CN109444239A - 一种基于抗原决定基法的分子印迹电化学传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子印迹技术领域和电化学领域，具体公开了一种基于抗原决定基法的分子印迹电化学传感器及其制备方法和应用。以乳腺癌标志物CA 15‑3的抗原决定基七肽PDTRPAP为模板分子，通过电聚合技术在玻碳电极上原位制备分子印迹聚合物膜，当把模板分子洗脱后，所得到的分子印迹电化学传感器不仅可以识别PDTRPAP，而且可以识别以PDTRPAP为抗原决定基的乳腺癌标志物癌抗原(CA15‑3)。

Description

一种基于抗原决定基法的分子印迹电化学传感器及其制备方 法和应用
技术领域
本发明涉及分子印迹技术领域和电化学领域，研制了一种基于抗原决定基法的分子印迹电化学传感器。以乳腺癌标志物CA 15-3的抗原决定基七肽脯氨酸-天冬氨酸-苏氨酸-精氨酸-脯氨酸-丙氨酸-脯氨酸（Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro，PDTRPAP）为模板分子，通过电聚合技术在玻碳电极上原位制备分子印迹聚合物膜，当把模板分子洗脱后，所得到的分子印迹电化学传感器不仅可以识别PDTRPAP，而且可以识别以PDTRPAP为抗原决定基的乳腺癌标志物癌抗原 (CA15-3)。
背景技术
乳腺癌是三大最常见肿瘤之一，目前临床应用最广泛的、与乳腺癌相关的肿瘤标志物是粘蛋白（mucin）MUC-1抗原。 MUC-1 抗原是一种粘蛋白类的糖蛋白，MUC-1 乳腺癌粘蛋白（cancer antigen 15- 3 , CA15-3 抗原）由瘤细胞分泌，可作为作乳腺癌的血清学标志物。
目前临床分析CA15-3 主要采用酶联免疫吸附分析法（ELISA）和放射免疫分析法（RIA）。ELISA 需要采用辣根过氧化物酶（HRP）标记CA15-3 抗体，技术要求较高，试剂昂贵，如专利号CN1773284，专利名称为：一种人血清乳腺癌特异抗原检测酶联免疫吸附试剂盒，该专利研制了人血清乳腺癌特异抗原检测酶联免疫吸附试剂盒，该试剂盒是通过ELISA试验，检测人血清中相应抗原BRCAA1与特异抗原表位SSKQKRSHK的微量诊断方法，用于检测人血清中的乳腺癌抗原，在实验中需要采用辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶标记CA15-3抗体。RIA 通常需要采用放射性元素，不仅废物难以处理，对化验员身体也非常有害。
此外还有应用电阻抗扫描成像检测仪对乳腺癌进行筛查的专利，如申请号为200420041746的专利，该发明名称为：一种用于乳腺癌早期普查的电阻抗扫描成像检测仪，仪器较为复杂。拉曼光谱检测方法也已经用于乳腺癌早期诊断，如申请号为200510036931的专利，其发明名称为：一种利用毛发实现乳腺癌早期诊断的拉曼光谱检测方法，该发明选取妇女自然白化的毛发，采用近红外激光对毛发进行照射，激发毛发的拉曼光谱，将获得的拉曼光谱与正常人毛发的拉曼光谱作比较，确定两者差异的特征谱线。该发明判断是否是乳癌的主要依据是拉曼光谱，该方法可以对乳癌进行早期诊断。从有关乳腺癌的专利检索中可以看出，尽管已经有多种研究手段对乳腺癌标志物进行识别与检测，但是分子印迹聚合物的优势在其中并未得到真正的发挥。
抗原决定簇法是种新的印迹方法，其原理是抗体识别抗原时，抗体只与抗原决定簇相作用, 因此具有相同决定簇的抗原可以被同一种抗体识别。该法是采用与蛋白质结构中暴露在表面的肽链(抗原决定簇) 相同的短肽作为印迹分子, 得到的大孔MIP 不仅可识别该肽, 也可以识别整个蛋白质分子。此法从经济的角度来看很有潜力，因为小肽分子通常都比较便宜, 并且可以选用比相应蛋白大分子多得多的功能单体。这一方法为高效合成对蛋白质具有高选择性的吸附剂和受体拓宽了思路。
在中国专利网以“抗原决定基”对专利名称进行检索，可以查到8项专利；在中国专利网以“抗原决定簇”对专利名称进行检索，可以查到41项专利；以“抗原决定基（或抗原决定簇）”和“分子印迹”为专利名称组合检索，未查到相关专利。
本发明提出了一种基于分子印迹抗原决定基法识别乳腺癌标志物的思路。以结构上与乳腺癌标志物CA15-3 的活性位点结构类似的七肽PDTRPAP 为印迹分子，其关键在于当把七肽洗脱后，所得到的分子印迹聚合物不仅可以识别PDTRPAP，而且可以识别以PDTRPAP 为抗原决定基的乳腺癌标志物CA15-3。
发明内容
从相关专利检索可以看出，分子印迹电化学传感器已经广泛的应用于小分子物质的检测，但仍未见有在玻碳电极上以抗原决定基作为模板分子合成分子印迹聚合物膜并应用于识别相应的大分子抗原的专利。
本发明的一个目的是提供一种基于抗原决定基法的分子印迹电化学传感器；
本发明的另一个目的是提供上述分子印迹电化学传感器的制备方法；
本发明的再一个目的是提供分子印迹电化学传感在检测乳腺癌标志物CA 15-3中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种基于抗原决定基法的分子印迹电化学传感器的制备方法：在玻碳电极表面修饰羧基化多壁碳纳米管后，采用乳腺癌标志物癌抗原CA15-3的抗原决定基七肽脯氨酸-天冬氨酸-苏氨酸-精氨酸-脯氨酸-丙氨酸-脯氨酸（Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro，PDTRPAP）为模板分子，邻氨基苯酚为功能单体，采用电化学聚合技术原位合成包含模板分子PDTRPAP的聚合物膜，当把模板分子洗脱后，由于抗原抗体的识别主要在于抗原决定基，得到的印迹空穴不仅可以识别PDTRPAP，而且可以识别以PDTRPAP 为抗原决定簇的乳腺癌标志物CA15-3。当印迹空穴物与CA15-3重新识别后，电极表面的绝缘程度变大，电化学探针K3[Fe(CN)6]在电极表面的穿透性变差，通过电化学探针K3[Fe(CN)6]在电极表面的电流变化实现CA 15-3的间接测定，该分子印迹电化学传感器识别原理见图1。
本发明提供了一种基于抗原决定基法的分子印迹电化学传感器的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）玻碳电极的预处理：将玻碳电极依次用1.0μm、0.3μm和0.05μm的抛光粉（Al2O3）抛光，然后依次用体积比1:1乙醇和蒸馏水超声清洗。将清洗后的电极用高纯氮气吹干，在1mmol/L K3[Fe(CN)6]（支持电解质：0.1 mol/L KCl，50mmol/L PBS）记录循环伏安曲线，直至得到可逆的氧化还原曲线（峰电位差小于90mV，氧化峰电流与还原峰电流之比约为1：1）；
（2）羧基化多壁碳纳米管修饰的玻碳电极 MGCE的制备：称取0.5 g 的多壁碳纳米管（MWCNTs），加入100mL 浓硝酸，在120℃条件下冷凝回流4h，待冷却至室温后，抽滤并用蒸馏水洗涤直至中性。将所得黑色固体放在真空干燥箱中干燥至恒重，得到羧基化的多壁碳纳米管，记为MWCNTs-COOH。酸处理后的碳纳米管表面不仅引入了羧基，而且还引入了大量的羟基，可以提高碳纳米管的分散性，增强其与模板分子之间的相互作用。将10 mg MWCNTs-COOH加入10 mL N，N-二甲基甲酰胺，然后超声形成均一的分散液。移取9 μL的分散液涂在玻碳电极上面，在室温下自然干燥，所得电极为MGCE（图2为MGCE的扫描电镜图）。
（3）分子印迹聚合物膜的制备：以MGCE电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极，以含5.0 mmol/L 邻氨基苯酚和0.1 mmol/L PDTRPAP的磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=7.0，50 mmol/L )为聚合液，首先往溶液中通入高纯氮气10min,设置扫描速度为50 mV/s，电位范围为-0.5~1.0 V 时，循环扫描，聚合20圈即得到嵌有PDTRPAP的聚氨基苯酚多壁碳纳米管玻碳电极。碳纳米管修饰电极和裸电极的聚合曲线见附图3。其中，图3中的A 为邻氨基苯酚在MGCE的电聚合曲线; 图3中的B为邻氨基苯酚在裸电极上的电聚合曲线。在图3中的A 可以看出，邻氨基苯酚在碳纳米管修饰电极上具有更高的初始峰电流，表明MWCNTs-COOH具有良好的导电性。随着扫描圈数增多，邻氨基苯酚的氧化电流下降；由于MWCNTs-COOH对邻氨基苯酚的氧化具有催化作用，其氧化电流下降速度较裸电极变缓。继续扫描，电极最终达到绝缘。
PDTRPAP可以与邻氨基苯酚产生氢键作用等，在聚合过程中，模板分子被吸纳进入聚合膜中，洗脱后便形成与模板分子相匹配的印迹空穴，因此具有良好的选择性。聚合物膜的厚度可以简单的通过聚合圈数进行调节，当聚合圈数达到20圈时，电流已经基本恒定。当聚合圈数太多，分子印迹聚合物膜太厚，模板分子嵌于聚合物膜中难以洗脱，因此选择聚合圈数为20。将此电极（嵌有PDTRPAP的聚氨基苯酚多壁碳纳米管玻碳电极）置于磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=7.0，50 mmol/L )中扫描6圈（扫描电位为0~2.0 V），除去聚合膜中的PDTRPAP，得到印迹碳电极(MIP-MGCE)。非印迹膜电极(NIP-MGCE)的制备除了不加模板分子外，其他步骤与MIP-MGCE的制备相同。
应用：基于抗原决定基法的分子印迹电化学传感器MIP-MGCE对CA 15-3的识别，将印迹电极在不同浓度的CA 15-3的磷酸盐缓冲溶液中(PBS，pH=6.2，50 mmol/L )孵化后，然后在1 mmol/L K3[Fe(CN)6]进行线性伏安扫描（LSV），附图4中的A为所得扫描图谱。由于孵化时印迹空穴的空间构型与大小与CA 15-3的抗原决定基相匹配，因此MIP-MGCE可以识别CA 15-3，随着CA 15-3浓度的增大，MIP-MGCE的绝缘程度变大，K3[Fe(CN)6]在电极上的穿透能力变差，其LSV图的峰电流减少。以K3[Fe(CN)6]在电极上的电流变化值为纵坐标，CA 15-3的浓度为横坐标作图，得到标准曲线,见附图4中的B。
测定CA15-3的线性曲线为△I (μA)= 0.1648 + 14.52 c (μmol/L), R =0.9948，线性范围为：2.0 × 10-9~8.0 × 10-7 mol/L检出限为4.0 × 10-10 mol/L。
该印迹电化学传感器能够选择性地识别CA 15-3，胰岛素(insulin)、牛血清白蛋白(BSA)和脯氨酸(Proline)均不干扰对CA 15-3的测定，该传感器具有较好的选择性。
与现有的分子印迹技术相比，本发明的抗原决定基法的分子印迹电化学传感器的优点是：1、 以抗原决定基而不是大分子抗原作为模板分子，模板分子易于洗脱；2. 印迹空穴与大分子物质CA 15-3的识别在于抗原决定基，而不是整个大分子，识别的空间位阻更小，从而可以实现对CA 15-3的高选择性和高亲和性快速识别。
附图说明
图1是本发明提供的基于抗原决定基法的分子印迹电化学传感器的识别原理图；
图2是MGCE的扫描电镜图；
图3 是采用电化学聚合法制备分子印迹聚合物膜的循环伏安图（5.0 mmol/L邻氨基苯酚、0.1 mmol/L PDTRPAP，PBS，pH=7.0，50 mmol/L，扫描电位：-0.5~1.0 V，扫描圈数：20 )。A：MGCE；B：GCE；
图4中A为当MIP-MGCE在不同浓度的CA 15-3溶液中孵化12分钟后，K3[Fe(CN)6]在MIP-MGCE上的LSV图（从下到上CA 15-3的浓度分别为：0、0.004、0.008、0.02、0.04、0.08、0.2、0.3、0.4和 0.8 μmol/L）；B为利用该印迹电化学传感器检测CA 15-3时，K3[Fe(CN)6]的LSV峰电流变化值与CA 15-3浓度的线性关系；
图5 是MIP-MGCE和NIP-MGCE对CA 15-3，胰岛素(insulin)、牛血清白蛋白(BSA)和脯氨酸(Proline)的响应。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例1 羧基化多壁碳纳米管修饰的玻碳电极 (MGCE)的制备
将玻碳电极依次用1.0μm、0.3μm和0.05μm的抛光粉（Al2O3）抛光，然后依次用体积比1:1乙醇和蒸馏水超声清洗。将清洗后的电极用高纯氮气吹干，在0.8mol/L H2SO4溶液中扫循环伏安法图，直至得到稳定的CV图为止。最后在1mmol/L K3[Fe(CN)6]（支持电解质：0.1mol/L KCl，50mmol/L PBS）记录循环伏安曲线，直至得到可逆的氧化还原曲线（峰电位差小于90mV，氧化峰电流与还原峰电流之比约为1：1）；称取0.5 g 的多壁碳纳米管MWCNTs，加入100mL 浓硝酸，在120℃条件下冷凝回流4h，待冷却至室温后，抽滤并用蒸馏水洗涤直至滤出液为中性。将所得黑色固体放在真空干燥箱中干燥至恒重，得到羧基化的多壁碳纳米管，记为MWCNTs-COOH。将10 mg MWCNTs-COOH加入10 mL N，N-二甲基甲酰胺，然后超声30分钟形成均一的分散液。移取9 μL的分散液涂在已打磨好的玻碳电极上面，在室温下自然干燥，所得电极为MGCE。
实施例2 基于抗原决定基法的分子印迹电化学传感器的制备
以MGCE电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极，所用仪器为CHI 620e电化学工作站（上海辰华仪器有限公司），以含5.0 mmol/L 邻氨基苯酚和0.1 mmol/LPDTRPAP的磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=7.0，50 mmol/L )为聚合液，首先在聚合液中通入高纯氮气10分钟除氧，选择扫描速度为50 mV/s，电位范围为-0.5~1.0 V 进行循环扫描，聚合20圈即得到嵌有PDTRPAP的聚氨基苯酚多壁碳纳米管玻碳电极。PDTRPAP中含有羟基和氨基，可以与邻氨基苯酚产生氢键作用等，在聚合过程中，作为模板分子的抗原决定基PDTRPAP被吸纳进入聚合膜中，洗脱后便形成很多与PDTRPAP相匹配的印迹空穴，因此具有良好的选择性。将此电极置于磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=7.0，50 mmol/L )中扫描6圈（扫描电位为0~2.0V），在扫描过程中PDTRPAP与聚氨基苯酚之间的氢键被破坏，PDTRPAP从聚合物膜中得以去除。每扫描一圈后，将电极取出，用蒸馏水润洗后在铁氰化钾溶液中扫CV图，当扫描6圈以后继续扫描，铁氰化钾在电极上的峰电流基本保持不变，说明PDTRPAP已被完全去除，得到分子印迹碳纳米管电极(MIP-MGCE)。非印迹膜电极(NIP-MGCE)的制备除了不加抗原决定基PDTRPAP外，其他步骤与MIP-MGCE的制备相同。
实施例3 基于抗原决定基法的分子印迹电化学传感器对CA 15-3的选择性测定
将MIP- MGCE在含有CA 15-3的溶液中孵化，随着孵化的进行，CA 15-3特异性的结合在印迹空穴中，阻碍了电化学探针K3[Fe(CN)6]在电极表面的扩散，从而使其峰电流变小。当孵化时间达到12分钟后，K3[Fe(CN)6]的峰电流基本保持不变，说明印迹膜对CA 15-3的吸附已经达到饱和。
在优化的实验条件下，将分子印迹传感器在含有不同浓度的CA 15-3溶液中孵化12分钟后，将传感器在K3[Fe(CN)6]溶液中进行线性伏安扫描，随着CA 15-3的浓度的增大，K3[Fe(CN)6]在印迹电极上的LSV峰电流减小；当CA 15-3的浓度达到4.0 × 10-7 mol/L后，继续增大CA 15-3的浓度，K3[Fe(CN)6]在印迹电极上的LSV峰电流基本不变，说明印迹膜对CA 15-3的吸附已经达到平衡。当CA 15-3的浓度在2.0 × 10-9 - 8.0 × 10-7 mol/L范围内时，K3[Fe(CN)6]在印迹电极上的LSV峰电流的变化值与CA 15-3的浓度成线性关系，线性方程为△I (μA)= 0.1648 + 14.52 c (μmol/L), R = 0.9948，检出限为4.0 × 10-10mol/L。
由于本工作采用的是小分子短肽作为模板分子，与采用CA 15-3作为模板分子进行印迹相比，该传感器中模板分子更容易洗脱，印迹空穴与CA 15-3的识别空间位阻更小，从而可以实现对CA 15-3的高选择性和高亲和性快速识别。
该印迹传感器能够选择性地识别CA 15-3，考察了MIP-MGCE分别在2.0 × 10-7mol/L CA 15-3溶液以及2.0 × 10-7 mol/L胰岛素(insulin)、牛血清白蛋白(BSA)和脯氨酸(Proline)孵化后，K3[Fe(CN)6]的LSV峰电流变化值，结果如附图5所示，表明上述物质不干扰对CA 15-3的测定，该传感器具有较好的选择性。
采用同一支印迹电极在含有2.0 × 10-7 mol/L CA 15-3的PBS溶液中孵化后，然后在K3[Fe(CN)6]溶液中进行线性伏安扫描，连续进行7次平行测定，所得电化学响应相对标准偏差为2.6%。将传感器在室温条件下避光保存一周，传感器的响应值为初次测定的94.8%，说明所制备的传感器具有良好的稳定性和重复性，这主要归因于聚邻氨基苯酚薄膜稳定的刚性结构。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属于本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 泉州师范学院
<120> 一种基于抗原决定基法的分子印迹电化学传感器及其制备方法和应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro
1 5

Claims (4)

1.一种基于抗原决定基法的分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，在玻碳电极表面修饰羧基化多壁碳纳米管后，以乳腺癌标志物癌抗原CA 15-3的抗原决定基七肽脯氨酸-天冬氨酸-苏氨酸-精氨酸-脯氨酸-丙氨酸-脯氨酸PDTRPAP为模板分子，通过电聚合技术在修饰后的玻碳电极上原位制备分子印迹聚合物膜，把模板分子洗脱后，得到分子印迹电化学传感器。
2.如权利要求1所述的基于抗原决定基法的分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
（1）将羧基化的多壁碳纳米管分散到N，N-二甲基甲酰胺中，然后超声形成1 mg/mL的均一的分散液，移取分散液滴涂在玻碳电极上面，在室温下自然干燥，得到羧基化多壁碳纳米管修饰电极MGCE；
（2）以MGCE电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极，以含5.0 mmol/L邻氨基苯酚和0.1 mmol/L PDTRPAP的磷酸盐缓冲溶液为聚合液，在聚合液中先通入高纯氮气10分钟，选择扫描速度为50 mV/s，电位范围为-0.5~1.0 V ，采用循环法扫描，聚合20圈即得到嵌有PDTRPAP的聚氨基苯酚多壁碳纳米管玻碳电极；
（3）将此电极置于磷酸盐缓冲溶液中扫描6圈，扫描电位为0~2.0 V，除去聚合物膜中的PDTRPAP，得到应用于CA15-3检测的分子印迹电化学传感器MIP-MGCE。
3.如权利要求2所述的基于抗原决定基法的分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤（2）和（3）中的磷酸盐缓冲溶液的pH=7.0，浓度为50 mmol /L。
4.如权利要求书1-3任一所述的方法制备得到的基于抗原决定基法的分子印迹电化学传感器在选择性检测CA15-3中的应用，其特征在于：测定CA15-3的线性曲线为△I= 0.1648+ 14.52 c, R = 0.9948，其中△I单位为μA，c单位为μmol/L，线性范围为：2.0 × 10-9~8.0× 10-7 mol/L，检出限为4.0 × 10-10 mol/L；该印迹电化学传感器能够选择性地识别CA15-3，胰岛素、牛血清白蛋白和脯氨酸均不干扰对CA 15-3的测定。
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