此所述的核酸(例如一种多核苷酸)和/或表达盒的载体。

在另一个方面中，提供了一种由以上和在此所述的核酸编码的变体酰基- 酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶(TE)。

在一个另外的方面中，提供了包括如以上和在此所述的核酸、表达盒、和/或变体酰基-ACP-TE的宿主细胞。在不同实施例中，该宿主细胞是一种产油细胞(例如植物细胞、藻类细胞、微藻细胞)。在一些实施例中，该藻类细胞属于无绿藻属(Prototheca)、或是一种如下的细胞，该细胞具有与SEQ ID NO:62-70中的一个或多个具有至少70％核酸序列一致性的23S rRNA序列。在一些实施例中，藻类细胞选自下组，该组由以下各项组成：桑椹型无绿藻 (Prototheca moriformis)、克鲁格尼无绿藻(Prototheca krugani)、雍滞无绿藻(Prototheca stagnora)以及祖菲无绿藻(Prototheca zopfii)。在一些实施例中，该宿主细胞进一步包括一种编码活性溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT) 的外源溶血磷脂酸酰基转移酶基因，该活性溶血磷脂酸酰基转移酶催化中链脂酰基基团转移到经取代的酰基甘油酯的sn-2位置。在不同实施例中，该宿主细胞与未转化的宿主细胞或用野生型酰基-ACPTE转化的宿主细胞相比产生一种具有至少1％增加水平，例如至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、 7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、从75％- 85％、从70％-90％、从90％-200％、从200％-300％、从300％-400％、从 400％-500％、或大于500％增加水平的C8:0、C10:0、C12:0或C14:0脂肪酸。

在一个另外的方面中，提供了一种包括如以上和在此所述的核酸、表达盒、载体、和/或变体酰基-ACP-TE的产油细胞或生物体(例如植物、藻类、微藻)。在一些实施例中，该藻类属于无绿藻属。在一些实施例中，该藻类选自下组，该组由以下各项组成：桑椹型无绿藻、克鲁格尼无绿藻、雍滞无绿藻以及祖菲无绿藻。在另一个方面中，提供了一种由该植物、藻类或微藻产生的油产品，或从该油产生的化学品、材料或食物产品。

在另一个方面中，提供了生产一种产生具有所希望的脂肪酸谱的油的植物、藻类或微藻的方法。在一些实施例中，这些方法包括用如以上和在此所述的核酸序列转化该植物、藻类或微藻，并且培养该植物、藻类或微藻以便产生该油。在一些实施例中，该植物、藻类或微藻与未转化的植物、藻类或微藻或用野生型酰基-ACP TE转化的植物、藻类或微藻相比产生至少约1％增加水平的C8:0、C10:0、C12:0和/或C14:0脂肪酸，例如至少约1％、2％、3％、 4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、 70％、从75％-85％、从70％-90％、从90％-200％、从200％-300％、从300％- 400％、从400％-500％、或大于500％增加水平的C18:0、C10:0、C12:0和/或 C14:0脂肪酸。

在另一个方面中，提供了生产一种油的方法。在一些实施例中，这些方法包括用一种如以上和在此所述的编码变体酰基-ACP TE的核酸分子转化该植物、藻类或微藻，表达该变体酰基-ACP TE以产生脂肪酸，并且回收由该植物、藻类或微藻产生的包括这些脂肪酸的油。

在另一个方面中，提供了生产一种油的方法。在一些实施例中，这些方法包括培养一种包括如以上和在此所述的编码变体酰基-ACP TE的核酸分子的植物、藻类或微藻，表达该变体酰基-ACP TE以产生脂肪酸，并且回收由该植物、藻类或微藻产生的包括这些脂肪酸的油。

定义

“酰基-ACP硫酯酶”或“酰基-ACP TE”可以互换地指代在脂质合成期间催化从酰基载体蛋白(ACP)切下脂肪酸的酶。酰基-酰基载体蛋白(ACP) 硫酯酶(TE)水解酰基-ACP硫酯键，释放游离脂肪酸和ACP。通过终止脂肪酸生物合成，该TE功能性地决定了该脂肪酸最终产品的长度和同一性。参见萨拉斯(Salas)等人，《生物化学与生物物理集刊》(Archivesof Biochemistry and Biophysics)(2002)403:25-34。

术语“催化结构域”是指酰基-ACP TE的C-末端部分，该C-末端部分包括Cys-His-Asn催化三联体，并且该催化结构域催化脂肪酸上的酰基的水解反应。酰基-ACP TE催化结构域在本领域中是已知的，并且已经被描述于例如布拉蒂(Blatti)等人，《公共科学图书馆·综合》(PLoS ONE)(2012)7(9): e42949以及迈尔(Mayer)和尚克林(Shanklin)，《BMC植物生物学》 (BMC Plant Biology)(2007)7:1-11中。

术语“疏水结构域”是指在酰基-ACP TE中的一个保守的疏水性18-氨基酸结构域或其子序列。疏水结构域已经被描述于本领域中并且被认为锚定质体膜中的FatB酰基-ACP TE。参见例如法茨乔蒂(Facciotti)和袁(Yuan) 《欧洲脂质科学和技术杂志》(Eur JLipid Sci Tech)(1998)100:167-172；布拉蒂(Blatti)等人，《公共科学图书馆·综合》(PLoS ONE)(2012)7(9): e42949；以及迈尔(Mayer)和尚克林(Shanklin)，《BMC植物生物学》 (BMC Plant Biology)(2007)7:1-11。

术语“接头结构域”是指酰基-ACP TE的氨基酸子序列，其被定位至疏水结构域的N-末端，并且可将该疏水结构域连接至转运肽。野生型FatB酰基 -ACP TE包含一种接头结构域。

相对于酰基-ACP TE的N-末端和N-末端结构域(例如转运肽、接头结构域、疏水结构域、特异性结构域)的术语“异源的”是指不是由天然存在的编码酰基-ACP TE C-末端和/或催化结构域的基因编码的氨基酸子序列。关于酰基-ACP TE的C-末端区域和/或催化结构域，酰基-ACP TE的异源N-末端区域可以源自将该酰基-ACP TE的N-末端区域交换或改变为不是由天然存在的编码一种酰基-ACP TE C-末端和/或C-末端催化结构域的基因编码的N-末端区域。这可以按本领域中已知的任何方式来完成，包括例如用一种改变的和/或非天然存在的结构域交换个别结构域，引入点突变，引入改变的或非天然存在的子序列，或缺失单个氨基酸残基、子序列和/或结构域。

术语“酰基-ACP偏好型TE”是指TE的脂酰基-ACP底物特异性。一种酰基-ACP偏好型TE优先释放来自酰基-ACP底物的特定脂肪酸。例如，相对于C18:0、C10:0、C12:0、C14:0、C16:0、C18:0、C18:1和C18:2脂肪酸的组中的所有其他脂肪酸，该酰基-ACP偏好型TE可以优先释放一种给定的脂肪酸。与其他非优选的脂肪酸-ACP底物相比，可以将酰基-ACP偏好型TE的优选项检测为更高的V_max(更高的k_cat或更高V/K)。在不存在使用纯化的蛋白质进行动力学测定的情况下，该优选项可以从相对于对照细胞(该对照细胞不会过表达酰基-ACP偏好型TE)经基因工程化以过表达酰基-ACP偏好型 TE的细胞的脂肪酸谱中的变化进行推断。

当任何给定聚合物组分(例如氨基酸、核苷酸，也通称为“残基”)的位置是通过参照所选择的氨基酸或核酸聚合物中的相同或等效位置(例如基于最优比对或共有序列)而指定，而并非通过在该给定聚合物中该组分的实际编号位置而指定时，一种给定的氨基酸聚合物或核酸聚合物的编号“对应于”或是“相对于”一种所选择的氨基酸聚合物或核酸聚合物的编号。

一种“变体”是一种包括如下序列的多肽，该序列与一种亲本多肽序列的序列具有一个或多个氨基酸位置差异(例如，通过取代、缺失、或插入)。一种变体可以包括如下的序列，该序列与亲本多肽序列具有多达40％的该亲本多肽序列残基总数诸如多达40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、 9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％2％或1％的亲本多肽序列残基总数的差异。例如，一种400个氨基酸多肽序列的变体包括一种如下的序列，该序列具有多达40％的该亲本多肽序列残基总数的差异，即在该400个氨基酸多肽序列之内具有多达160个氨基酸位置(诸如在参考序列(例如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、 SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:32； SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51；SEQ ID NO:53；SEQID NO:55；SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:59)之内具有1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、 57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、 74、75、76、78、79、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、 130、135、140、145、150、155、或160个氨基酸位置))的差异。

“天然存在的”当应用于一种组合物时，该组合物可在自然界中被发现，有别于由人类人工产生的那种。例如，生物(包括病毒、细菌、原生动物、昆虫、植物或哺乳动物的组织)中存在的、可从自然界中的来源中分离的并且尚未被人类在实验室中有意修饰的多肽或多核苷酸是天然存在的。“非天然存在的”(还称作“合成的”或“人工的”)当应用于一种对象时，意指该对象不是天然存在的-即，该对象不能在自然界中被发现而有别于由人类人工产生的那种。

“天然油”或“天然脂肪”是指主要从生物获得的甘油三酯油，其中该油未经历与另外的天然油或合成油掺合、或分级、或其他工艺以实质上改变该甘油三酯的脂肪酸谱。关于一种包括了具有特定区域特异性的甘油三酯的油，该天然油或天然脂肪尚未经受酯交换或其他合成工艺以获得该区域特异性甘油三酯谱，而是由一个细胞或细胞群体天然地产生区域特异性。关于一种天然油或天然脂肪，并且如贯穿本披露总体上所使用的，这些术语油和脂肪可互换地使用，除非另外指出。因此，“油”或“脂肪”在室温下可以是液体、固体或部分固体的，这取决于该物质的组成和其他条件。在此，术语 “分级”表示以相对于由生物所产生的谱而改变其脂肪酸谱的方式来从该油去除物质，不管用什么方法完成。天然油包括如从生物获得的油，其中该油已经经历最低限度的不实质性改变其甘油三酯谱的加工，包括精炼、漂白和/ 或脱胶。天然油还可以是“非酯交换的天然油”，表示该天然油未经历一种其中脂肪酸在其酰基连接中被重分布到甘油的加工并且基本上保持如从生物中回收时的相同构型。

“脂肪酸谱”是指就链长和/或饱和模式而言，细胞或衍生自细胞的油中的脂肪酸的分布。在这个背景下，饱和模式可以包括饱和酸相对于不饱和酸的量度或者细胞的多种脂肪酸(并且特别是细胞甘油三酯)中的双键的位置分布的更为详细的分析。一种细胞或油甘油三酯的脂肪酸谱中的“脂肪酸” 是指该细胞或油甘油三酯的脂酰基。

与一种油有关的“谱”是在该油内特定种类或甘油三酯或脂酰基的分布。 “脂肪酸谱”是在不参考与甘油主链的连接的情况下，该油的甘油三酯中脂酰基的分布。“sn-2谱”是在油中三酰甘油酯的sn-2位置处所见的脂肪酸的分布。“区域特异性谱”是在参考酰基连接到甘油主链的位置而不参考立体特异性的情况下甘油三酯的分布。换句话说，区域特异性谱描述了在sn-1/3 处相对于在sn-2处的酰基连接。因此，在区域特异性谱中，POS和SOP是进行相同地处理。“立体特异性谱”描述了在sn-1、sn-2及sn-3处酰基的连接。除非另外指明，否则甘油三酯(如SOP和POS)应被视为是等效的。“TAG 谱”是指在参考与甘油主链的连接，但不参考这些连接的区域特异性性质的情况下在甘油三酯中所见的脂肪酸的分布。因此，在TAG谱中，该油中的 SSO百分比是SSO与SOS的总和，而在区域特异性谱中，SSO的百分比是在不包括该油中的SOS种类的情况下计算。

“微藻”是含有叶绿体或质体并且任选地能够进行光合作用的微生物生物，或能够进行光合作用的原核微生物生物。微藻包括不能代谢固定碳源作为能量的专性光能自养生物，以及能够仅以固定碳源为生的异养生物。微藻包括细胞分裂后不久与姊妹细胞分开的单细胞生物，如衣藻属，连同微生物，例如像，团藻属，它是两种不同细胞类型的简单多细胞光合性微生物。微藻包括细胞例如小球藻属、杜氏藻属、以及无绿藻属。微藻还包括显示出细胞- 细胞粘附的其他微生物光合性生物，例如阿格门氏藻属(Agmenellum)、鱼腥藻属、以及桑椹藻属(Pyrobotrys)。微藻还包括专性异养微生物，它们已经丧失进行光合作用的能力，如某些双鞭甲藻属(dinoflagellate)藻类物种和无绿藻属(Prototheca)物种。

“产油”细胞是天然地或通过重组或经典株系改良能够产生按细胞干重计的至少20％脂质的非人细胞。“产油微生物”或“产油微生物体”是一种微生物，包括产油的微藻。

相对于多肽或多核苷酸，如所使用的术语“分离的”是指已经从典型地具有该多肽或多核苷酸的至少一种其他组分中分离的多肽或多核苷酸。因此，一种天然存在的多肽是分离的，如果它已经从伴随该多肽或多核苷酸天然存在的至少一种其他组分中纯化出来的话。一种重组多肽或多核苷酸是分离的，如果它已经从当产生该多肽或多核苷酸时存在的至少一种其他组分中纯化出来的话。

在此可互换使用术语“多肽”和“蛋白质”，以指代氨基酸的聚合物，并且除非另外限制，否则包括可以按类似于天然存在的氨基酸的方式发挥作用的非典型氨基酸。

除非另外特别指明，否则术语“氨基酸”或“氨基酸残基”包括天然存在的L-氨基酸或残基。在此使用最常用的用于氨基酸的一个和三个字母缩写 (莱宁赫尔(Lehninger)，A.L.(1975)《生物化学》(Biochemistry)，第二版，第71-92页，沃思出版社(WorthPublishers)，纽约)。术语“氨基酸” 和“氨基酸残基”包括D-氨基酸以及化学修饰的氨基酸，例如氨基酸类似物、通常未被掺入进蛋白质中的天然存在的氨基酸、以及具有氨基酸的特有特性的化学合成的化合物(统称“非典型”氨基酸)。例如，允许与天然Phe或 Pro相同的肽化合物构象限制的苯丙氨酸或脯氨酸的类似物或模拟物被包括在 “氨基酸”的定义内。

示例性非典型氨基酸包括例如描述于国际公开号WO 90/01940中的那些以及可以取代Glu和Asp的2-氨基己二酸(Aad)；可以取代Glu和Asp的 2-氨基庚二酸(Apm)；可以取代Met、Leu和其他脂肪族氨基酸的2-氨基丁酸(Abu)；可以取代Met、Leu和其他脂肪族氨基酸的2-氨基庚酸(Ahe)；可以取代Gly的2-氨基异丁酸(Aib)；可以取代Val、Leu和Ile的环己基丙氨酸(Cha)；可以取代Arg和Lys的高精氨酸(Har)；可以取代Lys、Arg 和His的2,3-二氨基丙酸(Dpr)；可以取代Gly、Pro和Ala的N-乙基甘氨酸 (EtGly)；可以取代Asn和Gln的N-乙基天冬酰胺(EtAsn)；可以取代 Lys的羟基赖氨酸(Hyl)；可以取代Lys的同分异构的羟基赖氨酸(Ahyl)；可以取代Pro、Ser和Thr的3-(和4-)羟基脯氨酸(3Hyp，4Hyp)；可以取代Ile、Leu和Val的同分异构的-异亮氨酸(Aile)；可以取代Ala的脒基苯丙氨酸；可以取代Gly、Pro和Ala的N-甲基甘氨酸(MeGly，肌氨酸)；可以取代Ile的N-甲基异亮氨酸(MeIle)；可以取代Met和其他脂肪族氨基酸的正缬氨酸(Nva)；可以取代Met和其他脂肪族氨基酸的正亮氨酸(Nle)；可以取代Lys、Arg和His的鸟氨酸(Orn)；可以取代Thr、Asn和Gln的瓜氨酸(Cit)和甲硫氨酸亚砜(MSO)；可以取代Phe的N-甲基苯丙氨酸 (MePhe)、三甲基苯丙氨酸、卤代(F、Cl、Br及I)苯丙氨酸以及三氟苯丙氨酸(trifluorylphenylalanine)。

如结合多肽或核酸聚合物所使用的术语“序列”是指组成聚合物或亚-聚合物的单体的顺序或具有该序列的片段。

氨基酸或核苷酸序列的“子序列”是更大的序列或肽或核酸亚-聚合物的一部分或由该更大的序列的部分表征的片段。

在两个或更多个氨基酸或核苷酸序列的背景下，术语“一致的”或“百分比一致性”是指如使用以下序列比较算法之一或通过目测进行测量，当比较和比对最大相应性时，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸。

关于确定核苷酸或氨基酸一致性百分比的序列比较，典型地以一个序列作为参考序列，将测试序列与之进行比较。当使用序列比较算法时，把测试序列和参考序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。基于指定的程序参数，序列比较算法随后相对于参考序列计算检验序列的序列一致性百分比。用于比较的最佳序列比对可以使用设置为默认参数的BLAST来进行。

如关于多肽所使用的术语“野生型”是指任何具有一种存在于来自天然存在的生物的多肽中的氨基酸序列的多肽，而不论该分子的来源；即，术语 “野生型”是指序列特征，而不论该分子是否从一种天然来源中纯化；重组表达，随后纯化；或合成。

术语“突变”意指通过改变编码蛋白质、多肽、或肽的核苷酸中的一个或多个核苷酸而产生的蛋白质、多肽、或肽序列或子序列中的变化，然而该改变是获得的。例如，一种突变可以通过PCR突变、通过整个基因的合成、或任何其他方法随机地产生。

术语“保守性氨基酸取代”在此使用以指代用一种功能等效的氨基酸替代一种氨基酸。功能等效的氨基酸总体上是与它们替代的这些氨基酸在大小和/或特征(例如，电荷或疏水性)方面是类似的。类似特性的氨基酸可以分组如下：

(1)疏水性：His、Trp、Trp、Tyr、Phe、Met、Leu、Ile、Val、Ala；

(2)中性疏水性：Cys、Ser、Thr；

(3)极性：Ser、Thr、Asn、Gln；

(4)酸性/带负电荷的：Asp、Glu；

(5)带电荷的：Asp、Glu、Asn、Lys、His；

(6)碱性/带正电荷的：Asn、Lys、His；

(7)碱性的：Asn、Gln、His、Lys、Arg；

(8)影响链取向的残基：Gly、Pro；以及

(9)芳香族：Trp、Tyr、Phe、His。

以下表显示示例性且优选的保守性氨基酸取代。

术语“载体”在此使用以描述包含一种多核苷酸的DNA构建体。这种载体可以稳定地或瞬时地在一种宿主细胞中被繁殖。该载体可以例如是质粒、病毒载体、或简单地一种潜在的基因组插入片段。一旦导入适合的宿主中，该载体可以独立于该宿主基因组复制和起作用，或在一些情况下可以整合到宿主基因组中。

如在此使用的，术语“表达载体”或“表达构建体”是指重组或合成产生的核酸构建体，带有允许特定核酸在宿主细胞中转录的一系列指定核酸元件。表达载体可以是质粒、病毒、或核酸片段的部分。一般而言，表达载体包含与启动子可操作地连接的待转录核酸。

“外源基因”是指一种转化到细胞中的核酸。相对于正在转化的细胞，外源基因可以来自不同的物种(因而是异源的)，或来自相同的物种(因而是同源的)。就一种外源基因来说，其相对于该基因的内源拷贝占据细胞基因组中不同位置。该外源基因可以在细胞中以多于一个拷贝存在。该外源基因可以在细胞中作为基因组中的插入片段或作为游离型分子而维持。

“外源提供的”描述提供到细胞培养物的培养基的分子。

“诱导型启动子”是响应于特定刺激介导可操作地连接的基因的转录的启动子。

如在此使用的，短语“处于可操作连接”是指两个序列(如控制序列 (典型地是启动子)和连接序列)之间的功能性连接。如果某启动子可以介导外源基因的转录，则该启动子与这个基因处于可操作的连接。

将“启动子”定义为可指导核酸转录的一段核酸控制序列。如在此使用的，启动子包括转录起始位点附近必需的核酸序列，如，在聚合酶II型启动子的情况下，TATA元件。启动子也任选地包括远端增强子或阻抑物元件，它们可以距转录起始位点远达几千碱基对存在。

如在此使用的，术语“重组”当用于指例如一种细胞、核酸、蛋白或载体时表明该细胞、核酸、蛋白或载体已经通过导入外源核酸或蛋白或者改变天然的核酸或蛋白进行修饰，或者表明该细胞衍生自这样修饰的细胞。因此，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内部找不到的基因，或表达天然基因，否则这些天然基因异常表达、过表达、低表达或根本不表达。如在此使用的“重组核酸”是指最初通过使用实验室方法合成的核酸分子，由此产生通常未发现于自然界中的核酸。通过使用实验室方法，实现了与不同序列 (例如，启动子、靶向序列等)可操作连接的重组核酸分子。因此，出于本发明的目的，通过连接正常情况下不连接的DNA分子在体外形成的处于线性形式的分离核酸或表达载体均被认为是重组体。应当理解的是一旦重组核酸被制备并且被重新导入到宿主细胞或生物中，它将以非重组方式复制，即它使用宿主细胞的体内细胞机制而不是体外操作；然而，此类核酸一旦被重组产生，即使随后以非重组方式复制，出于本发明的目的仍然被视为重组的。类似地，“重组蛋白”是使用重组技术，即，通过表达如上描绘的重组核酸所产生的蛋白质。

“转运肽”是一种氨基酸序列，该氨基酸序列指导融合至信号序列的多肽的运输。关于表达该多肽的质体细胞，该转运肽可以指导该多肽至该质体的运输。

术语“多核苷酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，否则包括可以按类似于天然存在的核苷酸的方式发挥作用的天然核苷酸的已知类似物。术语“多核苷酸”是指任何形式的DNA或RNA，包括例如基因组DNA；互补性DNA(cDNA)，其是mRNA的DNA表示，通常通过信使RNA(mRNA)的反转录或扩增获得；合成地或通过扩增产生的DNA分子；以及mRNA。术语“多核苷酸”包括双链核酸分子以及单链分子。在双链多核苷酸中，这些多核苷酸链无需是共同延伸的(即，一个双链多核苷酸无需沿着两条链的整个长度都是双链的)。

术语“宿主细胞”是指能够瞬时地或稳定地维持一种载体的细胞。宿主细胞包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、藻类细胞(例如微藻细胞)、植物细胞以及哺乳动物细胞。本领域中已知的或变得已知的其他宿主细胞也适合于在本发明中使用。

如在此使用的，术语“互补性”是指两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果在核酸分子的给定位置处的一个核苷酸能够与另一个核酸分子的一个核苷酸杂交，那么这两个核酸分子被认为在该位置处是彼此互补的。术语“基本上互补”描述了彼此充分互补以允许在严格杂交条件下特异性杂交的序列。

短语“严格杂交条件”通常是指在限定的离子强度和pH下，低于特定序列的熔解温度(Tm)大约5℃的温度。适合用于实现大多数序列的特异性杂交的示例性严格条件是在pH 7.0下至少约60℃的温度和约0.2摩尔的盐浓度。

“纤维素材料”表示消化纤维素的产物，包括葡萄糖与木糖，和任选地额外化合物如二糖、寡糖、木质素、糠醛和其他化合物。纤维素材料来源的非限制性实例包括甘蔗渣、甜菜浆、玉米秸秆、木屑、锯末和柳枝稷。

附图简述

图1展示了来自经工程化以表达C-末端FLAG表位标记的Uc TE(F)或 Cc TE(E)酰基-ACP硫酯酶的桑椹型无绿藻株系的全细胞裂解物的蛋白质印迹法。

图2展示了加州月桂(Uc)TE、樟树(Cc)TE以及嵌合表达构建体的图解卡通图。所有构建体包含相同的原壳小球藻SAD1转运肽、AscI接头和 C-末端FLAG表位标签。

图3A-C展示了质粒pSZ2037中所包含的转化DNA的核苷酸序列。使用构建体D1022[pSZ2037]以在桑椹型无绿藻(UTEX 1435株系A)内表达Cc- Uc TE嵌合体A。在5'至3'方向继续向前，通过小写字母、加框文本指示驱动酿酒酵母SUC2基因(编码蔗糖水解活性，由此允许该株系在蔗糖上生长) 表达的莱茵衣藻β-微管蛋白启动子。SUC2的起始子ATG和终止子TGA是由大写字母斜体指示，同时编码区是以小写字母斜体指示。该普通小球藻硝酸还原酶(NR)基因3’UTR是由小写字母文本指示的，后接间隔区段(虚的下划线，小写字母)及驱动樟树和加州月桂嵌合融合硫酯酶表达的桑椹型无绿藻AMT3启动子(由加框斜体文本指示)。原壳小球藻SAD1转运肽是由大写字母、加框文本指示的，而樟树和加州月桂衍生的序列分别用加下划线的斜体和粗体大写字母指示。C-末端FLAG表位标签是用加下划线的小写字母指出的。普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR同样是由小写字母文本指示，后接由小写字母粗体文本指示的A 6S基因组区域。

图4展示质粒pSZ2038中所包含的转化DNA的核苷酸序列。使用构建体D1023[pSZ2038]以在桑椹型无绿藻(UTEX 1435株系A)内表达Uc-Cc TE嵌合体。Cc TE衍生序列是用加下划线的斜体指出的，而Uc TE衍生序列是用粗体大写字母文本指出的。

图5展示质粒pSZ2231中所包含的转化DNA的核苷酸序列。使用构建体D1210[pSZ2231]以在桑椹型无绿藻(UTEX 1435株系A)内表达Cc-Uc TE嵌合体B。Cc TE衍生序列是用加下划线的斜体指出的，而Uc TE衍生序列是用粗体大写字母文本指出的。

图6展示质粒pSZ2232中所包含的转化DNA的核苷酸序列。使用构建体D1211[pSZ2232]以在桑椹型无绿藻(UTEX 1435株系A)内表达Cc-Uc TE嵌合体C。Cc TE衍生序列是用加下划线的斜体指出的，而Uc TE衍生序列是用粗体大写字母文本指出的。

图7展示质粒pSZ2233中所包含的转化DNA的核苷酸序列。使用构建体D1212[pSZ2233]以在桑椹型无绿藻(UTEX 1435株系A)内表达Cc-Uc TE嵌合体D。Cc TE衍生序列是用加下划线的斜体指出的，而Uc TE衍生序列是用粗体大写字母文本指出的。

图8展示质粒pSZ2234中所包含的转化DNA的核苷酸序列。使用构建体D1213[pSZ2234]以在桑椹型无绿藻(UTEX 1435株系A)内表达Cc-Uc TE嵌合体E。Cc TE衍生序列是用加下划线的斜体指出的，而Uc TE衍生序列是用粗体大写字母文本指出的。

图9展示将株系A、株系E和株系F以及用pSZ2037(D1022，Cc-Uc TE嵌合体A)和pSZ2038(D1023，Uc-Cc TE嵌合体)DNA转化的代表性衍生物转基因系进行比较的蛋白质印迹。

图10展示将株系A、株系E和株系F以及用pSZ2231(D1210，Cc-Uc TE嵌合体B)或pSZ2232(D1211，Cc-Uc TE嵌合体C)DNA转化的代表性衍生物转基因系进行比较的蛋白质印迹。

图11展示将株系A、株系E和株系F以及用pSZ2233(D1212，Cc-Uc TE嵌合体D)或pSZ2234(D1212，Cc-Uc TE嵌合体E)DNA转化的代表性衍生物转基因系进行比较的蛋白质印迹。

图12展示了从Cc TE和Uc TE之间的嵌合融合体鉴定的氨基酸，这些氨基酸对于新生蛋白的有效成熟是必需的(Asn91、Pro92和Pro102)；还展示了四个Cc TE特定氨基酸(Val127、Leu133、Ala137、以及Ile163)，它们当插入到Uc TE主链背景中时赋予新颖的1:1比率的C12:0和C14:0。

图13A-B展示FATA和FATB硫酯酶蛋白的序列比对。FATB的N-末端展现出高程度的序列保守。用于转运肽、富含脯氨酸的结构域和疏水性补丁 (hydrophobic patch)的近似区域是加框的。显示对Uc FATB2的有效加工是重要的三个氨基酸(例如N91、P92和P102)在第14排下方用下划线标注并且位于疏水性补丁与核心酶结构域起始处之间。

图14A-C展示构建体D1056[pSZ2084]的核苷酸序列。使用构建体 D1056[pSZ2084]以在桑椹型无绿藻(UTEX 1435株系A)内表达Uc TE，该 Uc TE包含一种来自原壳小球藻的延伸的异源转运肽。在5'至3'方向继续向前，通过小写字母、加框文本指示驱动酿酒酵母SUC2基因(编码蔗糖水解活性，由此允许该株在蔗糖上生长)表达的莱茵衣藻β-微管蛋白启动子。SUC2的起始子ATG和终止子TGA是由大写字母斜体指示，同时编码区是以小写字母斜体指示。该普通小球藻硝酸还原酶(NR)基因3’UTR是由小写字母文本指示的，后接间隔区段(虚的下划线，小写字母)及驱动加州月桂嵌合融合硫酯酶表达的桑椹型无绿藻AMT3启动子(由加框斜体文本指示)。该延伸的原壳小球藻SAD1转运肽是用加下划线的大写字母指示的，而该加州月桂 FATB2衍生的序列是用粗体大写字母标注的。C-末端FLAG表位标签是用加下划线的小写字母指出的。普通小球藻硝酸盐还原酶3’UTR同样是由小写字母文本指示，后接由小写字母粗体文本指示的A 6S基因组区域。

图15展示质粒pSZ2085中所包含的转化DNA的核苷酸序列。使用构建体D1057[pSZ2085]以在桑椹型无绿藻(UTEX 1435株系A)内表达Uc FATB2ExtA。该Uc FATB2硫酯酶延伸是用加下划线的斜体标注的，而发现于pSZ2084中的其余的Uc FATB2序列是用粗体大写字母文本标注的。

图16展示质粒pSZ2086中所包含的转化DNA的核苷酸序列。使用构建体D1058[pSZ2086]以在桑椹型无绿藻(UTEX 1435株系A)内表达Uc FATB2ExtB。该Uc FATB2硫酯酶延伸是用加下划线的斜体标注的，而发现于pSZ2084中的其余的Uc FATB2序列是用粗体大写字母文本标注的。

图17A-B展示当在桑椹型无绿藻中表达时，12:0-ACP硫酯酶Uc FATB2 的N-末端影响该酶活性。小图A说明D448、D1056、D1057与D1058之间相对于天然蛋白的序列差异。小图B比较了在桑椹型无绿藻转化后四种构建体之间的脂肪酸谱。相对于D448和D1056，D1057和D1058展现平均C12脂肪酸谱的近似两倍增加。指示了野生型株系(株系B和株系A)的脂肪酸谱。

图18展示质粒pSZ2450包含的转化DNA的核苷酸序列。使用构建体 D1431[pSZ2450]以在桑椹型无绿藻(UTEX 1435株系C)内表达Cc FATB1ExtA。该Cc FATB1硫酯酶延伸是用加下划线的斜体标注的，而其余的Cc FATB1序列是用粗体大写字母文本标注的。

图19展示质粒pSZ2451包含的转化DNA的核苷酸序列。使用构建体 D1432[pSZ2451]以在桑椹型无绿藻(UTEX 1435株系C)内表达Cc FATB1ExtB。该Cc FATB1硫酯酶延伸是用加下划线的斜体标注的，而其余的Cc FATB1序列是用粗体大写字母文本标注的。

图20A-B展示当在桑椹型无绿藻中表达时，14:0-ACP硫酯酶Cc FATB1 的N-末端影响该酶活性。小图A展示D534、D1431、D1432之间相对于天然蛋白的序列差异。小图B比较了在桑椹型无绿藻转化后三个构建体之间的脂肪酸谱。相对于D534，D1431和D1432展现平均C12脂肪酸谱的近似两倍增加。指示了野生型株系C的脂肪酸谱。

图21展示质粒pSZ2479中所包含的转化DNA的核苷酸序列。使用构建体D1481[pSZ2479]以在桑椹型无绿藻(UTEX 1435株系C)内表达湿地萼距花(Cpal)FATB2ExtA。Cpal FATB2硫酯酶延伸是用用加下划线的斜体标注的,而其余的Cpal FATB2序列是用粗体大写文本标注的并且FLAG表位 (pSZ2480)是以小写字母文本标注。

图22展示质粒pSZ2480包含的转化DNA的核苷酸序列。使用构建体 D1482[pSZ2480]以在桑椹型无绿藻(UTEX 1435株系C)内表达包含C-末端 FLAG表位标签的CpalFATB2ExtA。Cpal FATB2硫酯酶延伸是用用加下划线的斜体标注的,而其余的Cpal FATB2序列是用粗体大写文本标注的并且 FLAG表位(pSZ2480)是以小写字母文本标注。

图23A-B展示当在桑椹型无绿藻中表达时，14:0-ACP硫酯酶Cpal FATB2的N-末端影响该酶活性。小图A展示D280、D1481、D1482之间相对于天然蛋白的序列差异。小图B比较了在桑椹型无绿藻转化后三个构建体之间的脂肪酸谱。D1481和D1482展现大约33％的平均C14值。野生型株系 C和Cc FATB2表达株系(株系K)的脂肪酸谱是用箭头指示的。

图24展示质粒pSZ2477中所包含的转化DNA的核苷酸序列。使用构建体D1479[pSZ2477]以在桑椹型无绿藻(UTEX 1435株系C)内表达美洲榆 (Ua)FATB1ExtA。该UaFATB1硫酯酶序列延伸是用加下划线的斜体标注的，而其余的Ua FATB1序列是用粗体大写字母文本标注的。在pSZ2478中的FLAG表位是以小写字母文本标注的。

图25展示质粒pSZ2478中所包含的转化DNA的核苷酸序列。使用构建体D1480[pSZ2478]以在桑椹型无绿藻(UTEX 1435株系C)内表达包含C- 末端FLAG表位标签的UaFATB1ExtA。该Ua FATB1硫酯酶序列延伸是用加下划线的斜体标注的，而其余的Ua FATB1序列是用粗体大写字母文本标注的。在pSZ2478中的FLAG表位是以小写字母文本标注的。

图26A-B展示当在桑椹型无绿藻中表达时，10:0-14:0-16:0-ACP硫酯酶 Ua FATB1的N-末端影响该酶活性。小图A展示D449、D1479、D1480之间相对于天然蛋白的序列差异。小图B比较了在桑椹型无绿藻转化后三个构建体之间的脂肪酸谱。相对于D449，D1479和D1480展现平均C12脂肪酸谱的近似两倍增加。指示了野生型株系B和C的脂肪酸谱。

图27展示质粒pSZ2231中所包含的转化DNA的核苷酸序列。使用构建体D1210[pSZ2231]以在桑椹型无绿藻(UTEX 1435株系A)内表达Cc-Uc FATB2嵌合体B。Cc-Uc FATB2硫酯酶序列是由粗体大写字母文本指示的；该修整或延伸的原壳小球藻SAD1转运肽是用加下划线的大写字母指示的并且D1429内的Uc FATB2延伸是用加下划线的小写字母斜体标注的。

图28展示质粒pSZ2448中所包含的转化DNA的核苷酸序列。使用构建体D1429[pSZ2448]以在桑椹型无绿藻(UTEX 1435株系C)内表达包含延伸的原壳小球藻SAD1转运肽的Cc-Uc FATB2ExtA及衍生自天然Uc FATB2序列的五个氨基酸N-末端延伸。Cc-UcFATB2硫酯酶序列是由粗体大写字母文本指示的；该修整或延伸的原壳小球藻SAD1转运肽是用加下划线的大写字母指示的并且D1429内的Uc FATB2延伸是用加下划线的小写字母斜体标注的。

图29A-B展示当在桑椹型无绿藻中表达时，12:0-ACP硫酯酶Uc FATB2 的N-末端改善了Cc-Uc FATB2嵌合体B的酶活性。小图A展示D1210与 D1429之间相对于天然蛋白的序列差异。小图B比较了在桑椹型无绿藻转化后两个构建体之间的脂肪酸谱。相对于D1210，D1429展现平均C12脂肪酸谱的近似两倍增加。指示了野生型株系A和C的脂肪酸谱。相对于天然Uc TE酶，这些嵌合体TE内的相对C12:C14活性是显著降低的，其中C14:0活性显著增加(例如将图18、D448系与图30、D1210和D1429系进行比较)。

图30A-B展示Cpal FATB2和UaFATB1的延伸。A.CpalFATB2(C14) 延伸到AHPK-/+FLAG标签(psZ2479(D1481)和psZ2480(D1482))。 B.UaFATB1(C10-C16)延伸到PPKL-/+FLAG标签(psZ2477(D1479)和 psZ2478(D1480))。

图31展示pSZ2609(D1558)细叶萼距花(Cuphea hookeriana) (Chook)与赖特氏萼距花(Cw)Chook-Cw FATB嵌合体A的核酸序列。 CwFATB转运肽(加下划线的文本)、AscI接头(小写字母)、CwFATB序列(斜体)、Chook FATB序列(粗体)、FLAG表位标签(加下划线的小写字母)。

图32展示pSZ2610(D1559)Chook-CwFATB嵌合体B的核酸序列。 CwFATB转运肽(加下划线的文本)、AscI接头(小写字母)、CwFATB序列(斜体)、Chook FATB序列(粗体)、FLAG表位标签(加下划线的小写字母)。

图33展示pSZ2611(D1560)Chook-CwFATB嵌合体C的核酸序列。 CwFATB转运肽(加下划线的文本)、AscI接头(小写字母)、CwFATB序列(斜体)、Chook FATB序列(粗体)、FLAG表位标签(加下划线的小写字母)。

图34展示pSZ2612(D1561)Chook-CwFATB嵌合体D的核酸序列。 CwFATB转运肽(加下划线的文本)、AscI接头(小写字母)、CwFATB序列(斜体)、Chook FATB序列(粗体)、FLAG表位标签(加下划线的小写字母)。

图35展示pSZ2613(D1562)ChookFATB的核酸序列。CwFATB转运肽(加下划线的文本)、AscI接头(小写字母)、Chook FATB序列(粗体)、 FLAG表位标签(加下划线的小写字母)。

图36展示pSZ1954(D965)CwFATB的核酸序列。CwFATB转运肽 (加下划线的文本)、AscI接头(小写字母)、CwFATB序列(斜体)、 FLAG表位标签(加下划线的小写字母)。

图37展示细叶萼距花(Chook)与赖特氏萼距花(Cw)的酰基ACP TE FATB嵌合体(“Chook-CwFATB嵌合体”)。

图38A-B展示Chook-CwFATB嵌合体的主要脂质谱。

图39A-B展示Chook-CwFATB嵌合体的表达的蛋白质印迹分析以及脂肪酸谱的概述。

图40展示ChookFATB2、CwFATB1、UcFATB2和CcFATB的特异性结构域内的残基，这些残基影响TE的脂肪酸-ACP底物特异性。影响 ChookFATB2的脂肪酸-ACP底物特异性的残基包括例如E166、T175、I177、 L179、L186、K190、I198以及K203(残基编号参照SEQ ID NO:61)。影响 UcFATB2和CcFATB的脂肪酸-ACP底物特异性的残基包括例如L/V127、 M/L133、T/A137、M/I163以及(残基编号参照SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44)。

图41A-C.图41A.先前所述的衍生自Ch FATB2(D3042)、加州月桂 (Uc FatB2登录号M94159；D1058)、樟树FATB1(Cc FATB2，登录号 U31813；D1432)以及Uc FATB2嵌合体F(D1777)的N-末端特异性结构域的序列比对。加框突出显示了在Uc FATB2的N-末端特异性结构域内被改变以产生Uc FATB2嵌合体F的四个氨基酸。图41B展示D1058的C12:0偏好型脂肪酸谱、D1432的C14:0脂肪酸谱以及D1777的新颖杂合C12:0-C14:0谱。图41C.产生D1777的四个氨基酸改变在天然Uc FATB2的同源性模型上被突出显示。还显示包括酶核心的催化三联体(Cys、His、以及Asn)。

图42A-B.图42A.Ch FATB2、赖特氏萼距花(Cw FATB2，登录号 U56103)、寡瓣萼距花(Cuphea paucipetala)(Cpau FATB1)、湿地萼距花 (Cuphea palustris)(Cpal FATB1，登录号AAC49179)、火红萼距花 (Cuphea ignea)(Cignea FATB1)、艾薇格萼距花(Cupheaavigera)(Ca FATB1)、以及樟树(Cc FATB4)之间的序列比对。N-末端特异性结构域相对于该转运肽、催化三联体和C-末端FLAG表位标签被高亮。图42B.衍生自野生型Ch FATB2和六个Ch FATB2嵌合体的N-末端特异性结构域的序列比对。残基一致的野生型Ch FATB2(D3042)是用点标注的，而改变是用氨基酸字母标注的。衍生这些取代的FATB基因是以下：D3126 Cw FATB2； D3127 Cpau FATB1；D3128 Cpal FATB1；D3129 Cignea FATB1；D3130 CaFATB1；以及D3131 Cc FATB4。

图43A-C.图43A.衍生自Ch FATB2(D3042)、Cw FATB2(D965)以及Ch FATB2嵌合体Ver1(D3126)的N-末端特异性结构域的序列比对。加框突出显示了在Ch FATB2的N-末端特异性结构域内被改变以产生Ch FATB2嵌合体Ver1的六个氨基酸。图43B展示D965的C12:0-C14:0偏好型脂肪酸谱、D3042的C8:0-C10:0脂肪酸谱以及在表达D3126的株系中的几乎不可检测的C10:0积累。图43C.产生D3126的六个氨基酸改变在天然Uc FATB2的同源性模型上被突出显示。还显示包括酶核心的催化三联体(Cys、 His、以及Asn)。

图44A-C.图44A.衍生自Ch FATB2(D3042)、Cpau FATB1(D2506) 以及Ch FATB2嵌合体Ver2(D3127)的N-末端特异性结构域的序列比对。加框突出显示了在Ch FATB2的N-末端特异性结构域内被改变以产生Ch FATB2嵌合体Ver2的七个氨基酸。图44B展示D2506的C10:0-C14:0偏好型脂肪酸谱、D3042的C8:0-C10:0脂肪酸谱以及在表达D3127的株系中所有可检测的C8:0-C10:0积累的损失。图44C.产生D3127的七个氨基酸改变在天然 UcFATB2的同源性模型上被突出显示。还显示包括酶核心的催化三联体 (Cys、His、以及Asn)。

图45A-C.图45A.衍生自Ch FATB2(D3042)、Cpa1FATB1(D2839) 以及Ch FATB2嵌合体Ver3(D3128)的N-末端特异性结构域的序列比对。加框突出显示了在Ch FATB2的N-末端特异性结构域内被改变以产生Ch FATB2嵌合体Ver3的八个氨基酸。图45B展示D2839的C8:0-C10:0偏好型脂肪酸谱、D3042的C8:0-C10:0脂肪酸谱以及在表达D3128的株系中所有可检测的C8:0-C10:0积累的损失。图45C.产生D3128的八个氨基酸改变在天然 Uc FATB2的同源性模型上被突出显示。还显示包括酶核心的催化三联体 (Cys、His、以及Asn)。

图46A-C.图46A.衍生自Ch FATB2(D3042)、Cignea FATB1(D2676) 以及Ch FATB2嵌合体Ver4(D3129)的N-末端特异性结构域的序列比对。加框突出显示了在Ch FATB2的N-末端特异性结构域内被改变以产生Ch FATB2嵌合体Ver4的三个氨基酸。图46B展示D2676的C10:0-C14:0偏好型脂肪酸谱、D3042的C8:0-C10:0脂肪酸谱以及在表达D3129的株系中的几乎不可检测的C10:0积累。图46C.产生D3129的三个氨基酸改变在天然Uc FATB2的同源性模型上被突出显示。还显示包括酶核心的催化三联体(Cys、 His、以及Asn)。

图47A-C.图47A.衍生自Ch FATB2(D3042)、Ca FATB1(D2800)以及Ch FATB2嵌合体Ver5(D3130)的N-末端特异性结构域的序列比对。加框突出显示了在Ch FATB2的N-末端特异性结构域内被改变以产生Ch FATB2嵌合体Ver5的两个氨基酸。图47B展示D2800的C8:0-C12:0偏好型脂肪酸谱、D3042的C8:0-C10:0脂肪酸谱以及在表达D3130的株系中稳健的C8:0-C10:0积累。图47C.产生D3130的两个氨基酸改变在天然Uc FATB2的同源性模型上被突出显示。还显示包括酶核心的催化三联体(Cys、His、以及Asn)连同公开的M230I取代，已经显示M230I取代增强了Cpal FATB1 的酶活性。

图48A-C.图48A.衍生自Ch FATB2(D3042)、Cc FATB4(D1845)以及Ch FATB2嵌合体Ver6(D3131)的N-末端特异性结构域的序列比对。加框突出显示了在Ch FATB2的N-末端特异性结构域内被改变以产生Ch FATB2嵌合体Ver6的十三个氨基酸。图48B展示D1845的C12:0-C14:0偏好型脂肪酸谱、D3042的C8:0-C10:0脂肪酸谱以及在表达D3131的株系中缺少可检测的C10:0积累。图48C.产生D3131的十三个氨基酸改变在天然Uc FATB2的同源性模型上被突出显示。还显示包括酶核心的催化三联体(Cys、 His、以及Asn)。

图49展示Ch FATB2(D3042；pSZ4243)的氨基酸序列。来自原壳小球藻的藻类转运肽是用小写字母标注的并且C-末端FLAG表位标签是用加下划线的大写字母突出显示的。Ch FATB2是用粗体大写字母表示的并且N-末端特异性结构域是加框的。

详细说明

I.引言

提供了变体硫酯酶，它们允许更精细地控制酰基-ACP硫酯酶底物特异性以便在一种脂质产生生物中获得更精确定义的脂肪酸谱。

某些实施例基于以下发现：来自植物的酰基-ACP硫酯酶的N-末端疏水结构域在硫酯酶的成熟和细胞活性中是重要。已经发现这个区域的包含可增加活性，并且在植物硫酯酶之间的结构域的交换可以用来增加低活性硫酯酶中的活性。因此，某些实施例包括向硫酯酶中掺入一个更具活性的疏水结构域的融合蛋白以增加其在细胞中的活性并且由此改变该细胞的脂肪酸谱。还已经发现在FATB硫酯酶中，某些氨基酸在增加TE催化活性中起作用。具体地，对应于SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44的Asn91、Pro92和Pro102的一个或多个氨基酸残基的包含物可以增加硫酯酶活性。

在一些实施例中，可以使用一个接头结构域将该疏水性结构域连接至一种转运肽。该接头结构域的选择如下所述，包括脯氨酸残基的有利包含。

此外，将某些氨基酸取代包含到FATB的催化结构域的N-末端可以改变 FATB酶的脂肪酸偏好，并且由此改变伴随这些氨基酸取代而表达基因的细胞的脂肪酸谱。具体地，对应于SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44的Val127、 Leu133、Ala137、和Ile163的一个或多个氨基酸残基的包含可以改变FATB 硫酯酶的脂肪酸偏好。

可以组合这些发现以产生出一种变体酰基-ACP硫酯酶，该变体酰基- ACP硫酯酶由于疏水结构域的结构域交换和/或突变以及还在新发现的特异性- 改变位置处掺入突变两者而具有增加的活性。任选地，一种变体接头结构域被包含在具有变体疏水结构域和在此披露的新颖变体特异性突变中的一者或两者的变体酰基-ACP硫酯酶中。该结果是一种具有改善的活性或改变的特异性的硫酯酶。

当被掺入一种产油细胞(例如，一种油籽植物、藻类(例如微藻))中时，该变体硫酯酶可以改变细胞的脂肪酸谱以产生新颖或更经济的高价值商业产品。

这些实施例还涵盖在提取油之后来自此类细胞的残留生物质；由这些油制造的油脂化学品、燃料及食品；以及培养这些细胞的方法。在不同实施例中，这些细胞是微藻细胞(包括异养或专性异养细胞)，以及被分类为绿藻门、共球藻纲、小球藻目、小球藻科、或绿藻纲的细胞。这些细胞还可以是植物细胞或微藻细胞。具有II型脂肪酸合成途径的宿主细胞是优选的。尽管以下给出的实例使用四胞藻纲(Trebouxiophyte)桑椹型无绿藻作为宿主细胞，但所披露的这些基因、构建体和方法披露也可以用于油籽作物中。将这些基因导入至此类作物中的方法在本领域中是已知的；参见例如美国专利号 6331664、5512482、5455167、5667997。

II.变体酰基-ACP硫酯酶

可以在具有一种或多种外源基因的遗传构建体和基因工程化产油细胞 (例如植物、藻类、微藻)中使用该变体TE以产生脂肪酸、酰基甘油、或其衍生物。例如，会天然地或通过基因修饰产生高水平脂质的微藻或油籽作物可以被工程化(或进一步工程化)以表达一种外源变体脂酰基-ACP硫酯酶，该硫酯酶可以在脂肪酸合成过程中促进脂肪酸从酰基载体蛋白(ACP)的切割。这些合成的脂肪酸可以被掺入到酰基甘油酯(包括三酰甘油酯(TAG，甘油三酯))中。这些TAG可以被回收或通过在细胞内、或在体外进一步的酶促加工产生其他有用的化合物。

在一个实施例中，基于针对正在生长的(在脂肪酸合成期间)具有特定碳链长度的脂酰基所希望的特异性设计这些变体脂酰基-ACP硫酯酶。一种特异性结构域是基于其对于具体脂酰基ACP底物的偏好和/或针对其影响、增加和/或促进所希望的碳链长度的脂肪酸的生产的能力选择的。通常，这些变体脂酰基-ACP硫酯酶具有用于中链ACP-脂酰基底物(例如以释放C8、C10、 C12、和/或C14脂肪酸)的优先的底物特异性。在不同实施例中，酰基-ACP 硫酯酶的N-末端中的特异性结构域对于C-末端催化结构域是异源的(例如由于点突变和/或结构域交换)。在某些实施例中，脂肪酸链长度底物特异性和/ 或特异性结构域的偏好以及催化结构域是相同的或在1-2个碳之内。例如，在不同实施例中，该变体酰基-酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶(TE)包括：

在不同实施例中，该变体酰基-酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶(TE)包括：

i)来自细叶萼距花酰基-ACP TE的特异性结构域和来自赖特萼距花酰基-ACP TE偏好型TE的催化结构域；

ii)来自樟树酰基-ACP TE的特异性结构域和来自加州月桂酰基-ACP TE偏好型TE的催化结构域；和/或

iii)来自加州月桂酰基-ACP偏好型TE的特异性结构域和来自樟树酰基 -ACP偏好型TE的催化结构域。

在不同实施例中，该特异性结构域包括酰基-ACP TE的N-末端热狗折叠结构域之内的氨基酸子序列，例如对应于SEQ ID NO:43的氨基酸残基125- 163；SEQ ID NO:44的氨基酸残基125-163；SEQ ID NO:45的氨基酸残基 152-190；SEQ ID NO:46的氨基酸残基139-177；SEQ ID NO:47的氨基酸残基 117-155；SEQ ID NO:60的氨基酸残基158-196；或SEQ IDNO:61的氨基酸残基156-194。在不同实施例中，该特异性结构域包括一种基序，该基序包括氨基酸序列

SI(V/L/E)(A/T)(V/L)MN(H/Y/M/I)(L/M/V/F)QE(T/A)(A/S/T)(L/I)N(H/Q)(A/V/C) (K/E/R)(S/I/T/N/C)(V/L/A/T/I/N)G(L/I)(L/S/M)(G/L/D/N/E)(D/N/E)G(F/L)G(T/E/R/S/A)(T/S)(L/P/R)(E/G)M(S/Y/F/C/T)(K/R/L)(R/K/N/M)(D/G/N)L(M/I/F)。

iv)一种特异性结构域，该特异性结构域与选自下组的氨基酸序列包括至少60％的序列一致性，例如至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、 83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％的序列一致性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:43的氨基酸残基125-163和SEQ ID NO:44的氨基酸残基125-163；其中在或对应于位置127处的氨基酸残基是缬氨酸，在或对应于位置133处的氨基酸残基是亮氨酸，在或对应于位置137处的氨基酸残基是丙氨酸并且在或对应于位置163处的氨基酸残基是异亮氨酸，以及一种来自C10:0酰基-ACP 偏好型TE或来自C12:0酰基-ACP偏好型TE的催化结构域；

v)一种特异性结构域，该特异性结构域与选自下组的氨基酸序列包括至少60％的序列一致性，例如至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、 83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％的序列一致性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:43的氨基酸残基125-163和SEQ ID NO:44的氨基酸残基125-163；其中在或对应于位置127处的氨基酸残基是亮氨酸，在或对应于位置133处的氨基酸残基是甲硫氨酸，在或对应于位置137处的氨基酸残基是苏氨酸并且在或对应于位置163处的氨基酸残基是甲硫氨酸，以及一种来自C10:0酰基- ACP偏好型TE或来自C14:0酰基-ACP偏好型TE的催化结构域；和/或

vi)一种特异性结构域，该特异性结构域与SEQ ID NO:61的氨基酸残基156-203包括至少60％的序列一致性，例如至少65％、70％、75％、80％、 81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列一致性，其中在或对应于位置166处的氨基酸残基是谷氨酰胺；在或对应于位置175处的氨基酸残基是苏氨酸；在或对应于位置177处的氨基酸残基是异亮氨酸；在或对应于位置179处的氨基酸残基是亮氨酸；在或对应于位置186处的氨基酸残基是亮氨酸；在或对应于位置190处的氨基酸残基是赖氨酸；在或对应于位置198 处的氨基酸是异亮氨酸并且在或对应于位置203处的氨基酸是赖氨酸，以及一种来自C8:0酰基-ACP偏好型TE或来自C12:0酰基-ACP偏好型TE的催化结构域。

vii)一种特异性结构域，该特异性结构域与SEQ ID NO:61的氨基酸残基156-193包括至少60％的序列一致性，例如至少65％、70％、75％、80％、 81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列一致性；其中在或对应于位置163处的氨基酸残基是酪氨酸，或者在或对应于位置186处的氨基酸残基是脯氨酸；以及一种来自C8:0酰基-ACP偏好型TE、来自C10:0酰基-ACP 偏好型TE或来自C12:0酰基-ACP偏好型TE的催化结构域。

在实施例中，其中该特异性结构域与选自下组的氨基酸序列包括至少60％的序列一致性，例如至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、 85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％的序列一致性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:43的氨基酸残基125-163和SEQ ID NO:44的氨基酸残基125-163，当在或对应于位置91处的氨基酸残基是天冬酰胺、在或对应于位置92处的氨基酸是脯氨酸并且氨基酸位置102是脯氨酸时，可以增加、提高和/或促进到变体酰基-ACP 硫酯酶的成熟形式的切割。

可替代地，或此外，为了增加变体酰基-ACP硫酯酶在宿主细胞中的表达水平和/或增加酶活性，该变体酰基-ACP硫酯酶可以表达为具有相对于特异性结构域在N-末端定位的疏水结构域。在不同实施例中，该疏水结构域的N-末端氨基酸残基是亮氨酸。在不同实施例中，该疏水结构域的N-末端氨基酸残基是脯氨酸。在一个实施例中，如果适宜，包括疏水性结构域的子序列的长度可以是15、16、17、或18个氨基酸。在不同实施例中，该特异性结构域是在对应于以下项的酰基-ACP TE的N-末端那一半之内的氨基酸子序列：SEQ IDNO:43的氨基酸残基61-77；SEQ ID NO:44的氨基酸残基61-77；SEQ ID NO:45的氨基酸残基85-101；SEQ ID NO:46的氨基酸残基78-95；SEQ ID NO:47的氨基酸残基50-66；SEQ ID NO:60的氨基酸残基91-107；或SEQ ID NO:61的氨基酸残基90-106。在不同的实施例中，该疏水结构域包括一种基序，该基序包括氨基酸序列(L/- )(P/H)(G/D/V)(W/L)(S/N)(M/R/V)(P/L/S)(L/F)(E/A/T/S)(L/A/K)(I/V)TT(I/V)F(S/ L/V/G)(A/K/V)(A/P)。如在此所描述和证明的，该疏水性结构域可以但不需要包括一个N-末端亮氨酸残基。

已经发现又另一个方式可增加硫酯酶对宿主细胞的脂肪酸谱的影响。变体酰基-ACP硫酯酶可以表达为具有相对于疏水结构域在N-末端定位的接头结构域。该接头结构域可以富含脯氨酸。该接头结构域可以单独地使用，或与以上所讨论的疏水结构域以及赋予特异性的变化中的一者或两者组合使用。在其中该变体酰基-ACP包括一种转运肽或信号肽(例如一种质体转运肽)的实施例中，该接头结构域是相对于该转运肽在C-末端定位的(例如从N-至C- 末端，该接头结构域被定位在一种转运肽(当存在时)和一种疏水性结构域之间)。在不同实施例中，该酰基-ACP接头结构域是富含脯氨酸的并且包括 3、4、5、6或更多个脯氨酸残基。在不同实施例中，该接头结构域包括在N- 末端那一半的酰基-ACP-TE之内的氨基酸子序列，该氨基酸子序列对应于从来自酰基-ACP-TE子序列的C-末端向N-末端延伸的至少5个氨基酸残基，例如至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个残基并且对应于选自下组的残基，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:43的氨基酸残基43-59；SEQ ID NO:44的氨基酸残基43-59；SEQ ID NO:45的氨基酸残基49-83；SEQ ID NO:46的氨基酸残基53-77；SEQ ID NO:47的氨基酸残基15-48；SEQ ID NO:60的氨基酸残基57-89；以及SEQ ID NO:61的氨基酸残基56-88。

在不同实施例中，包括该接头结构域的子序列包括：

在不同实施例中，该变体酰基-ACP硫酯酶可以进一步包含一种信号肽或一种转运肽。在不同实施例中，该转运肽将该变体酰基-ACP硫酯酶引导至一种质体，例如叶绿体。在不同实施例中，该质体转运肽包括一种选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：MATASTFSAFNARCGDLRRSAGSGPRRPARPLPVRGRA， SGPRRPARPLPVR，SGPRRPARPLPVRAAIASEVPVATTSPR， RPARPLPVRGRA，RPARPLPVRAAIASEVPVATTSPR，RCGDLRRSAGSGPRRPARPLPVRGRA， RCGDLRRSAGSGPRRPARPLPVRAAIASEVPVATTSPR，PARPLPVR，PARPLPVRAAIASEVPVATTSPR，RRPARPLPVR，以及 RRPARPLPVRAAIASEVPVATTSPR。其他质体转运序列在本领域中是已知的，并且在以下进一步详细描述。

在不同实施例中，该多核苷酸编码一种变体酰基-ACP硫酯酶，该变体酰基-ACP硫酯酶具有与C-末端区域或与催化结构域是异源的N-末端区域，并且包括来自选自下组的酰基-ACP TE的疏水结构域和/或特异性结构域，该组由以下各项组成：加州月桂脂酰基-ACP硫酯酶(例如GenBank登录号 AAC49001、Q41635、M94159)，樟树脂酰基-ACP硫酯酶(例如GenBank 登录号Q39473；U31813)，肉豆蔻脂酰基-ACP硫酯酶(例如GenBank登录号AAB71729、AAB71730、AAB717291.1)，油棕脂酰基-ACP硫酯酶(例如GenBank登录号ABD83939、AAD42220、AAL15645)，毛白杨脂酰基- ACP硫酯酶(例如GenBank登录号ABC47311)，拟南芥脂酰基-ACP硫酯酶 (例如GenBank登录号NP_172327、CAA85387、CAA85388)，拟南芥脂酰基-ACP硫酯酶(例如GenBank登录号)，陆地棉脂酰基-ACP硫酯酶(例如 GenBank登录号AAD01982、Q9SQI3)，赖特氏萼距花脂酰基-ACP硫酯酶 (例如GenBank登录号U56103、Q39663)，披针叶萼距花脂酰基-ACP硫酯酶(例如GenBank登录号CAA54060、CAB60830、CAC19933)，细叶萼距花脂酰基-ACP硫酯酶(例如GenBank登录号AAC72882、U39834、Q39513、 Q39514、AAC49269)，美叶萼距花亚种(Cuphea calophylla subsp.)mesostemon脂酰基-ACP硫酯酶(例如GenBank登录号ABB71581)，湿地萼距花脂酰基-ACP硫酯酶(例如GenBank登录号AAC49180；AAC49179)，葡萄脂酰基-ACP硫酯酶(例如GenBank登录号CAN81819)，山竹脂酰基- ACP硫酯酶(例如GenBank登录号AAB51525)，芥菜脂酰基-ACP硫酯酶 (例如GenBank登录号ABI18986)，长叶马府油树脂酰基-ACP硫酯酶(例如GenBank登录号AAX51637)，甘蓝型油菜脂酰基-ACP硫酯酶(例如 GenBank登录号ABH11710；CAA52070.1)，水稻(籼型栽培品种组)脂酰基-ACP硫酯酶(例如GenBank登录号EAY86877)，水稻(粳型栽培品种组) 脂酰基-ACP硫酯酶(例如GenBank登录号NP_001068400)，水稻(籼型栽培品种组)脂酰基-ACP硫酯酶(例如GenBank登录号EAY99617)，美洲榆脂酰基-ACP硫酯酶(例如GenBank登录号AAB71731、O24420)，德国鸢尾脂酰基-ACP硫酯酶(例如GenBank登录号AAG43858、AAG43858.1)、蓖麻脂酰基-ACP硫酯酶(例如GenBank登录号ABS30422.1)，向日葵酰基- ACP硫酯酶(例如GenBank登录号AAL79361.1)，麻疯树酰基-ACP硫酯酶 (例如GenBank登录号ABX82799.3)，玉米油酰基-酰基载体蛋白硫酯酶(例如GenBank登录号ACG40089.1)、以及雨生红球藻脂酰基-ACP硫酯酶 (例如GenBank登录号HM560034.1)。

在具体实施例中，该变体酰基-ACP硫酯酶包含一个选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、 SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、以及SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:26； SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:34；SEQID NO:36；SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51；SEQ ID NO:53；SEQ ID NO:55； SEQ ID NO:57以及SEQ ID NO:59。

在具体实施例中，该变体酰基-ACP硫酯酶是由选自下组的氨基酸序列编码的，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、以及SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQID NO:23、SEQ ID NO:25； SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50；SEQ ID NO:52；SEQ ID NO:54； SEQ ID NO:56以及SEQ ID NO:58。

III.微生物工程-表达盒和载体

启动子、cDNA和3’UTR以及其他载体元件可以通过使用从天然来源分离的片段的克隆技术来生成(参见例如格林(Green)和萨姆布鲁克 (Sambrook)，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第四版，2012，冷泉港出版社(ColdSpring Harbor Press)；以及美国专利号4,683,202)。可替代地，可以使用已知方法合成地生成元件(参见例如《基因》(Gene)，1995年10月16；164(1):49-53)。

A.针对表达的密码子优化

编码要在微生物(例如一种变体酰基-ACP硫酯酶)中表达的多肽的 DNA可以是密码子优化的cDNA。再编码用于在微藻中表达的基因的方法描述于美国专利号7,135,290中。密码子优化的额外信息是可获得的，例如，在 kazusa.or.jp/codon/的密码子使用数据库处获得。在美国专利公开号 2012/0283460中还提供了用于无绿藻属优选的密码子使用的表，出于所有目的将这个文献通过引用以其全文结合在此。

B.启动子

许多启动子在微藻中有活性，包括相对于正在转化的微藻为内源的启动子，以及相对于正在转化的藻类不是内源的启动子(即，来自其他藻类的启动子、来自高等植物的启动子和来自植物病毒或藻类病毒的启动子)。在微藻中有活性的外源和/或内源启动子以及在微藻中有作用的抗生素抗性基因由以下项进行描述：例如，《当代微生物学》(CurrMicrobiol.)1997年12月；35(6):356-62(普通小球藻)；《海洋生物技术》(Mar Biotechnol)(NY)， 2002年1月；4(1):63-73(椭圆小球藻)；《分子遗传学和基因组》(Mol Gen Genet.)1996年10月16日；252(5):572-9(三角褐指藻)；《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol.)1996年4月；31(1):1-12(强壮团藻(Volvox carteri))；《美国国家科学院院刊》(Proc NatlAcad Sci USA)，1994年 11月22日；91(24):11562-6(强壮团藻)；法尔西亚特(FalciatoreA)，卡索特提(Casotti)，勒布朗(Leblanc)C，阿布雷西亚(Abrescia)C，鲍勒 (Bowler)C，PMID：10383998，1999年5月；1(3):239-251(植物分子生物学实验室，StazioneZoologica,VIIIa Comunale,I-80121那不勒斯(Naples)，意大利(Italy))(三角褐指藻和威氏海链藻)；《植物生理学》 (PlantPhysiol.)2002年5月；129(1):7-12.(紫球藻属)；《美国国家科学院院刊》(Proc Natl Acad Sci USA.)2003年1月21日；100(2):438-42.(莱茵衣藻)；《美国国家科学院院刊》(Proc Natl Acad Sci USA).1990年2月； 87(3):1228-32.(莱茵衣藻)；《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)1992年1 月25日；20(12):2959-65；《海洋生物技术》(Mar Biotechnol)(NY).2002 年1月；4(1):63-73(小球藻属)；《生物化学与分子生物学国际》 (Biochem Mol Biol Int.)1995年8月；36(5):1025-35(莱茵衣藻)；《微生物学杂志》(J.Microbiol.)2005年8月；43(4):361-5(杜氏藻属)；《遗传学报》(Yi Chuan XueBao).2005年4月；32(4):424-33(杜氏藻属)；《海洋生物技术》(Mar Biotechnol)(NY)，1999年5月；1(3):239-251.(海链藻属和褐指藻属)；科沙诺夫(Koksharova)，《应用微生物学生物技术》 (Appl Microbiol Biotechnol)2002年2月；58(2):123-37(不同种类)；《分子遗传学与基因组学》(Mol Genet Genomics)，2004年2月；271(1):50-9 (嗜热细长聚球藻)；《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)(2000)，182,211- 215；《FEMS微生物学》(FEMSMicrobiol Lett.)2003年4月25日；221(2): 155-9；《植物生理学》(PlantPhysiol.)1994年6月；105(2):635-41；《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol.)1995年12月；29(5):897-907(聚球藻属 PCC 7942)；《海洋污染学志》(Mar Pollut Bull.)2002；45(1-12):163-7 (鱼腥藻属PCC 7120)；《美国国家科学院院刊》(Proc Natl Acad Sci USA.) 1984年3月；81(5):1561-5(鱼腥藻属(不同株系))；《美国国家科学院院刊》(Proc Natl Acad Sci USA.)2001年3月27；98(7):4243-8(集胞藻属)；维尔特(Wirth)，《分子遗传学和基因组》(Mol GenGenet.)1989年3月； 216(1):175-7(不同种类)；《分子微生物学》(Mol Microbiol)，2002年6 月；44(6):1517-31以及《质粒》(Plasmid)，1993年9月；30(2):90-105 (Fremyelladiplosiphon)；霍尔(Hall)等人(1993)《基因》(Gene)124: 75-81(莱茵衣藻)；格鲁伯(Gruber)等人(1991)《现代微生物学》(Current Micro.)22:15-20；贾维斯(Jarvis)等人(1991)《现代遗传学》 (Current Genet.)19:317-322(小球藻属)；对于另外的启动子还参见自美国专利号6,027,900的表1)。

用来表达外源基因的启动子可以是与这个基因天然连接的启动子或可以是异源基因。一些启动子在多于一个微藻物种中有活性的。其他启动子是种类特异性的。说明性的启动子包括来自莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) 的启动子(如RBCS2)，和已经显示在多个微藻物种中有活性的病毒启动子 (如花椰菜花叶病毒(CMV)和小球藻病毒)(参见例如《植物细胞报告》 (Plant Cell Rep)，2005年3月；23(10-11):727-35；《微生物学杂志》(J. Microbiol.)2005年8月；43(4):361-5；《海洋生物技术》(Mar Biotechnol) (NY)2002年1月；4(1):63-73)。在其他实施例中，可以使用丛粒藻属苹果酸脱氢酶启动子、或莱茵衣藻RBCS2启动子。任选地，使用含有启动子的这些序列的至少10、20、30、40、50、或60个或更多个核苷酸。在不同实施例中，在表达盒中使用的启动子相对于小球藻属的物种是内源的。

可用于在小球藻属中表达外源基因的启动子包括小球藻属HUP 1基因的启动子以及椭圆小球藻硝酸还原酶启动子，小球藻病毒启动子也可以用来在小球藻中表达基因，描述于美国专利号6,395,965。在小球藻属中有活性的其他启动子可以在例如《生物化学与生物物理研究通讯》(Biochem Biophys Res Commun.)，1994年10月14日；204(1):187-94；《植物分子生物学》 (Plant Mol Biol.)，1994年10月；26(1):85-93；《病毒学》(Virology.)， 2004年8月15日；326(1):150-9；以及《病毒学》，2004年1月5日； 318(1):214-23中找到。

C.选择性标记

在对于转化微藻有用的转基因构建体中可以使用广泛的多种选择性标记中的任一种。适合的选择性标记的实例包括蔗糖转化酶基因、硝酸还原酶基因、潮霉素磷酸转移酶基因(HPT)、新霉素磷酸转移酶基因、以及赋予腐草霉素抗性的ble基因。确定微藻对抗生素敏感性的方法是熟知的。例如，《分子遗传学和基因组》(Mol Gen Genet)，1996年10月16；252(5):572-9。以下实例说明了蔗糖转化酶在无绿藻属的株系中作为选择性标记的用途。

D.诱导型表达

本发明还提供了诱导型启动子来表达感兴趣基因的用途。具体地，诱导型启动子用以表达一种变体酰基-ACP硫酯酶基因的用途允许在微生物生长后当条件已经被调整时产生变体酰基-ACP硫酯酶。

有用的诱导型启动子包括以下这些启动子，它们介导可操作地连接的基因响应于刺激(如外源提供的小分子(例如，葡萄糖)、温度(热或冷)、光，等等)的转录。合适的启动子可以激活基本上沉默的基因的转录，或例如大幅度地上调以低水平转录的可操作地连接的基因的转录。在后者情况下，酰基-ACP硫酯酶的转录的水平不显著干扰对它进行表达的微生物的生长。

E.两种或更多种外源基因的表达

此外，一种基因工程化的微生物(如微藻)可以包含并表达两种或更多种外源性基因，如例如，变体脂酰基-ACP硫酯酶和编码溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)的基因。一种或两种基因可以使用诱导型启动子表达，这允许控制这些基因表达的相对时间安排以增强脂质生产和转化成脂肪酸酯。两种或更多种外源基因的表达可以在相同的诱导型启动子控制之下或者在不同的诱导型启动子控制之下。在后一种情况下，可以诱导第一外源基因表达持续第一时间段(在此期间，可以诱导或可以不诱导第二外源基因的表达)，并且可以诱导第二外源基因表达持续第二时间段(在此期间，可以诱导或可以不诱导第一外源基因的表达)。在此提供的是载体以及用于工程化产生脂质的微生物以代谢蔗糖的方法，其是一种有利的性状，因为它允许这些工程化细胞将甘蔗原料转化为脂质。

适合用于本发明中的另外的修饰的实例包括基因工程化微藻株系以表达两种或更多种外源基因，一种编码固定碳源(例如蔗糖)的转运蛋白并且第二种编码蔗糖转化酶。所得到的可发酵生物以比已经通过先前已知的生物烃生产方法可获得的制造成本更低的制造成本产生烃。上文描述的两种外源基因的插入可以与通过定向和/或随机诱变破坏多糖生物合成相组合，这甚至使更多的碳流转向进入烃生产。单独和组合地，营养型转换、改变烃产生的工程化、以及用外源酶处理改变了由微生物产生的烃组成。这种改变可以是以下方面的变化：所产生烃的量、所产生的一种或多种烃种类相对于其他烃的量、和/或在微生物中产生的烃种类的类型。例如，可以将微藻工程化以产生更高量和/或百分比的TAG。

F.区室化表达

本发明还提供了感兴趣基因的区室化表达。在一些实施例中，可能所希望的是将酰基-ACP硫酯酶的表达靶向至一个或多个细胞区室。用于靶向的说明性细胞器是脂质体、质体(包括叶绿体)、线粒体、以及内质网。

1.表达并靶向至质体

可以使用质体靶向信号，将无绿藻的核基因组中表达的蛋白质靶向到质体。小球藻内源的质体靶向序列是已知的，如小球藻核基因组中编码靶向到该质体的蛋白的基因；参见，例如GenBank登录号AY646197和AF499684，并且在一个实施例中，此类控制序列用于本发明的载体中以便将蛋白质表达靶向至无绿藻属质体。

以下实例描述了藻质体靶向序列将异源蛋白质靶向到宿主细胞内正确区室的用途。cDNA文库是使用桑椹型无绿藻和原壳小球藻细胞制得，并且描述于美国专利公开号2012/0283460的实例中以及PCT申请号PCT/US 2009/066142中。从重组表达的变体酰基-ACP硫酯酶的有用的质体靶向的 cDNA文库中鉴定的藻类质体靶向序列的氨基酸序列提供于美国专利公开号 2012/0283460中以及此处。在不同实施例中，该质体转运肽包括一种选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成： MATASTFSAFNARCGDLRRSAGSGPRRPARPLPVRGRA， SGPRRPARPLPVR，SGPRRPARPLPVRAAIASEVPVATTSPR， RPARPLPVRGRA，RPARPLPVRAAIASEVPVATTSPR， RCGDLRRSAGSGPRRPARPLPVRGRA， RCGDLRRSAGSGPRRPARPLPVRAAIASEVPVATTSPR，PARPLPVR， PARPLPVRAAIASEVPVATTSPR，RRPARPLPVR，以及RRPARPLPVRAAIASEVPVATTSPR。

在本发明的一个实施例中，将在微生物中的多肽的表达靶向到叶绿体。用于将异源基因的表达靶向至叶绿体的方法是已知的并且可以用于本发明。用于将基因产物靶向至叶绿体的方法描述于舍里尔(Shrier)等人，《欧洲分子生物学学会杂志》(EMBO J.)(1985)4:25 32。还参见多马伊(Tomai) 等人《遗传生物化学》(Gen.Biol.Chem.)(1988)263:15104 15109以及美国专利号4,940,835针对使用转运肽用于将核基因产物转位至叶绿体中。用于指导蛋白转运至叶绿体的方法还综述于Kenauf TIBTECH(1987)5:40 47。小球藻内源的叶绿体靶向序列是已知的，如小球藻核基因组中编码靶向到该叶绿体的蛋白的基因；参见，例如GenBank登录号AY646197和AF499684。

瓦赫宁根UR-国际植物研究所(Wageningen UR-Plant Research International)出售一种IMPACTVECTOR1.4载体，该载体使用菊花 (Chrysanthemum morifolium)小亚基蛋白的分泌信号以将异源蛋白递送至叶绿体基质(细胞质)环境中，穿梭经过双层膜体系。将该蛋白与成熟的核酮糖二磷酸羧化酶(rubisco)蛋白的前11个氨基酸融合，以便允许信号肽的适当加工(王(Wong)等人，《植物分子生物学》(Plant Molecular Biology) 20:81-93(1992))。该信号肽包含来自RbcS基因的天然内含子。

在另一种方法中，将叶绿体基因组基因工程化以表达异源蛋白。已经描述了用包被有外源DNA的高速度钨微弹轰击受体细胞对莱茵衣藻(一种绿藻) 的叶绿体进行稳定转化。参见，例如博因顿(Boynton)等人，《科学》 (Science)(1988)240:1534 1538；布洛尔斯(Blowers)等人《植物细胞》 (Plant Cell)(1989)1:123 132以及德比希(Debuchy)等人，《欧洲分子生物学学会杂志》(EMBO J.)(1989)8:2803 2809。使用钨微弹的转化技术由克莱恩(Klein)等人，《自然》(Nature)(伦敦)(1987)7:70 73描述。用于植物和微藻两者的其他叶绿体转化方法是已知的。参见例如美国专利号5,693,507；6,680,426；和《植物生理学》(Plant Physiol.)2002年5月； 129(1):7-12；以及《植物生物技术杂志》(PlantBiotechnol J.)2007年5月； 5(3):402-12。

如在美国专利号6,320,101(2011年11月20颁布给卡普兰(Kaplan)等人；将其通过引用结合在此)，可以将细胞进行化学处理以便将每个细胞的叶绿体数降至约1。然后，可以经由粒子轰击将该异源核酸导入细胞中，目的是将至少一个异源核酸分子导入叶绿体中。选择异源核酸，使得其能够通过同源重组被整合到叶绿体的基因组中，该同源重组通过叶绿体固有的酶容易地实现。为此，该异源核酸除包括感兴趣基因之外，还包括至少一种衍生自叶绿体基因组的核酸序列。此外，该异源核酸典型地包括一种选择性标记。涉及这种技术的其他细节发现于美国专利号4,945,050和5,693,507中，将其通过引用结合在此。因此，可以通过叶绿体的蛋白质表达系统产生多肽。

美国专利号7,135,620(2006年11月14日颁布给丹尼尔(Daniell)等人；通过引用结合在此)描述了叶绿体表达载体和相关方法。典型的表达盒包含以下组分：来自微生物基因或叶绿体基因(如psbA)的5'非翻译区，其将提供编码感兴趣多肽的DNA序列在叶绿体中的转录和翻译；编码感兴趣多肽的 DNA序列；以及翻译和转录终止区，如叶绿体基因的3'反向重复区，其可以稳定被导入的基因的RNA，从而增强外源基因表达。该表达盒可以任选地包括一种抗生素抗性基因。

典型地，该表达盒侧翼是用于插入适当基因组中的便利限制性位点。该表达盒侧翼可以是来自叶绿体DNA的DNA序列，以有利于将表达盒稳定地整合到叶绿体基因组中，尤其是通过同源重组整合。可替代地，该表达盒可以保持未整合，在这种情况下，该表达盒典型地包括一个叶绿体复制起点，该复制起点能够提供异源DNA在叶绿体中复制。

该表达盒通常包括来自能够在叶绿体中表达的基因的启动子区。该启动子区可以包括可获得自叶绿体基因(如来自菠菜或豌豆的psbA基因)的启动子、或来自玉米的rbcL和atpB启动子区和Rma启动子。启动子的实例描述于汉利-鲍登(Hanley-Bowdoin)和蔡氏(Chua)，TIBS(1987)12:67 70；米莱(Mullet)等人，《植物分子生物学》(Plant MolecBiol.)(1985)4:39 54；汉利-鲍登(1986)《博士学位论文》(PhD.Dissertation)，洛克菲勒大学(the Rockefeller University)；克莱勃斯(Krebbers)等人，《核酸研究》 (NucleicAcids Res.)(1982)10:4985 5002；孜拉瓦克(Zurawaki)等人，《核酸研究》(1981)9:32513270；以及孜拉瓦克等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Nat'l Acad.Sci.)美国(1982)79:7699 7703。可以鉴定其他启动子并通过以下方式评价如此鉴定的启动子的相对强度：将感兴趣的启动子置于无启动子的标记基因的5'处，并且观察其相对于从一种相对强的叶绿体启动子(例如，来自psbA基因的启动子)获得的转录的效力。异源基因表达的效率另外可以通过多种技术中的任一种来增强。这些技术包括使用串联插入到异源基因的5'处的多个启动子，例如双psbA启动子，增强子序列的添加等等。

可以使用在小球藻属叶绿体中有活性的多种启动子用于在小球藻属叶绿体中表达外源基因，如发现于GenBank登录号NC001865(普通小球藻叶绿体，全基因组)中的那些启动子。

当所希望的是提供异源基因的诱导型表达时，表达盒中可以包含如下序列的诱导型启动子和/或5'非翻译区，这些序列提供在转录和/或翻译(在3'端) 水平上的调节。例如，5'非翻译区可以来自一种其中表达可受光调控的基因。类似地，3'反向重复区可以用来稳定异源基因的RNA。可以通过应答特定的感兴趣刺激增强的表达和在不存在该刺激时低或无表达来鉴定诱导型基因。例如，在用光辐照期间发生增强的表达，而在低光或无光中发生大幅降低的表达或无表达的情况下，可以鉴定光诱导型基因。来自绿色微藻的光调节型启动子是已知的(参见例如《分子遗传学与基因组学》(Mol Genet Genomics)，2005年12月；274(6):625-36)。

使用的终止区将主要是一种便利的终止区，因为该终止区显现在叶绿体和细菌之间是相对可互换的。终止区可以相对于转录起始区是天然的，可以相对于感兴趣DNA序列是天然的，或可以是从另一个来源可获得的。参见例如，陈和奥罗斯科(Chen和Orozco)，《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)， (1988)16:8411。

可以通过多种方法中的任一种将这些表达盒转化至感兴趣的植物细胞中。这些方法包括例如生物射弹法(参见例如桑福德(Sanford)，《生物技术趋势》(Trends InBiotech)，(1988)6:299 302，美国专利号4,945,050；电穿孔(弗罗姆(Fromm)等人，《美国科学院院刊》(Proc.Nat'l.Acad.Sci) (美国)(1985)82:5824 5828)；使用激光束、显微注射或能够将DNA导入叶绿体中的任何其他方法。

适用于微生物(如微藻)的叶绿体表达载体的另外的描述发现于美国专利号7,081,567(2006年7月25日颁布给薛(Xue)等人)；6,680,426(2004 年1月20日颁布给丹尼尔(Daniell)等人)；以及5,693,507(1997年12月 2日颁布给丹尼尔等人)中。

可以使用叶绿体靶向信号，将小球藻属的核基因组中表达的蛋白质靶向到该叶绿体。小球藻内源的叶绿体靶向序列是已知的，如小球藻核基因组中编码靶向到该叶绿体的蛋白的基因；参见，例如GenBank登录号AY646197 和AF499684。还可以通过将基因直接插入叶绿体基因组中，在小球藻属叶绿体中表达蛋白质。叶绿体转化典型地通过同源重组发生，并且如果用于创建靶向载体的叶绿体基因组序列是已知时可以进行(参见例如小球藻属叶绿体的全基因组序列；Genbank登录号NC001865)。

G.转化

可以通过任何适合的技术转化细胞，所述技术例如包括生物射弹 (biolistics)、电穿孔、玻璃珠转化(glass bead transformation)和碳化硅晶须转化(silicon carbidewhisker transformation)。

可以通过本领域技术人员熟悉的已知技术制备用于根据本发明的微生物的转化的载体。在一个实施例中，用于在微生物(如微藻)中表达酰基-ACP 硫酯酶基因的示例性载体设计包含编码酰基-ACP硫酯酶的基因，该基因与微藻中有活性的启动子可操作地连接。可替代地，如果这种载体不含与感兴趣基因可操作连接的启动子，则可以将该基因转化入细胞，从而它在载体整合时变成与内源启动子可操作连接。已经证明无启动子的转化方法在微藻(参见例如《植物杂志》(Plant Journal)14:4，(1998)，第441-447页)中有效。该载体还可以包含编码一种蛋白质的第二基因，该蛋白质例如赋予对抗生素或除草剂的抗性，即，一种选择性标记。任选地，一种或两种基因后接包含多聚腺苷酸化信号的3'非翻译序列。编码这两种基因的表达盒可以物理地连接在载体中或在分开的载体上。还可以使用微藻的共转化，其中将不同载体分子同时用于转化细胞(参见例如《原生生物》(Protist)2004 12月； 155(4):381-93)。可任选地基于在抗生素或其他选择性标记的存在下在缺少抗性盒的细胞将不会生长的条件下生长的能力来选择这些转化细胞。

IV.宿主细胞-生产油或生产脂质的微生物

可以使用生产适合的脂质和/或烃的任何物种的生物,但优选天然生产高水平的适合的脂质和/或烃的微生物。通过微生物生产烃由梅茨格(Metzger) 等人《应用微生物学与生物技术》(Appl Microbiol Biotechnol)(2005)66: 486-496以及《美国能源部水生生物计划回顾：来自藻类的生物柴油》(A Look Back at the U.S.Department of Energy'sAquatic Species Program:Biodiesel from Algae)，NREUTP-580-24190，约翰希恩(JohnSheehan)，特里度纳罕 (Terri Dunahay)，约翰本曼(John Benemann)以及保罗罗斯勒(Paul Roessler)(1998)综述。

除了产生适合的脂质或烃用于生产油、燃料和油脂化学品之外，对于选择微生物的考虑包括：(1)呈细胞重量百分比的高脂质含量；(2)生长方便性； (3)基因工程化方便性；以及(4)生物质加工方便性。在具体实施例中，野生型或基因工程化的微生物产生了含有至少40％、至少45％、至少50％、至少 55％、至少60％、至少65％或至少70％或更多脂质的细胞。优选的生物(在不存在光时依赖糖)异养生长或可以使用例如在此所披露的方法被工程化以进行异养生长。转化的方便性性以及选择性标记和在微生物中有功能的组成型或诱导型启动子的可获得性影响基因工程化的方便性。加工考虑可包括例如裂解细胞的有效手段的可用性。

A.藻类

在本发明的一个实施例中，该微生物是微藻。可以用于表达变体酰基- ACP硫酯酶的微藻的非限制性实例包括例如东方曲壳藻、阿格门氏藻属 (Agmenellum)、透明苗形藻(Amphiprora hyaline)、咖啡形双眉藻、咖啡形线状双眉藻、咖啡形双眉藻斑点变种(Amphora coffeiformis punctata)、泰勒氏咖啡形双眉藻、咖啡形细薄双眉藻、优美双眉藻、柔弱头状双眉藻属、双眉藻属、鱼腥藻、纤维藻属、镰形纤维藻、黄金色藻(Boekeloviahooglandii)、波氏藻属(Borodinella sp.)、布朗丛粒藻、苏台德克斯丛粒藻(Botryococcus sudeticus)、米诺尔丛粒藻(Bracteococcus minor)、 Bracteococcusmedionucleatus、四鞭藻属、纤细角毛藻、牟氏角毛藻、三角牟氏角毛藻、角毛藻属、无硝小球藻(Chlorella anitrata)、南极洲小球藻、黄绿小球藻、念球菌小球藻、囊状小球藻、干燥小球藻、髓圆形小球藻、浮水小球藻、淡褐小球藻、淡褐小球藻空泡变种、格鲁克特法小球藻(Chlorella glucotropha)、水溪小球藻、水溪海岸螺亚目小球藻变种、水溪小球藻增大变种(Chlorella infusionum var.auxenophila)、纺锤小球藻、匍扇小球藻(Chlorella lobophora)(株系SAG 37.88)、柠檬小球藻、黄绿柠檬小球藻变种、黄衣柠檬小球藻变种、小枝小球藻、极微小球藻、突变小球藻、夜间小球藻、Chlorella ovalis、微细小球藻、嗜光小球藻、勃氏小球藻、原壳小球藻(包括任何UTEX株系1806、411、264、256、255、250、249、31、29、 25)、原壳小球藻酸居变种、规则小球藻、规则小球藻极小变种、规则小球藻伞状变种、瑞氏小球藻(Chlorella reisiglii)、嗜糖小球藻、海洋小球藻捕圆变种、海水小球藻、单纯小球藻、耐热性小球藻、小球藻属、球抱小球藻、痣苔蛾属小球藻、万尼氏小球藻、普通小球藻、粗皮普通小球藻、普通小球藻自养变体、普通小球藻绿色变种、普通小球藻普通变种、粗皮普通小球藻普通变种、普通小球藻普通变种绿色变型(Chlorella vulgaris var.vulgaris f. viridis)、黄色小球藻(Chlorella xanthella)、左氏小球藻(Chlorella zofingiensis)、他伯氏小球藻(Chlorella trebouxioides)、普通小球藻、水溪绿球藻、绿球藻属、绿梭藻属、蓝隐藻属、金球藻属、球钙板藻属、寇氏隐甲藻、隐藻属、隐秘小环藻、梅尼小环藻、小环藻属、杜氏藻属、巴氏杜氏藻、双绿球杜氏藻、颗粒状杜氏藻、海生杜氏藻、微小杜氏藻、巴夫杜氏藻、皮尔斯杜氏藻、普林莫杜氏藻(Dunaliella primolecta)、盐生杜氏藻、陆生杜氏藻、杜氏盐藻、绿色杜氏藻、特氏杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)、绿色独球藻、独球藻属、后棘藻属、裸藻属、披剌藻属、绿色脆杆藻、脆杆藻属、蓝鼓藻属、丝藻属、膜胞藻属、等鞭金藻球亲近种(Isochrysisaff.Galbana)、球等鞭金藻、鳞孔藻属、微星藻属、微星藻属(UTEX LB 2614)、微小单针藻、单针藻属、侏囊菌属、盐生微绿球藻、微绿球藻属、截形舟形藻、毕氏舟形藻(Naviculabiskanterae)、假特氏舟形藻(Navicula pseudotenelloides)、具膜舟形藻(Naviculapelliculosa)、腐生舟形藻(Navicula saprophila)、舟形藻属、肾鞭藻属、肾藻属、普通菱形藻(Nitschia communis)、亚历山大菱形藻、普通菱形藻(Nitzschia communis)、细端菱形藻、碎片菱形藻、汉氏菱形藻、平庸菱形藻、中型菱形藻、小头菱形藻、微小菱形藻、椭圆微小菱形藻、单刀形微小菱形藻、四边形菱形藻、菱形藻属、棕鞭藻属、小卵囊藻、卵泡藻、卵囊藻属、沼泽颤藻、颤藻属、拟短形颤藻、凯氏拟小球藻 (ParaChlorella kessleri)、酸杜氏藻、巴夫藻属、噬菌体属、席藻属、扁藻、颗石藻、齿状颗石藻、颗石藻属、威克海姆无绿藻、雍滞无绿藻(Prototheca stagnora)、波多黎各无绿藻属、桑椹型无绿藻、饶氏无绿藻、水生假小球藻 (Pseudochlorella aquatica)、塔胞藻属(Pyramimonas sp.)、桑堪藻属(Pyrobotrys)、混浊红球菌(Rhodococcus opacus)、囊状金藻(Sarcinoid chrysophyte)、被甲栅藻(Scenedesmus armatus)、裂壶藻属 (Schizochytrium)、水绵属(Spirogyra)、钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)、裂丝藻属(Stichococcus sp.)、聚球藻属(Synechococcus sp.)、四角藻属 (Tetraedron)、四月藻属(Tetraselmis sp.)、司西四爿藻(Tetraselmis suecica)、威氏海链藻(Thalassiosira weissflogii)、以及Viridiellafridericiana。

说明性宿主细胞的特征在于产油细胞，这些产油细胞产生改变的脂肪酸谱和/或甘油脂中改变的脂肪酸区域特异性分布；以及由这些细胞产生的产物。产油细胞的实例包括了具有II型脂质生物合成途径的微生物细胞，包括质体产油细胞，如产油藻类的那些。细胞的特定实例包括绿藻门、四胞藻纲、小球藻目或小球藻科的异养或专性异养微藻。产油微藻的实例提供于公开的 PCT专利申请WO 2008/151149、WO 2010/06032、WO 2011/150410及WO 2011/150411中，包括了小球藻属和无绿藻属(一种包括专性异养生物的属)的物种。产油细胞可以例如能够产生按细胞重量计25％、30％、40％、50％、 60％、70％、80％、85％或约90％的油，±5％。以上提到的公开案还披露了用于培养此类细胞并提取油(尤其是从微藻细胞提取)的方法；此类方法适用于在此所披露的这些细胞。在此所描述的实施例的任一个中，这些细胞可以是包含外源转化酶基因的异养细胞，以便使这些细胞能够从蔗糖原料中生产油。

1.无绿藻属

在一个实施例中，该微生物属于无绿藻属。天然存在的和重组的无绿藻属株系可以用于脂质的生产。

无绿藻属是一种用于生产脂质的令人瞩目的微生物，因为它可以产生高水平脂质，特别是适于燃料和油料化学品生产的脂质。由无绿藻属产生的脂质比由其他微藻产生的脂质具有更短链长度和更高饱和度的烃链。此外，无绿藻属脂质通常不含色素(低至不可检测水平的叶绿素和某些类胡萝卜素) 并且在任何情况下包含比来自其他微藻的脂质少得多的色素。此外，相对于从其他微生物产生脂质，由本发明提供的重组无绿藻细胞可以用来以更高的产量和效率并且以降低的成本产生脂质。此外，这种微藻异养生长并且可以作为魏氏无绿藻(Prototheca wickerhamii)、雍滞无绿藻(Prototheca stagnora)(包括UTEX 327)、波多黎各无绿藻(Prototheca portoricensis)、桑椹型无绿藻(Protothecamoriformis)(包括UTEX株1441、1435)、以及祖菲无绿藻(Prototheca zopfii)而被基因工程化。无绿藻属物种是专性异养生物。

可以通过扩增基因组的某些靶区域鉴定用于本发明中的无绿藻属物种。例如，可以通过使用引物对核和/或叶绿体DNA进行扩增和测序并且使用基因组的任何区域的方法实现特异的无绿藻属种类或株系的鉴定，例如使用吴 (Wu)等人在“使用核糖体DNA序列鉴定小球藻属分离株(Identification of Chlorella spp.isolates using ribosomal DNAsequences)”，《中央研究院植物学汇刊》(Bot.Bull.Acad.Sin.)，(2001)42:115-121)中所述的方法。良好建立的系统进化分析方法，如核糖体内部转录间隔区(ITS1和ITS2 rDNA)、23S rRNA、18S rRNA和其他保守基因组区域的扩增和测序，可以由本领域技术人员用来不仅鉴定无绿藻属物种，还鉴定具有相似脂质谱和生产能力的其他产生烃和脂质的生物。关于藻类的鉴定和分类方法的实例，还见例如《遗传学》(Genetics)，2005年8月；170(4):1601-10和RNA，2005 年4月；11(4):361-4。

因此，基因组DNA比较可以用来鉴定适合的用于本发明中的微藻的种类。保守基因组DNA区域，如但不限于编码23S rRNA的DNA，可以从微藻物种中扩增并且与共有序列比较，以便筛选分类学上与用于本发明的优选微藻相关的微藻物种。以下示出无绿藻属内的物种之间的此类DNA序列比较的实例。基因组DNA比较法也可以用来鉴定已经在株系保藏中心遭错误鉴定的微藻物种。株系保藏中心将经常基于表型特征和形态学特征鉴定微藻物种。这些特征的使用可能导致微藻物种或属的错误分类。使用基因组DNA比较可能是一种基于微藻物种系统进化关系对它们分类的更好方法。

用于本发明中的微藻典型地具有编码23S rRNA的基因组DNA序列，这些基因组DNA序列与SEQ ID NO:62-70中所列的序列中至少一个序列具有至少99％、至少95％、至少90％或至少85％的核苷酸一致性。

2.小球藻属

在一个实施例中，该微生物属于小球藻属，例如原壳小球藻、椭圆小球藻、极微小球藻、或浮水小球藻。

小球藻属是单细胞绿藻的一种属，属于绿藻门。它的形状是球形，直径大约2到10μm，并且没有鞭毛。小球藻属的一些物种是天然异养的。

小球藻属(特别是原壳小球藻)是用于在表达变体酰基-ACP硫酯酶中使用的一种微生物，因为其具有高脂质组成，特别是高的适用于生物柴油的长链脂质组成。此外，这种微藻异养生长，并且可以被基因工程化。

在一个实施例中，用于表达转基因的微生物属于小球藻菌属，优选的是原壳小球藻(Chlorella protothecoides)、极微小球藻(Chlorella minutissima)、或浮水小球藻(Chlorella emersonii)。转基因在例如小球藻属中表达的实例可发现于文献中(参见例如《当代微生物学》(Current Microbiology)第35卷(1997)，第356-362页；《生物工程学报》(Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao)，2000年7月；16(4):443-6；《当代微生物学》第38卷(1999)，第335-341页；《应用微生物学生物技术》(Appl Microbiol Biotechnol)(2006)72:197-205；《海洋生物技术》(Marine Biotechnology)4,63-73,2002；《当代遗传学》(CurrentGenetics)39:5, 365-370(2001)；植物细胞报道》(Plant Cell Reports)18:9,778-780，(1999)；Biologia Plantarium 42(2):209-216，(1999)；《植物病理学杂志》 (PlantPathol.J)21(1):13-20，(2005))。其他生产脂质的微藻也可以被工程化，包括原核的微藻(参见卡尔朔伊尔(Kalscheuer)等人，《应用微生物学与生物技术》(AppliedMicrobiology and Biotechnology)，第52卷，1999 年11月4日/10月)。

3.小球藻属物种的鉴定

可以通过扩增基因组的某些靶区域鉴定用于在表达变体酰基-ACP硫酯酶中使用的小球藻属物种。例如，可以通过使用引物对核和/或叶绿体DNA进行扩增和测序并且使用基因组的任何区域的方法实现特异的小球藻属种类或株系的鉴定，例如使用吴(Wu)等人在“使用核糖体DNA序列鉴定小球藻属分离株(Identification of Chlorellaspp.isolates using ribosomal DNA sequences)”，《中央研究院植物学汇刊》(Bot.Bull.Acad.Sin.)，(2001) 42:115-121)中所述的方法。良好建立的系统进化分析方法，如核糖体内部转录间隔区(ITS1和ITS2rDNA)、18S rRNA和其他保守基因组区域的扩增和测序，可以由本领域技术人员用来不仅鉴定小球藻属，还鉴定其他能够使用在此所披露的方法生产烃和脂质的生物。关于藻类的鉴定和分类方法的实例，还见例如《遗传学》(Genetics)，2005年8月；170(4):1601-10和RNA， 2005年4月；11(4):361-4。

宿主细胞的说明性实施例包括表达一种或多种编码脂肪酸生物合成酶的外源基因的重组产油细胞。结果，一些实施例的特征在于在天然油方面，之前从未获得的天然油。在一些情况下，从非植物或非种子油无法获得或根本无法获得这些天然油。

产油细胞产生一种储存油，该油可以被储存在细胞的储存囊泡中。可以通过破坏细胞并分离出油来从细胞中获得粗油。如本领域中所知或如WO 2010/120939中所描述，可以对所产生的油进行精炼、漂白并除臭(RBD)。粗油或RBD油可以被用于多种食品、化学品或工业产品或工艺中。在回收油之后，有价值的残留生物质保留下来。该残留生物质的用途包括了制造纸、塑料、吸收剂、吸附剂、作为动物饲料、用于人类营养或用于肥料。

在给出甘油三酯细胞油的脂肪酸谱的情况下，应当理解的是，这是指从细胞提取的储存油的未分级样品，该样品在已经去除磷脂的条件下或用基本上对磷脂的脂肪酸不敏感的分析方法(例如，使用色谱法和质谱法)进行分析。由于这些细胞是产油的，在一些情况下，储存油将构成该细胞中全部 TAG的大部分。

在不同实施例中，该宿主细胞是一种质体细胞，例如，一种绿藻门 (phylumChlorpophya)、四胞藻纲(class Trebouxiophytae)、小球藻目 (order Chlorellales)或小球藻科(family Chlorellacae)的异养微藻。在不同实施例中，该细胞是产油的并且能够积累按干细胞重量计至少40％的油。该细胞可以是专性异养的，如无绿藻属物种，包括桑椹型无绿藻或祖菲无绿藻。编码在此所描述的变体酰基-ACP TE的核酸也可以在自养藻类或植物中表达。任选地，该细胞能够使用蔗糖产生油并且可以导入重组转化酶基因以允许蔗糖代谢，如PCT公开案WO 2008/151149、WO 2010/06032、WO 2011/150410、 WO 2011/150411；以及国际专利申请PCT/US 12/23696中所描述。该转化酶可以经过密码子优化并且被整合到细胞染色体中，并且在此提到的所有基因也可以进行此操作。针对不同藻类和感兴趣植物物种的密码子使用在本领域中是已知的并且可以发现于例如在的密码子使用数据库处的因特网上。

在此进一步描述的编码变体酰基-ACP TE的多核苷酸可以在多种多样的植物宿主细胞中表达。特别感兴趣的是参与生产用于食用和工业用途的植物油的植物(包括例如温带油籽作物)的植物细胞。感兴趣植物包括但不局限于葡萄籽(卡诺拉(Canola)和高芥酸品种))、向日葵、红花、棉花、萼距花、大豆、花生、椰子和油棕、以及玉米。

V.培养微生物的方法

出于实施基因操纵和随后生产烃(例如，脂质、脂肪酸、醛、醇和链烷) 两者的目的而培养微生物。前一类型的培养按小规模实施并且至少起初在起始微生物可以生长的条件下进行。例如，如果该起始微生物是一种光能自养生物的话，初始培养中是在光的存在下进行的。如果微生物被演化或工程化以不依赖于光生长，则可以改变培养条件。用于烃生产目的的培养通常大规模进行。优选地，存在一种固定碳源。培养物也可以在一些时间或所有时间中暴露于光。

微藻可以在液体培养基中培养。培养物可以包含在生物反应器中。任选地，该生物反应器不允许光进入。可替代地，微藻也可以在光生物反应器中培养，所述光生物反应器包含一种固定碳源并且允许光冲击这些细胞。将微藻细胞暴露于光，甚至在细胞转运并利用的固定碳源(即混合营养生长)的存在下，与在暗中培养细胞相比仍加速生长。可以操纵培养条件参数来优化总烃生产量、所产生的烃种类的组合、和/或烃种类的产生。在一些情况下，优选在黑暗中培养细胞，像例如，当使用不允许光冲击培养物的极大(例如， 10,000L、40,000L、100,000L 500,000L、或更大的生物反应器)发酵罐时。

微藻培养基典型地含有多种组分，如固定氮源、微量元素、任选地用于 pH维持的缓冲剂、和磷酸盐。其他组分可以包括固定碳源(如乙酸盐或葡萄糖)和盐(如氯化钠)，特别是对于海水微藻而言。微量元素的实例包括锌、硼、钴、铜、锰和钼，例如形式分别为ZnCl₂、H₃BO₃、CoCl₂6H₂O、 CuCl₂2H₂O、MnCl₂4H₂O以及(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O。

对于能够在固定碳源上生长的生物而言，固定碳源可以是，例如，葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、N-乙酰氨基葡萄糖、甘油、弗罗里多甘、和/或葡糖醛酸。一种或多种碳源可以按一种或多种外源提供的固定碳源的至少约50μM、至少约100μM、至少约500μM、至少约5 mM、至少约50mM、以及至少约500mM的浓度而供应。一些微藻物种可以在不存在光的情况下通过利用固定碳源(如葡萄糖或乙酸盐)生长。这种生长被称为异养生长。例如，对小球藻属和/或无绿藻属而言，异养生长导致高产生物质并在细胞中积累高脂质含量。

一些微生物天然地在一种固定碳源上生长或者可以被工程化为在固定碳源上生长，该固定碳源是异源化合物来源，如城市废物、经二级处理的污水、废水和固定碳和其他营养物(如硫酸盐、磷酸盐和硝酸盐)的其他来源。污水组分在烃的生产中充当营养源，并且培养物提供了廉价的烃来源。

也可以操纵其他培养参数，如培养基的pH、身份和微量元素浓度、和其他培养基组分。

A.光合生长

某些微藻可以在存在光的情况下生长。可以操纵冲击微藻细胞培养物的光子数量，以及其他参数如波长谱和每天的黑暗:光照小时比例。还可以在自然光以及自然光和人造光的同时和/或交替组合中培养微藻。例如，可以在白天时刻期间在自然光下并且在夜间时刻期间在人造光下培养小球藻属和/或无绿藻属的某些微藻物种。

可以操纵光生物反应器的气体含量来培育微生物，如微藻。光生物反应器的部分体积可以包含气体而不是液体。可以使用气体入口将气体泵入光生物反应器中。任何可以被泵送入生物反应器中的气体包括空气、空气/CO₂混合物、稀有气体(如氩气)、和其他气体。还可以操纵气体进入光生物反应器的速率。增加进入光生物反应器的气体流增加了微藻培养物的浊度。将气体传送到光生物反应器的端口的放置还可以影响在给定的气体流速下的培养物的浊度。可以调节空气/CO₂混合物以产生最优的CO₂量用于具体生物的最大生长。在光照下，微藻例如在3％CO₂/97％空气下比在100％空气中生长显著更快。3％CO₂/97％空气比空气中发现的CO₂多约100倍。例如，可以将约 99.75％空气:0.25％CO_2、约99.5％空气:0.5％CO₂、约99.0％空气:1.00％ CO₂、约98.0％空气:2.0％CO₂、约97.0％空气:3.0％CO₂、约96.0％空气:4.0％ CO₂、和约95.00％空气:5.0％CO₂的空气:CO₂混合物输注入生物反应器或光生物反应器中。

还可以使用以下装置将微藻培养物经受混合，所述装置如旋转叶片和叶轮、培养物的摇动、搅拌棒、注入加压气体和其他设备。

光生物反应器可以具有使气体、固体、半固体、和液体进入到包含微藻的腔室中的端口。端口通常附接至管道或其他传送物质的器件。例如，气体端口将气体传送进培养物中。将气体泵入光生物反应器可以起到饲喂细胞 CO₂和其他气体并且对培养物充气的两种作用，从而产生浊度。气体端口的数量和位置改变时，培养物的浊度量随之改变。例如，气体端口可以沿圆筒状聚乙烯袋的底部放置。当CO₂被添加进空气中并鼓泡至光生物反应器中时，微藻生长更快。例如，向含有丛粒藻属(Botryococcus)细胞的光生物反应器中输注入5％CO₂:95％空气混合物(参见例如《农业食品化学期刊》(J Agric Food Chem.)2006年6月28日；54(13):4593-9；《生物科学与生物工程期刊》(JBiosci Bioeng.)1999；87(6):811-5；和《天然产物杂志》(J Nat. Prod.)2003年6月；66(6):772-8)。

光生物反应器可以暴露于一种或多种光源，通过射到光生物反应器表面上的光为微藻提供光作为能源。优选地，光源提供足够细胞生长，但是不足以引起氧化损伤或引起光抑制应答的强度。在一些情况下，一种光源具有模拟或大概模拟太阳范围的波长范围。在其他情况下，使用不同的波长范围。光生物反应器可以被置于户外或置于温室或者允许阳光冲击表面的其他设施中。针对丛粒藻属物种，优选的光子强度是在25与500μE m^- ²s^-1之间(参见例如《光合作用研究》(Photosynth Res.)2005年6月；84(1-3):21-7)。

光生物反应器优选地具有一个或多个允许培养基进入的端口。仅一种物质进入或离开端口是不必要的。例如，一个端口可以用来使培养基流入光生物反应器并且然后之后可用于采样、气体进入、气体离开或其他目的。在一些情况下，在培养开始时，将光生物反应器以培养基填充，并且在培养物接种后不输注更多的生长培养基。换句话说，将微藻生物质在水性培养基中培养一段时间，在这段时间内微藻繁殖并且数目增加；然而，许多水性培养基并未在这整个时间段内流遍光生物反应器。因此在一些实施例中，在接种后，水性培养基不流遍光生物反应器。

在其他的实例中，培养基可以在微藻繁殖和数目增加的整个时间段期间流遍光生物反应器。在一些实施例中，将培养基在接种后但在细胞达到所需密度之前输注至光生物反应器中。换句话说，为繁殖微藻，不维持气体进入和培养基进入的湍流状态直至已经实现所需的所述微藻数目增加。

光生物反应器优选地具有一个或多个允许气体进入的端口。气体可以起提供营养物(如CO₂)以及在培养基中提供湍流的两种作用。可以通过将气体进口安置为低于水性培养基水平实现湍流，从而进入光生物反应器的气体鼓泡至培养物表面。一个或多个气体出口允许气体逃逸，从而防止光生物反应器中压力累积。优选地，气体出口引向防止污染性微生物进入光生物反应器的“单向”阀门。在一些情况下，将细胞在光生物反应器中培养一段时间，在该段时间期间微藻繁殖并数量增加，然而并不在整个时间段中维持由气体进入引起的、主要贯穿培养基的、具有湍流涡旋的湍流状态。在其他情况下，可以在微藻繁殖并且数量增加的整段时间内，维持由气体进入引起的、主要贯穿培养基的、具有湍流游涡的湍流状态。在一些情况下，不在微藻繁殖并且数量增长的时间段中维持光生物反应器规模与涡旋规模之间比例的预定范围。在其他情况下，可以维持这种范围。

光生物反应器优选地具有至少一个可用于对培养物取样的端口。优选地，采样端口可以反复使用，而不改变损害培养物的无外来污染的性质。采样端口可以被配置为具有允许样品流停止和开始的阀门或其他装置。可替代地，取样端口可以允许连续采样。光生物反应器优选地具有至少一个允许接种培养物的端口。此类端口还可以用于其他目的，如培养基或气体进入。

B.异养生长

作为如以上所描述的微生物光合生长的可替代方案，一些微生物可以被培养在异养生长条件下，其中固定碳源提供用于生长和脂质积累的能量。

在根据本发明的异养培养方法中，生物柴油生产的代价，粗制、部分纯化、或纯化的甘油(作为脂质酯交换副产物而产生)可以用作用于发酵(例如生产脂质的微生物培养物)的原料。因此，本发明包括在第一微生物培养物中培养微生物(例如微藻)；从培养物中回收微生物脂质；如以上所描述将微生物脂质经受酯交换，以产生脂肪酸酯和甘油；并且将甘油添加至第二微生物培养物中作为原料。该第一微生物培养物和第二微生物培养物可以但不需要是相同微生物的培养物。如果希望的话，可以设计一种连续系统，借此可以将从培养物中回收的脂质中生产的甘油供应回相同的培养物中。

结合甘油用于发酵真核和原核微生物两者的多个属的用途，本发明提供了显著改进的培养参数，所述微生物包括小球藻属、舟形藻属、栅藻属和螺旋藻属的微生物。如这些实例证明的，极端趋异性进化谱系的微生物，包括无绿藻属、小球藻属、舟形藻属、栅藻属和螺旋藻属以及多种不同无绿藻属和/或小球藻物种和株系的培养物不仅在纯化的试剂级甘油上非常良好地生长，而且在来自生物柴油酯交换的经酸化和未经酸化的甘油副产物上也非常良好地生长。在一些情况下，微藻(如小球藻属和/或无绿藻属株系)在甘油的存在下进行的细胞分裂比在葡萄糖的存在下进行的细胞分裂更快。在这些情况下，其中首先将甘油供应给细胞以快速增加细胞密度并且然后供应葡萄糖以积累脂质的两阶段生长过程可以提高产生脂质的效率。当返回该生产工艺时，酯交换法的甘油副产物的使用提供显著的经济优势。还提供了其他的进料方法，如甘油和葡萄糖的混合物。供应这类混合物还获得相同的经济益处。另外，本发明提供了向微藻供应替代性糖(如与甘油处于各种组合的蔗糖)的方法。本发明在此提供的这些益处己经在来自极端趋异进化谱系的微生物 (包括原核生物和真核生物两者)上得以证明，证明了本发明用于微生物发酵的效用。

用于小球藻属和/或无绿藻属生长和繁殖的标准方法是已知的(参见例如苗(Miao)和吴(Wu)，《生物技术杂志》(J.Biotechnology)，2004,11: 85-93以及苗(Miao)和吴(Wu)，《生物资源技术》(Biosource Technology)(2006)97:841-846)。此外，小球藻属和/或无绿藻属的多个物种和一个物种中的多种株系可以在甘油的存在下生长，所述甘油包括来自生物柴油酯交换的甘油副产物。

为了烃生产，优选大量培养或发酵细胞，包括在此所述的重组细胞。该培养可以是处于大的液体体积中，作为实例，例如处于悬浮培养物中。其他实例包括起始于小型培养的细胞，与细胞生长和繁殖连同烃生产结合，扩展到大型生物质。可以使用生物反应器或钢发酵罐来容纳大的培养体积。与啤酒和/或葡萄酒生产中使用的发酵罐类似的那些是合适的，乙醇生产中使用的极大发酵罐同样是合适的。

提供了用于在发酵罐中培养的适当营养来源。这些包括原材料，如以下项中的一种或多种：固定碳源，如葡萄糖、玉米淀粉、解聚的纤维素材料、蔗糖、甘蔗、甜菜、乳糖、乳清、或糖蜜；脂肪来源，如脂肪或植物油；氮源，如蛋白质、大豆粉、米浆、氨(纯的或处于盐形式的)、硝酸根或硝酸盐、或分子氮；以及磷源，如磷酸盐。另外，发酵罐允许控制培养条件如温度、pH、氧张力、和二氧化碳水平。任选地，可以将气态组分(如氧或氮) 鼓泡通过液体培养基。其他淀粉(聚合的葡萄糖)来源如小麦、马铃薯、水稻、以及高粱。其他碳源包括工艺流(process stream)，如工业级甘油、黑液、有机酸(如乙酸酯)、以及糖蜜。碳源也可以作为混合物如蔗糖和解聚甜菜浆的混合物提供。

可以使用发酵罐来允许细胞经历其生长周期的多个阶段。作为实例，可以将产生烃的细胞的接种物导入培养基中，随后在细胞开始生长之前存在一个延迟期(延迟阶段)。在延迟期后，生长速率稳步增加并且进入对数阶段或指数阶段。指数阶段之后转而是生长变慢，原因在于营养物减少和/或有毒物质增加。在这种变慢后，生长停止，并且细胞进入静止阶段或稳定状态，这取决于提供给细胞的特定环境。

借助于在此披露的细胞的烃生产可以发生在对数期或其后(包括静止阶段)，在静止阶段中营养物被供应或仍然是可获得的，以允许在不存在细胞分裂下的烃生产的继续。

在不同实施例中，使用在此所述的条件所培育的微生物包含按重量计至少约20％、优选地按重量计至少约40％、按重量计至少约50％、并且更优选地按重量计至少约60％、甚至更优选地按重量计至少约70％、75％、80％或 85％的脂质。

与在等量试剂级甘油中相比，小球藻属和/或无绿藻属的多个物种、以及一个物种内的多种株系在来自酯交换的甘油副产物的存在下表现更好。来自酯交换的甘油副产物除了甘油以外，通常还包含残余的甲醇和其他污染物。例如，与在纯试剂级甘油上生长时相比，小球藻属和无绿藻属物种的株系在来自脂质酯交换反应的经酸化和未经酸化的甘油副产物上时可以展现更好的生产力。与在等量试剂级甘油中相比，其他微生物(如栅藻属和舟形藻属微藻)还可以在来自酯交换的甘油副产物的存在下表现更好。在不同实施例中，与在纯甘油上相比，在生物柴油甘油副产物上的干细胞重量更高。例如，与在纯试剂级甘油上相比，在经酸化和未经酸化的生物柴油副产物甘油上每升被甲栅藻(Scenedesmus armatus)和具膜舟形藻(Navicula pelliculosa)的干细胞重量更高。对多种小球藻属和/或无绿藻属的多个物种以及小球藻属和/或无绿藻属的一个物种内的多种株系而言，与在等浓度的纯试剂级甘油的存在下培养相比，当在生物柴油甘油副产物的存在下培养细胞时每升的脂质水平更高。与当在等浓度的纯试剂级甘油的存在下培养时相比，当在生物柴油甘油副产物的存在下培养时，小球藻属和/或无绿藻属的多个物种以及小球藻属和/或无绿藻属的一个物种内的多种株系、连同钝顶螺旋藻、具膜舟形藻以及被甲栅藻积累干细胞重量的更高百分比作为脂质。

另一个出人意料的结果是与仅葡萄糖存在时相比，在甘油和葡萄糖混合物的存在下，微生物(包括微藻，如小球藻属和/或无绿藻属)的多个物种以及小球藻属和/或无绿藻属的一个物种内的多种株系、以及其他微藻(如栅藻属、舟形藻属、和螺旋藻属)展现更好的作为生物柴油生产者的特征。

通过生物柴油副产物的使用和碳源的时间分离，改进了微生物脂质生产中生产力的三种不同的标志(干细胞重量/升、克数/升液体、和干细胞重量作为脂质的百分比)。因此，本发明提供了在来自进化树的高度分支区域的多个微生物(包括原核生物和真核生物)物种中，每单位时间产生更高量的脂质的新颖方法。在此披露的使用甘油制造脂质和烃的这些方法不限于微藻，而是可以与能够利用甘油作为能源的任何微生物一起使用。

在一个可替代的异养生长方法中，根据本发明，可以使用解聚的纤维素生物质作为原料培养微生物。纤维素生物质(例如，秸秆，如玉米秸秆)是便宜的且易于获得的；然而，尝试使用这种材料作为用于酵母的原料以失败告终。具体而言，已经发现此类原料抑制酵母生长，并且酵母不能利用从纤维素材料中产生的5-碳糖(例如，来自半纤维素的木糖)。相反，微藻可以依赖加工的纤维素材料生长。因此，本发明提供了一种在纤维素材料和/或5- 碳糖的存在下培养微藻的方法。纤维素材料总体上包括呈组分干重百分比 40％-60％的纤维素、20％-40％的半纤维素、和10％-30％的木质素。

合适的纤维素材料包括来自草本和木质能源作物以及农业作物的残余物，即，植物部分，主要是茎秆和叶，它们不随主要食物或纤维产物一起从田间取得。实例包括农业废料，如甘蔗渣、稻壳、玉米纤维(包括茎、叶、外壳、和穗轴)、麦秆、稻秆、甜菜浆、柑橘浆、柑桔皮；林业废料，如硬木和软木疏伐木、和来自木料操作的硬木和软木残余物；木材废料，如锯木厂废料 (木屑、锯屑)和纸浆厂废料；城市废料，如城市固体废料的纸质部分、城市木材废料和城市绿色废料如城市碎草；以及木材建筑废料。额外纤维素包括专用的纤维素作物如柳枝稷、杂交杨木、和芒草、纤维用甘蔗、和纤维用高粱。从这类材料产生的5碳糖包括木糖。

已在此显示了与当单独地在葡萄糖或木糖上培养时相比，小球藻属和/或无绿藻属的一些物种当在葡萄糖和木糖的组合上培养时展现更高的生产力水平。这种协同作用提供了一个显著优点，在于它允许在木糖和葡萄糖的组合 (如纤维素材料)上培养小球藻属和/或无绿藻属。

在再另一个替代性异养生长方法中，使用例如由甘蔗或甜菜中生产的蔗糖作为原料，该方法自身可以任选地与以上所描述的方法组合。如在以下题为“微生物工程化”的部分中更详细描述的，可以通过将微生物(如小球藻属和/或无绿藻属)工程化以利用蔗糖作为碳源，促进脂质生产或使其更加有效率。例如，蔗糖转运蛋白和蔗糖转化酶的表达允许小球藻属和/或无绿藻将蔗糖从培养基转运至细胞中并且水解蔗糖以产生葡萄糖和果糖。任选地，在内源性己糖激酶活性不足以导致果糖最大磷酸化的情况下，也可以表达果糖激酶。合适的蔗糖转运蛋白的实例是Genbank登录号CAD91334、CAB92307、和CAA53390。适合的蔗糖转化酶的实例是Genbank登录号CAB95010、 NP012104和CAA06839。合适的果糖激酶的实例是Genbank登录号P26984、 P26420和CAA43322。可以如在此所述设计编码一个或多个此类基因的用于转化微藻(包括小球藻属和/或无绿藻属)的载体。

蔗糖转化酶的分泌可以避免表达一种可以将蔗糖转运至细胞中的转运蛋白的需要。这是因为分泌型转化酶催化一分子蔗糖转化成一分子葡萄糖和一分子果糖，两者均可以被在此所披露的微生物转运和利用。例如，具有分泌信号的蔗糖转化酶的表达在细胞外产生转化酶活性。参见霍金斯(Hawkins) 等人，《当代微生物学》(Current Microbiology)第38卷(1999)，第335- 341页，针对在小球属藻和/或无绿藻属中有活性的分泌信号的实例。这种蛋白质的表达(如通过在此所披露的基因工程方法学能够做到)允许已经能够利用细胞外葡萄糖作为能源的细胞利用蔗糖作为细胞外能源。小球藻属和/或无绿藻属细胞可以使用细胞外果糖和细胞外葡萄糖两者作为能源，转化酶的分泌可以提供用于使用蔗糖作为有效的、廉价的能源所必需的唯一催化活性。

例如，小球藻属和/或无绿藻属细胞可以被工程化为其中蔗糖转化酶基因处于三种启动子(花椰菜花叶病毒35S启动子(CMV)、小球藻属病毒启动子(CV)、或小球藻属HUP1启动子(HUP 1))之一的调控之下。这个实施例中使用的蔗糖转化酶基因包括对酿酒酵母SUC2基因的修饰，以针对原壳小球藻密码子使用来优化。一种分泌型蔗糖转化酶(如在此描述的)的表达允许使用糖蜜、甘蔗汁、以及其他包含蔗糖的原料用于细胞发酵。

通过向小球藻属和/或无绿藻属的培养基中添加转化酶，说明了表达外源分泌型蔗糖转化酶的微生物的生长潜能。小球藻属和/或无绿藻属细胞也可以在来自甘蔗加工的废弃糖蜜上生长，如同它们在纯试剂级的葡萄糖上生长那样；这种低价值的甘蔗加工废弃产物的使用可以在烃和其他油的生产中提供显著的成本节省。糖蜜包含毒害许多微生物并且妨碍它们生长的木质素和其他纤维素废弃产物，然而发现小球藻属和/或无绿藻属细胞在此类毒素的存在下茁壮生长。

可替代地，蔗糖转化酶还可以在表达蔗糖转运蛋白的细胞中、以及在表达任何允许蔗糖进入细胞的碳水化合物转运蛋白的细胞中进行胞内表达。

可以使用生物反应器用于异养生长方法中。如应当理解的，当在此所述的异养生长方法中使用固定碳源时，在光合生长方法中使细胞能够利用光的措施是不必要的。

在此所描述的工艺条件和异养生长方法的具体实例可以按任何适合的方式组合以改善微生物生长和/或脂质生产的效率。此外，本发明包括对微生物 (如微藻)进行选择和/或基因工程化，以生产甚至更适合于在上述方法中使用的微生物。例如，具有利用上述原料中任一种的更强能力用于增加的增殖和/或脂质(例如脂肪酸)生产的这些微生物是在本发明的范围内。

C.混合营养生长

混合营养生长是细胞利用光和一种或多种固定碳源两者作为生长和生产烃的能源。混合营养生长可以在光生物反应器中进行。可以将微藻在用不同类型的透明或半透明材料制成的闭合的光生物反应器中生长和维持。这种材料可以包括Plexiglas^TM外壳、玻璃外壳、用如聚乙烯的物质制成的袋子、透明或半透明管道和其他材料。微藻可以在开放的光生物反应器(如跑道水池 (raceway pond)、沉降池和其他非闭合的容器)中生长和维持。

D.生长培养基

根据本发明的方法使用的微生物发现于世界各处的各个地点和环境。由于它们与其他物种隔离和因此产生的进化趋异性，可能难以预测用于最佳培育和产生脂质和/或烃组分的特定生长培养基。在一些情况下，微生物的某些株系可能在特定生长培养上不能生长，原因在于存在一些抑制性组分或不存在特定微生物株系要求的一些必需营养。

固体和液体生长培养基通常有许多获取的来源，适合许多微生物株的特定培养基的制备说明可见于例如网上utex.org/(由德克萨斯大学奥斯汀分校维护的网站，用于其藻类培养物保藏(UTEX))。例如，不同的淡水和咸水培养基提供于美国专利公开号2012/0288930中，出于所有目的将这个文献通过引用以其全文结合在此。

在具体的实例中，适合用于培养小球藻属和/或无绿藻属细胞的培养基包括朊培养基(Proteose Medium)。这种培养基适合用于纯性培养物，并且可以通过添加1g朊蛋白胨至1升Bristol培养基中来制备1L体积的培养基(pH 约6.8)。Bristol培养基包括在水性溶液中的2.94mM NaNO₃、0.17mM CaCl₂2H₂O、0.3mM MgSO₄7H2O、0.43mM、1.29mM KH₂PO₄、以及1.43 mM NaCl。对于1.5％琼脂培养基，可以将15g琼脂添加至1L这种溶液。将溶液盖好并高压灭菌，并且随后使用之前贮存在冷藏温度。

可以通过咨询上文鉴定的URL或通过咨询维持微生物培养物的其他机构 (如SAG、CCAP、或CCALA)，轻易地确定用于本文所述方法中的其他合适培养基。SAG指在哥廷根大学的藻类培养物保藏中心(哥廷根，德国)， CCAP指苏格兰海洋科学协会管理的藻类和原虫培养物保藏中心(苏格兰，英国)，并且CCALA指在植物研究所(Institute of Botany)的藻实验室培养物保藏中心(特热邦(T{hacek over(r)}ebo{hacek over(n)})，捷克共和国)。

E.增加脂质产量

可以调节工艺条件以增加适于具体用途的脂质的产量和/或降低生产成本。例如，在某些实施例中，在限制性浓度的一种或多种营养物(例如像，碳和/ 或氮、磷、或硫)存在同时提供过量的固定碳能量如葡萄糖的情况下培养产油细胞(例如植物、藻类、微藻)。氮限制作用倾向于增加微生物脂质产量超过其中过量提供氮的培养物中的微生物脂质产量。在具体实施例中，脂质产量的增加是至少约：10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、200％、 300％、400％、或500％。可以将这些产油细胞(例如植物细胞、藻类细胞、微藻细胞)在限制量的营养物存在的情况下培养持续总培养时期的一部分或持续整个时期。在具体实施例中，在总培养时期期间，营养物浓度在限制性浓度和非限制性浓度之间循环至少两次。

为了增加脂质产量，可以在用于生产脂质的产油细胞或生物体(例如，植物、藻类、微藻)的原料中使用乙酸。乙酸直接供给到引发脂肪酸合成的代谢点(即，乙酰CoA)；因此在培养物中提供乙酸可以增加脂肪酸的生产量。通常，在足量乙酸的存在下培养产油细胞或生物，以提高微生物脂质产量和/或微生物脂肪酸产量，确切地，超过在乙酸不存在情况下的微生物脂质 (例如脂肪酸)产量。

在另一个实施例中，通过在脂质途径酶(例如，脂肪酸合成酶)的一种或多种辅因子存在的情况下培养产生脂质的产油细胞或生物(例如，植物、藻类、微藻)，增加脂质产量。通常，该一种或多种辅因子的浓度足以增加微生物脂质(例如，脂肪酸)产量，其超过在辅因子不存在情况下的微生物脂质产量。在一个具体实施例中，通过在培养物中包含产油细胞(例如，植物细胞、藻类细胞、微藻细胞)，将该一种或多种辅因子提供给培养物，其中所述产油细胞包含编码该一种或多种辅因子的外源基因。可替代地，可以通过包含含有一种外源基因的产油细胞(例如，植物、藻类、微藻)，将一种或多种辅因子提供给培养物，其中该外源基因编码参与该辅因子合成的蛋白质。在某些实施例中，适合的辅因子包括脂质途径酶所需要的任何维生素，例如像：生物素、泛酸盐。编码适合用于本发明的方法中的辅因子的或参与此类辅因子合成的基因是熟知的，并且可以使用构建体和如以上和在此所描述的那些技术将这些基因导入产油细胞(例如，植物细胞、藻类细胞、微藻细胞)中。

在不同实施例中，这些细胞关于一种或多种类型的脂肪酸可以是完全营养缺陷型的或部分营养缺陷型的(即，合成有弊病或毁坏性)。在补充该一种或多种脂肪酸的情况下培养这些细胞，以便增加细胞数量，然后使细胞能积累油(例如，按干细胞重量计达到至少40％)。可替代地，这些细胞包括一个可调控脂肪酸合成基因，该基因可以基于环境条件来转变活性，并且在第一细胞分裂阶段期间的环境条件有利于产生脂肪酸而在第二油积累阶段期间的环境条件不利于产生脂肪酸。

由于应用了这些补充或调控方法，可以从具有较少量的对于最佳细胞繁殖必需的一种或多种脂肪酸的细胞获得细胞油。可以获得的油的特定实例包括含较少硬脂酸、亚油酸和/或亚麻酸的那些。任选地，这些细胞是产油的质体微生物，如分裂绿藻门的那些。

因此，在一些实施例中，提供了用于生产油或脂肪的方法。该方法包括在生长阶段中，在容许细胞分裂的第一组条件下培养重组产油细胞，以便由于脂肪酸的存在而增加细胞数量；在油产生阶段中，在限制细胞分裂但容许脂肪酸被耗乏的油产生的第二组条件下培养该细胞；并且从该细胞提取该油，其中该细胞具有突变或外源核酸，这些核酸可操作以抑制脂肪酸合成酶的活性，该酶任选地为硬脂酰基-ACP去饱和酶、Δ12脂肪酸去饱和酶、或酮酰基- ACP合酶。该油中的脂肪酸可以被耗乏至少50、60、70、80或90。该细胞可以异养地培养。

在不同实施例中，该细胞可以是微藻细胞并且可以产生按干细胞重量计至少40％、50％、60％、70％、80％或90％的油。

VI.回收脂质和烃的方法

可以通过任何便利的手段收获或者以其他方式收集由在此所描述的细胞生产的烃(例如，脂质、脂肪酸、醛、醇和链烷)。例如，可以将从细胞中分泌的烃离心，以将疏水层中的烃与水性层中的污染物分离，并任选地与离心后作为沉淀物的任一固体材料分离。可以在离心之前或之后用蛋白酶处理包含细胞或细胞级分的材料，以降解污染性蛋白质。在一些情况下，污染性的蛋白与烃或烃前体关联，可能是共价关联，所述烃前体在去除蛋白质后形成烃。在其他情况下，这些烃分子是处于还包含蛋白质的制剂中。可以向包含蛋白质的烃制剂中添加蛋白酶，以降解蛋白质(例如可以使用来自灰色链霉菌(西格玛奥德里奇(SigmaAldrich)目录号P5147)的蛋白酶。在消化之后，优选地从残余的蛋白、肽片段、以及氨基酸中纯化烃。这种纯化可以例如通过以上列出的方法(如离心和过滤)来完成。

也可以如下从活的微藻细胞体内提取细胞外的烃(这些细胞然后被返回生物反应器中)：在其他方面无菌环境中，将这些细胞暴露于无毒的提取溶剂中，随后将活细胞与提取溶剂的疏水级分和烃分离，其中进而将分离的活细胞返回培养容器如不锈钢发酵罐或光生物反应器中(参见《生物技术与生物工程》(Biotechnol Bioeng.)2004年12月5日；88(5):593-600以及《生物技术与生物工程》2004年3月5日；85(5):475-81)。

还可以通过全细胞提取分离烃。首先，如在题为“裂解细胞”的部分中所描述的，破坏细胞，并且然后可以例如通过使用如上文所述的离心从整个细胞团中收集胞内烃和细胞膜/细胞壁关联的烃以及胞外烃。

多种方法可用于从通过以上方法产生的细胞裂解物中分离烃和脂质。例如，烃可以用疏水性溶剂如己烷提取(参见弗伦兹(Frenz)等人，1989，《酶与微生物技术》(EnzymeMicrob.Technol.)，11:717)。烃也可以使用液化法(参见例如沢山(Sawayama)等人，1999，《生物质与生物能源》 (Biomass and Bioenergy)17:33-39以及井上(Inoue)等人，1993，《生物质与生物能源》(Biomass Bioenergy)6(4):269-274)；油液化法(参见例如箕轮町(Minowa)等人，1995，《燃料》(Fuel)74(12):1735-1738)；和超临界CO₂萃取法(参见例如曼德斯(Mendes)等人，2003，《无机化学学报》 (Inorganica Chimica Acta)356:328-334)提取。

A.裂解细胞

在一些实施例中，在裂解微生物细胞之后提取产生于微生物中的细胞内脂质和烃。一旦被提取，可以将这些脂质或烃进一步精炼以生产油、燃料、或油脂化学品。

在完成培养之后，从发酵液中分离微生物。任选地，通过离心实现分离以产生浓缩膏。离心并不从这些微生物中去除显著量的细胞内水分并且并不是一个干燥步骤。然后，可以将该生物质用洗涤液(例如蒸馏水)洗涤以除去发酵液和碎片。任选地，也可以在破坏细胞之前干燥(烘箱干燥、冻干等) 洗涤的微生物生物质。可替代地，当发酵结束时，可以在不与一些或全部发酵液分开的情况下裂解细胞。例如，当裂解细胞时，细胞可以处于小于1:1 v:v细胞对胞外液体的比率。

可以裂解含有脂质和/或烃的微生物以产生裂解物。如本文中详述，可以通过任何便利的手段实现裂解微生物(也称作细胞裂解)的步骤，所述手段包括热诱导的裂解、添加碱、添加酸、使用酶如蛋白酶和多糖降解酶如淀粉酶、使用超声波、机械裂解、使用渗透休克、裂解病毒感染和/或表达一个或多个裂解基因。进行裂解以释放已经由微生物产生的胞内分子。这些用于裂解微生物的方法的每一种可以作为单一方法或以组合方式同时或依次地使用。

可以通过显微分析观察细胞破坏的程度。使用一种或多种本文所述的方法，一般观察超过70％的细胞破裂。优选地，细胞破裂超过80％、更优选地超过90％和最优选地是约100％。

在特定的实施例中，在生长之后裂解微生物，例如以便增加用于提取或进一步加工的细胞脂质和/或烃的暴露。可以调节酰基-ACP硫酯酶表达(例如，通过诱导型启动子)或细胞裂解的时序，以便优化脂质和/或烃的产生。下文描述众多裂解技术。这些技术可以单独或组合地使用。

1.热诱导的裂解

在一些实施例中，裂解微生物的步骤包括加热含有微生物的细胞悬液。在这个实施例中，加热含有该微生物的发酵液(或从发酵液中分离的微生物悬液)直到微生物(即微生物的细胞壁和细胞膜)降解或分解。典型地，施加的温度是至少50℃。更高的温度，如至少30℃、至少60℃.、至少70℃.、至少80℃.、至少90℃.、至少100℃.、至少110℃.、至少120℃.、至少130℃.或更高用于更高效的细胞裂解。

可以通过煮沸微生物进行细胞的热处理裂解。可替代地，可以在高压釜中进行热处理(不沸腾)。可以将热处理的裂解物冷却，用于进一步处理。

也可以通过蒸汽处理，即，通过添加加压的蒸汽，进行细胞破碎。例如在美国专利号6,750,048中描述为破碎细胞而蒸汽处理微藻。

2.使用碱进行裂解

在一些实施例中，裂解微生物的步骤包括将碱添加至含有微生物的细胞悬液。

碱基应当强到足以水解所用微生物的蛋白质化合物的至少一部分。用于增溶蛋白质的碱是化学领域已知的。用于本发明方法的示例性碱包括但不限于锂、钠、钾、钙的氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐，及其混合物。优选的碱是KOH。例如在美国专利号6,750,048中描述了为破碎细胞而对微藻进行碱处理。

3.酸性裂解

在一些实施例中，裂解微生物的步骤包括将酸添加至含有微生物的细胞悬液。可以使用浓度为10nM-500nM或优选地40nM-160nM的酸实现酸裂解。优选在室温以上(例如，在40℃-160℃，并且优选是50℃-130℃的温度) 进行酸裂解。对于中等温度(例如，室温至100℃.，并且尤其是室温至 65℃)，酸处理可以有用地与超声处理或其他细胞破碎方法组合。

4.使用酶裂解细胞

在一些实施例中，裂解微生物的步骤包括通过使用酶来裂解微生物。用于裂解微生物的优选酶是蛋白酶和多糖降解酶，如半纤维素酶(例如，来自黑曲霉(Aspergillusniger)的半纤维素酶；西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)，圣路易斯，密苏里州(Mo.)；#H2125)；果胶酶(例如，来自根霉种类 (Rhizopus sp.)的果胶酶；西格玛奥德里奇，圣路易斯，密苏里州； #P2401)；曼娜威(Mannaway)4.0L(诺维信(Novozymes))；纤维素酶 (例如，来自绿色木霉(Trichoderma viride)的纤维素酶；西格玛奥德里奇，圣路易斯，密苏里州；#C9422)；以及崩溃酶(例如，来自担子菌纲种类 (Basidiomycetes sp.)的崩溃酶；西格玛奥德里奇，圣路易斯，密苏里州； #D9515)。

a)纤维素酶

在本发明的一个实施例中，用于裂解微生物的纤维素酶是多糖降解酶，任选地来自小球藻属和/或无绿藻属或小球藻和/或无绿藻属病毒。

b)蛋白酶

可以使用如下蛋白酶裂解微生物：如灰色链霉菌(Streptomyces griseus) 蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K、在Degradation of Polylactide by Commercial Proteases(通过商业蛋白酶降解聚乳酸)，奥达(Oda)Y等人.，《聚合物和环境杂志》(Journal ofPolymers and the Environment)，第8卷，第1期，2000年1月，底29-32(4)中所列的蛋白酶以及其他蛋白酶。可以使用的其他蛋白酶包括碱性蛋白酶(Alcalase)2.4FG(诺维信(Novozymes)) 和风味酶(Flavourzyme)100L(诺维信)。

c)组合

也可以使用蛋白酶和多糖降解酶的任何组合，包括前述蛋白酶和多糖降解酶的任何组合。

5.使用超声波裂解细胞

在本发明的另一个实施例中，通过使用超声波(即，超声处理)进行裂解微生物的步骤。因此，也可以用高频声波裂解细胞。可以电子地产生声波并且将其通过金属头传输至适当浓缩的细胞悬液。这种超声波处理(或超声波)基于在细胞悬液中产生空腔而破坏细胞完整性。

6.机械裂解

在本发明的另一个实施例中，通过使用机械裂解法进行裂解微生物的步骤。可以将细胞机械地裂解并且任选地均质化以促进烃(例如，脂质)收集。例如，压力破碎仪可以用来泵送含有细胞的浆液穿过约束节流阀(restricted orifice valve)。施加高压(直至1500bar)，随后穿过出口喷嘴迅速膨胀。通过3种不同机制完成细胞破碎：冲击在阀门上、在喷嘴中的高液体剪切和释放时压力骤降，造成细胞爆裂。这种方法释放胞内分子。

可替代地，可以使用球磨机。在球磨机中，将细胞随小磨粒(珠)一起以悬浮状态搅拌。细胞因剪切力、珠之间碾磨和与珠碰撞而破裂。珠破坏细胞以释放细胞内容物。也可以通过剪切力破坏细胞，如使用掺合(如采用高速或瓦林粉碎机(Waring blender)作用实例)、弗氏压碎器或在脆弱细胞壁的情况下甚至离心，以破坏细胞。

B.脂质和烃的提取

可以通过用有机溶剂提取来回收由本发明的微生物产生的脂质和烃。在一些情况下，优选的有机溶剂是己烷。典型地，将有机溶剂直接添加至裂解物，而不事先分离裂解物组分。在一个实施例中，将通过上文所述的一种或多种方法产生的裂解物与有机溶剂接触足以允许脂质和/或烃组分与有机溶剂形成溶液的一段时间。在一些情况下，可以随后进一步精炼溶液以回收特定的所希望的脂质或烃组分。己烷提取法是本领域熟知的。

多种方法可用于从通过以上方法产生的细胞裂解物中分离脂质。例如，脂质和脂质衍生物如脂肪醛、脂肪醇和烃如链烷可以用疏水性溶剂如己烷提取(见弗伦兹(Frenz)等人1989，《酶与微生物技术》(Enzyme Microb. Technol.)，11:717)。脂质和脂质衍生物也可以使用液化法(参见例如沢山(Sawayama)等人，1999，《生物质与生物能源》(Biomass andBioenergy) 以及井上(Inoue)等人，1993，《生物质与生物能源》(Biomass Bioenergy) 6(4):269-274)；油液化法(参见例如箕轮町(Minowa)等人.1995，《燃料》 (Fuel)74(12):1735-1738)；和超临界CO₂萃取法(参见例如曼德斯 (Mendes)等人，2003，《无机化学学报》(Inorganica Chimica Acta)356: 328-334)提取。苗(Miao)和吴(Wu)描述了从原壳小球藻培养物回收微藻脂质的方案，其中将细胞通过离心收获、用蒸馏水洗涤并且通过冷冻干燥法干燥。在研钵中粉碎所得到的细胞粉末并且随后将其用正己烷提取。苗 (Miao)和吴(Wu)，《生物资源技术》(Biosource Technology)(2006) 97:841-846。

因此，可以用有机溶剂提取回收由本发明的微生物产生的脂质、脂质衍生物和烃。在一些情况下，优选的有机溶剂是己烷。一般而言，将有机溶剂直接添加至裂解物，而不事先分离裂解物组分。在一个实施例中，将通过上文所述的一种或多种方法产生的裂解物与有机溶剂接触足以允许脂质和/或烃组分与有机溶剂形成溶液的一段时间。在一些情况下，可以随后进一步精炼溶液以回收特定的所希望的脂质或烃组分。己烷提取法是本领域熟知的。

可以通过使用一种或多种酶(包括脂肪酶)修饰如在此所述的细胞产生的脂质和脂质衍生物，如脂肪醛、脂肪醇、以及烃(如链烷)，如上所述。当烃处于细胞的胞外环境中时，可以将一种或多种酶在酶修饰烃或从烃前体中完成其合成条件下添加至这个环境。可替代地，在添加一种或多种催化剂如酶之前，可以从细胞物质中部分或完全地分离烃。此类催化剂是外源添加的，并且它们的活性在细胞外部或在体外发生。

因此，如本文所述的由细胞在体内产生或在体外酶促修饰的脂质和烃可以任选地通过常规手段进一步加工。加工可以包括“裂化”以减少尺寸，并且因此增加烃分子的氢:碳比。催化裂化和热裂化方法常规地用于烃和甘油三酯油加工中。催化性方法涉及使用催化剂，如固态酸催化剂。这种催化剂可以是二氧化硅-氧化铝或沸石，这引起碳-碳键的异裂性或非对称破裂，产生碳正离子和负离子。这些活性中间体随后经历重排或与另一种烃发生氢负离子转移。反应可以因此再生这些中间体以导致自增殖链机制。也可以加工烃以减少其中碳-碳双键或三键的数目，任选地至零。也可以加工烃以除去或消除其中的环或环状结构。也可以加工烃以增加氢：碳比。这可以包括加氢 (“氢化”)和/或烃“裂化”成更小的烃。

热方法包括使用升高的温度和压力来减小烃的大小。可以使用大约 800℃.的升高的温度以及大约700kPa的升高的压力。这些条件产生“轻质 (light)”烃，这是一个有时用来指代富氢烃分子的术语(与光子通量区别)，同时还通过缩合产生更重质的氢相对耗乏的烃分子。该方法论提供了均裂断裂或对称断裂并且产生烯，其可以是任选地如以上所述酶促饱和的。

在工厂中用于烃加工和炼油的催化方法和热方法是标准的。因此可以通过常规手段收集并且加工或精炼由在此所述的细胞产生的烃。参见海伦 (Hillen)等人，(《生物技术与生物工程》(Biotechnology and Bioengineering)，第XXIV卷：193-205(1982))有关微藻产生的烃的加氢裂化的报道。在可替代的实施例中，将该级分用另一种催化剂处理，如有机化合物、热、和/或无机化合物。为了将脂质加工为生物柴油，使用酯交换方法。

通过本发明的方法产生的烃在多种工业应用中是有用的。例如，生产直链烷基苯磺酸盐(LAS)(一种在几乎所有类型的洗涤剂以及清洁用品中使用的阴离子表面活性剂)利用了通常包括10-14个碳原子链的烃。参见，例如，美国专利号6,946,430；5,506,201；6,692,730；6,268,517；6,020,509； 6,140,302；5,080,848；以及5,567,359。表面活性剂，例如LAS，可以用于个人护理组合物和洗涤剂的制造中，如描述于美国专利号5,942,479、6,086,903、 5,833,999、6,468,955、以及6,407,044中的那些。

VII.具有非天然存在的脂肪酸谱的油

在此披露的油与其他天然产生的中链脂肪酸含量高的油(如棕榈油、棕榈仁油、以及椰子油)不同。例如，在棕榈油和棕榈仁油中的污染物(如类胡萝卜素)水平远远高于在此所描述的油中的污染物水平。棕榈油和棕榈仁油特别地含有α与β胡萝卜素和番茄红素，其量远远高于它们在此处所描述的油中的量。另外，在棕榈油和棕榈仁油中发现了超过20种不同的类胡萝卜素，而这些实例证明在此所描述的油含有很少的类胡萝卜素种类并且水平很低。另外，在棕榈油、棕榈仁油、以及椰子油中的维生素E化合物(如生育三烯酚)的水平远远高于在此所描述的油中的水平。

通常，无绿藻属株系具有极少或不具有链长C8-C14的脂肪酸。例如，无绿藻属株系桑椹型无绿藻(UTEX 1435)、克鲁格尼无绿藻(UTEX 329)、雍滞无绿藻(UTEX 1442)以及祖菲无绿藻(UTEX 1438)不产生(或产生不可检测量的)C8脂肪酸、0-0.01％之间的C10脂肪酸、0.03％-2.1％之间的 C12脂肪酸以及1.0％-1.7％之间的C14脂肪酸。

在一些情况下，包含编码变体脂酰基-ACP硫酯酶的产油细胞(例如无绿藻属株系)具有一种脂肪酸谱，其特征在于5％-10％、10％-20％、20％-30％、 30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、或90％- 99％C8、C10、C12、或C14脂肪酸。在其他情况下，这些含有编码脂酰基- ACP硫酯酶(该硫酯酶对于链长C12和C14的脂酰基-ACP底物具有活性) 的转基因的无绿藻属株系以1:1+/-20％的比率生产链长C12和链长C14的脂肪酸。

在一些情况下，由于具有特定链长的所希望的脂肪酸的增加，在恒定的并且高的选择性压力下保持这些转基因无绿藻属株系以保留外源基因是有利的。还可以通过使用同源重组载体以及在此披露的方法将外源基因插入这些细胞的核染色体中来出现高水平的外源基因保留。也考虑了含有整合到核染色体中的外源基因的重组细胞。

微藻油还可以包含由微藻产生或从培养基中结合到微藻油中的其他组分。这些其他组分可以按不同的量存在，这取决于用于培养微藻的培养条件、微藻的种类、用来从生物质回收微藻油的提取方法和可能影响微藻油组成的其他因素。此类组分的非限制性实例包括从0.1-0.4微克/ml存在的类胡萝卜素、从0-0.02微克/千克油存在的叶绿素、从0.4-0.6微克/100克油存在的γ生育酚、以及从0.2-0.5微克/克油存在的总生育三烯酚。

其他组分可以包括而不限于磷脂、生育酚、生育三烯酚、类胡萝卜素 (例如，α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素，等等)、叶黄素(xanthophyll) (例如，叶黄素(lutein)、玉米黄质、α-隐黄质和β-隐黄质)、以及各种有机或无机化合物。

在一些情况下，从无绿藻属物种提取的油包括不超过0.02mg/kg叶绿素。在一些情况下，从无绿藻属物种提取的油包括不超过0.4mcg/ml总类胡萝卜素。在一些情况下，无绿藻属油包括0.40-0.60毫克之间的γ生育酚/100克油。在其他情况下，无绿藻属油包括0.2-0.5毫克之间的总生育三烯酚/克油。

从表达变体酰基-ACP硫酯酶的宿主细胞中产生的油将具有一种同位素谱(isotopic profile)，该谱将它例如与来自其他来源的共混油区别开。稳定碳同位素值δ13C是相对于标准品(例如PDB，来自美国南卡罗来纳州皮迪组 (Peedee formation)的美洲箭石(Belemnite americana)的化石骨架的天然焦) 的13C/12C的比率的一种表示。油的稳定碳同位素值δ13C(0/00)可以与所用原料的δ13C值相关。在一些实施例中，这些油衍生自异养地生长于衍生自 C4植物(如玉米或甘蔗)的糖上的产油生物。在一些实施例中，油的δ13C (0/00)是从10到-17 0/00或从13到-16 0/00。

在不同实施例中，表达一种变体酰基-ACP硫酯酶的宿主细胞产生一种以下的油，该变体酰基-ACP硫酯酶包括来自C10-偏好型酰基-ACP硫酯酶(例如，来自细叶萼距花的酰基-ACP硫酯酶)的特异性结构域的所有或特异性决定残基、和来自C12-偏好型酰基-ACP硫酯酶(例如，来自赖特氏萼距花或加州月桂的酰基-ACP硫酯酶)的催化结构域该油包括至少约10％C12:0脂肪酸，以及至少约10％C14:0脂肪酸。

在不同实施例中，表达一种变体酰基-ACP硫酯酶的宿主细胞产生一种以下的油，该变体酰基-ACP硫酯酶包括具有取代His163→Tyr或Leu186→Pro 一者或两者(或在相应于SEQ ID NO:61的His163→Tyr或Leu186→Pro的位置处)的第一酰基-ACP硫酯酶的经修饰的特异性结构域的所有或特异性决定残基、和第二酰基-ACP硫酯酶的催化结构域，该油包括至少约5％例如至少约6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、或更多C8:0脂肪酸或至少约5％例如至少约6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、或更多C10:0脂肪酸或一个C8:0/C10:0比率，该C8:0/C10:0比率是至少约5％例如至少约6％、7％、 8％、9％、10％、12％、15％、或更多。如果适当的话，该特异性结构域可以衍生自C8:0-、C10:0-或C12:0-偏好型酰基-ACP硫酯酶，并且独立地，该催化结构域可以衍生自C8:0-、C10:0-或C12:0-偏好型酰基-ACP硫酯酶。该特异性结构域和该催化结构域可以来自相同或不同的酰基-ACP硫酯酶。在不同实施例中，表达一种变体酰基-ACP硫酯酶的宿主细胞产生一种以下的油，该变体酰基-ACP硫酯酶包括来自C10-偏好型酰基-ACP硫酯酶(例如，来自细叶萼距花具有取代His163→Tyr或Leu186→Pro的一者或两者的酰基-ACP硫酯酶)的经修饰的特异性结构域的所有或特异性决定残基、和来自C10-偏好型酰基-ACP硫酯酶(例如，来自细叶萼距花的酰基-ACP硫酯酶)的催化结构域，该油包括至少约5％例如至少约6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、或更多C8:0脂肪酸或至少约5％例如至少约6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、或更多C10:0脂肪酸或一个C8:0/C10:0比率，该C8:0/C10:0比率是至少约5％例如至少约6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、或更多。

在不同实施例中，表达一种变体酰基-ACP硫酯酶的宿主细胞产生一种以下的油，该变体酰基-ACP硫酯酶包括来自C14-偏好型酰基-ACP硫酯酶(例如，来自樟树的酰基-ACP硫酯酶)的特异性结构域的所有或特异性决定残基、和来自C12-偏好型酰基-ACP硫酯酶(例如，来自赖特氏萼距花或加州月桂的酰基-ACP硫酯酶)的催化结构域，该油以大约1:1比率(例如1:1+/-20％的比率)包括C12:0脂肪酸和C14:0脂肪酸。

此外，表达一种包括从定位至疏水结构域N-末端的接头结构域的C-末端延伸的5个或更多个氨基酸残基的变体酰基-ACP硫酯酶的宿主细胞，与表达不具有接头结构域的相同酰基-ACP硫酯酶的宿主细胞相比，产生一种包括相对升高的中链长度脂肪酸(例如，C8:0、C10:0、C12:0、C14:0)的油。在不同实施例中，表达包括从定位至疏水结构域N-末端的接头结构域的C-末端延伸的5个或更多个氨基酸残基的变体酰基-ACP硫酯酶的宿主细胞，与表达不具有接头结构域的相同酰基-ACP硫酯酶的宿主细胞相比，产生一种包括增加至少1倍、2倍、3倍、或更多的中链长度脂肪酸的油。

在一个特定实施例中，一种重组细胞包括可操作表达一种外源基因的产物的核酸，这些核酸编码一种变体酰基-ACP硫酯酶外源基因，该外源基因编码一种有活性的酰基-ACP硫酯酶，该硫酯酶酶催化从ACP切下中链脂肪酸。结果，在一个实施例中，所产生的油的特征可以在于一种由于这些重组核酸的表达所致的C8、C10、C12、和/或C14脂肪酸升高以及C16、C18、和 C18:1脂肪酸降低的脂肪酸谱。在不同实施例中，C8、C10、C12、和/或C14脂肪酸增加是大于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、 20％、30％、40％、50％、60％、70％、从75％-85％、从70％-90％、从90％- 200％、从200％-300％、从300％-400％、从400％-500％、或大于500％。

在一些实施例中，增加细胞或细胞的油中的中链脂肪酸水平的另外一种基因修饰包括编码一种活性溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)的一种外源溶血磷脂酸酰基转移酶基因的表达，该酶催化中链脂酰基转移到经取代的酰基甘油酯的sn-2位置。在一个特定的相关实施例中，外源酰基-ACP硫酯酶和 LPAAT两者都在细胞中稳定地表达。由于将重组核酸导入到产油细胞(并且尤其是质体微生物细胞)中，一种外源中链特异性硫酯酶和一种催化中链脂酰基转移到经取代的酰基甘油酯的sn-2位置的外源LPAAT可以使该细胞增加它所产生的三酰甘油酯(TAG)中的具体的中链脂肪酸的百分比10、20 30、 40、50、60、70、80、90倍或更高倍数。与仅导入外源中链偏好型酰基-ACP 硫酯酶相比，导入外源LPAAT可以使在sn-2位置处的中链脂肪酸增加1、2、 3、4倍或更高倍数。在一个实施例中，该中链脂肪酸占到由该细胞产生的 TAG脂肪酸的大于30％、40％、50％60％、70％、80％、或90％。在不同实施例中，该中链脂肪酸是癸酸、辛酸、月桂酸、肉豆蔻酸、和/或棕榈酸。

在不同实施例中，编码溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)的基因选自下组，该组由以下各项组成：拟南芥1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶 (GenBank登录号AEE85783)、芥菜1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶 (GenBank登录号ABQ42862)、芥菜1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶 (GenBank登录号ABM92334)、甘蓝型油菜1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶(GenBank登录号CAB09138)、莱茵衣藻溶血磷脂酸酰基转移酶 (GenBank登录号EDP02300)、椰溶血磷脂酸酰基转移酶(GenBank登录号 AAC49119)、绣线菊溶血磷脂酸酰基转移酶(GenBank登录号EDP02300)、荷包蛋花1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶(推定的)(GenBank登录号 CAA88620)、荷包蛋花酰基-CoA:sn-1-酰基甘油-3-磷酸酰基转移酶(GenBank登录号ABD62751)、荷包蛋花1-酰基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶 (GenBank登录号CAA58239)、蓖麻1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶 (GenBank登录号EEF39377)。

可替代地，或除外源外源LPAAT外，细胞可以包含多个重组核酸，这些核酸可操作以表达外源KASI或KASIV酶并且任选地降低或消除KASII活性，这在表达中链偏好型酰基-ACP硫酯酶时特别有益。将无绿藻属细胞进行工程化以过表达KASI和/或KASIV酶连同中链偏好型酰基-ACP硫酯酶可以产生以下株系，在这些株系中C10-C12脂肪酸的生产是总脂肪酸的至少约40％，例如，总脂肪酸的至少约45％、50％、55％、60％或更多。也可以通过抑制KASI和/或KASII活性(例如使用敲除或敲低)来增加中链的产生。桑椹型无绿藻(UTEX1435)KASI的不同等位基因的染色体敲除连同中链偏好型酰基-ACP硫酯酶的过表达一起可以实现如下脂肪酸谱，这些脂肪酸谱是至少约60％C10-C14脂肪酸，例如，至少约65％、70％、75％、80％、85％或更多C10-C14脂肪酸酸。还可以由于KASI RNA发夹多核苷酸的表达来实现升高的中链脂肪酸。除这些修饰中的任一种外，还可以抑制不饱和或多不饱和脂肪酸产生，(例如通过敲除或敲低)SAD或FAD酶。

在一个实施例中，将以上所描述的高中链产生细胞之一进一步工程化，通过敲除或敲低一种或多种脂酰基去饱和酶来产生低多不饱和油。因此，产生的油具有高稳定性。

高中链油或衍生自这些油的水解的脂肪酸可以特别适用于食品、燃料和油化学应用中，包括制造润滑剂和表面活性剂。例如，衍生自这些细胞的脂肪酸可以被酯化、裂化、还原成醛或醇、氨化、硫酸化、磺酸化或经受本领域中已知的其他化学过程。

VIII.燃料和化学品生产

日益增长的兴趣指向生物起源的烃组分在燃料(如生物柴油、可再生柴油、以及喷气燃料)中的用途，因为可以替代衍生自化石燃料的起始材料的可再生生物起始材料是可获得的，并且其使用是令人希望的。本发明提供了使用通过在此所描述的方法产生的脂质作为生物材料生产生物柴油、可再生柴油、以及喷气燃料的方法，从而生产生物柴油、可再生柴油、以及喷气燃料。

传统的柴油燃料是富含石蜡烃的石油馏出物。它们具有宽至370°到 780°F的沸程，适合在压燃式发动机中燃烧，如柴油发动机车辆。根据该沸程，连同可允许范围的其他燃料特性，如十六烷值、浊点、闪点、粘度、苯胺点、含硫量、含水量、灰分含量、铜片腐蚀、以及碳渣，美国试验与材料协会 (American Society of Testing and Materials)(ASTM)建立了柴油的等级。技术上，衍生自生物质或以别的方式符合适当的ASTM规范的任何烃馏出物材料可以定义为柴油燃料(ASTM D975)、喷气燃料(ASTM D1655)，或如果它是脂肪酸甲酯则定义为生物柴油(ASTM D6751)。

在提取之后，可以使从在此描述的微生物生物质回收的脂质和/或烃组分经受化学处理以制造在柴油车辆或喷气发动机中使用的燃料。

生物柴油是一种颜色在金色与深棕色之间变化的液体，这取决于生产原料。它与水几乎不混溶，具有高沸点和低蒸汽压。生物柴油是指供在柴油发动机车辆中使用的等同柴油的加工燃料。生物柴油是可生物降解的并且是无毒的生物柴油胜过常规柴油燃料的一个另外的益处是较低的发动机磨损。典型地，生物柴油包含C14-C18烷基酯。多种方法将生物质或如在此描述地产生并分离的脂质转变为柴油燃料。生产生物柴油的一个优选方法是借助于如在此描述的脂质的酯交换反应。用于用作生物柴油的一种优选烷基酯是甲酯或乙酯。

在大多数现有的柴油发动机车辆中，通过在此描述的方法生产的生物柴油可以单独使用或以任何浓度与常规柴油燃料共混使用。当与常规柴油燃料 (石化柴油)共混使用时，生物柴油可以从大约0.1％至大约99.9％存在。世界上许多地方使用被称为“B”因子的系统来说明生物柴油在任何燃料混合物中的量。例如，含有20％生物柴油的燃料被标识为B20。纯生物柴油被称为 B100。

生物柴油还可以在家用或商用锅炉中用作加热燃料。现有的燃油锅炉可能含有橡胶部件并且可能需要转变以便靠生物柴油来运行。转变方法通常相对简单，包括将橡胶部件更换为合成部件，因为生物柴油是一种强溶剂。由于其强溶解能力，燃烧的生物柴油将增加锅炉的效率。生物柴油可以在柴油的配制品中用作添加剂以增加纯的超低硫柴油(ULSD)燃料的润滑性，超低硫柴油是有利的，因为它几乎不具有含硫量。生物柴油是一种比石化柴油更好的溶剂并且可以用来分解先前靠石化柴油运行的车辆的燃料管线中的残渣沉积物。

生物柴油可以通过包含在富油生物质中的甘油三酯的酯交换来生产。因此，本发明的另一个方面提供了一种用于生产生物柴油的方法。在一个优选实施例中，用于生产生物柴油的方法包括以下步骤：(a)使用在此披露的方法培养含脂质微生物，(b)裂解含脂质微生物以产生一种裂解产物，(c)从该裂解的微生物分离脂质，并且(d)将该脂质组合物酯交换，由此产生了生物柴油。用于微生物生长、裂解微生物以产生裂解产物、在包含有机溶剂的介质中处理该裂解产物以形成异质混合物以及将该处理的裂解产物分离为脂质组合物的方法已经描述于上文并且也可以在生产生物柴油的方法中使用。

生物柴油的脂质谱通常与原料油的脂质谱高度类似。可以使通过这些方法提供的其他油以及在此所描述的组合物经受酯交换以产生具有多种脂质谱的生物柴油，这些脂质谱包括(a)至少4％C8-C14；(b)至少0.3％C8；(c)至少2％C10；(d)至少2％C12；以及(3)至少30％C8-C14。

脂质组合物可以经受酯交换以产生作为生物柴油有用的长链脂肪酸酯。优选的酯交换反应概述于下文并且包括碱催化的酯交换和使用重组脂肪酶的酯交换。在碱催化的酯交换方法中，在碱性催化剂(典型地是氢氧化钾)的存在下使三酰甘油酯与醇(如甲醇或乙醇)反应。这一反应形成甲酯或乙酯以及作为副产物的丙三醇(甘油)。

动物或植物油典型地是由甘油三酯构成的，甘油三酯是游离脂肪酸与三元醇甘油的酯。在酯交换中，用一种短链醇(如甲醇或乙醇)来替代三酰甘油酯(TAG)中的甘油。

在这一反应中，用碱使醇去质子化以使其成为一种更强的亲核体。通常，使用非常过量(高达50倍)的乙醇或甲醇。通常，这一反应将极慢地进行或不进行。可以使用热，以及酸或碱来帮助该反应更快地进行。该酸或碱不被该酯交换反应消耗，因此它们不是反应物而是催化剂。使用碱催化技术已经生产了几乎所有的生物柴油，因为它仅要求低温低压并且产生了超过98％的转换率(其条件是起始油水分低并且不含脂肪酸)。

如以上所讨论，还已经使用一种酶(如脂肪酶)代替碱来进行酯交换。可以在例如室温至80℃.之间的温度、以及大于1:1(优选大约3:1)的 TAG与低级醇的摩尔比下进行脂肪酶催化的酯交换。适合在酯交换中使用的脂肪酶包括但不限于在表7中列出的那些。对于酯交换有用的脂肪酶的其他实例发现于例如美国专利号4,798,793、4,940,845 5,156,963、5,342,768、 5,776,741以及WO 89/01032中。这样的脂质肪酶包括但不限于由以下微生物产生的脂肪酶：根霉属、曲霉属、假丝酵母属、毛霉属、假单胞菌属、根毛霉属、假丝酵母属以及腐质霉属，以及胰脂肪酶。

适合于在酯交换中使用的脂肪酶包括但不限于黑曲霉脂肪酶ABG73614、南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶B(novozym-435)CAA83122、圆柱形假丝酵母(Candida cylindracea)脂肪酶AAR24090、解脂假丝酵母 (Candida lipolytica)脂肪酶(脂肪酶L；天野制药株式会社(Amano Pharmaceutical Co.,Ltd.))、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)脂肪酶(例如，脂肪酶-OF；名糖产业株式会社(Meito Sangyo Co.,Ltd.))、米黑毛霉 (Mucor miehei)脂肪酶(Lipozyme IM 20)、萤光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)脂肪酶AAA25882、日本根霉(Rhizopus japonicas)脂肪酶 (Lilipase A-10FG)Q7M4U7_1、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶 B34959、米根霉(Rhizopusoryzae)脂肪酶(脂肪酶F)AAF32408、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)脂肪酶(SM酶)ABI13521、绵毛嗜热丝孢菌 (Thermomyces lanuginosa)脂肪酶CAB58509、脂肪酶P(长濑化成株式会社(Nagase ChemteX Corporation))、以及脂肪酶QLM(名糖产业株式会社，名古屋，日本)

使用脂肪酶用于生产适合于生物柴油的脂肪酸酯的一个挑战是：脂肪酶的价格比强碱法所使用的氢氧化钠(NaOH)的价格高得多。已经通过使用可以再循环的固定化脂肪酶来解决这一挑战。然而，在循环持续一个最小的循环数之后必须维持固定化脂肪酶的活性，以允许基于脂肪酶的方法在生产成本方面与强碱法相竞争。固定化脂肪酶会遭受典型地在酯交换中使用的低级醇的毒害。美国专利号6,398,707(2002年6月4日颁布给吴(Wu)等人)描述了用于增强固定化脂肪酶活性以及再生具有降低活性的固定化脂肪酶的方法。一些适合的方法包括将固定化脂肪酶在具有不少于3的碳原子数目的醇中浸渍持续一段时间，优选从0.5-48小时，并且更优选从0.5-1.5小时。一些适合的方法包括将失活的固定化脂肪酶用具有不少于3的碳原子数目的醇进行洗涤并且然后将该失活的固定化脂肪酶浸渍在植物油中持续0.5-48小时。

在特定实施例中，在产生重组脂肪酶作用于其上的脂质的相同微生物中表达该重组脂肪酶。适合的重组脂肪酶包括以上列出的那些和/或具有以上列出的GenBank登录号的那些，或一种与在以上列出的脂肪酶之一具有至少70％氨基酸一致性并且展现出脂肪酶活性的多肽。在另外的实施例中，酶活性存在于与上述序列之一具有至少大约75％、至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％、至少大约95％、或者至少大约99％一致性的序列中，特此将所有序列通过引用进行结合，如同本文完全阐述。编码脂肪酶和选择性标记的 DNA优选是密码子优化的cDNA。再编码用于在微藻中表达的基因的方法描述于美国专利号7,135,290中。

针对生物柴油的国际通用标准是EN 14214。ASTM D6751是在美国和加拿大引用的最通用的生物柴油标准。德国使用DIN EN 14214而在英国要求遵循BS EN 14214。确定这些产品是否符合这些标准的基本工业测试典型地包括气相色谱、HPLC以及其他。符合质量标准的生物柴油是完全无毒的，具有大于50mL/kg的毒性度(LD₅₀)。

虽然符合ASTM标准的生物柴油必须是无毒的，但是可以存在倾向于作为沉积物从溶液中结晶和/或沉淀和沉降的污染物。当在较低温度下使用柴油时，沉积物形成尤其是个问题。沉积物或沉淀物可以引起问题，如降低燃料流动、阻塞燃料线管、阻塞过滤器等。具体涉及去除生物柴油中的这些污染物和沉积物以便产生更高质量产品的方法是本领域熟知的。这样的方法的实例包括但不限于对油进行预处理以去除污染物(例如磷酸酯和游离脂肪酸)

(例如脱胶、碱炼和二氧化硅吸附剂过滤)和冷过滤。冷过滤是一种特别研发以去除在生产之后存在于生物柴油中的任何微粒和沉积物的方法。这种方法冷却生物柴油并且过滤出当这种燃料在较低温度使用时可能形成的任何沉积物或沉淀物。这样一种方法在本领域内是熟知的并且描述于美国专利申请公开号2007-0175091中。适合的方法可以包括将生物柴油冷却至低于大约 38℃的温度，使得杂质和污染物作为在生物柴油液体中的微粒沉淀出来。然后可以将硅藻土或其他过滤材料添加至冷却的生物柴油以形成浆料，然后可以将这种浆料通过压力叶(pressure leaf)过滤器或其他类型的过滤器过滤以去除微粒。然后可以将过滤的生物柴油通过增泽过滤器(polish filter)以去除任何剩余的沉积物和硅藻土，从而产生最终的生物柴油产品。

美国专利公开号2012/0283460使用来自桑椹型无绿藻的甘油三酯油生产生物柴油。根据ASTM D6751A1方法，生产的生物柴油的冷浸过滤性是300 ml体积120秒。这种测试包括过滤300ml的B100，冷却至40°F持续16小时，允许加温至室温，并且在真空下使用0.7微米的具有不锈钢支撑的玻璃纤维过滤器进行过滤。在此描述的油可以进行酯交换以产生具有少于120秒、少于 100秒、以及少于90秒的冷浸时间的生物柴油。

如果将在特别冷的温度中使用生物柴油，还可以使用后续过程。这样的过程包括冬化和分级。两种过程都被设计为通过降低浊点(生物柴油开始结晶的温度)来改进燃料的冷流和冬季性能。存在着冬化生物柴油的若干途径。一种途径是将生物柴油与石化柴油共混。另一种途径是使用能够降低生物柴油的浊点的添加剂。另一种途径是通过在添加剂中混合并且允许饱和物结晶并且然后过滤出晶体而不加选择地去除饱和的甲酯。分级选择性地将甲酯分离成单独的组分或级分，从而允许去除或者包含特定的甲酯。分级方法包括尿素分级、溶剂分级和热蒸馏。

由本发明的方法提供的另一种有价值的燃料是可再生柴油，其包含链烷，如C10:0、C12:0、C14:0、C16:0以及C18:0并且因此是与生物柴油是可区别的。高质量的可再生柴油符合ASTM D975标准。由本发明的方法产生的脂质可以用作生产可再生柴油的原料。因此，本发明的另一个方面提供了一种用于生产可再生柴油的方法。可以通过至少三个过程来生产可再生柴油：氢热处理(氢化处理)、加氢处理、以及间接液化。这些方法产生非酯馏出物。在这些过程期间，如在此描述所产生和分离的三酰甘油酯被转化成链烷。

在一个实施例中，用于生产可再生柴油的方法包括(a)使用在此披露的方法培养含脂质微生物，(b)将微生物裂解以产生裂解产物，(c)从该裂解的微生物分离脂质，以及(d)将该脂质脱氧和氢化处理以产生链烷，由此产生可再生柴油。适合于制造可再生柴油的脂质可以通过使用有机溶剂(如己烷)从微生物生物质提取，或通过其他方法(如描述于美国专利号5,928,696中的那些)而获得。一些适合的方法可以包括机械压制和离心。

在一些方法中，首先将微生物脂质裂化连同将其氢化处理以分别降低碳链长度和减少饱和双键。然后将该材料异构化，也连同将其氢化处理。然后通过蒸馏去除石脑油部分，随后另外地蒸馏以蒸发并且蒸馏柴油燃料中的所希望的组分以符合ASTM D975标准，同时留下比所希望的组分更重的组分以便符合D975标准。化学修饰油(包括甘油三酯油)的氢化处理、加氢裂化、脱氧以及异构化方法在本领域内是熟知的。参见例如欧洲专利申请EP 1741768(A1)、EP 1741767(A1)、EP 1682466(A1)、EP 1640437 (A1)、EP 1681337(A1)、EP 1795576(A1)、以及美国专利号7,238,277、 6,630,066、6,596,155、6,977,322、7,041,866、6,217,746、5,885,440、 6,881,873。

在用于生产可再生柴油的方法的一个实施例中，产生链烷的脂质处理是通过脂质组合物的氢化处理来进行的。在氢热处理中，典型地，生物质是在升高的温度和压力下在水中发生反应以形成油和残留固体。转化温度典型地是300°F到660°F，并且压力足以保持水主要为液态，100到170个标准大气压(atm)。反应时间是近似15分钟至30分钟。在反应完成之后，从水中分离有机物。由此产生了适合于柴油的馏出物。

在制造可再生柴油的一些方法中，处理甘油三酯的第一步骤是加氢处理以使双键饱和，接着是在氢和催化剂存在下在升高的温度进行脱氧。在一些方法中，氢化和脱氧在同一个反应中发生。在其他方法中，脱氧在氢化之前发生。然后任选地进行异构化，同样是在氢和催化剂的存在下进行。优选通过蒸馏去除石脑油组分。例如，参见美国专利号5,475,160(甘油三酯的氢化)、5,091,116(脱氧、氢化以及脱气)、6,391,815(氢化)、以及 5,888,947(异构化)。

一种适合的用于甘油三酯的氢化的方法包括制备铜、锌、镁以及镧盐的水溶液以及另外的碱金属溶液，或优选碳酸铵溶液。这两种溶液可以被加热至大约20℃至大约85℃的温度并且以使得沉淀容器中的pH维持在5.5与 7.5之间的速率一起计量进入该沉淀容器，以便形成一种催化剂。另外的水可以最初用于该沉淀容器中或者与该盐溶液和沉淀溶液同时添加。然后将得到的沉淀物充分洗涤、干燥、在大约300℃.煅烧并且在从大约100℃至大约 400℃的温度范围在氢中进行活化。然后可以在反应器中在上述催化剂的存在下使一种或多种甘油三酯与氢接触并反应。该反应器可以是滴流床反应器、固定床气固反应器、填充的鼓泡塔反应器、连续搅拌槽反应器、浆液反应器、或在本领域内已知的任何其他适合的反应器类型。该过程可以分批或以连续方式进行。反应温度典型地是处于从大约170℃至大约250℃的范围，同时反应压力典型地是处于从大约300psig至大约2000psig的范围。而且，在本发明的该过程中的氢与甘油三酯的摩尔比典型地是处于从大约20:1至大约 700:1的范围。该过程典型地是在范围从大约0.1hr^-1至大约5hr^-1的重量时空速度(WHSV)下进行。本领域的普通技术人员将认识到，反应所需要的时间期限将根据所使用的温度、氢与甘油三酯的摩尔比、以及氢分压而变化。通过这样的氢化过程产生的产物包括脂肪醇、甘油、痕量的石蜡以及未反应的甘油三酯。典型地通过常规手段将这些产物分离，例如像蒸馏、萃取、过滤、结晶，等等。

石油精炼厂使用加氢处理以便通过用氢处理进料来去除杂质。加氢处理转化温度典型地是300°F至700°F。压力典型地是40至100个大气压。反应时间典型地是近似10分钟至60分钟。采用固体催化剂来增加某些反应速率、改进对于某些产物的选择性、以及优化氢消耗。

适合的用于油的脱氧的方法包括将一种油加热至大约350°F至大约 550°F范围的温度并且在至少范围从大气压至大气压以上的压力下使该加热的油连续地与氮接触持续至少大约5分钟。

适合的用于异构化的方法包括使用碱异构化以及本领域内已知的其他油异构化。

氢化处理和加氢处理最终导致甘油三酯进料的分子量的减小。甘油三酯分子在加氢处理条件下被还原为四个烃分子：一个丙烷分子以三个较重的烃分子，典型地在C8至C18的范围。

因此，在一个实施例中，对在此描述的脂质组合物进行的一种或多种化学反应的产物是包含ASTM D975可再生柴油的链烷混合物。通过微生物生产烃由梅茨格(Metzger)等人《应用微生物学与生物技术》(Appl Microbiol Biotechnol)(2005)66:486-496以及《美国能源部水生生物计划回顾：来自藻类的生物柴油》(A Look Back at theU.S.Department of Energy's Aquatic Species Program:Biodiesel from Algae)，TP-580-24190，约翰希恩(John Sheehan)，特里度纳罕(Terri Dunahay)，约翰本曼(JohnBenemann)以及保罗罗斯勒(Paul Roessler)(1998)综述。

根据T10-T90(分别是在10％与90％蒸馏体积处的温度)描述柴油燃料的蒸馏特性。从桑椹型无绿藻甘油三酯油生产可再生柴油。在实例14中产生的材料的T10-T90是57.9℃。可以采用在此披露的油的氢化处理、异构化以及其他的共价修饰方法、以及在此披露的蒸馏和分级方法(如冷过滤)，使用根据在此披露的方法生产的甘油三酯油来产生具有其他T10-T90范围(如 20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、60℃以及65℃)的可再生柴油组合物。

所产生的材料的T10是242.1℃。可以采用在此披露的油的氢化处理、异构化以及其他的共价修饰方法、以及在此披露的蒸馏和分级方法(如冷过滤)来产生具有其他T10值(如在180与295之间、在190与270之间、在 210与250之间、在225与245之间、以及至少290的T10)的可再生柴油组合物。

所产材料的T90是300℃。可以采用在此披露的油的氢化处理、异构化以及其他的共价修饰方法、以及在此披露的蒸馏和分级方法(如冷过滤)来产生具有其他T90值(如在280与380之间、在290与360之间、在300与 350之间、在310与340之间、以及至少290的T90)的可再生柴油组合物。

所产生的材料的FBP是300℃。可以采用在此披露的油的氢化处理、异构化以及其他的共价修饰方法、以及在此披露的蒸馏和分级方法(如冷过滤) 来产生具有其他FBP值(如在290与400之间、在300与385之间、在310 与370之间、在315与360之间、以及至少300的FBP)的可再生柴油组合物。

可以使通过在此描述的方法和组合物提供的其他油经受氢化处理、异构化以及其他共价修饰的组合，这些油包括具有多种脂质谱的油，这些脂质谱包括(a)至少4％C8-C14；(b)至少0.3％C8；(c)至少2％C10；(d)至少2％ C12；以及(3)至少30％C8-C14。

可以通过两步法从任何形式的生物质生产传统的超低硫柴油。首先，将该生物质转化为一种合成气，合成气是一种富含氢和一氧化碳的气体混合物。然后，将该合成气催化转化为液体。典型地，使用费歇尔-托罗普希(Fischer- Tropsch)(FT)合成来完成液体的产生。这一技术适用于煤、天然气、以及重油。因此，在用于生产可再生柴油的方法的又另一个优选实施例中，对于产生链烷的脂质组合物的处理是通过对该脂质组合物进行间接液化来进行的。

本发明还提供了生产喷气燃料的方法。喷气燃料是澄明至稻草色的。最常见的燃料是一种基于无铅/石蜡油的、被分类为飞机A-1(Aeroplane A-1) 的燃料，其按照一套国际标准化的规范生产。喷气燃料是大量的不同的烃的混合物，这些烃可能多达一千种或更多。它们的大小范围(分子量或碳数) 受到对产品的要求的限制，例如凝固点或烟点。煤油型(Kerosone-type)飞机燃料(包括喷气A(Jet A)以及喷气A-1(Jet A-1))具有在大约8与16 碳数之间的碳数分布。宽馏分以及石脑油类型的飞机燃料(包括喷气B(Jet B))典型地具有在大约5与15个碳之间的碳数分布。

两种飞机燃料(喷气A和喷气B)可以含有一些添加剂。有用的添加剂包括但不限于抗氧化剂、抗静电剂、腐蚀抑制剂、以及燃料系统结冰抑制剂 (FSII)。抗氧化剂预防胶质化并且通常基于烷基化苯酚，例如AO-30、AO- 31、或AO-37。抗静电剂消散静电并且预防发电花。Stadis 450是一个实例，其具有二壬基萘磺酸(DINNSA)作为活性成分。腐蚀抑制剂(例如DCI-4A) 用于民用和军用燃料并且DCI-6A用于军用燃料。FSII剂包括例如Di-EGME。

在一些实施例中，喷气燃料是通过将藻类燃料与现有喷气燃料共混而生产的。由本发明的方法产生的这些脂质可以用作生产喷气燃料的原料。因此，本发明的另一个方面提供了一种用于生产喷气燃料的方法。同此提供了两种用于从这些通过本发明的方法产生的脂质来生产喷气燃料的方法：流化催化裂化(FCC)、以及加氢脱氧(HDO)。

流化催化裂化(FCC)是一种用来从重质粗级分生产烯烃尤其是丙烯的方法。通过本发明的方法生产的脂质可以转化为烯烃。该过程包括使脂质流动通过FCC区并且收集由烯烃组成的产物流，其作为喷气燃料是有用的。将所产生的脂质在裂化条件下与裂化催化剂相接触以提供作为喷气燃料有用的包含烯烃和烃的产物流。

在一个实施例中，用于生产喷气燃料的方法包括(a)使用在此披露的方法培养含脂质微生物，(b)将该含脂质微生物裂解以产生裂解产物，(c)从该裂解产物分离脂质，并且(d)处理该脂质组合物，由此产生喷气燃料。在用于生产喷气燃料的方法的一个实施例中，可以使该脂质组合物流动通过一个流体催化裂化区，在一个实施例中，其包括使该脂质组合物在裂化条件下与裂化催化剂相接触以提供一种包括C₂-C₅烯烃的产物流。

在这种方法的某些实施例中，可能令人希望的是去除任何可能存在于该脂质组合物中的污染物。因此，在使该脂质组合物流动通过液体催化裂化区之前，将该脂质组合物进行处理。预处理可以涉及使该脂质组合物与一种离子交换树脂相接触。该离子交换树脂是一种酸性离子交换树脂，如 Amberlyst^TM-15，并且可以在反应器中用作该脂质组合物流动通过(向上流动或向下流动)的床。其他预处理可以包括通过使该脂质组合物与酸(如硫酸、乙酸、硝酸、或盐酸)相接触而进行的温和酸洗。接触通常是在环境温度和大气压用稀释酸溶液来完成的。

任选地使预处理的脂质组合物流到FCC区，在此这些含烃组分被裂化为烯烃。催化裂化是通过使该脂质组合物在反应区内与由精细分散的微粒材料组成的催化剂相接触来完成的。与加氢裂化相反，该反应是催化裂化并且是在不添加氢或无氢消耗下进行的。随着该裂化反应的进行，大量的焦炭沉积在催化剂上。通过在一个再生区内燃烧来自该催化剂的焦炭在高温下再生该催化剂。含焦炭的催化剂(在此称为“积炭催化剂”)被从反应区连续地输送至再生区以进行再生并且被来自再生区的基本上无焦炭的再生催化剂替代。不同气体流对这些催化剂微粒的流化允许催化剂在反应区与再生区之间输送。用于在流化的催化剂流中裂化烃(如在此描述的脂质组合物中的那些)、在反应区与再生区之间输送催化剂、以及在再生器中燃烧焦炭的方法对于FCC 过程领域内的技术人员是熟知的。示例性的FCC应用以及对于裂化脂质组合物以产生C₂-C₅烯烃有用的催化剂描述于美国专利号6,538,169、7,288,685中，通过引用以全文将其结合。

适合的FCC催化剂通常包括至少至少两种组分，它们可以在或可以不在相同基质上。在一些实施例中，两种组分都可以循环遍及整个反应容器。第一组分通常包括在流化催化裂化领域内使用的任何熟知催化剂，如活性无定形粘土型催化剂和/或高活性结晶分子筛。分子筛催化剂可以是比无定形催化剂更优选的，这是因为它们的相对于所希望的产物的大大改进的选择性。在一些优选的实施例中，沸石可以用作FCC过程中的分子筛。优选地，该第一催化剂组分包括大孔沸石，如Y型沸石、活性氧化铝材料、粘合剂材料，包括二氧化硅或氧化铝以及惰性填料(如高岭土)。

在一个实施例中，裂化本发明的脂质组合物发生在FCC区的提升管段 (risersection)或可替代地提升器部分(lift section)。通过一个喷嘴将脂质组合物引入该提升管，导致脂质组合物的迅速蒸发。在接触催化剂之前，脂质组合物一般将具有大约149℃.至大约316℃.(300°F.至600°F.)的温度。催化剂从共混容器流到提升管，在此它与脂质组合物接触大约2秒或更少的时间。

然后将共混的催化剂和反应的脂质组合物蒸气通过一个出口从提升管的顶部释放并且分离成包含烯烃的裂化产物蒸气流以及一批覆盖有大量焦炭并且通常被称为“积炭催化剂”的催化剂颗粒。在最小化脂质组合物与催化剂的接触时间的努力中(可以促进所希望的产物另外转化为不希望的其他产物)，可以使用任何分离器安排(如涡旋臂安排)以从产物流中迅速去除积炭催化剂。该分离器，例如涡旋臂分离器，被定位在一个腔的上部分，该腔具有一个位于该腔的下部分的汽提区(stripping zone)。通过该涡旋臂安排分离的催化剂落下到该汽提区中。包括裂化的烃(包括低碳烯烃)的裂化产物蒸气流和某一催化剂经由一个管道从该腔排出，该管道与旋风分离器连通。这些旋风分离器从该产物蒸气流去除剩余的催化剂颗粒以将颗粒浓度降低至极低水平。然后该产物蒸气流从分离容器的顶部排出。通过这些旋风分离器分离的催化剂返回到分离容器并且然后到达汽提区。汽提区通过与流的逆流接触将来自催化剂表面的吸附的烃去除。

低的烃分压起作用以有利于低碳烯烃的产生。因此，提升管压力被设置在大约172至241kPa(25至35磅/平方英寸(绝对压力))，具有大约35 至172kPa(5至25磅/平方英寸(绝对压力))的烃分压，具有优选的大约 69至138kPa(10至20磅/平方英寸(绝对压力))的烃分压。这种相对低的烃分压是通过使用流作为稀释剂达到这种程度而实现的：该稀释剂是脂质组合物的10wt-％至55wt-％并且优选是脂质组合物的大约15wt-％。其他稀释剂，如干气，可以用来达到等同的烃分压。

在提升管出口的裂化流的温度将是大约510℃.至621℃.(950°F.至 1150°F.)。然而，566℃.(1050°F.)以上的提升管出口温度产生更多的干气和更多的烯烃。然而，566℃.(1050°F.)以上的提升管出口温度产生更少的乙烯和丙烯。因此，在大约566℃.至大约630℃.的优选温度、在大约138kPa 至大约240kPa(20至35磅/平方英寸(绝对压力))的优选压力下运行FCC 过程是优选的。用于该过程的其他条件是催化剂与脂质组合物的比率，其可以从大约5至大约20并且优选是从大约10至大约15而变化。

在用于生产喷气燃料的方法的一个实施例中，脂质组合物被引入FCC反应器的提升器部分。提升器部分的温度会非常热并且范围是从大约700℃ (1292°F)至大约760℃(1400°F)，具有大约100至大约150的催化剂与脂质组合物比率。预期的是，将脂质组合物引入提升器部分将产生大量的丙烯和乙烯。

在使用脂质组合物或如在此描述所产生的脂质而生产喷气燃料的方法的另一个实施例中，该脂质组合物或脂质的结构是通过一种被称为加氢脱氧 (HDO)的过程而破坏的。HDO表示借助于氢来去除氧，即，在破坏该材料的结构时氧被去除。烯属双键被氢化并且任何硫或氮化合物被去除。硫去除被称作加氢脱硫(HDS)。原料(脂质组合物或脂质)的预处理和纯化有助于催化剂的使用寿命。

通常在HDO/HDS步骤中，将氢与原料(脂质组合物或脂质)混合并且然后使该混合物作为并向流、或者作为单相或两相原料通过催化剂床。在 HDO/MDS步骤之后，将产物级分分离并且传送到一个分开的异构化反应器。用于生物起始材料的异构化反应器作为一种并流反应器(co-current reactor) 描述于文献(FI 100 248)中。

用于通过氢化烃进料(例如，在此处的脂质组合物或脂质)而生产燃料的方法还可以通过以下来进行：使该脂质组合物或脂质作为与氢气的并流通过一个第一氢化区，并且其后通过使氢气作为相对于烃流出物的逆流经过一个第二氢化区而使该烃流出物进一步在该第二氢化区中氢化。示例性的HDO 应用以及对于裂化脂质组合物以产生C₂-C₅烯烃有用的催化剂描述于美国专利号7,232,935中，通过引用以其全文进行结合。

典型地，在加氢脱氧步骤中，生物学组分(如在此处的脂质组合物或脂质)的结构被分解，氧、氮、磷以及硫化合物、以及作为气体的轻烃被去除，并且烯属键被氢化。在该过程的第二个步骤中，即，在所谓的异构化步骤中，进行异构化以便支化烃链并且改进石蜡在低温下的性能。

在该裂化过程的第一个步骤中，即HDO步骤，将氢气以及在此处的有待氢化的脂质组合物或脂质作为并流或逆流传送到HDO催化剂床系统，所述催化剂床系统包括一个或多个催化剂床，优选是1-3个催化剂床。该HDO步骤典型地是以并流方式运行的。在HDO催化剂床系统包括两个或更多个催化剂床的情况下，可以利用逆流原理对这些床中的一个或多个进行操作。在该 HDO步骤中，压力在20巴与150巴之间、优选在50巴与100巴之间变化，并且温度是在200℃与500℃之间、优选在300℃-400℃的范围内变化。在该HDO步骤中，可以使用已知的、含有来自周期系统的VII族和/或VIB族金属的氢化催化剂。优选地，这些氢化催化剂是负载有Pd、Pt、Ni、NiMo和 /或CoMo的催化剂，载体是氧化铝和/或二氧化硅。典型地，使用了 NiMo/Al₂O₃和CoMo/Al₂O₃催化剂。

在该HDO步骤之前，可以任选地通过在较温和的条件下预氢化来处理在此处的脂质组合物和脂质，由此避免这些双键的副反应。这样的预氢化是在预氢化催化剂的存在下、在50℃-400℃的温度以及在1200巴的氢压(优选在150℃与250℃之间的温度以及在10巴与100巴之间的氢压)进行的。该催化剂可以含有来自周期系统的VIII族和/或VIB族金属。优选地，该预氢化催化剂是负载有Pd、Pt、Ni、NiMo和/或CoMo的催化剂，载体是氧化铝和/或二氧化硅。

将来自该HDO步骤的含有氢的气体流进行冷却并且然后从其中去除一氧化碳、二氧化碳、氮、磷以及硫化合物、气态轻烃以及其他杂质。在压缩之后，将经纯化的氢或再循环的氢返回至该第一催化剂床和/或这些催化剂床之间以补偿退出的气流。去除冷凝的液体中的水。将该液体传送到该第一催化剂床和/或这些催化剂床之间。

在该HDO步骤之后，使产物经受异构化步骤。对于该过程而言重要的是在烃与异构化催化剂接触之前尽可能完全去除杂质。该异构化步骤包括一个任选的汽提步骤，其中可以通过用水蒸气或适合的气体(如轻烃、氮或氢) 进行汽提而纯化来自该HDO步骤的反应产物。该任选的汽提步骤是以逆流方式在异构化催化剂上游的一个单元中进行的，其中气体与液体彼此接触，或者在利用逆流原理的分开的汽提单元中的实际异构化反应器之前进行。

在该汽提步骤之后，将氢气以及在此处的氢化脂质组合物或脂质、以及任选地n-石蜡混合物传送到包括一个或多个催化剂床的反应性异构化单元。该异构化步骤的这些催化剂床可以按并流或逆流方式进行操作。

对于该过程而言重要的是逆流原理在该异构化步骤中适用。在该异构化步骤中，这是通过以逆流方式进行该任选的汽提步骤或该异构化反应步骤或两者来完成的。在该异构化步骤中，压力在20 150巴范围内、优选是在20 100巴范围内变化，温度是在200℃与500℃之间、优选是在300℃与400℃ 之间变化。在该异构化步骤中，可以使用在本领域内已知的异构化催化剂。适合的异构化催化剂含有分子筛或来自VII族的金属和/或载体。优选地，该异构化催化剂含有SAPO-11或SAPO41或ZSM-22或ZSM-23和/或镁碱沸石以及Pt、Pd或Ni以及Al₂O₃或SiO₂。典型的异构化催化剂是例如Pt/SAPO- 11/Al₂O₃、Pt/ZSM-22/Al₂O₃、Pt/ZSM-23/Al₂O₃以及Pt/SAPO-11/SiO₂。该异构化步骤和该HDO步骤可以在同一个压力容器中或在分开的压力容器中进行。任选的预氢化可以在分开的压力容器中或在同一个压力容器中进行，如同 HDO和异构化步骤。

因此，在一个实施例中，一种或多种化学反应的产物是包含ASTM D1655喷气燃料的链烷混合物。在一些实施例中，符合ASTM 1655喷气燃料的规范的组合物具有低于10ppm的含硫量。在其他实施例中，符合ASTM 1655喷气燃料的规范的组合物具有低于205℃的蒸馏曲线的T10值。在另一个实施例中，符合ASTM 1655喷气燃料的规范的组合物具有低于300℃的终沸点(FBP)。在另一个实施例中，符合ASTM 1655喷气燃料的规范的组合物具有至少38℃的闪点。在另一个实施例中，符合ASTM 1655喷气燃料的规范的组合物具有在775K/M³与840K/M³之间的密度。在又另一个实施例中，符合ASTM 1655喷气燃料的规范的组合物具有低于-47℃的凝固点。在另一个实施例中，符合ASTM 1655喷气燃料的规范的组合物具有至少42.8MJ/K 的燃烧热。在另一个实施例中，符合ASTM 1655喷气燃料的规范的组合物具有至少13.4质量％的氢含量。在另一个实施例中，符合ASTM 1655喷气燃料的规范的组合物具有在260℃的热稳定性，如通过定量重量分析JFTOT在低于3mm的Hg所测试的。在又另一个实施例中，符合ASTM 1655喷气燃料的规范的组合物具有低于7mg/dl的实际胶质。

因此，本发明披露了多种方法，其中进行微藻脂质的化学修饰以产生在多种工业和其他应用中有用的产物。用于修饰由本文中公开的方法产生的油的方法实例包括但不限于，油的水解、油的氢化加工和油的酯化。微藻油的改性产生基本油料化学品，这些化学品可以为所需功能进一步改性成所选择的衍生油料化学品。参考燃料生产方法，按照与上文描述相似的方式，也可以对从本文所述的微生物培养物中产生的油进行这些化学改性。基础油脂化学品的实例包括但不限于肥皂、脂肪酸、脂肪酸甲酯、以及甘油。衍生油脂化学品的实例包括但不限于脂肪腈、酯类、二聚酸、季铵化合物、表面活性剂、脂肪酸烷醇酰胺、脂肪醇硫酸酯、树脂、乳化剂、脂肪醇、烯烃、以及高级链烷。

来自通过在此描述的方法产生的甘油酯的脂肪酸组分的水解产生游离脂肪酸，这些脂肪酸可以被衍生化以产生其他有用的化学品。水解在水和催化剂(可以是酸或碱)的存在下发生。这些释放的游离脂肪酸可以被衍生化以产生多种产物，如在以下文献中报道的：美国专利号5,304,664(高度硫酸化的脂肪酸)、7,262,158(清洁组合物)、7,115,173(织物柔软剂组合物)、 6,342,208(用于处理皮肤的乳剂)、7,264,886(拒水组合物)、6,924,333 (涂料添加剂)、6,596,768(脂质富集的反刍动物原料)、以及6,380,410 (用于洗涤剂和清洁剂的表面活性剂)。

关于水解，在一些实施例中，甘油三酯油任选地首先在一种液体介质 (如水或氢氧化钠)中水解以获得甘油和肥皂。存在着各种适合的甘油三酯水解方法，包括但不限于皂化、酸水解、碱水解、酶水解(在此称为裂解)、以及使用加压热水的水解。本领域内的技术人员将认识到，为了产生油脂化学品，甘油三酯油不需要水解；相反，这种油可以通过其他已知的过程直接转化为所希望的油脂化学品。例如，甘油三酯油可以通过酯化直接转化为脂肪酸甲酯。

在一些实施例中，由在此披露的方法产生的油的催化水解通过将该油裂解为甘油和脂肪酸而发生。如以上所讨论的，然后可以通过一些其他修饰进一步加工这些脂肪酸以获得衍生油脂化学品。例如，在一个实施例中，这些脂肪酸可以经历胺化反应以产生脂族氮化合物。在另一个实施例中，这些脂肪酸可以经历臭氧分解以产生一元酸或二元酸。

在其他实施例中，水解可以经由在此产生的油的裂解而发生，从而产生油脂化学品。在一些实施例中，甘油三酯油可以在其他过程之前裂解。本领域的技术人员将认识到，存在着许多适合的甘油三酯裂解方法，包括但不限于酶裂解以及加压裂解。

通常，酶促的油裂解方法使用酶(脂肪酶)作为作用于水/油混合物的生物催化剂。然后酶裂解将油或脂肪分别裂解为甘油或游离脂肪酸。然后甘油迁移至水相中，而有机相富集有游离脂肪酸。

这些酶裂解反应通常在有机相与水相之间的相界处发生，其中酶仅存在于相界处。然后遇到相界的甘油三酯促成或参与裂解反应。随着反应进行，与游离脂肪酸相比，仍然化学键合为甘油酯的脂肪酸的占有密度或浓度在相界处减少，使得反应减慢。在某些实施例中，酶裂解可以在室温发生。本领域的普通技术人员将知道适合的用于将油裂解为所希望的脂肪酸的条件。

作为实例，可以通过增加界面边界表面来加速反应速度。一旦反应完成，则将游离脂肪酸从不含酶的有机相中分离，并且将仍然含有化学键合为甘油酯的脂肪酸的残余物进行反馈或再循环并与有待经受裂解的新鲜油或脂肪混合。以这种方式，然后将再循环的甘油酯经受另外的酶裂解过程。在一些实施例中，以这样一种方式从部分裂解的油或脂肪中提取游离脂肪酸。以那种方式，如果将这些化学键合的脂肪酸(甘油三酯)返回或反馈进入该裂解过程，则酶消耗可以大幅减少。

裂解程度测定为测量的酸值除以理论上可能的酸值的比率，对于一种给定的油或脂肪而言，这可以计算。优选地，酸值是根据通用标准方法通过滴定而测量的。可替代地，可以将水性甘油相的密度当作裂解程度的量度。

在一个实施例中，如在此描述的裂解过程还适合于裂解被包含在来自这些产生的油的碱精炼过程的所谓的皂料中的甘油单酯、甘油二酯以及甘油三酯。以这种方式，可以将该皂料定量转化，无需事先将中性油皂化为脂肪酸。出于这个目的，优选地在裂解之前通过加入酸来释放化学键合在皂料中的脂肪酸。在某些实施例中，除了用于裂解过程的水和酶之外，使用一种缓冲溶液。

在一个实施例中，还可以使根据在此描述的方法所产生的油经受皂化作用(作为一种水解方法)，动物和植物油典型地是由三酰甘油(TAG)构成，三酰甘油是脂肪酸与三元醇(甘油)的酯。在碱水解反应中，TAG中的甘油被去除，留下三羧酸阴离子，这些三羧酸阴离子能与碱金属阳离子(如钠或钾)缔合而产生脂肪酸盐。在这种方案中，这些羧酸组分被从甘油部分上切割并且被用基基团替代。在该反应中使用的碱(例如，KOH)的量是由所希望的皂化度决定的。如果目的是例如生产一种含有一些最初存在于TAG组合物中的油类的肥皂产品，则将不足以把所有TAG转化为脂肪酸盐的碱量引入反应混合物中。通常，这种反应是在一种水溶液中进行的并且进展缓慢，但是可以通过加热而加快。可以通过向反应混合物中添加盐(如水溶性碱金属卤化物(例如，NaCl或KCl))来促进脂肪酸盐的沉淀。优选地，该碱是一种碱金属氢氧化物，如NaOH或KOH。可替代地，可以在该反应方案中使用其他碱，如烷醇胺，包括例如三乙醇胺以及氨甲基丙醇。在一些情况下，这些可替代物可以优先地产生一种透明肥皂产品。

在一些方法中，化学修饰的第一步可以是加氢处理以使双键饱和，接着是在氢和催化剂存在下在升高的温度进行脱氧。在其他方法中，氢化和脱氧可以在同一反应中发生。仍然在其他方法中，脱氧在氢化之前发生。然后可以任选地进行异构化，同样在氢和催化剂的存在下进行。最后，如果希望的话，可以去除气体和石脑油。例如，参见美国专利号5,475,160(甘油三酯的氢化)、5,091,116(脱氧、氢化以及脱气)、6,391,815(氢化)、以及5,888,947(异构化)。

在一些实施例中，甘油三酯油被部分或完全脱氧。这些脱氧反应形成所希望的产物，包括但不限于脂肪酸、脂肪醇、多元醇、酮、以及醛。通常，不受任何特定的理论限制，这些脱氧反应涉及各种不同反应途径的组合，包括但不限于：氢解、氢化、连续的氢化-氢解、连续的氢解-氢化、以及组合的氢化-氢解反应，其导致氧从脂肪酸或脂肪酸酯中至少部分去除以产生可以通过进一步加工而容易地转化为所希望的化学品的反应产物，如脂肪醇。例如，在一个实施例中，可以通过FCC反应将脂肪醇转化为烯烃或通过缩合反应转化为高级链烷。

一种这样的化学修饰是羟化，其是将氢加成至甘油或游离脂肪酸的脂肪酸组分中的双键。氢化过程允许液体油转化成半固体或固体脂肪，其更适合于特定应用。

由在此描述的方法产生的油的氢化可以与在此提供的一种或多种方法和/ 或材料结合进行，如在以下文献中报道：美国专利号7,288,278(食品添加剂或药剂)、5,346,724(润滑产品)、5,475,160(脂肪醇)、5,091,116(食用油)、6,808,737(用于人造黄油或涂抹食品的结构性脂肪)、5,298,637(卡路里降低的脂肪代用品)、6,391,815(氢化催化剂乙基以及硫吸附剂)、 5,233,099和5,233,100(脂肪醇)、4,584,139(氢化催化剂)、6,057,375(泡沫抑制剂)、以及7,118,773(可食用乳液涂抹食品)。

本领域的技术人员将认识到可以使用各种方法将碳水化合物氢化。一种适合的方法包括使碳水化合物与氢或与混合有适合的气体或催化剂的氢在氢化反应器中在足以形成氢化产物的条件下接触。氢化催化剂通常可以包括Cu、Re Ni、Fe、Co、Ru、Pd、Rh、Pt、Os、Ir、以及其合金或任何组合，其可以是单独的或具有促进剂(如W、Mo、Au、Ag、Cr、Zn、Mn、Sn、B、P、Bi、以及其合金或任何组合)。其他有效的氢化催化材料包括负载型镍或用铼修饰的钌。在一个实施例中，取决于所希望的催化剂的官能度，该氢化催化剂还包括任何一种载体。可以通过本领域的普通技术人员已知的方法来制备这些氢化催化剂。

在一些实施例中，氢化催化剂包括负载型VIII族金属催化剂和金属海绵材料(例如，海绵镍催化剂)。拉尼镍提供了一个适合于在本发明中使用的活化的海绵镍催化剂的实例。在其他实施例中，本发明的氢化反应是使用一种包含镍-铼催化剂或钨修饰的镍催化剂的催化剂来进行的。适合的用于氢化反应的催化剂的一个实例是碳负载型镍-铼催化剂。

在一个实施例中，适合的拉尼镍催化剂可以通过以下来制备：用水性碱溶液(例如，含有大约25重量％的氢氧化钠)处理按重量计大致等量的镍和铝的合金。铝被水性碱溶液选择性地溶解，产生主要包含镍并带有少量铝的海绵状材料。最初的合金包括一定量的促进剂金属(即，钼或铬)，该量使得大约1重量％至2重量％保留在所形成的海绵镍催化剂中。在另一个实施例中，使用浸透适合的载体材料的在水中的亚硝酰硝酸钌(III)、氯化钌(III)溶液来制备该氢化催化剂。然后将该溶液干燥以形成一种具有低于按重量计大约1％的含水量的固体。然后可以将该固体在大气压、在氢气流中、在300℃(非煅烧的)或400℃(煅烧的)、在旋转球炉(rotary ball furnace)中还原4小时。在冷却并用氮气致使该催化剂具有惰性之后，使氮气中按体积计5％的氧在催化剂上流过持续2小时。

在某些实施例中，描述的催化剂包括一种催化剂载体。该催化剂载体稳定并负载该催化剂。所使用的催化剂载体的类型取决于所选择的催化剂和反应条件。适合的用于本发明的载体包括但不限于碳、二氧化硅、二氧化硅-氧化铝、氧化锆、二氧化钛、二氧化铈、氧化钒、氮化物、一氮化硼、杂多酸、羟基磷灰石、氧化锌、氧化铬、沸石、碳纳米管、碳富勒烯以及其任何组合。

可以使用本领域已知的那些常规方法来制备在本发明中使用的催化剂。适合的方法可以包括但不限于初期润湿、蒸发浸透、化学气相沉积、洗涂 (wash-coating)、磁控溅射技术，等等。

用于进行氢化反应的条件将根据起始材料的类型和所希望的产物而变化。得益于本披露，本领域的普通技术人员将认识到适当的反应条件。通常，氢化反应是在80℃至250℃、并且优选在90℃至200℃、并且最优选在100℃ 至150℃的温度下进行的。在一些实施例中，氢化反应是在500KPa至14000 KPa的压力下进行的。

在在本发明的氢解反应中使用的氢可以包括外部氢、再循环氢、原位产生的氢、以及其任何组合。如在此使用的，术语“外部氢”是指不是源自生物质反应本身而是从另一种来源加入到系统中的氢。

在一些实施例中，令人希望的是将起始碳水化合物转化为一种更小的分子，该分子更容易转化为所希望的高级烃。一种适合的用于这种转化的方法是借助于氢解反应。已知多种方法可以用于进行碳水化合物的氢解。一种适合的方法包括使碳水化合物与氢或与混合有适合的气体或氢解催化剂的氢在氢解反应器中在足以形成包含较小的分子或多元醇的反应产物的条件下接触。如在此使用的，术语“更小的分子或多元醇”包括具有更小分子量的任何分子，该分子可以包括比起始碳水化合物更少数目的碳原子或氧原子。在一个实施例中，这些反应产物包括包含多元醇和醇的较小的分子。本领域的普通技术人员将能够选择适当的藉此进行氢解反应的方法。

在一些实施例中，可以使用一种氢解催化剂将5和/或6碳糖或糖醇转化为丙二醇、乙二醇、以及甘油。氢解催化剂可以包括Cr、Mo、W、Re、Mn、 Cu、Cd、Fe、Co、Ni、Pt、Pd、Rh、Ru、Ir、Os、以及其合金或任何组合，其可以是单独的或具有促进剂(如Au、Ag、Cr、Zn、Mn、Sn、Bi、B、O、以及其合金或任何组合)。氢解催化剂还可以包括一种含有过渡金属(例如，铬、钼、钨、铼、锰、铜、镉)或VIII族金属(例如，铁、钴、镍、铂、钯、铑、钌、铱、以及锇)的含碳焦化聚合物催化剂(carbonaceous pyropolymer catalyst)。在某些实施例中，氢解催化剂可以包括与碱土金属氧化物结合的或附着至催化活性载体上的任何以上金属。在某些实施例中，在氢解反应中的所描述的催化剂可以包括一种如在以上描述的用于氢化反应的催化剂载体。

用于进行氢解反应的条件将根据起始材料的类型和所希望产物而变化。得益于本披露，本领域的普通技术人员将认识到用来进行该反应的适当条件。通常，氢化反应是在110℃至300℃、并且优选在170℃至200℃、并且最优选在200℃至225℃的温度下进行的。在一些实施例中，氢解反应是在碱性条件下、优选在8至13的pH、并且甚至更优选在10至12的pH下进行的。在一些实施例中，氢解反应是在60KPa与16500KPa之间的范围、并且优选在1700KPa与14000KPa之间的范围、并且甚至更优选在4800KPa与11000 KPa之间的范围的压力下进行的。

在本发明的氢解反应中使用的氢可以包括外部氢、再循环氢、原位产生的氢、以及其任何组合。

在一些实施例中，可以在缩合反应器(示意性地在图1中示出为缩合反应器110)中通过缩合反应将以上讨论的反应产物转化为高级烃。在这样的实施例中，这些反应产物的缩合在一种能够形成高级烃的催化剂的存在下发生。虽然不意图受理论限制，但是认为高级烃的产生通过逐步加成反应而进行，包括碳-碳或碳-氧键的形成。所得到的反应产物包括含有这些部分的任何数目的化合物，如在以下更详细描述。

在某些实施例中，适合的缩合催化剂包括酸催化剂、碱催化剂、或酸/碱催化剂。如在此所使用的，术语“酸/碱催化剂”是指具有酸和碱官能度两者的催化剂。在一些实施例中，缩合催化剂可以包括但不限于沸石、碳化物、氮化物、氧化锆、氧化铝、二氧化硅、铝硅酸盐、磷酸盐、氧化钛、氧化锌、氧化钒、氧化镧、氧化钇、氧化钪、氧化镁、氧化铈、氧化钡、氧化钙、氢氧化物、杂多酸、无机酸、酸改性树脂、碱改性树脂、以及其任何组合。在一些实施例中，缩合催化剂还可以包括一种改性剂。适合的改性剂包括La、 Y、Sc、P、B、Bi、Li、Na、K、Rb、Cs、Mg、Ca、Sr、Ba、及其任何组合。在一些实施例中，缩合催化剂还可以包括一种金属。适合的金属包括Cu、Ag、 Au、Pt、Ni、Fe、Co、Ru、Zn、Cd、Ga、In、Rh、Pd、Ir、Re、Mn、Cr、Mo、W、Sn、Os、合金、以及其任何组合。

在某些实施例中，在缩合反应中所描述的催化剂可以包括一种如在以上描述的用于氢化反应的催化剂载体。在某些实施例中，缩合催化剂是自负载的。如在此所使用的，术语“自负载”表示该催化剂不需要另一种材料作为载体。在其他实施例中，该缩合催化剂与一种分开的适合于悬浮该催化剂的载体结合使用。在一个实施例中，该缩合催化剂载体是二氧化硅。

缩合反应在其下发生的条件将根据起始材料的类型和所希望的产物而变化。得益于本披露，本领域的普通技术人员将认识到用来进行该反应的适当条件。在一些实施例中，该缩合反应是在对于所提出的反应的热力学是有利的一个温度下进行的。缩合反应的温度将根据特定的起始多元醇或醇而变化。在一些实施例中，缩合反应的温度是在从80℃.至500℃.、并且优选从125℃. 至450℃.、并且最优选从125℃.至250℃.的范围内。在一些实施例中，缩合反应是在0KPa与9000KPa之间的范围、并且优选在0KPa与7000KPa之间的范围、并且甚至更优选在0KPa与5000KPa之间的范围的压力下进行的。

由本发明形成的高级链烷包括但不限于具有从4至30个碳原子的支链或直链链烷、具有从4至30个碳原子的支链或直链烯、具有从5至30个碳原子的环烷、具有从5至30个碳原子的环烯、芳基、稠和芳基、醇、以及酮。适合的链烷包括但不限于丁烷、戊烷、戊烯、2-甲基丁烷、己烷、己烯、2-甲基戊烷、3-甲基戊烷、2,2,-二甲基丁烷、2,3-二甲基丁烷、庚烷、庚烯、辛烷、辛烯、2,2,4-三甲基戊烷、2,3-二甲基己烷、2,3,4-三甲基戊烷、2,3-二甲基戊烷、壬烷、壬烯、癸烷、癸烯、十一烷、十一烯、十二烷、十二烯、十三烷、十三烯、十四烷、十四烯、十五烷、十五烯、壬基癸烷、壬基癸烯、二十烷、二十烯、二十一烷、二十一烯、二十二烷、二十二烯、二十三烷、二十三烯、二十四烷、二十四烯、以及其异构体。这些产物中的一些可以适合用作燃料。

在一些实施例中，这些环烷和环烯是未经取代的。在其他实施例中，这些环烷和环烯是单取代的。仍然在其他实施例中，这些环烷和环烯是多取代的。在包含取代的环烷和环烯的实施例中，这些取代的基团包括但不限于具有1至12个碳原子的支链或直链烷基、具有1至12个碳原子的支链或直链亚烷基、苯基、以及其任何组合。适合的环烷和环烯包括但不限于环戊烷、环戊烯、环己烷、环己烯、甲基-环戊烷、甲基-环戊烯、乙基-环戊烷、乙基-环戊烯、乙基-环己烷、乙基-环己烯、其异构体以及任何组合。

在一些实施例中，所形成的芳基是未取代的。在另一个实施例中，所形成的芳基是单取代的。在包含取代的芳基的实施例中，这些取代的基团包括但不限于具有1至12个碳原子的支链或直链烷基、具有1至12个碳原子的支链或直链亚烷基、苯基、以及其任何组合。适合的用于本发明的芳基包括但不限于苯、甲苯、二甲苯、乙苯、对二甲苯、间二甲苯、以及其任何组合。

在本发明中产生的醇具有从4至30个碳原子。在一些实施例中，这些醇是环状的。在其他实施例中，这些醇是支链的。在另一个实施例中，这些醇是直链的。适合的用于本发明的醇包括但不限于丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一醇、十二醇、十三醇、十四醇、十五醇、十六醇、庚基癸醇、辛基癸醇、壬基癸醇、二十醇、二十一醇(uneicosanol)、二十二醇(doeicosanol)、二十三醇(trieicosanol)、二十四醇(tetraeicosanol)、以及其异构体。

本发明中产生的酮具有从4至30个碳原子。在一个实施例中，这些酮是环状的。在另一个实施例中，这些酮是支链的。在另一个实施例中，这些酮是直链的。适合的用于本发明的酮包括但不限于丁酮、戊酮、己酮、庚酮、辛酮、壬酮、癸酮、十一烷酮、十二烷酮、十三烷酮、十四烷酮、十五烷酮、十六烷酮、庚基癸酮、辛基癸酮、壬基癸酮、二十烷酮、二十一烷酮 (uneicosanone)、二十二烷酮(doeicosanone)、二十三烷酮 (trieicosanone)、二十四烷酮(tetraeicosanone)、以及其异构体。

另一种这样的化学修饰是酯交换。天然产生的甘油脂不具有脂肪酸组分的均匀分布。在油的情况下，酯交换是指在不同甘油酯的两个酯之间的酰基的交换。该酯交换程序提供了一种机制，通过该机制可以将甘油酯混合物的脂肪酸组分重排以改变分布模式。酯交换是一种熟知的化学过程，并且通常包括在一种催化剂的存在下(如碱金属或碱金属烷基化物(例如，甲醇钠)) 将油的混合物加热(至大约200℃)持续一段时间(例如，30分钟)。这个过程可以用来使一种油混合物的脂肪酸组分的分布模式随机化，或者可以指向产生所希望的分布模式。可以对在此提供的材料(如具有至少20％细胞干重的脂质的微生物生物质)进行脂质的这种化学修饰方法。

可以通过将油混合物维持在低于可能出现的一些TAG的熔点以下的温度来进行定向酯交换(其中寻求一种特定的脂肪酸分布模式)。这导致这些TAG的选择性结晶，从而有效地随着它们结晶而将其从反应混合物中去除。例如，该过程可以继续直到油中的大多数脂肪酸已经沉淀。定向酯交换可以用来例如通过用较短链对应物取代较长链脂肪酸来生产一种具有较低卡路里含量的产物。定向酯交换还可以用来生产一种具有脂肪混合物的产物，该产物可以提供在食品添加剂或产品(例如，人造黄油)中寻求的所希望的熔化特性和结构特征，无需借助于氢化，氢化可能产生不需要的反式异构体。

由在此描述的方法产生的油的酯交换可以与一种或多种方法和/或材料结合进行，或产生如在以下文献中报道的产品：美国专利号6,080,853(不易消化的脂肪代用品)、4,288,378(花生酱稳定剂)、5,391,383(食用喷淋油 (Edible spray oil))、6,022,577(用于食品的食用脂肪)、5,434,278(用于食品的食用脂肪)、5,268,192(低卡路里坚果产品)、5,258,197(卡路里降低的食用组合物)、4,335,156(食用脂肪产品)、7,288,278(食品添加剂或药剂)、7,115,760(分级方法)、6,808,737(结构脂肪)、5,888,947(发动机润滑剂)、5,686,131(食用油混合物)、以及4,603,188(固化的氨基甲酸乙酯组合物)。

在根据本发明的一个实施例中，如以上描述的油的酯交换后继之为酯交换的产物与多元醇的反应(如在美国专利号6,465,642中报道)以产生多元醇脂肪酸聚酯。这样一种酯化与分离过程可以包括以下步骤：在肥皂的存在下使一种低级烷基酯与多元醇反应；从产物混合物中去除残余的肥皂；水洗并且干燥产物混合物以去除杂质；漂白产物混合物用于精炼；将至少一部分未反应的低级烷基酯与产物混合物中的多元醇脂肪酸聚酯分离；并且将分离的未反应的低级烷基酯进行再循环。

还可以对具有短链脂肪酸酯的微生物生物质进行酯交换，如在美国专利号6,278,006中报道的。通常，可以通过在一种适合的催化剂存在下将一种短链脂肪酸酯添加至一种油并且加热该混合物来进行酯交换。在一些实施例中，该油构成了按重量计该反应混合物的大约5％至大约90％。在一些实施例中，该短链脂肪酸酯构成了按重量计该反应混合物的大约10％至大约50％。催化剂的非限制性实例包括碱催化剂；甲醇钠；酸催化剂，包括无机酸(如硫酸) 与酸化粘土，有机酸，如甲磺酸、甲磺酸、以及甲苯磺酸，以及酸性树脂，如Amberlyst 15。金属(如钠与镁)、以及金属氢化物也是有用的催化剂。

另一种这样的化学修饰是羟化，其包括将水加成至双键，从而导致饱和以及羟基部分的掺入。该羟化过程提供了一种用于将甘油脂的一种或多种脂肪酸组分转化为羟基脂肪酸的机制。羟化可以例如经由在美国专利号 5,576,027中报道的方法来进行。羟化脂肪酸(包括蓖麻油及其衍生物)作为在若干工业应用(包括食品添加剂、表面活性剂、颜料润湿剂、消泡剂、防水添加剂、增塑剂、化妆品乳化和/或除臭剂)以及电子设备、药物、涂料、油墨、胶粘剂、以及润滑剂中的组分是有用的。可以如何进行甘油酯的羟化的一个实例如下：加热脂肪，优选与庚烷结合加热至大约30℃-50℃.并且在此温度下保持三十分钟或更长；然后将乙酸添加至该混合物，接着添加硫酸水溶液，再接着以小的增量经过一小时添加过氧化氢水溶液至该混合物；在添加过氧化氢水溶液之后，然后可以将温度增加到至少大约60℃.并且搅拌至少六小时；在搅拌之后，允许该混合物沉降并且可以将由该反应形成的下部水层去除，同时用具有大约60℃.的温度的热水洗涤由该反应形成的上部庚烷层；然后可以将洗涤的庚烷层用氢氧化钾水溶液中和至大约5至7的pH并且然后在真空下通过蒸馏将其去除；然后可以将反应产物在100℃.在真空下干燥并且将干燥的产物在真空条件下进行蒸汽除臭并且在大约50℃至60℃.使用硅藻土过滤。

由在此描述的方法产生的微生物油的羟化可以与一种或多种方法和/或材料结合进行，或生产如在以下文献中报道的产品：美国专利号6,590,113(油基涂层和油墨)、4,049,724(羟化过程)、6,113,971(橄榄油脂(Olive oil butter))、4,992,189(润滑剂和润滑油添加剂)、5,576,027(羟化奶)、以及6,869,597(化妆品)。

羟化甘油酯可以被转化为交内酯。交内酯由其中羟化脂肪酸组分已经被酯化为另一种脂肪酸分子的甘油酯组成。羟化甘油酯至交内酯的转化可以通过以下来进行：加温甘油酯与脂肪酸的混合物并且将该混合物与一种矿物酸接触，如由Isbell等人，JAOCS 71(2):169-174(1994)所描述的。交内酯在多种应用中是有用的，包括但不限于在以下文献中报道的那些：美国专利号 7,196,124(弹性材料与地板覆盖物)、5,458,795(用于高温应用的稠化油)、 5,451,332(用于工业应用的流体)、5,427,704(燃料添加剂)、以及 5,380,894(润滑剂、润滑脂、增塑剂以及印刷墨)。

其他的可以对微生物油进行的化学反应包括使三酰甘油与环丙烷化剂(cyclopropanating agent)反应以增强流动性和/或氧化稳定性，如在美国专利号6,051,539中报道；从三酰甘油制造蜡，如在美国专利号6,770,104中报道；以及三酰甘油的环氧化，如在“脂肪酸组合物对环氧化的三酰甘油的酰化动力学的影响”("The effect offatty acid composition on the acrylation kinetics of epoxidizedtriacylglycerols")，《美国油化学协会杂志》(Journal of the American Oil Chemists'Society)，79:1,59-63，(2001)以及《自由基生物学与医学》(Free Radical Biology andMedicine)，37:1,104-114(2004)中报道的。

用于如以上描述的燃料和化学产品的含油微生物生物质的产生导致脱脂生物质粉的产生。脱脂粉是制备藻油的副产物并且作为农场动物(例如，反刍动物、家禽、猪以及水产养殖)的动物饲料是有用的。所得到的粉虽然具有降低的油含量，但仍然含有高品质的蛋白质、碳水化合物、纤维、灰分、残油以及其他适合用于动物饲料的营养物。由于这些细胞大部分被油分离过程裂解，该脱脂粉可以容易地被这些动物消化。脱脂粉可以任选地在动物饲料中与其他成分结合，如谷粒。由于脱脂粉具有粉状一致性(powderyconsistency)，可以使用可商业获得的挤出机或膨胀器或另一种类型的机器将它压制成小丸。

本发明已经如上详述，用下实施例举例，其中提供所述实施例旨在说明，而不限制要求保护的发明。

实例

提供以下实例以说明但不限制请求保护的本发明。

实例1

改变12:0-酰基-酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶的特异性

这个实例证明使用桑椹型无绿藻作为宿主改变12:0-酰基ACP硫酯酶 (TE)的特异性。

在本实例中，我们证明了改变来自加利福尼亚月桂树(加州月桂， “Uc”)(UcFatB2/Uc TE，登录号M94159)的12:0-酰基-酰基载体蛋白 (ACP)硫酯酶的底物特异性以及增强其成熟的能力。这通过用从密切相关的来自樟脑树(樟树，“Cc”)的14:0-ACP硫酯酶(Cc FATB1/Cc TE，登录号U31813)的对应区替代Uc TE的N-末端部分来实现。

Uc TE和Cc TE两者都是核编码蛋白，其必须运输到质体中以在微藻中执行它们各自的活性。通过由质体转运蛋白复合物识别一种位于新生的硫酯酶的N-末端的转运肽，这个转运发生。一旦在质体内，该转运肽被切割，从而释放成熟的硫酯酶。由于新生蛋白与成熟蛋白之间可辨别的迁移率差异，可以通过总细胞裂解物的蛋白质印迹追踪这个成熟过程。如在图1中所示，我们发现了桑椹型无绿藻内的Uc TE与Cc TE之间的成熟总体效率方面的显著差异。这个发现是出人意料的，因为两者蛋白都包含来自原壳小球藻硬脂酰ACP去饱和酶(SAD)蛋白的相同异源转运肽并且在成熟蛋白之间展现出大于90％的氨基酸一致性。

然后，我们研究该Cc TE(如与相应比对的Uc TE序列相比)的N-末端内的九个非重叠氨基酸中的一个或多个是否对所观察到的这种硫酯酶的有效成熟是关键的。因此，我们决定测试用来自Cc TE的对应区替代Uc TE的N- 末端的影响。袁(Yuan)等人(《美国国家科学院院刊》(Proc Natl Acad Sci USA)，(1995)92(23):10639-43)得出结论：酰基-ACP硫酯酶特异性不受Uc TE或Cc TE的N-末端178个氨基酸的影响，如在大肠杆菌中所评估的。在袁(Yuan)等人，Leu84是用于在大肠杆菌中表达的成熟蛋白的起始。相比之下，Pro61是用于本发明的Cc TE和Uc TE表达构建体的原壳小球藻 SAD转运肽后的第一个残基。Trp179是用于袁(Yuan)等人的Uc TE和Cc TE硫酯酶嵌合体的融合点。

我们使用Trp179作为用于构建六个Cc-Uc TE嵌合体的融合点，其中使用Cc TE基因的不同区段来替代Uc TE的对应区(图3)。将这些构建体转化到桑椹型无绿藻株系UTEX1435(我们称为株系A)的一种经典诱变衍生物中。转化、细胞培养物、脂质生产和定量都如先前例如在PCT公开案WO 2008/151149、WO 2010/06032、WO 2011/150410、和WO 2011/150411中所述的进行。经由总细胞裂解物的蛋白质印迹，将每个嵌合硫酯酶对成熟的影响与野生型Cc TE和Uc TE进行比较。

如以下所描述的，我们发现对Cc TE是独特的三个氨基酸(Asn91、 Pro92和Pro102)，这三个氨基酸当移植到Uc TE上时使得能够有效成熟。该更有效的成熟可以允许一种以下的油的脂肪酸谱中更大的改变，该油是由表达一种在那些位置处具有变体氨基酸的外源酰基-ACP TE的细胞产生。此外，我们发现四个Cc TE特定氨基酸(Val127、Leu133、Ala137、以及 Ile163)，该四个氨基酸当移植到Uc TE授予一种新颖的、双重的12:0和 14:0ACP活性。当在这些氨基酸位置中的酰基-ACP TE变体在一种产油细胞中表达时，该细胞可以产生具有令人希望的或甚至新颖的脂肪酸谱的甘油三酯。

实例2

Cc-Uc硫酯酶嵌合体构建体

用来在桑椹型无绿藻(UTEX 1435株系A)内表达Cc-Uc FATB TE嵌合体A的构建体 D1022[pSZ2037]。

在本实例中，产生了用构建体pSZ3070转化的A株系，这些株系表达蔗糖转化酶(允许它们在包含蔗糖的培养基上进行选择并生长)以及在Cc TE 与Uc TE之间的嵌合融合。经导入的用于在株系A中表达的构建体pSZ2037 可以写作6SA::Cr(btub)-syn(yINV)-Cv(nr):Pm(amt03)-Cp(SAD1tp)-Cc(TE2)- Uc(TE2)-嵌合体A-Cv(nr)::6sB。

转化DNA的序列提供于图4。将该构建体中的相关限制性位点用加下划线的小写字母指示，并且从5’-3’对应地为BspQI、KpnI、AscI、MfeI、EcoRI、 SpeI、AscI、XhoI、SacI、BspQI。BspQI位点界定转化DNA的5'和3'端。粗体、小写字母序列代表来自A的允许通过同源重组在6S基因座处靶向整合的基因组DNA。在5'至3'方向继续向前，通过小写字母、加框文本指示驱动酿酒酵母SUC2基因(编码蔗糖水解活性，由此允许该株在蔗糖上生长)表达的莱茵衣藻β-微管蛋白启动子。SUC2的起始子ATG和终止子TGA是由大写字母斜体指示，同时编码区是以小写字母斜体指示。该普通小球藻硝酸还原酶(NR)基因3’-UTR是由小写字母文本指示的，后接间隔区段(虚的下划线，小写字母)及驱动樟树和加州月桂嵌合融合硫酯酶表达的桑椹型无绿藻 AMT3启动子(由加框斜体文本指示)。原壳小球藻SAD1转运肽是由大写字母、加框文本指示的，而樟树和加州月桂衍生的序列分别用加下划线的斜体和粗体大写字母指示。C-末端FLAG表位标签是用加下划线的小写字母指出的。普通小球藻硝酸盐还原酶3’-UTR同样由小写字母加下划线文本指示，后接由小写字母粗体文本指示的A6S基因组区域。对最终构建体进行测序以确保正确的阅读框和靶向序列。

用于表达Uc-Cc TE嵌合体的构建体以及在A中的四个另外的Cc-Uc TE嵌合体(嵌合体B-E)

除Cc-UC TE嵌合体A之外，还设计了五个另外的嵌合硫酯酶表达构建体。这些构建体可以被描述为：

pSZ2038-6SA::Cr(btub)-syn(INV)-Cv(nr):Pm(amt03)-Cp(SAD1tp)- Uc(TE2)-Cc(TE2)-Cv(nr)::6sB

pSZ2231-6SA::Cr(btub)-syn(yINV)-Cv(nr):Pm(amt03)-Cp(SAD1tp)- Cc(TE2)-Uc(TE2)-嵌合体B-Cv(nr)::6sB

pSZ2232-6SA::Cr(btub)-syn(yINV)-Cv(nr):Pm(amt03)-Cp(SAD1tp)- Cc(TE2)-Uc(TE2)-嵌合体C-Cv(nr)::6sB

pSZ2233-6SA::Cr(btub)-syn(yINV)-Cv(nr):Pm(amt03)-Cp(SAD1tp)- Cc(TE2)-Uc(TE2)-嵌合体D-Cv(nr)::6sB

pSZ2234-6SA::Cr(btub)-syn(yINV)-Cv(nr):Pm(amt03)-Cp(SAD1tp)- Cc(TE2)-Uc(TE2)-嵌合体E-Cv(nr)::6sB

所有这些构建体具有与pSZ2037相同的载体骨架、选择性标记、启动子、质体转运肽、FLAG表位标签以及3’-UTR，不同之处仅在于各自的Cc-Uc嵌合硫酯酶。这些构建体中的相关限制性位点也与pSZ2037中的相同。图5-9 指示适当的嵌合硫酯酶序列，其中Cc TE衍生序列是用加下划线的斜体指出的，而Uc TE衍生序列是用粗体大写字母文本指出的。

异源硫酯酶变体在桑椹型无绿藻中的表达产生感兴趣的独特的特异性脂肪酸谱。株系D，其表达一种具有它的内源质体转运肽的赖特氏萼距花硫酯酶(登录号U56103)，给出升高水平的具有大约1:6:3比率(C10:C12:C14) 的C10:0、C12:0和C14:0脂肪酸。在株系E中对具有原壳小球藻SAD转运肽的Cc TE(登录号U31813)的表达，以1:10比率的C12:C14产生升高的 C12:0和C14:0脂肪酸。在株系F中对也包含原壳小球藻SAD转运肽的Uc TE(登录号M94159)的表达，以7:1比率的C12:C14产生升高的C12:0和 C14:0脂肪酸。株系A代表桑椹型无绿藻的基础株系。对于每个株系以生物学重复(A和B)将数据示出在表1中。

表1

样品ID	C8:0	C10:0	C12:0	C14:0	C16:0	C18:0	C18:1	C18:2
									株系D-A	0.03	5.59	32.11	15.59	12.73	1.14	24.59	6.98
株系D-C	0.03	5.89	32.79	15.61	12.58	1.16	24.01	6.63
									株系E-A	0.00	0.03	2.47	23.90	23.95	1.72	35.93	10.32
株系E-B	0.00	0.04	2.50	25.02	23.06	1.69	36.91	9.28
									株系F-A	0.00	0.25	29.59	4.00	11.51	0.84	36.86	14.91
株系F-B	0.00	0.22	27.16	4.20	13.50	1.06	37.30	14.42
									株系A-A	0.00	0.00	0.03	1.28	28.88	2.92	59.91	5.32
株系A-A	0.00	0.01	0.04	1.35	30.23	2.89	58.38	5.44

表2和图10展示了针对以下项的脂肪酸(FA)谱的比较：用pSZ2037 (D1022，Cc-UcTE嵌合体A)和pSZ2038(D1023，Uc-Cc TE嵌合体) DNA(参见图3)转化的代表性衍生物转基因系，并且在株系A中的表达作为参考。用来自Cc TE(pSZ 2037；D1022)的对应区替代UcTE的N-末端产生一种新颖的FA谱，该FA谱展现以大约1:1比率升高的C12:0和C14:0。此外，与野生型Uc TE(在株系F中代表的)相比，这些株系展现成熟蛋白质的增加的稳态水平。相比之下，用来自Uc TE(pSZ2038；D1023)的对应区替代Cc TE的N-末端导致弱表达以及新生蛋白向成熟形式的限制加工。

表2

样品ID	C10:0	C12:0	C14:0	C16:0
					对照A	0.01	0.04	1.37	29.62
T289；D1023-36	0.01	0.04	1.52	29.98
					T289；D1023-27	0.01	0.04	1.39	26.97
T289；D1023-20	0.01	0.04	1.43	27.18
					T289；D1023-11	0.01	0.04	1.45	29.11
T289；D1023-10	0.01	0.04	1.40	28.38
					T289；D1022-33	0.02	2.34	3.09	24.81
T289；D1022-27	0.08	14.43	10.92	20.21
					T289；D1022-17	0.02	1.8	2.7	25.07
T289；D1022-12	0.03	3.27	3.72	23.75
					T289；D1022-8	0.02	1.54	2.47	25.92

表3和图11展示了针对以下株系中的表达的FA谱的比较：株系A对比用pSZ2231(D1210，Cc-Uc TE嵌合体B)或pSZ2232(D1211，Cc-Uc TE嵌合体C)DNA转化的代表性衍生物转基因系。然而表达Cc-Uc TE嵌合体B (pSZ2231；D1210)的株系展现以下FA谱：C12:0和C14:0水平为大约1:1 比率；Cc-Uc TE嵌合体C(pSZ2232；D1211)产生大约4:1比率的C12:0比C14:0。

表3

样品ID	C8:0	C10:0	C12:0	C14:0	C16:0
						对照A	0.00	0.01	0.04	1.48	28.70
T326；D1211-48	0.00	0.03	5.73	1.88	22.07
						T326；D1211-36	0.00	0.05	8.22	2.19	20.16
T326；D1211-34	0.00	0.04	6.75	2.00	21.85
						T326；D1211-12	0.00	0.06	10.89	2.48	20.12
T326；D1211-2	0.00	0.06	11.24	2.50	18.90
						T326；D1210-46	0.00	0.05	7.85	6.65	19.71
T326；D1210-32	0.00	0.05	7.35	6.36	19.92
						T326；D1210-23	0.00	0.08	12.48	8.91	19.24
T326；D1210-20	0.00	0.08	12.58	9.12	18.12
						T326；D1210-17	0.00	0.05	8.12	6.70	20.43

此外，与野生型Uc TE(在株系F中代表的)相比，表达任一构建体的株系展现成熟蛋白质的增加的稳态水平。

表4和图12展示了对于在以下株系中的表达的FA谱的比较：株系A对比用pSZ2233(D1210，Cc-Uc TE嵌合体D)或pSZ2234(D1213，Cc-Uc TE 嵌合体E)DNA(参见图3)转化的代表性衍生物转基因系。表达Cc-Uc TE 嵌合体(pSZ2233；D1212)的株系展现以下FA谱：C12:0和C 14:0水平为大约4:1比率，与天然Uc TE酶的相似。相比之下，表达Cc-Uc TE嵌合体E(pSZ2234；D1213)的株系展现以大约1:1比率的C12:0比C14:0的FA谱。此外，与野生型UcTE(在株系F中代表的)相比，表达任一构建体的株系展现成熟蛋白质的稳态水平中的适度增加。

表4

图13描绘了从Cc TE和Uc TE之间的嵌合融合体鉴定的氨基酸，这些氨基酸对于新生蛋白的有效成熟是必需的(Asn91、Pro92和Pro102)；还描绘了四个Cc TE特定氨基酸(Val127、Leu133、Ala137、以及Ile163)，它们当插入到Uc TE主链背景中时赋予新颖的1:1比率的C12:0和C14:0。因此， FATB2基因至具有一个或多个或Asn91、Pro92和Pro102的突变，当在一种产油细胞并且尤其是一种具有II型脂肪酸合成途径的微藻藻类或植物细胞中表达时，可以增加由该基因编码的基因产物的活性。类似地，FATB2基因至具有一个或多个或Val127、Leu133、Ala137和Ile163的突变，当在一种产油细胞并且特别是一种具有II型脂肪酸合成途径的微藻藻类或植物细胞中表达时，可以增加由该基因编码的基因产物的活性。

实例3

紧接预测的质体转运肽下游的保守结构域增强FATB硫酯酶的活性

在本实例中，我们证明通过包括将保守结构域包括在紧接预测的质体转运肽的下游增强FATB硫酯酶的活性的能力。这些结构域没有功能是先前已知的，并且因此它们可以已经被想到仅为该酶与其质体转运肽之间的接头。我们示出将这些构域与一种天然或异源转运肽包括在一起显著改进了在桑椹型无绿藻中过表达的FATB酰基-ACP硫酯酶的总体酶活性，如改变的脂肪酸谱表现的。此外，我们确定融合来自高度有活性的硫酯酶(如来自湿地萼距花(Cpal FATB2，登录号AAC49180)或赖特氏萼距花(Cw FATB2，登录号U56103)的14:0-酰基-酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶)的这个区域增强更少功能性硫酯酶(如来自加州月桂的FATB2蛋白(Uc FatB2/Uc TE，登录号 M94159)的活性。

我们观察到若干个FATB蛋白当在桑椹型无绿藻中表达时始终展现升高的比活性。作为努力确定这种差异的原因的一部分，我们研究是否FATB硫酯酶的N-末端区域促成该酶活性。植物硫酯酶的序列比对展示了在FATB蛋白的极端N-末端处的显著保守程度(图14)。这个区域重叠所预测的质体转运肽并且包括一种富含脯氨酸结构域和一种疏水性补丁。基于该假定，即N- 末端区域的主要功能是为了提供将新生的蛋白适当地靶向到质体中，该硫酯酶的这个部分通常被一种异源转运肽替代用于在桑椹型无绿藻内表达。

出人意料地，我们注意到具有最高活性程度的FATB硫酯酶表达构建体包括大多数或所有的天然N-末端，并且其活性可以通过改变疏水性补丁或富含脯氨酸结构域来改进。如以下所述，我们通过延伸其N-末端以包括疏水性补丁以及所有或部分的富含脯氨酸结构域改进了若干硫酯酶(例如Uc FATB2，登录号M94159；樟树FATB1，登录号U31813；CpalFATB2，登录号 AAC49180；美洲榆FATB1，登录号O24420以及在此所描述的Cc-Uc FATB 嵌合体B(构建体D1210))的比活性。这些结果证明N-末端区域对FATB 硫酯酶的最大活性的重要性。此外，这些结果证明通过用高度有活性的硫酯酶的N-末端替代它的N-末端能够改进表现不佳的FATB硫酯酶的活性。

构建体D1056

使用构建体D1056[pSZ2084]以在桑椹型无绿藻(UTEX 1435株系A) 内表达包含一种来自原壳小球藻的延伸的异源转运肽的Uc FATB2。

产生用构建体pSZ2084转化的A株系，这些株系表达蔗糖转化酶(允许其在包含蔗糖的培养基上选择和生长)，以及衍生自pSZ1118的Uc FATB2 表达构建体，其中来自原壳小球藻的该异源转运肽从SAD1转运肽和侧翼区延伸为包括15个另外的氨基酸。导入用于在株系A表达的构建体pSZ2084可以写为6SA::CrTUB2-ScSUC2-CvNR:PmAMT3-CpSAD1tpExt-UcFATB2- CvNR::6SB。

转化DNA的序列提供于图14A-C。将该构建体中的相关限制性位点用加下划线的小写字母指示，并且从5’-3’对应地为BspQI、KpnI、AscI、MfeI、 EcoRI、SpeI、XhoI、SacI、BspQI。BspQI位点界定转化DNA的5'和3'端。粗体、小写字母序列代表来自A的允许通过同源重组在6S基因座处靶向整合的基因组DNA。在5'至3'方向继续向前，通过小写字母、加框文本指示驱动酿酒酵母SUC2基因(编码蔗糖水解活性，由此允许该株系在蔗糖上生长)表达的莱茵衣藻β-微管蛋白启动子。SUC2的起始子ATG和终止子TGA是由大写字母斜体指示，同时编码区是以小写字母斜体指示。该普通小球藻硝酸还原酶(NR)基因3’-UTR是由小写字母文本指示的，后接间隔区段(虚的下划线，小写字母)及驱动加州月桂嵌合融合硫酯酶表达的桑椹型无绿藻 AMT3启动子(由加框斜体文本指示)。该延伸的原壳小球藻SAD1转运肽是用加下划线的大写字母指示的，而该加州月桂FATB2衍生的序列是用粗体大写字母标注的。C-末端FLAG表位标签是用加下划线的小写字母指出的。普通小球藻硝酸盐还原酶3’-UTR同样由小写字母文本指示，后接由小写字母粗体文本指示的A 6S基因组区域。对最终构建体进行测序以确保正确的阅读框和靶向序列。

构建体D1057和D1058

使用构建体D1057和D1058用于在株系A中表达具有5或15个氨基酸 N-末端延伸(分别为Uc FATB2Ext A和Uc FATB2Ext B)的Uc FATB2。

除pSZ2084之外，还设计了两个另外的Uc FATB2硫酯酶表达构建体。这些构建体可以被描述为：

pSZ2085-6SA::CrTUB2-ScSUC2-CvNR:PmAMT3-CpSAD1tpExt- UcFATB2ExtA-CvNR::6SB

pSZ2086-6SA::CrTUB2-ScSUC2-CvNR:PmAMT3-CpSAD1tpExt- UcFATB2ExtB-CvNR::6SB

这些构建体具有与pSZ2084相同的载体骨架、选择性标记、启动子、质体转运肽、FLAG表位标签以及3’-UTR，不同之处仅在于各自的Uc FATB2 硫酯酶编码序列。这些构建体中的相关限制性位点也与pSZ2084中的相同。图16-17指示适当延伸的Uc FATB2硫酯酶序列，其中该延伸是用加下划线的斜体标注的，而发现于pSZ2084中的其余的Uc FATB2序列是用粗体大写字母文本标注的。

构建体D1431和D1432

使用构建体D1431和D1432[pSZ2450和pSZ2451]以在桑椹型无绿藻 (UTEX 1435株系C)内表达樟树14:0-ACP硫酯酶(Cc FATB1/Cc TE，登录号U31813)，该14:0-ACP硫酯酶包含一种来自原壳小球藻的延伸的异源转运肽以及衍生自Uc FATB2或Cc FATB1(分别为D1431或D1432)的五个氨基酸N-末端延伸。这些构建体可以被描述为：

pSZ2450-6SA::CrTUB2-ScSUC2-CvNR:PmAMT3-CpSAD1tpExt- CcFATB1ExtA-CvNR::6SB

pSZ2451-6SA::CrTUB2-ScSUC2-CvNR:PmAMT3-CpSAD1tpExt- CcFATB1ExtB-CvNR::6SB

这些构建体两者都具有与pSZ2084相同的载体骨架、选择性标记、启动子、质体转运肽、FLAG表位标签以及3’-UTR，不同之处仅在于各自的Cc FATB1硫酯酶编码序列。这些构建体中的相关限制性位点也与pSZ2084中的相同。图19-20指示适当延伸的Cc FATB1硫酯酶序列，其中该延伸是用加下划线的斜体标注的，而其余的Cc FATB1序列是用粗体大写字母文本标注的。

构建体D1481和D1482

使用构建体D1481和D1482[pSZ2479和pSZ2480]以在桑椹型无绿藻 (UTEX 1435株系C)内表达湿地萼距花14:0-ACP硫酯酶(Cpal FATB2，登录号AAC49180)，该14:0-ACP硫酯酶包含延伸的来自原壳小球藻的异源转运肽以及衍生自天然Cpal FATB2序列的41个氨基酸N-末端延伸。这些构建体可以被描述为：

pSZ2479-6SA::CrTUB2-ScSUC2-CvNR:PmAMT3-CpSAD1tpExt- CpalFATB2ExtA-CvNR::6SB

pSZ2480-6SA::CrTUB2-ScSUC2-CvNR:PmAMT3-CpSAD1tpExt-CpalFATB2ExtA3xFLAG-CvNR::6SB

这些构建体两者都具有与pSZ2084相同的载体骨架、选择性标记、启动子、质体转运肽、以及3’UTR，不同之处仅在于各自的Cpal FATB2硫酯酶编码序列和FLAG表位标签的存在或不存在。这些构建体中的相关限制性位点也与pSZ2084中的相同。图22-23指示适当延伸的Cpal FATB2硫酯酶序列，其中该延伸是用用加下划线的斜体标注的,而其余的CpalFATB2序列是用粗体大写文本标注的并且FLAG表位(pSZ2480)以小写字母文本标注。

构建体D1479和D1480

使用构建体D1479和D1480[pSZ2477和pSZ2478]以在桑椹型无绿藻 (UTEX 1435株系C)内表达美洲榆10:0-16:0-ACP硫酯酶(Ua FATB1，登录号O24420)，该10:0-16:0-ACP硫酯酶包含延伸的来自原壳小球藻的异源转运肽以及衍生自天然Ua FATB1序列的34个氨基酸N-末端延伸。这些构建体可以被描述为：

pSZ2477-6SA::CrTUB2-ScSUC2-CvNR:PmAMT3-CpSAD1tpExt- UaFATB1ExtA-CvNR::6SB

pSZ2478-6SA::CrTUB2-ScSUC2-CvNR:PmAMT3-CpSAD1tpExt-UaFATB1ExtA3xFLAG-CvNR::6SB

这些构建体两者都具有与pSZ2084相同的载体骨架、选择性标记、启动子、质体转运肽、以及3’UTR，不同之处仅在于各自的Ua FATB1硫酯酶和 C-末端的FLAG表位标签的存在或不存在。这些构建体中的相关限制性位点也与pSZ2084中的相同。图25-26指示适当延伸的Ua FATB1硫酯酶序列，其中该延伸是用加下划线的斜体标注的，而其余的Ua FATB1序列是用粗体大写字母文本标注的。在pSZ2478中的FLAG表位是以小写字母文本标注的。

构建体D1210和D1429

使用构建体D1210和D1429[pSZ2231和pSZ2448]以在桑椹型无绿藻 (UTEX 1435株系C)内表达Cc-Uc FATB嵌合体B12:0-14:0-ACP硫酯酶。 Cc-Uc嵌合体B(先前描述的构建体D1210)是通过用来自密切相关的樟树 14:0-ACP硫酯酶(Cc FATB1/Cc TE，登录号U31813)的对应区替代加州月桂(Uc FatB2/Uc TE，登录号M94159)的N-末端部分产生的。构建体D1429 包含一种来自原壳小球藻的延伸的异源转运肽以及衍生自天然Uc FATB2序列的五个氨基酸N-末端延伸。这些构建体可以被描述为：

pSZ2231-6SA::CrTUB2-ScSUC2-CvNR:PmAMT3-CpSAD1tp-CcFATB1- UcFATB2-嵌合体B-CvNR::6SB

pSZ2448-6SA::CrTUB2-ScSUC2-CvNR:PmAMT3-CpSAD1tpExt- CcFATB1-UcFATB2-嵌合体B-ExtA-CvNR::6SB

这些构建体两者都具有与pSZ2084相同的载体骨架、选择性标记、启动子、C-末端FLAG表位以及3’UTR，不同之处仅在于各自的Cc-Uc FATB2嵌合硫酯酶以及质体转运肽。这些构建体中的相关限制性位点也与pSZ2084中的相同。图28-29指示适当的Cc-Uc FATB2硫酯酶序列(粗体大写字母文本)，其中该修整或延伸的原壳小球藻SAD1转运肽是用加下划线的大写字母指示的并且D1429内的Uc FATB2延伸是用加下划线的小写字母斜体标注的。

实例4

细叶萼距花FATB硫酯酶的修饰活性以及特异性

在本实例中，我们证明通过诱变特定的氨基酸以修饰细叶萼距花FATB 硫酯酶(ChFATB2，登录号U39834)的活性和特异性的能力。某些变体 FATB在N-末端特异性结构域中是经修饰的，以上我们将其描述为影响酶的脂肪酸特异性(图41)。这些突变中的某些在生产富含C8或C10脂肪酸 (例如，具有含至少10％C8、10％C10或10％C8/C10的脂肪酸谱)的天然油中是有用的。例如，与野生型FATB相比，使用这些变体可以至少加倍在由一种细胞群体产生的天然油中的C8、C10百分比或C8/C10比率。

基于通过诱变N-末端特异性结构域产生一种新颖的C12:0-C14:0硫酯酶的能力，遵循一种类似的方法来改变C8:0-C10 Ch FATB2硫酯酶的活性。经由如在前述实例中所描述的同源重组，将变体FATB基因克隆进桑椹型无绿藻中。图42A展示了六种独特的FATB硫酯酶相对于Ch FATB2的序列比对。产生六种嵌合体FATB，其中将Ch FATB2的高亮的N-末端特异性结构域进行突变以匹配来自六种可替代的FATB序列中的每一种的相同区域。这产生具有仅有两个至多达13个氨基酸取代的Ch FATB2嵌合体(图42B)。通过在桑椹型无绿藻中表达来测试每种Ch FATB2嵌合体的活性。将每种嵌合体的脂肪酸谱与野生型FATB硫酯酶的表达相比较(图43-48)。

有趣的是，表达D3126-D3129、或D3131的桑椹型无绿藻株系与非转化的株系相比具有很少或没有C8:0-C10:0脂肪酸积累。然而，表达D3130的桑椹型无绿藻株系展现C18:0-C10:0脂肪酸的显著积累。事实上，对于D3130 嵌合体的C8:0-C10:0积累程度大于在表达野生型D3042 Ch FATB2的株系中所观察到的(分别为19.6％对9.7％C8:0-C10:0总和)。此外，D3130株系之内的C8:0-C10:0的比率高于在野生型D3042 Ch FATB2株系中所观察到的(分别为0.49对0.26 C8:0/C10:0)。这些结果表明D3130 Ch FATB2嵌合体相对于野生型D3042Ch FATB2展现改进的酶活性以及一种改变的特异性。

D3130嵌合体相对于野生型D3042 Ch FATB2包含两个氨基酸取代。两个氨基酸取代都位于该模型结构内的螺旋上。在相同螺旋内发现His163-Tyr 取代，该螺旋包含存在于D1777 Uc FATB2嵌合体F中的四个氨基酸取代中的三个。Leu186-Pro取代显现是在公开的Met230-Iso取代的对面，改进了湿地萼距花FATB1的酶活性。因此，可能的是His163-Tyr取代造成改变的 C8:0-C10比率，而Leu186-Pro取代改进了总C8:0-C10:0脂肪酸的积累。这些变异可以协同使用。例如，具有H163Y和L186P两者变异的株系将C8从1.8％增加至6.5％，将C10从7.44％增加至13.11％，并且将C8/C10比率从0.23增加至0.51。

应当理解的是，在此描述的实例和实施例仅是出于说明性目的，并且根据它们进行的不同修改或变更将启发本领域技术人员并且将被包含在本申请的精神与权限范围内和所附权利要求书的范围之内。在此引用的所有公开物、专利和专利申请都出于所有目的以其全部内容而特此结合。

非正式序列表

序列ID号：1-构建体D1022[pSZ2037]，还写作6SA::Cr(btub)-syn(yINV)- Cv(nr):Pm(amt03)-Cp(SAD1tp)-Cc(TE2)-Uc(TE2)-嵌合体A-Cv(nr)::6sB。

序列ID号：2-在构建体D1022[pSZ2037]中的原壳小球藻SAD1转运肽、后接樟树和加州月桂嵌合硫酯酶的核酸序列。

序列ID号：3-由构建体D1022[pSZ2037]编码的原壳小球藻SAD1转运肽、后接樟树和加州月桂嵌合硫酯酶的氨基酸序列。

序列ID号：4-在构建体D1022[pSZ2037]中的樟树和加州月桂嵌合硫酯酶的核酸序列。

序列ID号：5-由构建体D1022[pSZ2037]编码的樟树和加州月桂嵌合硫酯酶的氨基酸序列。

序列ID号：6-在构建体D1023[pSZ2038]中的樟树和加州月桂嵌合硫酯酶的核酸序列

序列ID号：7-由构建体D1023[pSZ2038]编码的樟树和加州月桂嵌合硫酯酶的氨基酸序列。

序列ID号：8-在构建体D1210[pSZ2231]中的樟树和加州月桂嵌合硫酯酶B 的核酸序列

序列ID号：9-由构建体D1210[pSZ2231]编码的樟树和加州月桂嵌合硫酯酶 B的氨基酸序列

序列ID号：10-在构建体D1211[pSZ2232]中的樟树和加州月桂嵌合硫酯酶C 的核酸序列

序列ID号：11-由构建体D1211[pSZ2232]编码的樟树和加州月桂嵌合硫酯酶 C的氨基酸序列

序列ID号：12-在构建体D1212[pSZ2233]中的樟树和加州月桂嵌合硫酯酶D 的核酸序列

序列ID号：13-由构建体D1212[pSZ2233]编码的樟树和加州月桂嵌合硫酯酶 D的氨基酸序列

序列ID号：14-在构建体D1213[pSZ2234]中的樟树和加州月桂嵌合硫酯酶E 的核酸序列

序列ID号：15-由构建体D1213[pSZ2234]编码的樟树和加州月桂嵌合硫酯酶 E的氨基酸序列

序列ID号：16-构建体pSZ2084，还写作6SA::CrTUB2-ScSUC2- CvNR:PmAMT3-CpSAD1tpExt-UcFATB2-CvNR::6SB，包括一种来自原壳小球藻的延伸的异源转运肽，该异源转运肽从SAD1转运肽和侧翼区延伸为包括15个另外的氨基酸

序列ID号：17-在构建体D1056[pSZ2084]中的延伸的原壳小球藻SAD1转运肽与加州月桂FATB2衍生的序列融合的核酸序列。

序列ID号：18-由构建体D1056[pSZ2084]编码的延伸的原壳小球藻SAD1转运肽与加州月桂FATB2衍生的序列融合的氨基酸序列。

序列ID号：19-在构建体D1057[pSZ2085]中编码具有5个氨基酸N-末端延伸的UcFATB2的核酸序列

序列ID号：20-由构建体D1057[pSZ2085]编码的具有5个氨基酸N-末端延伸的UcFATB2的氨基酸序列

序列ID号：21-在构建体D1058[pSZ2086]中编码具有15个氨基酸N-末端延伸的UcFATB2的核酸序列

序列ID号：22-由构建体D1058[pSZ2086]编码的具有15个氨基酸N-末端延伸的UcFATB2的氨基酸序列

序列ID号：23-在构建体D1431[pSZ2450]中的樟树14:0-ACP硫酯酶(Cc FATB 1/CcTE，登录号U31813)的核酸序列，该硫酯酶包含衍生自Uc FATB2的五个氨基酸N-末端延伸

序列ID号：24-由构建体D1431[pSZ2450]编码的樟树14:0-ACP硫酯酶(Cc FATB 1/Cc TE，登录号U31813)的氨基酸序列，该硫酯酶包含衍生自Uc FATB2的五个氨基酸N-末端延伸

序列ID号：25-在构建体D1432[pSZ2451]中的樟树14:0-ACP硫酯酶(Cc FATB 1/CcTE，登录号U31813)的核酸序列，该硫酯酶包含衍生自Cc FATB1的五个氨基酸N-末端延伸

序列ID号：26-由构建体D1432[pSZ2451]编码的樟树14:0-ACP硫酯酶(Cc FATB 1/Cc TE，登录号U31813)的氨基酸序列，该硫酯酶包含衍生自Cc FATB1的五个氨基酸N-末端延伸

序列ID号：27-在构建体D1481[pSZ2479]中编码湿地萼距花14:0-ACP硫酯酶(Cpal FATB2，登录号AAC49180)的核酸序列，该硫酯酶包含延伸的来自原壳小球藻的异源转运肽以及衍生自天然Cpal FATB2序列的41个氨基酸 N-末端延伸

序列ID号：28-由构建体D1481[pSZ2479]编码的湿地萼距花14:0-ACP硫酯酶(Cpal FATB2，登录号AAC49180)的氨基酸序列，该硫酯酶包含延伸的来自原壳小球藻的异源转运肽以及衍生自天然Cpal FATB2序列的41个氨基酸N-末端延伸

序列ID号：29-在构建体D1481[pSZ2479]中编码湿地萼距花14:0-ACP硫酯酶(Cpal FATB2，登录号AAC49180)的核酸序列，该硫酯酶包含延伸的来自原壳小球藻的异源转运肽、衍生自天然Cpal FATB2序列的41个氨基酸N- 末端延伸、以及C-末端FLAG表位标签

序列ID号：30-由构建体D1482[pSZ2480]编码的湿地萼距花14:0-ACP硫酯酶(Cpal FATB2，登录号AAC49180)的氨基酸序列，该硫酯酶包含延伸的来自原壳小球藻的异源转运肽、衍生自天然Cpal FATB2序列的41个氨基酸 N-末端延伸、以及C-末端FLAG表位标签

序列ID号：31-在构建体D1479[pSZ2477]中编码美洲榆10:0-16:0-ACP硫酯酶(UaFATB1，登录号O24420)的核酸序列，该硫酯酶包含延伸的来自原壳小球藻的异源转运肽以及衍生自天然Ua FATB1序列的34个氨基酸N-末端延伸

序列ID号：32-由构建体D1479[pSZ2477]编码的美洲榆10:0-16:0-ACP硫酯酶(UaFATB1，登录号O24420)的氨基酸序列，该硫酯酶包含延伸的来自原壳小球藻的异源转运肽以及衍生自天然Ua FATB1序列的34个氨基酸N- 末端延伸

序列ID号：33-在构建体D1480[pSZ2478]中编码美洲榆10:0-16:0-ACP硫酯酶(UaFATB1，登录号O24420)的核酸序列，该硫酯酶包含延伸的来自原壳小球藻的异源转运肽、衍生自天然Ua FATB1序列的34个氨基酸N-末端延伸、以及C-末端FLAG表位标签

序列ID号：34-由构建体D1480[pSZ2478]编码的美洲榆10:0-16:0-ACP硫酯酶(UaFATB1，登录号O24420)的氨基酸序列，该硫酯酶包含延伸的来自原壳小球藻的异源转运肽、衍生自天然Ua FATB1序列的34个氨基酸N-末端延伸、以及C-末端FLAG表位标签

序列ID号：35-在构建体D1429[pSZ2448]中编码Cc-Uc FATB嵌合体B 12:0-14:0-ACP硫酯酶的核酸序列，该硫酯酶包含延伸的来自原壳小球藻的异源转运肽以及衍生自天然Uc FATB2序列的五个氨基酸N-末端延伸

序列ID号：36-由构建体D1429[pSZ2448]中编码的Cc-Uc FATB嵌合体B 12:0-14:0-ACP硫酯酶的氨基酸序列，该硫酯酶包含延伸的来自原壳小球藻的异源转运肽以及衍生自天然Uc FATB2序列的五个氨基酸N-末端延伸

序列ID号：37-5个氨基酸Uc/Cc FATB N-末端延伸

SLK(R/K)

序列ID号：38-15个氨基酸Uc/Cc FATB N-末端延伸

INGTKFSYTESLK(R/K)

序列ID号：39-衍生自该天然Cpal FATB2序列的N-末端延伸

AHPKANGSAVSLKSGSLETQEDKTSSSSPPPRTFINQ

序列ID号：40-衍生自该天然Ua FATB1序列的N-末端延伸

PPKLNGSNVGLVKSSQIVKKGDDTTSPPARTFINQ

序列ID号：41-衍生自该天然Cw FATB1序列的N-末端延伸

AHPKANGSAVNLKSGSLETPPRSFINQ

序列ID号：42-衍生自该天然Cw FATB2序列(GenBank登录号Q39663) 的N-末端延伸

PHPKANGSAVSLKSGSLNTLEDPPSSPPPRTFLNQ

序列ID号：43-野生型加利福尼亚桂树酰基-ACP硫酯酶(GenBank登录号M94159.1)

序列ID号：44-野生型樟树酰基-ACP硫酯酶(GenBank登录号U31813.1)

序列ID号：45-野生型湿地萼距花(Cpal)酰基-ACP硫酯酶(GenBank登录号AAC49180)

序列ID号：46-野生型赖特氏萼距花(Cw)酰基-ACP硫酯酶FATB1 (GenBank登录号U56103)

序列ID号：47-野生型美洲榆酰基-ACP硫酯酶(GenBank登录号O24420)

序列ID号：48-pSZ2609(D1558)Chook-CwFATB嵌合体A的核酸序列

序列ID号：49-由pSZ2609(D1558)Chook-CwFATB嵌合体A编码的氨基酸序列

序列ID号：50-pSZ2610(D1559)Chook-CwFATB嵌合体B的核酸序列

序列ID号：51-由pSZ2610(D1559)Chook-CwFATB嵌合体B编码的氨基酸序列

序列ID号：52-pSZ2611(D1560)Chook-CwFATB嵌合体C的核酸序列

序列ID号：53-由pSZ2611(D1560)Chook-CwFATB嵌合体C编码的氨基酸序列

序列ID号：54-pSZ2612(D1561)Chook-CwFATB嵌合体D的核酸序列

序列ID号：55-由pSZ2612(D1561)Chook-CwFATB嵌合体D编码的氨基酸序列

序列ID号：56-pSZ2613(D1562)ChookFATB的核酸序列

序列ID号：57-编码pSZ2613(D1562)ChookFATB的氨基酸序列

序列ID号：58-pSZ1954(D965)CwFATB的核酸序列

序列ID号：59-由pSZ1954(D965)CwFATB编码的氨基酸序列

序列ID号：60-野生型赖特氏萼距花(Cw)酰基-ACP硫酯酶FATB2 (GenBank登录号U56104.1(RNA)；Q39663(蛋白质))

序列ID号：61-野生型细叶萼距花(Chook)酰基-ACP硫酯酶(GenBank登录号U39834.1(RNA)；Q39514(蛋白质))

SEQ ID NO:62-克鲁格尼无绿藻23S rRNA

SEQ ID NO:63-魏氏无绿藻23S rRNA

SEQ ID NO:64-雍滞无绿藻23S rRNA

SEQ ID NO:65-桑椹型无绿藻23S rRNA

SEQ ID NO:66-桑椹型无绿藻23S rRNA

SEQ ID NO:67-魏氏无绿藻23S rRNA

SEQ ID NO:68-桑椹型无绿藻23S rRNA

SEQ ID NO:69-祖菲无绿藻23S rRNA

SEQ ID NO:70-桑椹型无绿藻rRNA

SEQ ID NO:71-针对D3042的核酸序列(pSZ4243)(野生型)；藻类转运肽用小写字母表示，FLAG表位标签加下划线

SEQ ID NO:72-针对D3042的氨基酸序列；pSZ4243(野生型)；藻类转运肽用小写字母表示，FLAG表位标签加下划线

SEQ ID NO:73-针对D3126(pSZ4331)的核酸序列；藻类转运肽用小写字母表示，FLAG表位标签加下划线，并且相对于野生型ChFATB2(D3042， pSZ4243)进行突变的N-末端特异性结构域的部分用粗体文本高亮

SEQ ID NO:74-针对D3126(pSZ4331)的氨基酸序列；藻类转运肽用小写字母表示，FLAG表位标签加下划线，并且相对于野生型ChFATB2(D3042， pSZ4243)进行突变的N-末端特异性结构域的部分用粗体文本高亮

SEQ ID NO:75-针对D3127(pSZ4332)的核酸序列；藻类转运肽用小写字母表示，FLAG表位标签加下划线，并且相对于野生型ChFATB2(D3042， pSZ4243)的进行突变的N-末端特异性结构域的部分用粗体文本高亮

SEQ ID NO:76-针对D3127(pSZ4332)的氨基酸序列；藻类转运肽用小写字母表示，FLAG表位标签加下划线，并且相对于野生型ChFATB2(D3042， pSZ4243)进行突变的N-末端特异性结构域的部分用粗体文本高亮

SEQ ID NO:77-针对D3128(pSZ4333)的核酸序列；藻类转运肽用小写字母表示，FLAG表位标签加下划线，并且相对于野生型ChFATB2(D3042， pSZ4243)进行突变的N-末端特异性结构域的部分用粗体文本高亮

SEQ ID NO:78-针对D3128(pSZ4333)的氨基酸序列；藻类转运肽用小写字母表示，FLAG表位标签加下划线，并且相对于野生型ChFATB2(D3042， pSZ4243)进行突变的N-末端特异性结构域的部分用粗体文本高亮

SEQ ID NO:79-针对D3129(pSZ4334)的核酸序列；藻类转运肽用小写字母表示，FLAG表位标签加下划线，并且相对于野生型ChFATB2(D3042， pSZ4243)进行突变的N-末端特异性结构域的部分用粗体文本高亮

SEQ ID NO:80-针对D3129(pSZ4334)的氨基酸序列；藻类转运肽用小写字母表示，FLAG表位标签加下划线，并且相对于野生型ChFATB2(D3042， pSZ4243)进行突变的N-末端特异性结构域的部分用粗体文本高亮

SEQ ID NO:81-针对D3130(pSZ4335)的核酸序列；藻类转运肽用小写字母表示，FLAG表位标签加下划线，并且相对于野生型ChFATB2(D3042， pSZ4243)进行突变的N-末端特异性结构域的部分用粗体文本高亮

SEQ ID NO:82-针对D3130(pSZ4335)的核酸序列；藻类转运肽用小写字母表示，FLAG表位标签加下划线，并且相对于野生型ChFATB2(D3042， pSZ4243)进行突变的N-末端特异性结构域的部分用粗体文本高亮

SEQ ID NO:83-针对D3131(pSZ4336)的氨基酸序列；藻类转运肽用小写字母表示，FLAG表位标签加下划线，并且相对于野生型ChFATB2(D3042， pSZ4243)进行突变的N-末端特异性结构域的部分用粗体文本高亮

SEQ ID NO:84-针对D3131(pSZ4336)的氨基酸序列；藻类转运肽用小写字母表示，FLAG表位标签加下划线，并且相对于野生型ChFATB2(D3042， pSZ4243)进行突变的N-末端特异性结构域的部分用粗体文本高亮

Claims

1.一种编码变体酰基-ACP硫酯酶的核酸分子，该核酸分子包括C-末端催化结构域和N-末端疏水结构域以及特异性结构域，其中该疏水结构域和/或该特异性结构域中的一个或多个与该催化结构域是异源的。

2.如权利要求1所述的核酸，其中该核酸编码一种变体酰基-酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶(TE)，该变体酰基-酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶(TE)包括：

i)来自一种C10:0酰基-ACP偏好型TE的特异性结构域和来自一种C12:0酰基-ACP偏好型TE的催化结构域；

ii)来自一种C12:0酰基-ACP偏好型TE的特异性结构域和来自一种C14:0酰基-ACP偏好型TE的催化结构域；

iii)来自一种C14:0酰基-ACP偏好型TE的特异性结构域和来自一种C12:0酰基-ACP偏好型TE的催化结构域；

iv)来自一种C12:0酰基-ACP偏好型TE的特异性结构域和来自一种C10:0酰基-ACP偏好型TE的催化结构域；或

v)来自一种C10:0酰基-ACP偏好型TE的特异性结构域和来自一种C8:0酰基-ACP偏好型TE的催化结构域。

3.如权利要求1至2中任一项所述的核酸，其中该核酸编码一种特异性结构域，该特异性结构域包括：

a)一种酰基-ACP-TE的对应于选自下组的氨基酸序列的氨基酸残基，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:43的氨基酸残基125-163；SEQ ID NO:44的氨基酸残基125-163；SEQ IDNO:45的氨基酸残基152-190；SEQ ID NO:46的氨基酸残基139-177；SEQ ID NO:47的氨基酸残基117-155；SEQ ID NO:60的氨基酸残基158-196；以及SEQ ID NO:61的氨基酸残基156-194；

b)一种基序，该基序包括氨基酸序列SI(V/L/E)(A/T)(V/L)MN(H/Y/M/I)(L/M/V/F)QE(T/A)(A/S/T)(L/I)N(H/Q)(A/V/C)(K/E/R)(S/I/T/N/C)(V/L/A/T/I/N)G(L/I)(L/S/M)(G/L/D/N/E)(D/N/E)G(F/L)G(T/E/R/S/A)(T/S)(L/P/R)(E/G)M(S/Y/F/C/T)(K/R/L)(R/K/N/M)(D/G/N)L(M/I/F)和/或

c)与选自下组的氨基酸序列至少60％的序列一致性，该组由以下各项组成：SEQ IDNO:43的氨基酸残基125-163；SEQ ID NO:44的氨基酸残基125-163；SEQ ID NO:45的氨基酸残基152-190；SEQ ID NO:46的氨基酸残基139-177；SEQ ID NO:47的氨基酸残基117-155；SEQ ID NO:60的氨基酸残基158-196；以及SEQ ID NO:61的氨基酸残基156-194。

4.如权利要求1至3中任一项所述的核酸，其中该核酸编码一种特异性结构域，该特异性结构域促进具有改变的脂肪酸谱的甘油三酯的生产并且包括：

a)一种基序，该基序包括氨基酸序列SI(V/L/E)(A/T)(V/L)MN(H/Y/M/I)(L/M/V/F)QE(T/A)(A/S/T)(L/I)N(H/Q)(A/V/C)(K/E/R)(S/I/T/N/C)TGI(L/S/M)L(D/N/E)G(F/L)G(T/E/R/S/A)(T/S)L(E/G)M(S/Y/F/C/T)K(R/K/N/M)(D/G/N)L(M/I/F)WV(V/L)I(K/R)(M/T)(Q/H)(I/V)K；和/或

b)与SEQ ID NO:61的氨基酸残基156-203至少60％的序列一致性，其中在位置166处的氨基酸残基是谷氨酰胺；在位置175处的氨基酸残基是苏氨酸；在位置177处的氨基酸残基是异亮氨酸；在位置179处的氨基酸残基是亮氨酸；在位置186处的氨基酸残基是亮氨酸；在位置190处的氨基酸残基是赖氨酸；在位置198处的氨基酸是异亮氨酸并且在位置203处的氨基酸是赖氨酸；和/或

c)SEQ ID NO:61。

5.如权利要求1至3中任一项所述的核酸，其中该核酸编码一种特异性结构域，该特异性结构域促进C12:0脂肪酸的生产并且包括：

a)一种基序，该基序包括氨基酸序列SIL(A/T)(V/L)MN(H/Y/M/I)MQE(T/A)T(L/I)N(H/Q)(A/V/C)(K/E/R)(S/I/T/N/C)(V/L/A/T/I/N)G(L/I)(L/S/M)(G/L/D/N/E)(D/N/E)G(F/L)G(T/E/R/S/A)(T/S)(L/P/R)(E/G)M(S/Y/F/C/T)(K/R/L)(R/K/N/M)(D/G/N)LM；

b)与选自下组的氨基酸序列至少60％的序列一致性，该组由以下各项组成：SEQ IDNO:43的氨基酸残基125-163；SEQ ID NO:44的氨基酸残基125-163；其中在位置127处的氨基酸残基是亮氨酸，在位置133处的氨基酸残基是甲硫氨酸，在位置137处的氨基酸残基是苏氨酸并且在位置163处的氨基酸残基是甲硫氨酸；和/或

c)SEQ ID NO:43。

6.如权利要求1至3中任一项所述的核酸，其中该核酸编码一种特异性结构域，该特异性结构域促进C14:0脂肪酸的生产并且包括：

a)一种基序，该基序包括氨基酸序列SIV(A/T)(V/L)MN(H/Y/M/I)LQE(T/A)A(L/I)N(H/Q)(A/V/C)(K/E/R)(S/I/T/N/C)(V/L/A/T/I/N)G(L/I)(L/S/M)(G/L/D/N/E)(D/N/E)G(F/L)G(T/E/R/S/A)(T/S)(L/P/R)(E/G)M(S/Y/F/C/T)(K/R/L)(R/K/N/M)(D/G/N)LI；

b)与选自下组的氨基酸序列至少60％的序列一致性，该组由以下各项组成：SEQ IDNO:43的氨基酸残基125-163；SEQ ID NO:44的氨基酸残基125-163；其中在位置127处的氨基酸残基是缬氨酸，在位置133处的氨基酸残基是亮氨酸，在位置137处的氨基酸残基是丙氨酸并且在位置163处的氨基酸残基是异亮氨酸；和/或

c)SEQ ID NO:44。

7.如权利要求1至3中任一项所述的核酸，其中该核酸编码一种特异性结构域，该特异性结构域促进、增加和/或优选C8:0-C:10脂肪酸的生产并且包括：

a)一种基序，该基序包括氨基酸序列SI(E/M)(T/A)(L/V)MN(H/Y)(L/V)Q(E/D)(T/A)(S/A)(L/I/R)N(H/Q)(C/A)(K/E)S(T/V/L/I/A)G(I/L)L(L/N/D/H/G)DGFG(R/E)(T/S)(L/P)(E/G)M(C/S)(K/T)(R/N)DL；

b)与选自下组的氨基酸序列至少60％的序列一致性，例如至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列一致性，该组由氨基酸残基156-193SEQ ID NO:61组成；其中在位置163处的氨基酸残基是酪氨酸，和/或在位置186处的氨基酸残基是脯氨酸；

c)与选自下组的氨基酸序列至少60％的序列一致性，该组由氨基酸残基156-193SEQID NO:61组成；其中在位置163处的氨基酸残基是酪氨酸，并且在位置186处的氨基酸残基是脯氨酸；和/或

d)SEQ ID NO:84。

8.如权利要求5至7中任一项所述的核酸，其中该核酸编码一种特异性结构域，该特异性结构域与选自下组的氨基酸序列包括至少60％的序列一致性，该组由以下各项组成：SEQID NO:43的氨基酸残基91-163和SEQ ID NO:44的氨基酸残基91-163，并且其中在位置91处的氨基酸残基是天冬酰胺，在位置92处的氨基酸是脯氨酸并且氨基酸位置102是脯氨酸。

9.如权利要求6至8中任一项所述的核酸，其中该核酸编码一种特异性结构域，该特异性结构域与一种选自下组的氨基酸序列包括至少60％的序列一致性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:43的氨基酸残基91-163和SEQ ID NO:44的氨基酸残基91-163，并且其中在位置91处的氨基酸残基是天冬酰胺，在位置92处的氨基酸是脯氨酸，氨基酸位置102是脯氨酸，在位置127处的氨基酸残基是缬氨酸，在位置133处的氨基酸残基是亮氨酸，在位置137处的氨基酸残基是丙氨酸并且在位置163处的氨基酸残基是异亮氨酸。

10.如权利要求5或8中任一项所述的核酸，其中该核酸编码一种特异性结构域，该特异性结构域与一种选自下组的氨基酸序列包括至少60％的序列一致性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:43的氨基酸残基91-163和SEQ ID NO:44的氨基酸残基91-163，并且其中在位置91处的氨基酸残基是天冬酰胺，在位置92处的氨基酸是脯氨酸，氨基酸位置102是脯氨酸，在位置127处的氨基酸残基是亮氨酸，在位置133处的氨基酸残基是甲硫氨酸，在位置137处的氨基酸残基是苏氨酸并且在位置163处的氨基酸残基是甲硫氨酸。

11.如权利要求1至10中任一项所述的核酸，其中该核酸编码一种疏水结构域，该疏水结构域包括：

a)一种酰基-ACP-TE的对应于选自下组的氨基酸序列的氨基酸残基，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:43的氨基酸残基61-77；SEQ ID NO:44的氨基酸残基61-77；SEQ ID NO:45的氨基酸残基85-101；SEQ ID NO:46的氨基酸残基78-95；SEQ ID NO:47的氨基酸残基50-66；SEQ ID NO:60的氨基酸残基91-107；以及SEQ ID NO:61的氨基酸残基90-106；

b)一种基序，该基序包括氨基酸序列(P/H)(G/D/V)(W/L)(S/N)(M/R/V)(P/L/S)(L/F)(E/A/T/S)(L/A/K)(I/V)TT(I/V)F(S/L/V/G)(A/K/V)(A/P)；

c)与选自下组的氨基酸序列至少60％的序列一致性，该组由以下各项组成：SEQ IDNO:43的氨基酸残基61-77；SEQ ID NO:44的氨基酸残基61-77；SEQ ID NO:45的氨基酸残基85-101；SEQ ID NO:46的氨基酸残基78-95；SEQ ID NO:47的氨基酸残基50-66；SEQ ID NO:60的氨基酸残基91-107；以及SEQ ID NO:61的氨基酸残基90-106；和/或

d)SEQ ID NO:43的氨基酸残基61-77；SEQ ID NO:44的氨基酸残基61-77；SEQ ID NO:45的氨基酸残基85-101；SEQ ID NO:46的氨基酸残基78-95；SEQ ID NO:47的氨基酸残基50-66；SEQ ID NO:60的氨基酸残基91-107；或SEQ ID NO:61的氨基酸残基90-106。

12.如权利要求11所述的核酸，其中该核酸编码一种包括N-末端亮氨酸残基的疏水结构域。

13.如权利要求1至12中任一项所述的核酸，其中该核酸进一步编码一个编码质体转运肽的N-末端序列。

14.如权利要求13所述的核酸，其中该质体转运肽包括一种来自原壳小球藻硬脂酰ACP去饱和酶(SAD)蛋白的转运肽子序列。

15.如权利要求13至14中任一项所述的核酸，其中该质体转运肽包括一种选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：MATASTFSAFNARCGDLRRSAGSGPRRPARPLPVRGRA，SGPRRPARPLPVR，SGPRRPARPLPVRAAIASEVPVATTSPR，RPARPLPVRGRA，RPARPLPVRAAIASEVPVATTSPR，RCGDLRRSAGSGPRRPARPLPVRGRA，RCGDLRRSAGSGPRRPARPLPVRAAIASEVPVATTSPR，PARPLPVR，PARPLPVRAAIASEVPVATTSPR，RRPARPLPVR，以及RRPARPLPVRAAIASEVPVATTSPR。

16.如权利要求1至15中任一项所述的核酸，其中该核酸进一步编码一种定位至该疏水结构域的N-末端的接头结构域。

17.如权利要求16所述的核酸，其中该核酸编码一种接头结构域，该接头结构域包括：

a)从对应于选自下组的残基的酰基-ACP-TE子序列的C-末端延伸的至少5个氨基酸残基，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:43的氨基酸残基43-59；SEQ ID NO:44的氨基酸残基43-59；SEQ ID NO:45的氨基酸残基49-83；SEQ ID NO:46的氨基酸残基53-77；SEQ ID NO:47的氨基酸残基15-48；SEQ ID NO:60的氨基酸残基57-89；以及SEQ ID NO:61的氨基酸残基56-88；

b)从与选自下组的氨基酸序列包括至少60％的序列一致性的酰基-ACP-TE子序列的C-末端延伸的至少5个氨基酸残基，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:43的氨基酸残基43-59；SEQ ID NO:44的氨基酸残基43-59；SEQ ID NO:45的氨基酸残基49-83；SEQ ID NO:46的氨基酸残基53-77；SEQ ID NO:47的氨基酸残基15-48；SEQ ID NO:60的氨基酸残基57-89；以及SEQ ID NO:61的氨基酸残基56-88；

c)从选自下组的酰基-ACP-TE子序列的C-末端延伸的至少5个氨基酸残基，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:43的氨基酸残基43-59；SEQ ID NO:44的氨基酸残基43-59；SEQ IDNO:45的氨基酸残基49-83；SEQ ID NO:46的氨基酸残基53-77；SEQ ID NO:47的氨基酸残基15-48；SEQ ID NO:60的氨基酸残基57-89；以及SEQ ID NO:61的氨基酸残基56-88；和/或

d)一个选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41以及SEQ ID NO:42。

18.如权利要求1至13中任一项所述的核酸，其中该变体酰基-ACP-TE包含一个选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32；SEQ IDNO:34；SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51；SEQ ID NO:53；SEQ ID NO:55；SEQ IDNO:57以及SEQ ID NO:59。

19.如权利要求1至18中任一项所述的核酸，该核酸包括针对在藻类宿主细胞中改进的表达的密码子偏倚。

20.一种表达盒，包括如权利要求1至19中任一项所述的核酸。

21.一种包括如权利要求1至19中任一项所述的核酸的载体，和/或如权利要求20所述的表达盒。

22.一种由如权利要求1至19中任一项所述的核酸编码的变体酰基-酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶(TE)。

23.一种宿主细胞，该宿主细胞包括如权利要求1至19中任一项所述的核酸、如权利要求20所述的表达盒、如权利要求21所述的载体、和/或如权利要求22所述的变体酰基-ACP-TE。

24.如权利要求23所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是一种产油细胞。

25.如权利要求23至24中任一项所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是选自植物细胞、藻类细胞和微藻细胞。

26.如权利要求23至25中任一项所述的宿主细胞，其中该藻类细胞属于无绿藻属、或是一种如下的细胞，该细胞具有与SEQ ID NO:62-70中的一个或多个具有至少70％的核酸序列一致性的23S rRNA序列。

27.如权利要求26所述的宿主细胞，其中该藻类细胞选自下组，该组由以下各项组成：桑椹型无绿藻、克鲁格尼无绿藻、雍滞无绿藻以及祖菲无绿藻。

28.如权利要求23至27中任一项所述的宿主细胞，其中该宿主细胞进一步包括一种编码活性溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)的外源溶血磷脂酸酰基转移酶基因，该活性溶血磷脂酸酰基转移酶催化中链脂酰基基团转移到经取代的酰基甘油酯的sn-2位置。

29.如权利要求23至28中任一项所述的宿主细胞，其中该宿主细胞与未转化的宿主细胞或用野生型酰基-ACP TE转化的宿主细胞相比产生一种具有至少1％增加水平的C8:0、C10:0、C12:0或C14:0脂肪酸的油。

30.如权利要求23至29中任一项所述的宿主细胞，其中该宿主细胞产生一种包括至少约5％、例如至少约6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、或更多的C8:0脂肪酸的油。

31.如权利要求23至30中任一项所述的宿主细胞，其中该宿主细胞产生一种包括至少约5％、例如至少约6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、或更多的C10:0脂肪酸的油。

32.如权利要求23至31中任一项所述的宿主细胞，其中该宿主细胞产生一种包括C8:0/C10:0比率的油，该C8:0/C10:0比率是至少约5％，例如至少约6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、或更多。

33.一种植物、藻类或微藻，该植物、藻类或微藻包括如权利要求1至19中任一项所述的核酸、如权利要求20所述的表达盒、如权利要求21所述的载体、和/或如权利要求22所述的变体酰基-ACP-TE。

34.如权利要求33所述的藻类，其中该藻类属于无绿藻属。

35.如权利要求33至34中任一项所述的藻类，其中该藻类选自下组，该组由以下各项组成：桑椹型无绿藻、克鲁格尼无绿藻、雍滞无绿藻以及祖菲无绿藻。

36.一种由如权利要求33至35中任一项所述的植物、藻类或微藻产生的油产品，或从该油产生的化学品、材料或食物产品。

37.一种生产产生具有所希望的脂肪酸谱的油的植物、藻类或微藻的方法，该方法包括用如权利要求1至19中任一项所述的核酸序列转化该植物、藻类或微藻，并且培养该植物、藻类或微藻以便产生该油。

38.如权利要求37所述的方法，其中该植物、藻类或微藻与未转化的植物、藻类或微藻或者用野生型酰基-ACP TE转化的植物、藻类或微藻相比产生至少1％增加水平的C8:0、C10:0、C12:0或C14:0脂肪酸。

39.如权利要求37至38中任一项所述的方法，其中该植物、藻类或微藻产生一种包括至少约5％、例如至少约6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、或更多的C8:0脂肪酸的油。

40.如权利要求37至39中任一项所述的方法，其中该植物、藻类或微藻产生一种包括至少约5％、例如至少约6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、或更多的C10:0脂肪酸的油。

41.如权利要求37至40中任一项所述的方法，其中该植物、藻类或微藻产生一种包括C8:0/C10:0比率的油，该C8:0/C10:0比率是至少约5％，例如至少约6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、或更多。

42.一种产生油的方法，该方法包括用如权利要求1至19中任一项所述的核酸分子转化该植物、藻类或微藻，表达该变体酰基-ACP TE以产生脂肪酸，并且回收由该植物、藻类或微藻产生的包括这些脂肪酸的油。

43.一种产生油的方法，该方法包括培养如权利要求33至35中任一项所述的植物、藻类或微藻，表达该变体酰基-ACP TE以产生脂肪酸，并且回收由该植物、藻类或微藻产生的包括这些脂肪酸的油。