CN109431970A - 一种含有促进伤口愈合双药的纤维束/多肽水凝胶及其制备方法 - Google Patents

一种含有促进伤口愈合双药的纤维束/多肽水凝胶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含有促进伤口愈合双药的纤维束/多肽水凝胶，它是将含有促进伤口愈合作用药物的海藻酸钠溶液通过微流控“纺织”技术制备成海藻酸钠纤维束；再将海藻酸钠纤维束与含有抗菌药的多肽预凝胶溶液复合得到水凝胶预凝胶体系，自组装形成海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶复合载药体系。本发明双药载药体系是一种内部海藻酸钠纤维束包裹的药物缓释、外部多肽水凝胶包裹的抗菌药快速释放的材料，可治疗伤口感染并在伤口愈合过程中缓释药物以促进愈合，能有效缩短慢性伤口的急性炎症期，促进伤口快速愈合；还能为伤口提供湿润环境，确保伤口表面有一定的透气性，在治疗慢性伤口等创面具有广泛的应用价值。

Description

一种含有促进伤口愈合双药的纤维束/多肽水凝胶及其制备 方法
技术领域
本发明涉及一种含有双药促进伤口愈合的纤维束/多肽水凝胶及其制备方法。
背景技术
伤口愈合主要分为急性炎症期、细胞增殖期、瘢痕修复期三个阶段。慢性伤口一直处于炎症期，或者伤口愈合后又复发感染，导致慢性伤口发病率高、治愈性差，令很多病人饱受痛苦。据调查，每年有很多病人承受因皮肤失调症例如慢性创面亦或是术后产生的大面积创口等创伤带来的痛苦，并且承担着大笔的治疗费用。创口愈合是一个复杂的动态过程，包括pH的变化、蛋白酶的活化和血管组织的再生，且受到各种外界因素的影响，如病人固有的体质和外在的恢复环境。在治疗伤口感染促进其愈合的过程中，需要阻止细菌的感染，保证创口处于合适的湿润度。较大的创口不能完全暴露在空气中，但是又要保证一定的透气性；由于伤口创面较大，有时需要在创口表面做抗菌处理，换药次数频繁易造成伤口二次损伤；或者采用全身静脉滴注的治疗方式，导致静脉滴注药物引起的不良反应的发病率高。因此，开发一种能够促进伤口愈合的安全的新型创口缓释给药体系成为临床治疗慢性伤口愈合的一个重要问题，减少给药次数，从而提高病人的顺应性。
随着医药技术的发展，众多生物相容性良好的药物载体已被报道，如壳聚糖、海藻酸钠、淀粉等天然高分子水凝胶和由氨基酸组成的多肽水凝胶。此类水凝胶作为治疗伤口愈合的载体，不但可被生物体自身的酶降解，具有良好的生物相容性，而且在治疗伤口愈合的过程中可以保持创口合适的湿润性和透气性。其中，海藻酸钠因为其生物可降解、无毒、温和成胶等特点，可以作为嵌入式的药物载体。同时，海藻酸钠本身具有一定的止血功效，所以此类材料在载药、组织粘合剂、止血材料等方面有很多潜在的应用。目前，一般采用微流控技术制备成海藻酸钠微球，该方法制备的海藻酸钠微球尺寸以及形态简单可控，制备过程可视化，但是微球降解快速，基本上24h释放药物就已经到达平台期，且释药形式单一。而传统多肽水凝胶通常采用离子共价结合的成胶方式，成胶过程缓慢，内部包裹的药物易发生聚集；也有报道采用传统循环冻融法和过夜静置成胶方法制备创口给药体系，但是存在药物沉降、分布不均一、载药量低的缺点。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中制备用于伤口愈合的水凝胶药物物理包埋方式造成的药物装载不均匀、释药形式单一的缺点，将高分子纤维束与多肽水凝胶相结合，利用微流控纺织技术制备海藻酸钠纤维束，并将多肽快速自组装包裹在纤维束外，提供一种可包含两种促进伤口愈合药物的纤维束/多肽复合水凝胶体系，实现对抗炎药物的快速释放和促进伤口修复药物的缓慢释放，同时为创口提供合适的湿润度以及透气环境，能够促进慢性创口愈合。
为了达到上述的目的，本发明采用了下列技术方案：
一种含有双药促进伤口愈合的纤维束/多肽水凝胶，它是将含有促进伤口愈合作用药物的海藻酸钠溶液通过微流控“纺织”技术制备成海藻酸钠纤维束；再将海藻酸钠纤维束与载有抗菌药的多肽预凝胶溶液复合得到水凝胶预凝胶，自组装形成海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶复合载药体系。
本发明所述的含有双药促进伤口愈合的纤维束/多肽水凝胶是由以下方法制得的：
步骤(1)、采用微流控“纺织”技术，以含有促进伤口愈合药物的海藻酸钠溶液为中间相溶液，含有促海藻酸钠成胶的有机相为外相溶液，制备微纤维束，固化、干燥；
步骤(2)、将干燥后的海藻酸钠纤维束与载有抗菌药的多肽预凝胶溶液复合成水凝胶预凝胶体系；调节水凝胶预凝胶体系的pH至5.5-6.5，水凝胶预凝胶体系通过自组装方式成胶，形成海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶复合载药体系。
本发明的另一个目的是提供含有双药促进伤口愈合的纤维束/多肽水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)、采用微流控“纺织”技术，以含有促进伤口愈合药物的海藻酸钠溶液为中间相溶液，含有促海藻酸钠成胶的有机相为外相溶液，制备微纤维束，固化、干燥；
步骤(2)、将干燥后的海藻酸钠纤维束与载有抗菌药的多肽预凝胶溶液复合成水凝胶预凝胶体系；调节水凝胶预凝胶体系的pH至5.5-6.5，水凝胶预凝胶体系通过外部多肽水凝胶自组装的方式成胶，形成海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶复合载药体系。
步骤(1)中，所述的促进伤口愈合药物为重组牛碱性成纤维细胞生长因子、重组人表皮生长因子、重组人酸性成纤维细胞生长因子、重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人血小板源生长因子中的一种或多种。
所述的中间相溶液中海藻酸钠浓度为1wt％～3wt％；促进伤口愈合药物的浓度为0.1～10μg/mL，优选为0.1μg/mL。
所述的外相溶液为浓度为3％w/v的氯化钙异丙醇溶液。
所述的微流控“纺织”技术为：将中间相溶液、外相溶液抽入到注射器内，分别注入到微流控芯片的内外相中，控制中间相溶液的流速为30～70μL/min，外相溶液的流速为300～800μL/min，制得装载有促进伤口愈合药物的海藻酸钠纤维束。
固化所用溶剂为浓度8～10％w/v的氯化钙异丙醇溶液，固化时间为20～22小时。固化完成后用异丙醇溶液清洗，除去纤维束表面残留的氯化钙，室温干燥至恒重。
步骤(2)中，所述的载有抗菌药的多肽预凝胶溶液中抗菌药的浓度为0.05～8mg/mL，优选为1mg/mL，多肽的浓度为0.8～1.5wt％，优选为1wt％。
所述的载有抗菌药的多肽预凝胶溶液的制备方法：将多肽溶于去离子水中配制成多肽预凝胶溶液，将抗菌药溶于多肽预凝胶溶液中，得到载有抗菌药的多肽预凝胶溶液；或将抗菌药溶于去离子水中，配制成抗菌药水溶液，再将多肽溶于抗菌药水溶液中，得到载有抗菌药的多肽预凝胶溶液。
所述的抗菌药为青霉素类、头孢菌类、林可胺类、四环素类、氨基糖苷类、酰胺醇类、大环类脂内中的一种或多种；优选为氨苄青霉素、盐酸林可霉素。
多肽通过固相合成法合成，多肽为以Nap为头基、Gly-Phe-Phe为主链的多肽分子；优选为以Nap为头基、Gly-Phe-Phe-Lys-His为主链的多肽分子，即Nap-GFFKH，序列如SEQID NO.1所示。Gly-Phe-Phe作为多肽中促进自组装的三个氨基酸结构，促进多肽分子自组装成胶的同时，由于Phe中含有苯环，导致多肽水溶性较差，因此发明人设计氨基酸序列时引入Lys和His以增加多肽的水溶性。同时，调节多肽预凝胶水溶液pH至5.5-6.5，达到等电点，多肽分子发生自组装成胶。由于此时海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶复合载药体系的pH显弱酸性，也避免了海藻酸钠在碱性条件下发生降解。
多肽通过固相合成方法制备得到，包括：
(1)、将2-氯三苯甲基氯树脂至于固相合成管中，清洗树脂后加入Fmoc-His-Trt，在N,N-二异丙基乙胺催化下反应使组氨酸C端和树脂链接；清洗树脂使未反应的氨基酸无残留；其中，所述的2-氯三苯甲基氯树脂、Fmoc-His-Trt、N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为2:3:6；
(2)、加入封闭液封闭树脂，封闭树脂后，DMF清洗树脂以洗净封闭液；加入脱保护液脱Fmoc保护基，反应后除去反应液，DMF清洗树脂以洗净脱保护液；其中，所述的封闭液为二氯甲烷:甲醇:N,N-二异丙基乙胺＝80:15:5V/V/V；所述的脱保护液为20％V/V的哌啶/N,N-二甲基甲酰胺；
(3)、取Fmoc-Lys-OH，用DMF溶解后加入到固相合成管中与步骤(2)得到的树脂混合，在TBTU、HOBT和N,N-二异丙基乙胺催化下进行反应，反应结束后按照步骤(2)处理；其中，所述的2-氯三苯甲基氯树脂、Fmoc-Lys-OH、TBTU、HOBT和N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为2:6:6:6:12；
(4)、取Fmoc-Phe-OH，用DMF溶解后加入到固相合成管中与步骤(3)得到的树脂混合，在TBTU、HOBT和N,N-二异丙基乙胺催化下进行反应，反应结束后按照步骤(2)处理；其中，所述的2-氯三苯甲基氯树脂、Fmoc-Phe-OH、TBTU、HOBT和N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为2:6:6:6:12；
(5)、取Fmoc-Phe-OH，用DMF溶解后加入到固相合成管中与步骤(4)得到的树脂混合，在TBTU、HOBT和N,N-二异丙基乙胺催化下进行反应，反应结束后按照步骤(2)处理；其中，所述的2-氯三苯甲基氯树脂、Fmoc-Phe-OH、TBTU、HOBT和N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为2:6:6:6:12；
(6)、取Fmoc-Gly-OH，用DMF溶解后加入到固相合成管中与步骤(5)得到的树脂混合，在TBTU、HOBT和N,N-二异丙基乙胺催化下进行反应，反应结束后按照步骤(2)处理；其中，所述的2-氯三苯甲基氯树脂、Fmoc-Gly-OH、TBTU、HOBT和N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为2:6:6:6:12；
(7)、取2-萘乙酸，用DMF溶解后加入到固相合成管中与步骤(6)得到的树脂混合，在TBTU、HOBT和N,N-二异丙基乙胺催化下进行反应，反应结束后依次用DMF、DCM清洗树脂，得到接有多肽分子的树脂；
(8)、步骤(7)得到树脂与三氟乙酸混合，室温反应1.5-2h后，除去树脂，得到含有多肽的反应液，除去溶剂得到固体；
(9)、往步骤(8)得到的固体中加入冰乙醚进行沉淀，2000-3000rpm/min低速离心5-10min，弃去上层乙醚，重复多次除去样品中的三氟乙酸；得到的多肽样品挥干乙醚后加入超纯水分散样品，-20℃预冻至样品溶液完全冻住；将预冻后的样品置于冷冻干燥机中，-80℃至-70℃冻干24-48h，即得以Nap为头基、Gly-Phe-Phe-Lys-His为主链的多肽粉末。
所述的载有抗菌药的多肽预凝胶溶液与中间相溶液的体积比为1～5:1，考虑到复合水凝胶体系中的海藻酸钠纤维束的降解速度，同时确保该复合体系具有合适的机械强度，以适用于治疗伤口愈合的药物载体，优选为3～5:1。
步骤(3)中，水凝胶预凝胶体系包括含有促进伤口愈合药物的海藻酸钠纤维束、多肽、抗菌药。水凝胶预凝胶体系中多肽在室温下反应时间为5-10s，进行自组装交联成胶。
本发明所述的含有促进伤口愈合双药的海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶体系以海藻酸钠纤维束作为内部装载促进伤口愈合药物的载体，外部包裹载有抗菌药的多肽水凝胶，可以进一步对海藻酸钠纤维束中包裹的生长因子释放起到延缓的作用，多肽水凝胶中所包裹的抗菌药快速释放，形成一种内部药物缓释、外部药物突释的载药体系，从而在促进伤口愈合的过程中快速的抑制创口感染，并在创口愈合过程中缓释药物、逐步提供促进伤口愈合的药物，能有效的缩短慢性伤口的急性炎症期，促进伤口的快速愈合。同时双药纤维束/多肽复合水凝胶体系还能为伤口提供湿润环境，确保伤口表面有一定的透气性。因此，本发明涉及的海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶复合双药载药体系在治疗慢性伤口等创面具有广泛的应用价值。本发明所述的含有促进伤口愈合双药的海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶在制备治疗慢性伤口药物中的应用。所述的慢性伤口为创伤性溃疡、糖尿病所引发的溃疡等。
本发明的有益效果：
(1)、本发明基于微流控技术制备海藻酸钠纤维束，制作过程方便快速，海藻酸钠纤维束不仅作为药物载体，同时提供细胞所需的营养物质；外部自组装多肽水凝胶通过其内部相互缠绕的纳米束或者网状结构形成水凝胶，可以在5-10s内成胶，由于表面张力的作用，成胶过程中可以捕获溶剂中小分子，实现载药。避免了已有报道制备创口给药体系所采用的的传统循环冻融法和过夜静置成胶方法所造成的药物沉降、分布不均一、药物损失引起的载药量低的缺点。
(2)、本发明含有促进伤口愈合双药的海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶复合体系，能够达到外层多肽水凝胶内包裹的药物快速释放、内层海藻酸钠纤维束包裹的药物缓慢释放的效果。
(3)、本发明含有促进伤口愈合双药的海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶在促进伤口愈合的同时可以保证创口的湿润性和透气性，从而进一步促进伤口愈合。
(4)、本发明所制备的含有双药促进伤口愈合的海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶中的组装多肽水凝胶柔软湿润，与天然组织的细胞外基质相当，可以形成不规则形状以加速伤口愈合。
(5)、构建载体所采用的海藻酸钠高分子材料与多肽超分子生物相容性好，可由生物体自身降解。
附图说明
图1为含有促进伤口愈合双药的海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶的制备方法示意图。
图2为实施例6多肽水凝胶的透射电镜图。
图3为实施例1-3复合水凝胶中海藻酸钠纤维束于第8小时、1天、3天、7天降解失重率变化示意图。
图4为含有促进伤口愈合双药的海藻酸钠纤维束/多肽复合水凝胶在7天内降解光学图。
图5为实施例2复合水凝胶中含有重组牛碱性成纤维细胞生长因子海藻酸钠纤维束于第0天、7天降解后的扫描电镜图；其中，上图为扫描电镜500倍，下图为2000倍镜下观察到的。
图6为实施例2、4中含有促进伤口愈合双药的海藻酸钠纤维束/多肽复合水凝胶中重组牛碱性成纤维细胞生长因子(FGF)体外释放曲线。
图7为实施例2中含有促进伤口愈合双药的海藻酸钠纤维束/多肽复合水凝胶中氨苄青霉素体外释放曲线。
图8为实施例4中含有促进伤口愈合双药的海藻酸钠纤维束/多肽复合水凝胶中盐酸林可霉素体外释放曲线。
图9为含有促进伤口愈合双药的海藻酸钠纤维束/多肽复合水凝胶的抑菌效果测试中对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径变化图。
图10为大鼠伤口感染伤口愈合率变化趋势图(第1、3、5、7、11天)。
图11为大鼠伤口感染病理检测结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及其优点更加的清楚明白，结合附图及实施例，对于本发明进行进一步的阐述说明。给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
实施例采用的多肽分子为以Nap为头基、Gly-Phe-Phe-Lys-His为主链的多肽分子，通过固相合成方法制备得到，制备方法如下：
(1)、用二氯甲烷(DCM)清洗固相合成管并捡漏，保证固相合成管处于无水环境，称量0.2mmol 2-氯三苯甲基氯树脂(2-CTA树脂)，加入到固相合成管中；
(2)、清洗树脂：向固相合成管中加入5mL二氯甲烷，置于摇床，摇摆溶胀30min，真空泵抽滤掉二氯甲烷，保留树脂；再加入5mL二氯甲烷，摆床摇摆2min后抽滤，重复该操作5次以保证树脂液洗干净；
(3)、组氨酸的连接：称量0.1859g(0.3mmol)Fmoc-His-Trt(M＝619.7)于10mL固相合成管中，用移液枪吸取100μL N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，振荡混匀，摇摆反应3h，使C端和树脂链接；
(4)、清洗树脂：取5mL DCM于固相合成管中，摆床摇摆2min后抽滤，重复该步骤5次保证未反应的氨基酸无残留；
(5)、封闭树脂：取封闭液(DCM:甲醇:DIPEA＝80:15:5V/V/V)，分两次加入，每次7.5mL，间隔10min；
(6)、清洗树脂：用真空泵抽去反应液，加入5mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，摆床摇摆2min，抽滤，重复该步骤保证封闭液被洗净；
(7)、脱Fmoc保护基：向固相合成管中加入5mL脱保护液(20％V/V的哌啶/DMF)，摇摆反应5min，再加入20mL脱保护液，摇摆反应25min后，抽干溶剂；
(8)、清洗树脂：用真空泵抽去反应液，加入5mL DMF，摆床摇摆2min后抽滤，重复该步骤5次，保证脱保护液被洗净；
(9)、赖氨酸的连接：称取0.2811Fmoc-Lys-OH(M＝486.5)，0.1926g TBTU和0.0811g HOBT于10mLEP管中，用5mLDMF溶解后加入到固相合成管中，加入200μL DIPEA，振荡摇匀，摇摆4.5h或者隔夜，连接上氨基酸；重复步骤(6)～步骤(8)；
(10)、苯丙氨酸的连接：称取0.2325g Fmoc-Phe-OH(M＝387.4)、0.1926g TBTU和0.0811g HOBT于10ml EP管中，用5mL DMF溶解后加入到固相合成管中，加入200μL DIPEA，振荡反应3h与赖氨基酸连接；重复步骤(6)～步骤(8)；
(11)、苯丙氨酸的连接：称取0.2325g Fmoc-Phe-OH(M＝387.4)、0.1926g TBTU和0.0811g HOBT于10ml EP管中，用5mL DMF溶解后加入到固相合成管中，加入200μL DIPEA，振荡反应3h与上一个氨基酸连接；重复步骤(6)～步骤(8)；
(12)、甘氨酸的连接，称取0.1784g Fmoc-Gly-OH(M＝297.3)、0.1926g TBTU和0.0811g HOBT于10ml EP管中，加入5mL DMF溶解后加入到固相合成管中，用移液枪吸取200μL的DIPEA，振荡反应3h与上一个氨基酸连接；重复步骤(6)～步骤(8)；
(13)、Nap头基的连接：称取0.1117g 2-萘乙酸(M＝186.2)、0.1926g TBTU和0.0811g HOBT于10ml EP管中，加入5mL DMF溶解后加入到固相合成管中，用移液枪吸取200μL DIPEA，振荡反应3h与甘氨基酸连接；加入5mL DMF，摇摆，每次2min，重复该操作5次保证反应液被洗净；再加入5mL DCM，摆床摇摆2min后抽滤，重复该步骤5次保证反应液洗干净，抽干固相合成管中的DCM，得到接有多肽分子的树脂；
(14)、向圆底烧瓶中加入搅拌子，将树脂转移到圆底烧瓶中，加入8mL三氟乙酸，在磁力搅拌器上充分搅拌，室温反应1.5-2h，通过三氟乙酸切下树脂上面的氨基酸；反应结束后，利用真空泵抽滤将圆底烧瓶内的多肽段到梨形瓶中，加入三氟乙酸荡洗圆底烧瓶，使合成的多肽全部转移至梨形瓶中；将梨形瓶连接到装有防爆瓶的旋转蒸发仪上，在温度55-60℃下旋蒸，梨形瓶瓶壁上出现棕色固体后(粘稠状)，并且蒸发至无液体挥发，停止加热；
(15)、后处理：向梨形瓶中加入5mL冰乙醚，多肽以白色的沉淀形式析出(如果无沉淀，蒸干乙醚，加水沉淀)；将白色沉淀和乙醚转移到EP管中，2000-3000rpm/min低速离心5-10min，弃去上层乙醚；再加入5mL冰乙醚后离心，重复三次，保证样品中的三氟乙酸被洗净，用纸巾包裹EP管管口，置于通风处中挥干乙醚；再向EP管中加入少量的超纯水(刚好覆盖所有的样品)分散样品，-20℃预冻至样品溶液完全冻住；
(16)、冻干：将预冻后的样品置于冷冻干燥机中，-80℃至-70℃冻干24-48h，即得以Nap为头基、Gly-Phe-Phe-Lys-His为主链的多肽粉末。
实施例1
一种含有双药促进伤口愈合的海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶，通过以下制备方法制得，包括以下步骤：
步骤(1)、将1μg重组牛碱性成纤维细胞生长因子(购自上海生工生物工程有限公司，C600062-0010)溶解于10mL 3wt％的海藻酸钠水溶液中，形成中间相溶液；将3g氯化钙粉末溶于100mL异丙醇中，搅拌至完全溶解，配制成3％w/v的氯化钙异丙醇溶液，作为外相溶液；将1mL中间相溶液和100mL外相溶液抽入到注射器内，分别注入到微流控芯片的内外相中，内相的流速为50μL/min，外相的流速为500μL/min，制备装载有重组牛碱性成纤维细胞生长因子的海藻酸钠纤维束；收集海藻酸钠纤维束，投入到8％w/v的氯化钙异丙醇溶液里，进一步固化20-21小时，固化完成后用异丙醇溶液清洗三次，除去纤维束表面残留的氯化钙，清洗后室温干燥至恒重；
称取10mg以Nap为头基Gly-Phe-Phe为主链的多肽粉末，溶于1mL去离子水中，配制成1mL浓度为1wt％的多肽预凝胶溶液；称取1mg氨苄青霉素溶于1mL多肽预凝胶溶液中，直至完全溶解，形成溶液B，即载有抗菌药的多肽预凝胶溶液；
步骤(2)、将含有重组牛碱性成纤维细胞生长因子的海藻酸钠纤维束投入到1mL溶液B中，采用1M NaOH溶液调节预凝胶溶液的pH近6，室温下5s左右自组装形成海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶。
实施例2
一种含有双药促进伤口愈合的海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶，通过以下制备方法制得，包括以下步骤：
步骤(1)、将1μg重组牛碱性成纤维细胞生长因子溶解于10mL3wt％的海藻酸钠水溶液中，形成中间相溶液；将3g氯化钙粉末溶于100mL异丙醇中，搅拌至完全溶解，配制成3％w/v的氯化钙异丙醇溶液，作为外相溶液；将1mL中间相溶液和100mL外相溶液抽入到注射器内，分别注入到微流控芯片的内外相中，内相的流速为50μL/min，外相的流速为500μL/min，制备装载有重组牛碱性成纤维细胞生长因子的海藻酸钠纤维束；收集制备好的海藻酸钠纤维束，投入到8％w/v的氯化钙异丙醇溶液里，进一步固化20-21小时，固化完成后用异丙醇溶液清洗三次，除去纤维束表面残留的氯化钙，清洗后室温干燥至恒重；
称取30mg以Nap为头基Gly-Phe-Phe为主链的多肽粉末，溶于3mL去离子水中，配制成3mL浓度为1wt％的多肽预凝胶溶液；称取3mg氨苄青霉素溶于3mL多肽预凝胶溶液中，直至完全溶解，形成溶液B。
步骤(2)、将含有重组牛碱性成纤维细胞生长因子海藻酸钠纤维束投入到3mL溶液B中得到水凝胶预凝胶体系，调节体系的pH近6，室温下5s左右自组装形成海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶。
实施例3
一种含有双药促进伤口愈合的海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶，通过以下制备方法制得，包括以下步骤：
步骤(1)、将1μg重组牛碱性成纤维细胞生长因子溶解于10mL3wt％的海藻酸钠水溶液中，形成中间相溶液；将3g氯化钙粉末溶于100mL异丙醇中，搅拌至完全溶解，配制成3％w/v的氯化钙异丙醇溶液，作为外相溶液；将1mL中间相溶液和100mL外相溶液抽入到注射器内，分别注入到微流控芯片的内外相中，内相的流速为50μL/min，外相的流速为500μL/min，制备装载有重组牛碱性成纤维细胞生长因子的海藻酸钠纤维束；收集制备好的海藻酸钠纤维束，投入到8％w/v的氯化钙异丙醇溶液里，进一步固化20-21小时，固化完成后用异丙醇溶液清洗三次，除去纤维束表面残留的氯化钙，清洗后室温干燥至恒重；
称取50mg以Nap为头基Gly-Phe-Phe为主链的多肽粉末，溶于5mL去离子水中，配制成5mL浓度为1wt％的多肽预凝胶溶液；称取5mg氨苄青霉素溶于5mL多肽预凝胶溶液中，直至完全溶解，形成溶液B；
步骤(2)、将含有重组牛碱性成纤维细胞生长因子海藻酸钠纤维束投入到5mL溶液B中得到水凝胶预凝胶体系，调节体系的pH近6，室温下5s左右自组装形成海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶。
实施例4
一种含有双药促进伤口愈合的海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶，通过以下制备方法制得，包括以下步骤：
步骤(1)、将1μg重组牛碱性成纤维细胞生长因子溶解于10mL 3wt％的海藻酸钠水溶液中，形成中间相溶液；将3g氯化钙粉末溶于100mL异丙醇中，搅拌至完全溶解，配制成3％w/v的氯化钙异丙醇溶液，作为外相溶液；将1mL中间相溶液和100mL外相溶液抽入到注射器内，分别注入到微流控芯片的内外相中，内相的流速为50μL/min，外相的流速为500μL/min，制备装载有重组牛碱性成纤维细胞生长因子的海藻酸钠纤维束；收集制备好的海藻酸钠纤维束，投入到8％w/v的氯化钙异丙醇溶液里，进一步固化20-21小时，固化完成后用异丙醇溶液清洗三次，除去纤维束表面残留的氯化钙，清洗后室温干燥至恒重；
称取30mg以Nap为头基Gly-Phe-Phe为主链的多肽粉末，溶于3mL去离子水中，配制成3mL浓度为1wt％的多肽预凝胶溶液；称取3mg盐酸林可霉素溶于3mL多肽预凝胶溶液中，直至完全溶解，形成溶液B；
步骤(3)、将含有重组牛碱性成纤维细胞生长因子海藻酸钠纤维束投入到3mL溶液B中得到水凝胶预凝胶体系，调节体系的pH近6，室温下5s左右自组装形成海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶。
实施例5
一种含有双药促进伤口愈合的海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶，通过以下制备方法制得，包括以下步骤：
步骤(1)、将1μg重组牛碱性成纤维细胞生长因子溶解于10mL 3wt％的海藻酸钠水溶液中，形成中间相溶液；将3g氯化钙粉末溶于100mL异丙醇中，搅拌至完全溶解，配制成3％w/v的氯化钙异丙醇溶液，作为外相溶液；将1mL中间相溶液和100mL外相溶液抽入到注射器内，分别注入到微流控芯片的内外相中，内相的流速为50μL/min，外相的流速为500μL/min，制备装载有重组牛碱性成纤维细胞生长因子的海藻酸钠纤维束；收集制备好的海藻酸钠纤维束，投入到8％w/v的氯化钙异丙醇溶液里，进一步固化20-21小时，固化完成后用异丙醇溶液清洗三次，除去纤维束表面残留的氯化钙，清洗后放置室温下干燥至恒重；
称取50mg氨苄青霉素溶于50mL去离子水中，直至完全溶解，配制成浓度为1.00mg/mL的氨苄青霉素溶液，并逐步稀释配制成浓度为0.75、0.50、0.25、0.05mg/mL的氨苄青霉素水溶液；称取6份30mg以Nap为头基Gly-Phe-Phe为主链的多肽粉末，分别加入到氨苄青霉素浓度为0、0.05、0.25、0.50、0.75、1.00mg/mL的氨苄青霉素溶液中，配制成3mL多肽浓度为1wt％的多肽预凝胶溶液，形成溶液B1-B6。
步骤(2)、将1mL中间相溶液制备得到的含有重组牛碱性成纤维细胞生长因子海藻酸钠纤维束投入到3mL B1-B6溶液中，调节预凝胶溶液的pH近6，室温下5s左右自组装形成复合水凝胶，制得复合水凝胶C1-C6。
实施例6多肽水凝胶的透射电镜测试
称取10mg以Nap为头基Gly-Phe-Phe为主链的多肽粉末，溶于1mL去离子水中，配制成浓度为1wt％的多肽预凝胶溶液，调节预凝胶溶液的pH近6，室温下5s左右自组装形成水凝胶。用移液枪取少量滴在直径为3mm的碳涂层铜网上，用滤纸吸去多余水分，置于红外灯下干燥1小时，将铜网送入透射电子显微镜，在200kv电压轰击下成像观察，以此表征该多肽水凝胶的内部结构。结果见图2，可以看出自组装多肽水凝胶成胶后内部生成大量宽度为20nm左右的纳米微束。
实施例7海藻酸钠纤维束降解测试
取实施例1-3制得的含有促进伤口愈合双药的海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶于成胶小瓶中，加入等体积PBS缓冲液(pH7.4)。在第8小时、1天、3天、5天、7天，取出，用去离子水洗去表面的多肽水凝胶，放置于通风处，室温干燥至恒重，称量后记录质量。用失重率代表第8小时、1天、3天、5天、7天海藻酸钠的降解度。以实施例1只含有重组牛碱性成纤维细胞生长因子的海藻酸钠纤维束作为对照。
失重率＝(原始海藻酸钠纤维束质量—第n天海藻酸钠纤维束质量)/原始海藻酸钠纤维束质量×100％。
失重率结果见图3，实施例2和3中复合水凝胶体系中的海藻酸钠纤维束的降解速度明显低于实施例1，实施例2与3中的海藻酸钠纤维束降解速度相似。
含有促进伤口愈合双药的海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶在七天内降解光学图见图4，相比于实施例1中复合水凝胶，实施例2、3中复合水凝胶在降解7天后仍能保持原来的形状，说明此复合体系具有合适的机械强度，可用于治疗伤口愈合的药物载体，解决了传统水凝胶易被溶蚀、不能维持原有宏观状态的缺点。
实施例8海藻酸钠纤维束的扫描电镜测试
取实施例2制得的含有促进伤口愈合双药的海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶，置于成胶小瓶中，加入等体积PBS缓冲液(pH7.4)。第7天，取出，用去离子水洗去表面的多肽水凝胶，经不同纯度(50、75、95、100％)的乙醇溶液脱水后，室温条件下干燥1天。取干燥后的海藻酸钠纤维束粘于双面导电胶带上，除去视野中多余的部分。待仪器抽真空后，将样品座送入样品室。设置参数完成后开始对样品进行扫描，用于表征水凝胶的外表面微观形貌。结果见图5，未经处理时(第0天)重组牛碱性成纤维细胞生长因子(FGF)明显包裹在海藻酸钠纤维束中，第7天时，纤维束表面出现粗糙、不完整、破裂等降解的情况，说明在降解过程中，海藻酸钠纤维束内的FGF随着海藻酸钠纤维束的降解而释放。
实施例9模拟体外药物从海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶复合体系释放行为考察
样品制备：实施例2含有促进伤口愈合双药的海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶；实施例4含有促进伤口愈合双药的海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶。
对照组1：实施例2步骤(1)制备得到的海藻酸钠纤维束；对照组2：取3mL实施例2溶液B，调节pH至6，于室温下得到多肽水凝胶；对照组3：取3mL实施例4溶液B，调节pH至6，于室温下得到多肽水凝胶。
取实施例2中制得的含有促进伤口愈合双药的海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶于成胶小瓶中，将新鲜配制的PBS缓冲液(pH7.4)加入到小瓶中复合水凝胶的上方。在1小时、2小时、4小时、8小时、12小时及第1～7天，用移液枪吸取1mL PBS上清液，再补加1mL新鲜的PBS溶液。所取上清液全部用于定量从含有促进伤口愈合双药的海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶中释放的药物累积释放量，并计算累积释放率。重组牛碱性成纤维细胞生长因子的释放量用酶联免疫试剂盒(上海通蔚实业有限公司，CK-E77240)测定，氨苄青霉素药物的释放根据中国药典2015年版二部中所规定的高效液相色谱检测条件，于254nm波长处测定溶液的吸光度。
氨苄青霉素的色谱检测如下：
高效液相色谱仪：岛津-20AB
色谱柱：Sepax Gp-C18色谱柱，4.6mm*250mm，填充粒径5μm；
A相：12％醋酸溶液:0.2mol/L磷酸二氢钾溶液:乙腈:水＝0.5:50:50:900
B相：12％醋酸溶液:0.2mol/L磷酸二氢钾溶液:乙腈:水＝0.5:50:400:550
A相:B相＝85:15、
流速：1.0mL/min
柱温：35℃
柱压：9.4～9.5MPa。
取实施例4中制得的含有促进伤口愈合双药的海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶于成胶小瓶中，将新鲜配制的PBS缓冲液(pH7.4)加入到小瓶中复合水凝胶的上方。在1h、2h、4h、8h、12h及第1～7天，用移液枪吸取1mLPBS上清液，再补加1mL新鲜的PBS溶液。所取上清液则全部用于定量从含有促进伤口愈合双药的海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶中释放的药物累积释放量，并计算累积释放率。重组牛碱性成纤维细胞生长因子的累积释放量用酶联免疫试剂盒测定，盐酸林可霉素的释放根据中国药典2015年版二部中所规定的高效液相色谱检测条件，于214nm波长处测定溶液的吸光度。
盐酸林可霉素的色谱检测如下：
高效液相色谱仪：岛津-20AB
色谱柱：Sepax Gp-C18色谱柱，4.6mm*250mm，填充粒径5μm；
A相：0.05M硼砂水溶液(85％磷酸调节pH至6.1)
B相：甲醇
A相:B相＝1:1
流速：1.0mL/min
柱温：40℃
柱压：15.1MPa
含有促进伤口愈合双药的海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶中重组牛碱性成纤维细胞生长因子(FGF)体外释放曲线如图6所示，氨苄青霉素的体外释放曲线如图7所示，盐酸林可霉素的体外释放曲线如图8所示，可知：在海藻酸钠纤维束外包裹多肽水凝胶后，实施例2、4中内部重组牛碱性成纤维细胞生长因子在1天内的释放率分别比未被多肽水凝胶包裹的纤微束降低了26.2％和37.8％，在第2天时释放率分别降低了21.2％和30.3％，延缓了海藻酸钠纤维束内部所装载的重组牛碱性成纤维细胞生长因子释放，同时外部多肽水凝胶内包裹的抗菌药在一天内的释放达到70％，说明海藻酸钠纤维束包裹了多肽水凝胶后，在延缓纤维束降解的同时达到纤维束内部药物缓释的作用，但对外部多肽水凝胶内的抗菌释放基本无影响，达到了外部多肽水凝胶药物快速释放、内部海藻酸钠水凝胶包裹的重组牛碱性成纤维细胞生长因子缓慢释放的效果。
实施例10含有促进伤口愈合双药的海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶的抑菌效果的测定
样品制备：取实施例5制备得到的复合水凝胶C1-C6，对照组为按照实施例2制备但不含药物的海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶。
菌种选择：以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)代表革兰氏阳性细菌，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)代表革兰氏阴性菌。
测定方法：用平板打孔法测定复合水凝胶C1-C6与对照组的抑菌圈大小，评判含有促进伤口愈合双药的海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶的抑菌效果。将3mL菌悬液(108CFU/mL)加入到50℃水浴条件下300mL液态MH培养基(称取牛肉粉6.0g，可溶性淀粉1.5g，酸水解酪蛋白17.5g，琼脂17.0g，加入1L蒸馏水溶解，调节pH至7.3±0.1，搅拌均匀121℃灭菌后待用)中，并且混合均匀。平均分配25mL上述混有菌悬液的培养基转移到灭菌处理后的培养皿中，使其凝固(菌落数为106-107CFU/mL)。用灭菌处理过的打孔器在平板上打出均匀分布的三个直径5mm的空洞。每个空洞内分别注入50μL复合水凝胶C1-C6及对照组，静置30min，待培养基吸收平衡后，于37℃培养箱中倒置培养18h。抑菌圈直径见图9，可知，抑菌圈大小与复合水凝胶中所含有的抗菌药浓度成正比，复合水凝胶C1-C6对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径大小基本相同，也说明对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果基本相同。
实施例11含有双药促进伤口愈合的海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶体系对大鼠伤口感染的愈合作用
样品制备：取实施例2含有促进伤口愈合双药的海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶，对照组为不含药物的海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶。
菌种选择：以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)代表革兰氏阳性细菌。
大鼠伤口感染模型：实验采用体重为220-250g Sprague-Dawley大鼠(购于江苏省南京市青龙山实验动物中心)，适应性饲养一周，按其体重、性别随机分为3组，每组5只：①生理盐水组(NS)；②对照组：无药海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶；③载体给药组：实施例2含有双药的海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶。大鼠用乙醚麻醉，用8％硫化钠备毛处理，并用灭菌后的温水清洗备毛区域，每只大鼠分笼饲养。24小时后，将大鼠麻醉，用75％酒精对备毛区域消毒杀菌，用手术刀切取边长为8mm的全层皮肤缺损伤口。每组大鼠伤口涂布200μL金黄色葡萄球菌(1×109CFU/mL)，10min后覆盖无菌纱布，连续三天进行涂布菌液处理。每组大鼠伤口化脓感染，创口周围红肿有脓液，大鼠精神萎靡不振，完成伤口感染造模。从第4天开始，于第4、6、8、10、12天取1mL生理盐水、1mL含有双药的海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶、1mL无药海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶涂布在感染伤口处，每两天一次，于伤后第3、5、7、9、11、13天拍照记录，采用Image J图像分析软件测定伤口的面积变化，收集数据并计算伤口愈合率。
伤口愈合率＝(原始伤口面积-第n天未愈合的伤口面积)/原始伤口面积×100％。
大鼠感染伤口愈合率变化趋势结果见图10，载体给药组大鼠的伤口愈合效率明显高于对照组和生理盐水组，感染化脓的伤口可较快愈合。
于第7天乙醚过量麻醉大鼠处死，手术刀切去伤口部分做病理检测，结果见图11。伤口愈合率结果和病理检测结果基本一致。生理盐水组创口可以观察到组织发生坏死，局部红染，大量蓝染的细胞核碎屑，结构不清；对照组淋巴细胞和浆细胞浸润；载体给药组创口可见大量成熟的纤维组织以及少量的淋巴细胞浸润。由此说明，含有促进伤口愈合双药的纤维束/多肽水凝胶体系为创口提供了合适的湿润度及透气环境，能够促进慢性创口的愈合。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 一种含有促进伤口愈合双药的纤维束/多肽水凝胶及其制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Phe Phe Lys His
1 5

Claims (10)

1.一种含有促进伤口愈合双药的纤维束/多肽水凝胶，其特征在于：它是将含有促进伤口愈合作用药物的海藻酸钠溶液通过微流控“纺织”技术制备成海藻酸钠纤维束；再将海藻酸钠纤维束与载有抗菌药的多肽预凝胶溶液复合得到水凝胶预凝胶体系，自组装形成海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶复合载药体系。
2.权利要求1所述的含有双药促进伤口愈合的纤维束/多肽水凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤(1)、采用微流控“纺织”技术，以含有促进伤口愈合药物的海藻酸钠溶液为中间相溶液，含有促海藻酸钠成胶的有机相为外相溶液，制备微纤维束，固化、干燥；
步骤(2)、将干燥后的海藻酸钠纤维束与载有抗菌药的多肽预凝胶溶液复合成水凝胶预凝胶体系；调节水凝胶预凝胶体系的pH至5.5-6.5，水凝胶预凝胶通过自组装方式成胶，形成海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶复合载药体系。
3.根据权利要求2所述的含有促进伤口愈合双药的纤维束/多肽水凝胶的制备方法，其特征在于：所述的促进伤口愈合药物为重组牛碱性成纤维细胞生长因子、重组人表皮生长因子、重组人酸性成纤维细胞生长因子、重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人血小板源生长因子中的一种或多种；所述的抗菌药为青霉素类、头孢菌类、林可胺类、四环素类、氨基糖苷类、酰胺醇类、大环类脂内中的一种或多种。
4.根据权利要求2所述的含有双药促进伤口愈合的纤维束/多肽水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的中间相溶液中海藻酸钠浓度为1wt％～3wt％；促进伤口愈合药物的浓度为0.1～10μg/mL；所述的外相溶液为浓度为3％w/v的氯化钙异丙醇溶液。
5.根据权利要求2所述的含有促进伤口愈合双药的纤维束/多肽水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的微流控“纺织”技术为：将中间相溶液、外相溶液抽入到注射器内，分别注入到微流控芯片的内外相中，控制中间相溶液的流速为30～70μL/min，外相溶液的流速为300～800μL/min，制得装载有促进伤口愈合药物的海藻酸钠纤维束。
6.根据权利要求2所述的含有双药促进伤口愈合的纤维束/多肽水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，固化所用溶剂为浓度8～10％w/v的氯化钙异丙醇溶液，固化时间为20～22小时；所述步骤(2)中，所述的载有抗菌药的多肽预凝胶溶液中抗菌药的浓度为0.05～8mg/mL，多肽的浓度为0.8～1.5wt％。
7.根据权利要求2或6所述的含有双药促进伤口愈合的纤维束/多肽水凝胶的制备方法，其特征在于：多肽为以Nap为头基、Gly-Phe-Phe为主链的多肽分子。
8.根据权利要求7所述的含有双药促进伤口愈合的纤维束/多肽水凝胶的制备方法，其特征在于：多肽通过固相合成方法制备得到，包括：
(1)、将2-氯三苯甲基氯树脂至于固相合成管中，清洗树脂后加入Fmoc-His-Trt，在N,N-二异丙基乙胺催化下反应使组氨酸C端和树脂链接；清洗树脂使未反应的氨基酸无残留；
(2)、加入封闭液封闭树脂，封闭树脂后，清洗树脂；加入脱保护液脱Fmoc保护基，清洗树脂；其中，所述的封闭液为二氯甲烷:甲醇:N,N-二异丙基乙胺＝80:15:5V/V/V；所述的脱保护液为20％V/V的哌啶/N,N-二甲基甲酰胺；
(3)、取Fmoc-Lys-OH，DMF溶解后与步骤(2)得到的树脂混合，在TBTU、HOBT和N,N-二异丙基乙胺催化下进行反应，反应结束后按照步骤(2)处理；
(4)、取Fmoc-Phe-OH，DMF溶解后与步骤(3)得到的树脂混合，在TBTU、HOBT和N,N-二异丙基乙胺催化下进行反应，反应结束后按照步骤(2)处理；
(5)、取Fmoc-Phe-OH，DMF溶解后与步骤(4)得到的树脂混合，在TBTU、HOBT和N,N-二异丙基乙胺催化下进行反应，反应结束后按照步骤(2)处理；
(6)、取Fmoc-Gly-OH，DMF溶解后与步骤(5)得到的树脂混合，在TBTU、HOBT和N,N-二异丙基乙胺催化下进行反应，反应结束后按照步骤(2)处理；
(7)、取2-萘乙酸，DMF溶解后与步骤(6)得到的树脂混合，在TBTU、HOBT和N,N-二异丙基乙胺催化下进行反应，反应结束后依次用DMF、DCM清洗树脂，得到接有多肽分子的树脂；
(8)、步骤(7)得到树脂与三氟乙酸混合，室温反应1.5-2h，除去树脂，得到含有多肽的反应液，除去溶剂得到固体；
(9)、往步骤(8)得到的固体中加入冰乙醚进行沉淀，2000-3000rpm/min低速离心5-10min，弃去上层乙醚，重复多次除去样品中的三氟乙酸；得到的多肽样品挥干乙醚后加入超纯水分散样品，-20℃预冻至样品溶液完全冻住；预冻后的样品冷冻干燥24-48h，即得以Nap为头基、Gly-Phe-Phe-Lys-His为主链的多肽粉末。
9.根据权利要求3所述的含有双药促进伤口愈合的纤维束/多肽水凝胶的制备方法，其特征在于：所述的载有抗菌药的快速自组装多肽水凝胶预凝胶体系与中间相溶液的体积比为1～5:1，优选为3～5:1。
10.权利要求1所述的含有促进伤口愈合双药的海藻酸钠纤维束/多肽水凝胶在制备治疗慢性伤口药物中的应用。
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