CN109439622B - 一种脂肪组织消化专用酶 - Google Patents

一种脂肪组织消化专用酶 Download PDF

Info

Publication number
CN109439622B
CN109439622B CN201811341165.XA CN201811341165A CN109439622B CN 109439622 B CN109439622 B CN 109439622B CN 201811341165 A CN201811341165 A CN 201811341165A CN 109439622 B CN109439622 B CN 109439622B
Authority
CN
China
Prior art keywords
parts
adipose tissue
tissue digestion
enzyme
digestion
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811341165.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN109439622A (zh
Inventor
路明华
冯成宝
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
YOCON HENGYE BIOTECHNOLOGY (BEIJING) Co.,Ltd.
Original Assignee
Yocon Hengye Biotechnology Beijing Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yocon Hengye Biotechnology Beijing Co ltd filed Critical Yocon Hengye Biotechnology Beijing Co ltd
Priority to CN201811341165.XA priority Critical patent/CN109439622B/zh
Publication of CN109439622A publication Critical patent/CN109439622A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109439622B publication Critical patent/CN109439622B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种脂肪组织消化专用酶，是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为mg/L：I型胶原酶75～200,L‑谷氨酰胺200～350,葡萄糖2500～3500,抗坏血酸20～200，余量为水。本发明中脂肪组织消化专用酶相比传统所用的胶原酶，具有对细胞损伤小、不影响脂肪干细胞传代次数的优点，使用本发明的脂肪组织消化专用酶处理得到的ASCs，可以连续传代6代以上，细胞数扩增倍数保持在5倍以上。

Description

一种脂肪组织消化专用酶
技术领域
本发明涉及一种脂肪组织处理所使用的消化专用酶、分离脂肪干细胞的方法，属于干细胞分离技术领域。
背景技术
人自体的脂肪组织（Adipose Tissue）可被用于改善面部、手部以及身体其他部位的软组织凹陷，其效果在美容外科和重建整形外科领域中已经得到了充分的肯定。人自体脂肪组织作为干细胞的丰富来源，相对于骨髓而言，其更方便获取。如此丰富的干细胞储存源，如果能在体外得到良好的培养和长期保存，并且在需要时拿来以供临床应用，将为再生医学和组织工程学的发展做出巨大的贡献。但目前从脂肪组织中分离脂肪干细胞（Adipose-derived Stem Cells，ASCs）通常采用酶消化法，而采用酶消化最大的问题就在于对消化程度的控制，消化不足，得到的细胞数量会少，消化过度，直接影响ASCs的形态和状态，以及后续的传代培养，因此如果能够有一种脂肪消化的专用酶来处理脂肪组织而又不对脂肪干细胞造成损伤，势必会带来很大的好处。本发明正是基于这一出发点而进行研究得到，本发明中脂肪组织消化专用酶相比传统所用的胶原酶，具有对细胞损伤小、不影响脂肪干细胞传代次数的优点，使用本发明的脂肪组织消化专用酶处理得到的ASCs，可以连续传代6代，细胞数扩增倍数仍保持在5倍以上。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种脂肪组织消化专用酶，实现了高效分离ASCs细胞，使其能够维持正常的细胞形态、正常的细胞生长速度及传代代数。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种脂肪组织消化专用酶，是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为mg/L：
I型胶原酶75～200；
L-谷氨酰胺200～350；
葡萄糖2500～3500；
抗坏血酸20～200；
余量为水。
作为优选，脂肪组织消化专用酶是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为mg/L：
I型胶原酶90～150；
L-谷氨酰胺250～300；
葡萄糖2700～3200；
抗坏血酸20～80；
余量为水。
更为优选的，脂肪组织消化专用酶是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为mg/L：
I型胶原酶100；
L-谷氨酰胺290；
葡萄糖3100；
抗坏血酸25；
余量为水。
本发明的脂肪组织消化专用酶制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节pH 值至7.0～7.4，工业滤芯过滤除菌（0.22μm滤膜过滤），即得， 同时氮气保护进行分装（避免不稳定性成分被氧化）。
本发明的脂肪组织消化专用酶，根据脂肪组织组成及特性，细胞体外生长的营养需求，除选用I型胶原酶外，加入了不同营养物质并对不同营养物质的比例进行了合理调整，以维持细胞活性并使细胞免受消化酶损伤，所以分离出的细胞状态更好，生长速度快，传代次数多。
附图说明
图1所示为实施例3传代培养的ASCs细胞P1代正常生长镜检图。
图2所示为实施例3传代培养的ASCs细胞P3代正常生长镜检图。
图3所示为实施例3传代培养的ASCs细胞P6代正常生长镜检图。
图4所示为实施例2和实施例3收获细胞数及扩增倍数。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1 制备脂肪组织消化专用酶
是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为mg/L：
I型胶原酶100；
L-谷氨酰胺290；
葡萄糖3100；
抗坏血酸25；
余量为水。
制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入蒸馏水使各组分终浓度如上所述，调节pH 值至7.2，0.22μm工业滤芯过滤除菌，即得，同时氮气保护进行分装（避免不稳定性成分被氧化），-20℃保存。
实施例2 运用实施例1的消化酶进行脂肪组织消化、分离ASCs
取脂肪组织用PBS进行清洗，反复若干次后清洗液无血色，1500r/min，水平离心5min，取上层脂肪10ml，加入等体积的实施例1中消化酶，置于37℃恒温水浴振荡器上120r/min消化60min。消化完成后离心收集沉淀，PBS清洗一次再次离心收集细胞，用干细胞无血清培养基重悬细胞后转移至T25方瓶，置于37℃、5%CO2培养箱，静置培养，24h换液，之后每三天换液一次，待细胞汇合度长至80%进行传代。
实施例3 ASCs细胞连续传代培养
将实施例2分离的长至80%的ASCs用PBS进行清洗一次，加入实施例1中消化酶1ml，显微镜下观察，待90%细胞收缩、变圆时，加入PBS 5ml终止消化，用移液管轻轻吹打使细胞从瓶壁脱落，取样进行细胞计数。1500r/min，水平离心5min，收集细胞，用5ml干细胞无血清培养基重悬细胞后，再次计数，并按10000个细胞/cm2的密度进行接种后，置于37℃、5%CO2培养箱，静置培养，三天后细胞汇合度达80%以上进行传代。
上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (4)

1.一种脂肪组织消化专用酶，其特征在于：是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为mg/L：I型胶原酶90～150，L-谷氨酰胺250～300，葡萄糖2700～3200，抗坏血酸20～80，余量为水。
2.根据权利要求1所述的脂肪组织消化专用酶，其特征在于：是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为mg/L：I型胶原酶100，L-谷氨酰胺290，葡萄糖3100，抗坏血酸25，余量为水。
3.权利要求1或2所述的脂肪组织消化专用酶的制备方法，其特征在于：取除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如权利要求1或2所述，调节pH值至7.0～7.4，即得。
4.权利要求1或2所述的脂肪组织消化专用酶在消化脂肪组织中的应用。
CN201811341165.XA 2018-11-12 2018-11-12 一种脂肪组织消化专用酶 Active CN109439622B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811341165.XA CN109439622B (zh) 2018-11-12 2018-11-12 一种脂肪组织消化专用酶

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811341165.XA CN109439622B (zh) 2018-11-12 2018-11-12 一种脂肪组织消化专用酶

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109439622A CN109439622A (zh) 2019-03-08
CN109439622B true CN109439622B (zh) 2021-03-16

Family

ID=65552221

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811341165.XA Active CN109439622B (zh) 2018-11-12 2018-11-12 一种脂肪组织消化专用酶

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109439622B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108300690A (zh) * 2018-02-07 2018-07-20 北京汇智驰康生物科技有限公司 一种脂肪间充质干细胞的分离培养方法和无血清培养基

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108300690A (zh) * 2018-02-07 2018-07-20 北京汇智驰康生物科技有限公司 一种脂肪间充质干细胞的分离培养方法和无血清培养基

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Isolation and Characterization of Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells(ADSCs) from Cattle;Taofeng Lu et al.;《Appl Biochem Biotechnol》;20140803;第174卷;第719–728页 *
大鼠前脂肪细胞消化酶原代培养方法改良的探讨;蒋茂莹 等;《重庆医科大学学报》;20091231;第34卷(第6期);第743页右栏1.1.2，第744页左栏1.2.1 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109439622A (zh) 2019-03-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109536440A (zh) 外泌体的提取方法
CN103667187B (zh) 一种人脂肪干细胞的分离培养方法和干细胞库的构建方法
CN106479971A (zh) 一种用于培养间充质干细胞的无血清培养基和方法
CN107475190B (zh) 一种脂肪svf细胞临床级高效制备和冻存的方法及其用途
CN101914495A (zh) 用于体外大量扩增毛囊干细胞的培养方法
CN110564682B (zh) 一种大规模生产人脂肪间充质干细胞外泌体的方法
CN102732586B (zh) 一种间充质干细胞分泌素的制备方法
CN104357387A (zh) 一种从人脂肪组织中分离人脂肪干细胞的方法
CN101802177A (zh) 从人或动物胚胎提取间质性干细胞及提取其分泌物的方法
CN108531448A (zh) 一种人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基及制备方法
CN104450611A (zh) 一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法
CN107541486A (zh) 一种美容护肤用的胎盘亚全能干细胞活性因子及其制备与应用
CN105779388B (zh) 一种脐血间充质干细胞的培养基及其培养方法
CN106978396A (zh) 一种脂肪间充质干细胞克隆的扩增培养方法
CN107502588B (zh) 一种分离制备牙髓干细胞的方法
CN109234230B (zh) 一种皮肤间充质干细胞的原代分离方法
CN109439622B (zh) 一种脂肪组织消化专用酶
CN108324993A (zh) 一种诱导毛发再生的干细胞复合体、其制备方法及应用
CN110755319A (zh) 大麻花叶发酵方法、大麻花叶发酵提取物和化妆品
CN102250841A (zh) 可回复性永生化大鼠骨髓间充质干细胞及其制备方法和应用
CN103920161A (zh) 一种在细胞膜微囊中高效装载药物的方法
CN114752590A (zh) 一种高效且经济的猪肌肉干细胞的分离方法及其应用
CN106421910A (zh) 脂肪组织制剂及其制备方法与应用
CN107496987A (zh) 一种制备骨诱导成骨制剂的方法
US10576159B2 (en) Method for preparing an induced osteogenesis formulation

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20200904

Address after: 304, 3rd floor, No.7, Fengxian Middle Road, Haidian District, Beijing 100094

Applicant after: YOCON HENGYE BIOTECHNOLOGY (BEIJING) Co.,Ltd.

Address before: 100094, Beijing, Haidian District Feng Yin Zhong Road, No. 7, block B

Applicant before: Wang Xiaoke

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant