CN109415430A

CN109415430A - 单体蛋白及其用途

Info

Publication number: CN109415430A
Application number: CN201780042387.9A
Authority: CN
Inventors: 理查德·普利斯; 帕特丽夏·布伦德尔
Original assignee: Liverpool School of Tropical Medicine
Current assignee: Liverpool School of Tropical Medicine
Priority date: 2016-05-06
Filing date: 2017-04-28
Publication date: 2019-03-01
Also published as: US20190151446A1; GB201607979D0; AU2017259198B2; WO2017191439A1; AU2017259198A1; US11090382B2; EP3452501A1

Abstract

提供了包含两条嵌合多肽链的蛋白，其中每条嵌合多肽链包含Fc受体结合部分和免疫球蛋白尾片段区，所述Fc受体结合部分包含两个免疫球蛋白G重链恒定区。与野生型免疫球蛋白的序列和糖基化相比，所述蛋白尾片段区的氨基酸序列和糖基化被修改以抑制蛋白的聚合。氨基酸序列的修改可以是丢失半胱氨酸残基，例如对应于SEQ ID NO:1的残基248的半胱氨酸残基。所述蛋白可以用于静脉注射免疫球蛋白(IVIG)或皮下注射免疫球蛋白(SCIG)疗法。所述蛋白可以用于预防或治疗通过唾液酸依赖性受体结合介导的疾病。本发明的蛋白可以用于预防和/或治疗自身免疫性疾病或炎性疾病。所述蛋白可以与免疫调节剂缀合，并且在此类情况下适合于疫苗使用。

Description

单体蛋白及其用途

发明领域

本发明涉及蛋白和包含该蛋白的组合物。本发明还涉及该蛋白和组合物的医学用途。特别地，本发明的蛋白或组合物可以用于预防或治疗自身免疫性疾病或炎性疾病、或用于预防或治疗通过结合唾液酸依赖性受体介导的疾病、或作为疫苗。本发明还涉及使用该蛋白预防或治疗自身免疫性疾病或炎性疾病或通过结合唾液酸依赖性受体介导的疾病的方法。本发明还涉及编码蛋白的核酸，以及制造蛋白的方法。

背景

自身免疫性疾病(AD)是常见的，并且单独地影响5000万美国公民。静脉注射免疫球蛋白(IVIG)治疗涉及施用纯化的免疫球蛋白G，并且是AD 最常见治疗方案中的一种，其被食品与药品管理局(Food and Drug Administration)(FDA)批准用于各种各样的疾病，如特发性血小板减少症 (ITP)、川崎氏病(Kawasaki disease)、格林-巴利病(Guillain-Barré)、皮肌炎和慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病。

由于70％的全球IVIG供应(2012年价值50亿美元)现在被用于治疗 AD，因此对于最需要IVIG的患者来说，特别是具有原发性免疫缺陷的个体(其中IVIG被用作替代疗法)，IVIG变得越来越不可得。

自1980年以来，全球IVIG消费增加300多倍，并且目前每年消费100 吨。NHS和全球范围内的IVIG供应受到严重限制，这意味着迫切需要药物的患者经常失去药物。由于IVIG依赖于人类捐赠者来制造，以及由于这一事实：在用于特发性血小板减少性紫癜(ITP)时，<5％的注射的IVIG(正确糖基化和/或低聚-Fc)是有治疗活性的，导致需要高剂量(2g/kg)，因此也存在显著的临床缺陷。结果是，IVIG昂贵并且由于过量的蛋白载量而引起的不良事件并不少见。

尽管IgG与自身免疫性疾病相关的一些效应机制可能是F(ab′)2介导的，例如经由抗独特型相互作用阻断/中和受体、细胞因子、过敏毒素和致病性自身抗体，但许多抗炎功能被认为是由Fc部分介导的。这些抗炎功能包括FcRn饱和、FcγR表达的阻断和调节，树突细胞、B细胞和调节性T细胞功能的调节以及补体成分的阻断/清除。IVIG通过占用低亲和力抑制性受体并且通过在体内注射时形成免疫复合物(IC)和/或二聚体(其允许IVIG 以更大强度(亲合力)与这些受体相互作用)来抑制有害炎症，从而介导更有效的抗炎作用。

以上提及的问题已经引起产生人工药剂的许多尝试，该人工药剂能够大规模表达，其可以在诸如IVIG的疗法中用作人类IgG的替代物，用于在治疗自身免疫性和炎性疾病中使用。

迄今已经描述的此类人工药剂的实例包括由Momenta制造的“SIF” (Fc受体的选择性免疫调节剂)诸如SIF-3、由Pfizer制造的“stradomers”、和由本发明人生产的基于免疫球蛋白杂合蛋白“hexa-Fc”。以这种方式产生的每个分子都已经被设计为有利于形成掺入多于一个(multiple)Fc受体结合结构域的低聚结构。采取这种方法是为了增加人工药剂在它们被施用至的受试者中结合的亲合力。

细胞携带其结合依赖于包含唾液酸的聚糖的多种受体。此类唾液酸依赖性受体的实例包括SIGLEC-1和SIGLEC-2。已知，一系列疾病通过与这些唾液酸依赖性受体结合被介导。例如，许多致病原(infectious agent)(诸如逆转录病毒)与细胞结合，并且从而通过与细胞的唾液酸依赖性受体结合引起其相关的感染。

发明概述

在第一实施方案中，本发明提供了一种蛋白，所述蛋白包含两条嵌合多肽链；其中每条嵌合多肽链包含Fc受体结合部分和免疫球蛋白尾片段区，所述Fc受体结合部分包含两个免疫球蛋白G重链恒定区；

其中与野生型免疫球蛋白的序列和糖基化相比，尾片段区的氨基酸序列和糖基化被修改以抑制蛋白的聚合。

合适地，本发明的蛋白在对应于SEQ ID NO:1的残基89(这继而对应于人类IgG的残基309)的残基处包含半胱氨酸。

在第二实施方案中，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含根据本发明的第一方面的蛋白，其中被掺入组合物中的至少95％的本发明的第一方面的蛋白呈单体形式。

如在本发明的上下文中使用的术语“单体的”在本公开内容中其他地方被更具体地考虑。

在第三方面，本发明提供了根据本发明的第一方面的蛋白，其用于作为药物使用。在本发明的第三方面的用于使用的蛋白可以以根据本发明的第二方面的组合物的形式提供。

本发明的蛋白或组合物可以用作预防和/或治疗自身免疫性疾病或炎性疾病中的药物。此类疾病的合适实例在说明书中其他地方被考虑。

可选地，本发明的蛋白或组合物可以用作预防和/或治疗通过结合唾液酸依赖性受体介导的疾病中的药物。在实施方案中，受体可以选自由以下组成的组：SIGLEC-1和SIGLEC-2。如在说明书中其他地方所考虑的，此类疾病的合适实例包括逆转录病毒感染。

在第四方面，本发明提供了一种预防或治疗自身免疫性疾病或炎性疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的根据本发明的第一方面的蛋白提供给需要此类预防或治疗的受试者。受试者可以是人类受试者。

在第五方面，本发明提供了一种预防或治疗通过结合唾液酸依赖性受体介导的疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的根据本发明的第一方面的蛋白提供给需要此类预防或治疗的受试者。合适地，受试者是人类。在实施方案中，受体可以选自由以下组成的组：SIGLEC-1和SIGLEC-2。疾病可以是感染或自身免疫性疾病。疾病可以是逆转录病毒感染。本发明还提供了对应的医学用途。

本发明的第三、第四或第五方面的医学用途或治疗方法可以在静脉注射免疫球蛋白(IVIG)或皮下注射免疫球蛋白(SCIG)疗法中采用本发明的蛋白。

在第六方面，本发明提供了一种核酸，所述核酸编码根据本发明的第一方面的蛋白。

在第七方面，本发明提供了一种产生根据本发明的第一方面的蛋白的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达根据本发明的第六方面的核酸。

具体实施方式

本发明基于本发明人的惊人发现：在生理条件下保持单体的本发明蛋白适合于在治疗应用，诸如IVIG和/或SCIG中使用。这完全违背本领域技术人员的预期，因为人们普遍认为，为了增加所产生的用于在IVIG和/ 或SCIG中使用的人工药剂的有效性，产生低聚或多聚Fc受体结合分子是期望的。

分子与聚糖受体，特别是树突细胞特异性细胞间粘附分子-3抓获非整联蛋白(DC-SIGN)结合的能力与IVIG或SCIG中的治疗效用相关。先前已经发现，少于5％的天然单体IgG分子以允许它们与DC-SIGN相互作用的方式被正确糖基化，从而使得这些分子不适合于治疗目的。

低聚或多聚Fc受体结合分子对DC-SIGN具有增加的亲合力，这在其与该受体结合的能力方面是有利的。然而，先前在现有技术中描述的低聚或多聚Fc受体结合分子已经显示出激活补体级联反应。由于不良后果诸如过敏性休克的风险，这是潜在治疗分子的显著缺点。

本发明人已经发现，本发明的蛋白的尾片段区的氨基酸序列和糖基化的修改产生以允许本发明的蛋白与DC-SIGN和唾液酸依赖性受体诸如 SIGLEC-1结合的方式被糖基化的单体蛋白，并且从而在IVIG或SCIG中发挥治疗效用。此外，出乎意料地，本发明的蛋白不导致补体级联反应的激活。

与本发明的蛋白源自的野生型免疫球蛋白中存在的序列和糖基化相比，本发明的蛋白的特征在于尾片段区的氨基酸序列和糖基化的修改，并且这些抑制本发明的杂合蛋白的聚合。

合适地，氨基酸序列的修改是半胱氨酸残基的丢失。合适地，修改可以是与野生型序列相比单个半胱氨酸残基的丢失。可选地，丢失可以是与野生型序列相比多于一个半胱氨酸残基的丢失。

丢失可以包括对应于SEQ ID NO:1的残基248的半胱氨酸的丢失。在合适的实施方案中，本发明的蛋白也可以具有对应于SEQ ID NO:1的残基 89的半胱氨酸残基的丢失。

与野生型免疫球蛋白尾片段(诸如IgM尾片段)或SEQ ID NO:1蛋白的序列相比，一个或更多个半胱氨酸残基可以通过它们的取代或缺失而被丢失。在取代的合适的实施方案中，半胱氨酸残基，诸如对应于SEQ ID NO:1 的残基248的半胱氨酸残基，被不同的氨基酸替代。半胱氨酸残基可以被任何氨基酸残基(例如丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸残基)替代。合适地，半胱氨酸残基，诸如对应于SEQID NO:1的残基248的半胱氨酸残基，被丙氨酸残基替代。

如以上提及的，本发明的蛋白还掺入抑制其聚合的尾片段区的糖基化的修改。本发明人已经发现，与本发明的蛋白(如由SEQ ID NO:2所例示) 的糖基化位点附接的聚糖比相关对照蛋白(诸如SEQ ID NO:1的蛋白)上的聚糖大。

在合适的实施方案中，本发明的蛋白还可以包含对抑制其聚合的免疫球蛋白G来源的序列(诸如免疫球蛋白G重链恒定区Cγ2)的糖基化的修改。此类糖基化可以存在于例如对应于SEQ ID NO:2的N77的残基处。掺入此类修改的本发明的蛋白在需要和使用结合唾液酸依赖性受体的能力的应用中可能是特别有用的。

合适地，本发明的蛋白的免疫球蛋白G来源的序列可以包含人工糖基化位点。此类人工糖基化位点可以包括在对应于SEQ ID NO:1的残基 D1(又对应于人类IgG的D221)的残基处的取代。合适地，此类人工糖基化可以通过天冬氨酸到天冬酰胺的取代(例如SEQ IDNO:1中的D1N取代，对应于人类IgG的D221N取代)获得。包含此类修饰的本发明的蛋白的实例示于SEQ ID NO:17中，除了用N取代残基D1之外，SEQ ID NO:17对应于SEQ ID NO:2。SEQID NO:17的蛋白是本发明的蛋白的特别有用的实例。它代表了高度适于医学用途和方法的实施方案，在该实施方案中，期望本发明的蛋白与唾液酸依赖性受体结合(例如以预防或治疗通过结合唾液酸依赖性受体介导的疾病)。

应当理解，人工糖基化构成为抑制本发明的蛋白的聚合而对其氨基酸序列和糖基化的进一步修改。

不希望受任何假设的束缚，本发明人相信，半胱氨酸残基的丢失(否则将能够在蛋白单体之间形成二硫键桥)与在单体内存在的糖基化位点处添加更大聚糖的能力的组合极大地抑制本发明的蛋白的聚合。如本发明其他地方讨论的，这些变化足以将以聚合物形式存在的蛋白比例从大于80％降低至少于1％。这种减少的显著程度在本说明书中首次公开的结果之前是不可预测的。

由于本发明的蛋白的聚合通过尾片段的氨基酸序列和糖基化的修改的组合影响而被抑制，因此这些单独的修饰中的每一种都可以相对最小，同时仍然实现对聚合的总体水平的明显抑制。以这种方式利用与野生型序列的最小偏离的能力降低本发明的蛋白在它们被施用至的受试者中诱导不良免疫原性应答的可能性，并且这提供了本发明的蛋白的另外的显著优点。

所观察到的糖基化修饰的另外的优点是，存在的更大且更复杂的聚糖更可能终止于唾液酸(神经氨酸)中。已知以这种方式终止的聚糖与 DC-SIGN相互作用，并且对于本发明的蛋白，观察到增强的与DC-SIGN 和SIGLEC-1的结合。

另外地，本发明人已经发现引入人工糖基化位点能够产生具有比不具有此类人工糖基化位点的蛋白更大的唾液酸化的蛋白，并且从而可以产生用于在唾液酸依赖性疗法中使用的具有更大效力的蛋白。

鉴于以上，还应当理解，特别是在SEQ ID NO:2的残基1处(诸如在 SEQ ID NO:17的蛋白中)的人工糖基化位点的存在，可以允许本发明的蛋白与包括SIGLEC-1(也称为唾液酸粘附素)的唾液酸依赖性受体以及 DC-SIGN结合。

因此，此类蛋白可能在其中与唾液酸依赖性受体诸如SIGLEC-1结合可能是期望的许多疾病中具有治疗作用。例如，本发明的蛋白可以用作其中竞争其他分子与唾液酸依赖性受体诸如SIGLEC-1的结合并从而抑制或阻止其他分子与唾液酸依赖性受体诸如SIGLEC-1的结合是期望的疾病的药物。仅仅举例来说，本发明的蛋白与唾液酸依赖性受体诸如SIGLEC-1 的结合可能在抑制逆转录病毒与这些受体结合方面具有治疗作用，从而预防或治疗逆转录病毒感染(诸如HIV或T细胞白血病病毒感染)。

在人工糖基化位点处另外的聚糖的存在也可以赋予另外的优点，因为它可以增加蛋白的稳定性。目前，为了增加免疫球蛋白的稳定性，免疫球蛋白通常经化学方法被糖基化，例如通过体外酶促或非酶促反应。然而，人工糖基化位点的存在允许通过表达蛋白的细胞引入此类修饰，并且从而可以消除对该另外的化学糖基化步骤的需要。结果是，与在IVIG治疗中使用的传统药剂相比，本发明的蛋白可以以更具成本和时间效益的方式产生。

现在将在以下段落中进一步描述本发明的各个方面和实施方案。

本发明的示例性蛋白

本发明的蛋白的实例以SEQ ID NO:2列出。本发明的另外的示例性蛋白以SEQ IDNO:17列出。本发明的蛋白可以包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:17。在合适的实施方案中，本发明的蛋白可以由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:17组成。

SEQ ID NO:2的嵌合多肽包含人类IgG1的残基221至447(对应于SEQ ID NO:2的残基1至227)与基于并且修改自人类IgM的尾片段的558至 576(对应于SEQ ID NO:2的残基232至249)的残基的组合。野生型免疫球蛋白尾片段序列在SEQ ID NO:2中被修改以抑制本发明的蛋白的聚合。

除了SEQ ID NO:17的残基1处存在D至N取代之外，SEQ ID NO:17 直接对应于SEQID NO:2。如以上讨论的，该取代在SEQ ID NO:17的蛋白中引入新的糖基化位点。

应当理解在嵌合多肽中，由于不存在完整的IgG或IgM序列，基于全长IgG或IgM分子的残基的编号不再是有用的。因此，我们也将在本公开内容中提及参考嵌合蛋白序列，其被列出为SEQ ID NO:1。该序列代表单条嵌合多肽链。当提及该序列时，全长IgM序列的Cys575被重新编号为融合蛋白的Cys248(SEQ ID NO:1的第248个残基)。

为了避免疑问，由具有SEQ ID NO:1中列出的序列的嵌合蛋白链组成的蛋白将不构成本发明的蛋白，因为它将不掺入抑制聚合的必要修改。

本发明人出乎意料地发现，SEQ ID NO:2可以编码两种不同尺寸，特别是～53kDa和～58kDa的单体蛋白。不希望受任何假设的束缚，本发明人相信，在SEQ ID NO:2的免疫球蛋白G重链恒定区(诸如Cγ2结构域)中的残基N77(对应于人类IgG1的N297)处和SEQ IDNO:2的免疫球蛋白尾片段中的N236(对应于人类IgM的N563)处的差异糖基化产生两种尺寸的单体蛋白。

除了Fc受体结合部分和尾片段区之外，本发明的蛋白还可以包含铰链区和/或间隔区(spacer region)。

在合适的实施方案中，本发明的蛋白可以与治疗有效载荷(therapeuticpayload)缀合。合适的治疗有效载荷在本说明书的其他地方描述。合适地，有效载荷可以与本发明的蛋白的Fc受体结合部分缀合。可选地，有效载荷可以与本发明的蛋白的铰链区缀合。

在合适的实施方案中，铰链区可以位于Fc受体结合部分的N-末端处。铰链区可以是天然或合成的铰链区。

在合适的实施方案中，铰链区是天然的。天然铰链区是抗体的Fc和 Fab部分之间天然存在的铰链区。天然铰链区与Fc受体结合部分可以源自相同的物种。可选地，天然铰链区可以源自不同的物种。

在合适的实施方案中，天然铰链区与Fc受体结合部分可以源自相同类别或亚类的抗体。可选地，天然铰链区与Fc受体结合部分可以源自不同类别或亚类的抗体。

在合适的实施方案中，铰链区源自IgG1。更合适地，铰链区可以源自人类IgG1。举例来说，在根据SEQ ID NO:2的本发明的蛋白中，包含源自人类的铰链区。

在合适的实施方案中，铰链区的N-末端可以以便于抑制本发明的蛋白聚合的方式被糖基化。合适地，糖基化可以在对应于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的残基1的位置处(如由SEQ ID NO:17的蛋白所例示的)。铰链区的糖基化可能是有益的，因为它可以导致暴露的聚糖，这可以改进本发明的蛋白的功能。举例来说，并且如本说明书的实施例部分进一步解释的，铰链区的糖基化可以减少蛋白与Fc-γ受体的相互作用，同时增加与唾液酸依赖性受体诸如SIGLEC-1的相互作用。

在另一个实施方案中，铰链区是合成的。合成的铰链区是在长度或序列上与天然存在的铰链区不同的铰链区。举例来说，合成铰链区和天然铰链区之间的长度的差异可以是合成铰链区中残基的添加或缺失(例如半胱氨酸残基的添加或缺失)的结果。合成铰链区和天然铰链区之间的序列的差异可以是合成铰链区中一个或更多个残基的取代(例如半胱氨酸残基被另一个残基诸如丝氨酸或丙氨酸取代)的结果。

在合适的实施方案中，铰链区可以是至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十五个、至少二十个、至少二十五个、至少三十个或更多个氨基酸残基的长度。

举例来说而非限制地，本发明的蛋白可以包含铰链区，其中铰链区具有选自由以下组成的组的序列：VPSTPPTPSPSTPPTPSPS(SEQ ID NO:8)、 VPPPPP(SEQ ID NO:9)、EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:10)、 ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:11)、ESKYGPPCPSCP(SEQ IDNO:12)、 CPPC(SEQ ID NO:13)、CPSC(SEQ ID NO:14)、和SPPC(SEQ ID NO:15)。其他合适的天然和合成的铰链对于本领域技术人员来说是已知的。

铰链区的存在在本发明的蛋白与治疗有效载荷缀合的实施方案中可能是特别期望的。应当理解，此类铰链区可以增加Fc受体结合部分和治疗有效载荷(如果存在的话)之间的距离。当治疗有效载荷与本发明的蛋白缀合时，增加Fc受体结合部分和治疗有效载荷之间的距离可能是期望的以便为聚糖分子与糖基化位点的附接提供足够的空间。合适地，铰链区为聚糖分子与人工糖基化位点的附接提供空间(例如在SEQ ID NO:1的残基1 处，如SEQ ID NO:17中存在的)。

还应当理解，铰链区的存在对于本发明的蛋白中的另外的N-连接的糖基化位点的插入和/或附接可能是期望的。

如以上所涉及，本发明的蛋白可以包含间隔区。合适地，间隔区可以在Fc受体结合部分和尾片段区之间。

合适的间隔区可以是至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、或更多个氨基酸残基的长度。更合适地，间隔区可以是四个氨基酸残基长。在如由SEQ ID NO:2列出的本发明的示例性蛋白中，间隔区可以存在于残基 228至231处。

合适地，间隔区可以具有序列LVLG(SEQ ID NO:16)。

间隔区的存在可以改善尾片段碳水化合物的布置(例如，如果本发明如以SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2所列出，则对应于蛋白的氨基酸残基 N236)，并且从而改进与聚糖受体的相互作用，而不损害通过Fc恒定结构域介导的相互作用。

抑制聚合的尾片段氨基酸序列的修改

用于掺入本发明的蛋白中的免疫球蛋白尾片段可以基于任何免疫球蛋白分子。合适地，尾片段可以基于选自由以下组成的组的免疫球蛋白的尾片段：IgM、IgA、和IgE。

基于IgM的尾片段的尾片段特别适合于掺入本发明的蛋白中。本文参考IgM尾片段(其被掺入SEQ ID NO:1的参考蛋白、以及SEQ ID NO:2或 SEQ ID NO:17的本发明的示例性蛋白中)描述示例性修改。应当理解，其他免疫球蛋白的尾片段可以在对应于关于IgM例示的残基的残基处修改。此外，源自除了IgM之外的免疫球蛋白的尾片段可以以与如关于IgM描述的相同方式被修改。

适合于掺入本发明的蛋白中的尾片段可以与天然免疫球蛋白尾片段，诸如IgM尾片段，共有至少55％的同一性，只要它们包含相关修改即可。事实上，合适的尾片段，只要被合适地修改，可以与天然免疫球蛋白尾片段的对应部分的序列共有至少55％、至少65％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多的同一性。

特别地，适合于掺入本发明的蛋白中的尾片段可以与SEQ ID NO:2的 IgM来源序列(即SEQ ID NO:2的氨基酸残基232-249)共有至少55％的同一性，只要它们包含SEQ IDNO:2存在的修改即可。合适地，用于掺入本发明的蛋白中的尾片段可以与SEQ ID NO:2的残基232-249共有至少55％、至少65％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多的同一性。

为了避免疑问，包含免疫球蛋白尾片段(诸如IgM尾片段)的野生型氨基酸序列的蛋白(不含任何改变，无论是通过取代还是缺失)将不构成本发明的蛋白。

抑制聚合的尾片段糖基化的修改

本发明的蛋白在尾片段内必须包含至少一个糖基化位点，并且可以包含两个或更多个糖基化位点。这些可以是由天然免疫球蛋白尾片段序列保留的天然存在的糖基化位点。可选地，本发明的蛋白可以在尾片段区中包含人工引入的糖基化位点，或者包含天然存在的位点和人工位点的组合。本发明人已经发现，当糖基化位点不存在时(诸如在SEQ IDNO:4的对照蛋白中)，聚合的抑制被大大减少，并且因此多聚物形成增加。

为了本公开内容的目的，其中免疫球蛋白尾片段诸如IgM尾片段的糖基化与关于野生型尾片段观察到的糖基化相比未被改变的蛋白将不构成本发明的蛋白。

抑制聚合的铰链区氨基酸序列的修改

用于掺入本发明的蛋白中的铰链区可以基于任何免疫球蛋白分子。合适地，铰链区基于选自由以下组成的组的免疫球蛋白的铰链区：IgG、IgA、 IgE、IgD和IgM。更合适地，IgG免疫球蛋白的铰链区可以选自由以下组成的组：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。

基于免疫球蛋白IgG1的铰链区的铰链区特别适合于掺入本发明的蛋白中。本文参考IgG1铰链区(其被掺入SEQ ID NO:1的参考蛋白、以及SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:17的本发明的示例性蛋白中)描述铰链区的示例性修改。

应当理解，其他IgG免疫球蛋白的铰链区可以在对应于关于IgG1例示的残基的残基处被修改。此外，源自除了IgG之外的免疫球蛋白的铰链区可以以与如关于IgG1描述的相同方式被修改。

适合于掺入本发明的蛋白中的铰链区可以与天然免疫球蛋白铰链区，诸如IgG铰链区，共有至少55％的同一性，只要它们包含相关修改即可。事实上，合适的铰链区，只要被合适地修改，可以与天然铰链区的对应部分的序列共有至少55％、至少65％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多的同一性。

特别地，适合于掺入本发明的蛋白中的铰链区可以与SEQ ID NO:2的 IgG铰链区来源序列共有至少55％的同一性，只要它们包含SEQ ID NO:2 中发现的修改即可。合适地，用于掺入本发明的蛋白中的铰链区可以与 SEQ ID NO:2的铰链区的残基共有至少55％、至少65％、至少75％、至少 80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多的同一性。

抑制聚合的铰链区糖基化的修改

本发明的蛋白可以在铰链区内包含糖基化位点。糖基化位点可以是由天然免疫球蛋白铰链区序列保留的天然存在的糖基化位点。可选地，本发明的蛋白可以在铰链区中包含人工引入的糖基化位点，或者包含天然存在的位点和人工位点的组合。本发明人已经发现，当糖基化位点不存在时(诸如在SEQ ID NO:4的对照蛋白中)，聚合的抑制被大大降低，并且因此多聚物形成会增加。

本发明的蛋白的聚合的抑制

在本发明的蛋白中，当分别与对应野生型尾片段(诸如IgM尾片段)和天然铰链区的序列和糖基化相比时，尾片段区和任选铰链区的氨基酸序列和糖基化被修改，以抑制蛋白的聚合。此类蛋白的聚合的抑制可以通过以聚合形式存在的蛋白的比例的降低或者以单体形式存在的蛋白的比例的增加来证明。这可以参考在适当的对照蛋白中发现的聚合蛋白或单体蛋白的比例来评价。此类适当的对照蛋白可以包含野生型尾片段，例如IgM尾片段，并且任选地，可以包含天然铰链区。

在缺乏本发明的蛋白(如由SEQ ID NO:2所例示)的修改的对照蛋白 (SEQ ID NO:1)中，单体占总蛋白的少于20％。相比之下，本发明人已经发现，在生理条件下，多于90％的本发明的蛋白(诸如SEQ ID NO:2)以单体形式存在。

因此，就蛋白，诸如由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:17所例示的本发明的蛋白(其中与野生型序列相比，尾片段区和铰链区的氨基酸序列和糖基化被修改)而言，如果在生理条件下90％或更多的蛋白以单体形式存在，那么该修改可以被证明是抑制聚合的修改。事实上，在合适的实施方案中，聚合的抑制可以导致95％或更多的蛋白以单体形式存在，例如96％或更多、 97％或更多、98％或更多、或者甚至99％或更多。在合适的实施方案中，聚合的抑制可导致基本上所有本发明的蛋白在生理条件下以单体形式存在。

在本说明书中后面的实施例部分描述了藉以可以确定样品中聚合蛋白或单体蛋白的比例的合适方法。简而言之，这些方法包括尺寸排阻层析和SDS-PAGE丙烯酰胺梯度凝胶。

适合于在本发明的蛋白中使用的IgG序列

本发明的蛋白掺入两个免疫球蛋白G重链恒定区。在合适的实施方案中，本发明的单体蛋白中采用的免疫球蛋白G重链恒定区源自选自由以下组成的组的免疫球蛋白：IgG1；IgG2；IgG3；和IgG4。特别地，免疫球蛋白G重链恒定区可以源自IgG1。

应当理解，只要免疫球蛋白G重链恒定区满足形成Fc受体结合部分的要求，本发明的蛋白中利用的免疫球蛋白G重链恒定区可以在它们的序列中包含与它们源自的天然序列相比的改变。仅仅举例来说，本发明的合适蛋白可以利用IgG来源的序列，所述IgG来源的序列与它们源自的相关天然IgG序列共有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。

本发明的蛋白的单体

为了避免疑问，在本公开内容的上下文中，提及本发明的蛋白的“单体”意图覆盖由彼此缔合的两个嵌合多肽链构成的分子。合适地，两条嵌合多肽链可以通过SEQ ID NO:1的残基Cys226和Cys229之间形成的分子间二硫键(inter-disulphide bond)连接。

因此可见，为了本发明的目的，“三聚体”将由如以上所提及的三个“单体”—总计六条嵌合多肽链构成。“六聚体”将由六个单体，并且因此总计十二条嵌合多肽链组成。

本发明的组合物和药物组合物

本发明的第二方面提供了一种组合物，所述组合物包含根据本发明的第一方面的蛋白。在此类组合物中，掺入组合物中的至少95％的本发明的第一方面的蛋白呈单体形式。

合适地，本发明的第二方面的组合物可以是药物组合物，其中蛋白通过药学上可接受的载体提供。

在本发明的组合物的合适的实施方案中，无论是药物组合物还是其他，掺入组合物中的至少96％或至少97％的本发明的第一方面的蛋白呈单体形式。事实上，在合适的实施方案中，掺入组合物中的至少98％或至少99％的本发明的第一方面的蛋白呈单体形式。合适地，基本上掺入此类组合物中的所有本发明的第一方面的蛋白可以呈单体形式。

本发明的蛋白的医学用途

本发明的蛋白，例如以本发明的组合物提供的蛋白，可以用作药物。

例如，本发明的蛋白可以用作IVIG或SCIG中的药物。蛋白和组合物的此类医学用途在预防或治疗自身免疫性疾病或炎性疾病中特别有用。本发明的蛋白以这种方式的医学用途可以是有效的，不管它们是否与治疗有效载荷缀合。

本发明的蛋白可以用作用于预防或治疗通过唾液酸依赖性受体结合介导的疾病的药物。

如本说明书中其他地方提及的，本发明的蛋白，特别是在SEQ ID NO:2 或SEQ IDNO:17的残基1处包含人工糖基化位点的蛋白，具有结合唾液酸依赖性受体诸如SIGLEC-1、并且从而防止其他分子与该受体结合的能力。本发明人相信蛋白结合SIGLEC-1和其他唾液酸依赖性受体的能力是它们更大的唾液酸化的结果。

因此，本发明的蛋白可以用作其中防止其他分子与唾液酸依赖性受体结合可能具有治疗作用的疾病的药物。仅仅举例来说，防止与SIGLEC-1 结合可以对逆转录病毒感染(诸如HIV或T细胞白血病病毒感染)或其中致病原经由SIGLEC-1结合的其他状况具有治疗作用。因此，本发明的蛋白，并且特别是包含对应于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:17的残基1处存在的人工糖基化位点的人工糖基化位点的蛋白，可以用于预防或治疗感染。合适地，本发明的蛋白可以在预防或治疗逆转录病毒感染中使用。

包含SEQ ID NO:17或由SEQ ID NO:17组成的本发明的蛋白特别适合于以上描述医学用途。

可能受益于通过本发明的蛋白的医学用途而被预防或治疗的此类疾病的其他合适实例在下面被考虑。

如本说明书中其他地方提及的，本发明的蛋白可以与治疗有效载荷缀合。如本文使用的术语“治疗有效载荷”指本身具有治疗作用的化合物。治疗有效载荷的治疗作用可以是对本发明的蛋白的治疗作用的增加，或者独立于本发明的蛋白的治疗作用。

本发明的蛋白的另外医学用途可以参考与此类蛋白缀合的治疗有效载荷来选择。合适的治疗有效载荷可以选自由以下组成的组：免疫调节剂、药物、蛋白、碳水化合物和核酸。

合适的免疫调节剂可以上调或下调免疫系统的成分。

与上调免疫系统的成分的免疫调节剂缀合的本发明的蛋白可以用作疫苗。举例来说，可以用作疫苗的免疫调节剂可以是病原体相关的分子模式(PAMP)分子或抗原。因此，本发明提供了本发明的蛋白作为疫苗的使用。

与下调免疫系统的成分的免疫调节剂缀合的本发明的蛋白可以用作自身免疫性疾病例如类风湿性关节炎的药物。

下调免疫系统的成分的此类免疫调节剂的实例是促红细胞生成素。因此，应当理解，在合适的实施方案中，促红细胞生成素可以与本发明的蛋白缀合。此类缀合的蛋白可以用于预防或治疗自身免疫性疾病。

如本文使用的术语“药物(drug)”指具有治疗活性的化合物，例如小分子，其可以与本发明的蛋白缀合。仅仅举例来说，合适的药品治疗有效载荷可以是一种，诸如单甲基澳瑞他汀E，其可以用于治疗癌症。合适地，药物，诸如单甲基澳瑞他汀E，可以另外与抗体缀合。因此，本发明的蛋白可以与抗癌药物，诸如单甲基澳瑞他汀E缀合。此类缀合的蛋白可以用于预防或治疗癌症。

仅仅举例来说，用于与本发明的蛋白缀合的合适的蛋白治疗有效载荷可以是细胞因子受体。细胞因子受体可以用于抑制引起疾病的细胞因子，例如通过结合此类引起疾病的细胞因子，并且从而防止它们与细胞结合而致病。

待与本发明的蛋白缀合的合适碳水化合物有效载荷可以是例如透明质酸。

待与本发明的蛋白缀合的合适的核酸有效载荷可以是例如未甲基化的CpG低聚脱氧核苷酸。以这种方式缀合的本发明的蛋白适合于作为免疫刺激剂的医学用途。

使用本发明的蛋白的治疗方法

本发明的蛋白，例如以本发明的组合物提供的本发明的蛋白，可以用作药物。蛋白可以与治疗有效载荷缀合。可选地，蛋白可以不与治疗有效载荷缀合。

蛋白及其组合物的此类医学用途在预防或治疗自身免疫性疾病或炎性疾病中特别有用，无论蛋白是否与治疗有效载荷缀合。

另外地，如已经提及的，本发明人已经出乎意料地发现本发明的蛋白，特别是在SEQ ID NO:2的残基1处包含人工糖基化位点的蛋白(诸如SEQ ID NO:17的蛋白)具有结合唾液酸依赖性受体，例如SIGLEC-1受体的能力。因此，该蛋白可以防止其他分子与该受体结合，或者可以用于触发此类受体以获得治疗作用。

因此，未与治疗有效载荷缀合的本发明的蛋白可以特别用于预防或治疗其中防止其他分子与SIGLEC-1结合可能具有治疗作用的疾病。仅仅举例来说，防止与唾液酸依赖性受体诸如SIGLEC-1结合在预防或治疗感染诸如逆转录病毒感染(诸如人类免疫缺陷病毒或T细胞白血病病毒感染)中可以具有治疗作用。

可以受益于通过本发明的蛋白的医学用途而被预防或治疗的此类疾病的其他合适实例在下面被考虑。

可以通过任何技术向受试者提供本发明的蛋白，通过该技术，受试者将最终接受治疗有效量的本发明的蛋白。

因此，在合适的实施方案中，可以向受试者直接提供本发明的蛋白。在此类实施方案中，例如，可以向受试者提供包含呈单体形式的本发明的蛋白的本发明的组合物。

在另一个实施方案中，可以向受试者间接提供单体蛋白。举例来说，在此类实施方案中，可以将根据本发明的第六方面的核酸(编码本发明的蛋白的核酸)施用至受试者，而治疗有效量的本发明的蛋白通过表达产生该蛋白的核酸来提供。因此，在第七方面，本发明提供了用于作为药物使用的根据本发明的第六方面的核酸。本发明的核酸以这种方式的医学用途在参考本发明的蛋白的医学用途描述的应用中可以是有益的。

本发明的核酸

本发明的第六方面提供了核酸，所述核酸编码本发明的蛋白。在合适的实施方案中，核酸可以编码嵌合多肽，其中对应于IgM的位置575处的半胱氨酸(相当于SEQ ID NO:1的C248)的半胱氨酸被丢失。在此类实施方案中，半胱氨酸残基可以被丙氨酸残基取代。

本发明的核酸可以是编码本发明的蛋白的DNA分子。可选地，本发明的核酸可以是编码本发明的蛋白的RNA分子。

合适地，本发明的核酸可以包括编码SEQ ID NO:2的多肽的SEQ ID NO:3。

在合适的实施方案中，本发明的核酸可以与SEQ ID NO:3共有至少70％的同一性、与SEQ ID NO:3共有至少75％的同一性、与SEQ ID NO:3共有至少80％的同一性、与SEQ IDNO:3共有至少85％的同一性、与SEQ ID NO:3共有至少90％的同一性、与SEQ ID NO:3共有至少95％的同一性、与SEQ ID NO:3共有至少96％的同一性、与SEQ ID NO:3共有至少97％的同一性、与SEQ ID NO:3共有至少98％的同一性、或与SEQ ID NO:3 共有至少99％的同一性。

应当理解，本发明的核酸可以被掺入更大的核酸序列中，该核酸序列将包含不编码本发明的单体蛋白的区域。仅仅举例来说，本发明的核酸可以被掺入表达质粒(诸如pFUSE-hlgG1-Fc-TP-LH309/310CL或 pFUSE-hlgG1-Fc-TP-L310H)中。

本发明的蛋白的产生

本发明的第七方面提供了一种产生根据本发明的第一方面的蛋白的方法。这些方法包括在宿主细胞中表达根据本发明的第六方面的核酸。

在合适的实施方案中，宿主细胞可以是真核宿主细胞。特别地，合适的真核表达宿主可以选自由以下组成的组：酵母(例如毕赤酵母(Pichia pastoris)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))和哺乳动物细胞系统。

合适的哺乳动物细胞系统可以选自由以下组成的组：HEK-293细胞、 CHO-K1细胞、小鼠来源的NS0细胞和BHK细胞。其他合适的哺乳动物细胞系统将是本领域技术人员已知的。应当理解，合适的宿主细胞将包含用于将聚糖与表达的蛋白附接的工具(means)。

还应当理解，其中表达本发明的蛋白的细胞类型可能影响本发明的蛋白和唾液酸之间形成的键类型。举例来说，在CHO-K1细胞中产生的本发明的蛋白可能仅形成α2,3键，并且因此可以仅结合SIGLEC-1(而不是 SIGLEC-2)受体。

然而，本发明的蛋白在其他类型的细胞(例如人类细胞(诸如HeLa或 HEK细胞))中的表达可能允许形成α2,3键和α2,6键。α2,6键的存在可以使本发明的蛋白能够结合SIGLEC-2受体(也称为CD22)。本发明的蛋白结合SIGLEC-2受体的能力在治疗自身免疫性疾病中特别有用，例如通过 IVIG或SCIG治疗。

因此，将认识到，其中待表达本发明的蛋白的细胞可以参考待实现的期望糖基化和蛋白的预期治疗使用来选择。

本发明人相信本发明的蛋白与多种实践优势相关。例如，它们简化制造方法，因为本发明的蛋白作为均匀单体产生。因此，选择仅特定尺寸的蛋白的步骤可以被省略。蛋白具有不聚合的能力的事实也可以延长包含本发明的蛋白的产品的保质期，而不必担心它们将聚合而失去其生物活性。

可以被预防或治疗的疾病

用于使用本发明的蛋白预防或治疗的合适的自身免疫性疾病或炎性疾病包括用IVIG可治疗的那些疾病。这些疾病可以是目前常规用IVIG治疗的疾病，或者其中已经发现IVIG在临床上有用的疾病，诸如自身免疫性血细胞减少症、格林-巴利综合征、重症肌无力、抗因子VIII自身免疫性疾病、皮肌炎、血管炎、和葡萄膜炎。IVIG通常用于治疗特发性血小板减少性紫癜(ITP)、川崎氏病、格林-巴利综合征和慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病。IVIG还可以用于治疗对主流疗法无响应的多种其他自身免疫性疾病，包括关节炎、糖尿病、肌炎、克罗恩结肠炎(Crohn’s colitis)、和系统性红斑狼疮。

适合于治疗的自身免疫性疾病或炎性疾病包括自身免疫性血细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、哮喘、川崎氏病、格林-巴利综合征、史蒂文斯-约翰逊综合征(Stevens–Johnson syndrome)、克罗恩结肠炎、糖尿病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病重症肌无力、抗因子VIII自身免疫性疾病、皮肌炎、血管炎、葡萄膜炎、和阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)。应当理解，自身免疫性疾病或炎性疾病，诸如以上列出的那些疾病，可以通过本发明的蛋白可治疗，而不需要治疗有效载荷。在此类实施方案中，治疗可以通过IVIG或SCIG提供。可选地或另外地，疾病可以通过与治疗有效载荷缀合的本发明的蛋白可治疗。此类治疗有效载荷可以是例如下调免疫系统的成分的免疫调节剂。

待治疗的状况可以包括具有在细胞因子网络中失衡的炎性疾病，由病原性自身抗体或自身侵袭性T细胞介导的自身免疫性紊乱，或者慢性复发性自身免疫性、炎性疾病或传染病或病程的急性或慢性期。另外，具有炎症性成分的其他医学状况，诸如肌萎缩性脊髓侧索硬化、亨廷顿病 (Huntington's Disease)、阿尔茨海默病、帕金森病(Parkinson'sDisease)、心肌梗塞、中风、乙型肝炎、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒相关炎症、T细胞白血病病毒相关炎症、肾上腺脑白质营养不良、和癫痫性紊乱，特别是那些被认为与包括拉斯穆森综合征(Rasmussen Syndrome)、韦斯特综合征 (West Syndrome)和林-戈综合征(Lennox-Gastaut Syndrome)的病毒性脑炎 (postviral encephalitis)相关的那些癫痫性紊乱被包括。

待治疗的状况可以是血液免疫性疾病，例如特发性血小板减少性紫癜、同种免疫性/自身免疫性血小板减少症、获得性免疫性血小板减少症、自身免疫性中性粒细胞减少症、自身免疫性溶血性贫血、细小病毒B19相关红细胞再生障碍性贫血(Parvovirus B19-associated red cell aplasia)、获得性抗因子VIII自身免疫、获得性血管性血友病(acquired von Willebrand disease)、多发性骨髓瘤和意义不明的单克隆丙种球蛋白病、再生障碍性贫血、纯红细胞再生障碍性贫血、戴-布二氏贫血(Diamond-Blackfan anemia)、新生儿溶血病、免疫介导的中性粒细胞减少症、血小板输血无效(refractoriness toplatelet transfusion)、新生儿输血后紫癜、溶血性尿毒症综合征、系统性血管炎、血栓性血小板减少性紫癜、或埃文斯综合征(Evan's syndrome)。

可选地，可以治疗神经免疫性疾病，例如神经炎、格林-巴利综合征、慢性炎性脱髓鞘性多法性神经根性神经病、副蛋白血症性IgM脱髓鞘性多发性神经病、兰伯特-伊顿肌无力综合征(Lambert-Eaton myasthenic syndrome)、重症肌无力、多灶性运动神经病、与抗GM1抗体相关的下位运动神经元综合征、脱髓鞘、多发性硬化和视神经炎、僵人综合征、具有抗Yo抗体的副肿瘤性小脑退化、副肿瘤性脑脊髓炎、具有抗Hu抗体的感觉神经病、癫痫、脑炎、脊髓病，特别是与人类T细胞嗜淋巴病毒-1相关的脊髓病、自身免疫性糖尿病性神经病变、或急性特发性自主神经功能障碍(Acute Idiopathic Dysautonomic Neuropathy)和阿尔茨海默病。

可以治疗风湿性疾病，例如川崎氏病、类风湿性关节炎、费耳蒂氏综合征(Felty'ssyndrome)、ANCA阳性血管炎、自发性多发性肌炎、皮肌炎、抗磷脂综合征、复发性自然流产、系统性红斑狼疮、幼年特发性关节炎、雷诺病(Raynaud's)、CREST综合征或葡萄膜炎。

可以治疗皮肤免疫性疾病，例如表皮坏死松解、坏疽、肉芽肿、自身免疫性皮肤起泡疾病(包括寻常天疱疮、大疱性天疱疮、和落叶性天疱疮)、白癜风、链球菌中毒性休克综合征、硬皮病、系统性硬化(包括弥漫性和局限性皮肤系统性硬化)、特应性皮炎或类固醇依赖性特应性皮炎。

可以治疗肌肉骨骼免疫性疾病，例如包涵体肌炎、坏死性筋膜炎、炎性肌病、肌炎、抗核心蛋白聚糖(BJ抗原)肌病、副肿瘤坏死性肌病、X连锁空泡性肌病、青霉胺诱导的多发性肌炎、动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、或心肌病。

可以治疗胃肠免疫性疾病，例如恶性贫血、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、乳糜泻、疱疹样皮炎、隐源性肝硬化、反应性关节炎、克罗恩病(Crohn'sdisease)、惠普尔病(Whipple's disease)、溃疡性结肠炎、或硬化性胆管炎。

疾病可以是，例如，感染后疾病炎症、哮喘、伴随抗β细胞抗体的1 型糖尿病、干燥综合征、混合性结缔组织病、阿狄森病(Addison's disease)、伏格特-小柳-原田三氏综合征(Vogt-Koyanagi-Harada Syndrome)、膜性增生性肾小球肾炎、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture's syndrome)、格雷夫斯病(Graves'disease)、桥本甲状腺炎(Hashimoto'sthyroiditis)、韦格纳肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、微型多动脉炎(micropolyarterits)、丘尔-斯特劳斯综合征(Churg-Strauss syndrome)、结节性多动脉炎、或多系统器官衰竭。

用于治疗的示例性疾病是特发性血小板减少性紫癜(ITP)。

应当理解，能够通过IVIG治疗的状况，诸如以上列出的那些状况，也可以通过SCIG治疗。因此，本发明还提供了本发明的蛋白或组合物在 SCIG治疗这些状况中的使用。

本发明人相信本发明的蛋白本身可有助于用于改善疫苗活化和/或疫苗耐受。此类疫苗可适合于在可能不期望补体激活的个体中使用。

本发明的蛋白可以用于预防或治疗由SIGLEC-1受体介导的疾病。此类疾病包括诸如病毒感染的那些疾病，其中致病原(infectious agent)通过 SIGLEC-1结合。合适的病毒感染包括由例如人类免疫缺陷病毒、T细胞白血病病毒引起的逆转录病毒感染。

由SIGLEC-1受体介导的疾病可以通过本发明的蛋白(不管其是否与治疗有效载荷缀合)预防或治疗。未与治疗有效载荷缀合的本发明的蛋白可以通过竞争性结合阻断SIGLEC-1受体来预防或治疗疾病。可选地，本发明的蛋白，无论是否与治疗有效载荷缀合，都可以通过触发来自此类受体的效应功能来实现治疗活性。与治疗有效载荷缀合的本发明的蛋白可以通过治疗有效载荷的治疗作用或者通过治疗有效载荷的治疗作用和通过竞争性结合阻断SIGLEC-1受体的组合来预防或治疗疾病。

如本说明书中其他地方提及的，已经引入另外的糖基化位点(例如在 SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的残基1处，如在SEQ ID NO:17中发现的) 的本发明的那些蛋白代表用于在预防或治疗由SIGLEC-1调节的疾病中使用的特别合适的实施方案。

现在将参考以下实施例和附图进一步描述本发明，其中：

图1.显示在六聚体Fc模板质粒hIgG1-Fc-CL309/310CH-TP上产生的聚糖和半胱氨酸突变体的示意图。星形分别指示IgG重链恒定区(诸如Cγ2) N297和尾片段N563聚糖位点。C＝A指示尾片段中半胱氨酸575突变为丙氨酸。

图2.突变体Fc蛋白通过SDS-PAGE的表征。(A)野生型hexa-Fc和 N297A、D221N/N297A突变体作为高分子量五聚体和六聚体运行。N297A 聚糖的丢失未抑制低聚化，但产生比完全糖基化的野生型hexa-Fc相称地小的低聚体(箭头所示)。N563A突变体以接近十二聚体的分子量运行(还参见图7)。(C)N563A/C575A突变体产生作为梯状低聚体运行的蛋白，而C575A和L448STOP突变体作为单体运行。C575A的去除可以导致比低聚体中可能的聚糖更复杂的聚糖与N563A序列段附接作为单体，并且因此对于该突变体观察到的两种单体物质最有可能代表差异化糖基化的单体。(B) 来自(A)的蛋白在还原条件下运行。在Fc中观察到的降低的分子量代表N- 连接的聚糖的顺序丢失。因此N297A/N563A突变体具有最小的分子量，因为它不具有与Fc附接的聚糖。该图还示出附接的聚糖的对比尺寸，N221 聚糖比N563大，N563又(in turn)比N297大。

图3.突变体与DC-SIGN的结合。通过ELISA，缺乏N297聚糖的突变体在其结合DC-SIGN的能力方面受到严格限制。单体C575A突变体比野生型IgG-Fc(缺乏尾片段，并且如在IVIG制剂中)更好地结合DC-SIGN，表明N563聚糖可能有助于DC-SIGN，但仅当通过去除Cys575作为单体存在时(还参见图6)。与D221N突变体一样，在位置221处添加N-连接的糖产生具有减少的结合DC-SIGN的能力的蛋白。

图4.通过ELISA评价突变体与典型FcγR的结合。如在N297A和 D221N/N297A突变体中的N297聚糖的去除(图4A)导致急剧丧失与研究的所有FcγR的结合。产生梯状低聚体的N563A/C575A突变体(图4B)与野生型六聚体-Fc或D221N/N563A十二聚体同样良好地结合低亲和力FcγRIIA、 FcγRIIB、FcγRIIIA、FcγRIIIB，但与六聚体-Fc或D221/N563A相比较差地结合高亲和力FcγRI。C575A单体(图4B)具有模拟单体IgG1-Fc对照的 FcγR结合谱。

图5.如通过ELISA评价的C5b-9(膜攻击复合物)沉积来测量的突变体与补体成分C1q的结合以及随后补体级联的激活。如在N297A、 N297A/N563A、D221N/N297A、或D221N/N297A/N563A突变体中的Asn297聚糖的去除导致与C1q的结合和随后C5b-9沉积两者的急剧丧失。 N563A和D221N/N563A突变体在激活补体方面与野生型hexa-Fc一样好。虽然不能结合FcγR，但D221N突变体明显能够结合C1q，导致C5b-9沉积，尽管不如hexa-Fc或N563A有效。(n＝2个独立实验)。

图6.显示Asn563、Cys309和Cys575对不同Fc化学计量的贡献的模型。Cys575的存在允许单体Fc的尾片段中Cys575之间的最佳二硫键键合。因此，尾片段聚糖Asn563控制嵌入(fit into)中心冠状物(corona)的单体尾部的数目(在hexa-Fc的情况下为五-六个)，同时仍然允许Cys309分子间二硫键桥形成。Cys575允许不同单体的尾片段之间的二硫键键合，但是现在Asn563聚糖的缺乏允许更多的尾片段(在十二聚体的情况下多达十二个) 嵌入中心冠状物，同时仍然允许通过Cys309的二硫键形成。Cys575的不存在防止尾片段之间的二硫键键合，从而产生具有两个被占据的N-糖基化位点(Asn297和Asn563)的单体。这些单体中的另外的尾片段聚糖现在允许与DC-SIGN的更大的亲合力相互作用，并且如六聚体通过Asn297聚糖所观察到的(参见插图)。较大体积的Asn563聚糖及其预测的总负电荷现在导致两个单体之间的排斥，并且阻止每个单体Fc中两个相邻Cys309残基之间的二硫键形成。Asn563和Cys575两者的丢失意味着更高级的多聚物仅可以通过在IgG重链恒定区(诸如Cγ2结构域)中通过Cys309介导的二硫键键合产生。该N563A/C575A突变体中的二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和六聚体的存在(图2)暗示这些结构通过不同机制产生，最有可能通过单体Fc单元的顺序添加产生。缺乏这些梯状条带(ladder)的L448STOP突变体(SEQ IDNO:6和7)暗示尾片段中的其他氨基酸参与引起促进通过 Cys309的二硫键键合的单体相互作用。

图7.hexa-Fc野生型、和N563A、C575A、N563A/C575A突变体在 Superdex-200 10/300GL柱上的尺寸排阻层析(SEC)分析。为了清楚起见，省略分子量标准物的洗脱曲线，但用箭头指示牛甲状腺球蛋白(670kDa)、牛γ-球蛋白(158kDa)和鸡卵清白蛋白(44kDa)。

图8.差异化糖基化的hexa-Fc突变体的产生。通过凝胶中蛋白N-聚糖酶F消化从靶低聚重组Fc糖型中释放的用2-氨基苯甲酸标记的N-连接的聚糖的正相高效液相层析分析。N-连接的聚糖的HPLC分析如先前所述的¹(星形)5-N-乙酰神经氨酸；(白色菱形)Gal；(正方形)GlcNAc；(圆形)Man； (黑色菱形)Fuc。键位置由连接糖残基的线的角度表示(垂直线，2键；斜杠 (forward slash)，3键；水平线，4键；黑色斜线，6键)。端基异构性(anomericity)由β键的实线和α键的虚线指示。

图9.显示在hexa-Fc模板质粒hIgG1-Fc-CL309/310CH-TP上产生的聚糖和半胱氨酸突变体的示意图。星形指示铰链N221、Cγ2N297、和尾片段N563聚糖位点。C＝A指示尾片段中半胱氨酸575突变为丙氨酸。使用的缩写包括：M(单体)、D(二聚体)、O(低聚体)、HOM(更高等级多聚体)，如通过尺寸排阻分析和SDS-PAGE确定的，n.d.，未确定。

图10.示出了突变体Fc蛋白通过SDS-PAGE的表征。图10A示出了 hexa-Fc、N297A、N563A和N297A/N563A突变体在非还原条件下作为不同价的高分子量多聚体运行。N297A聚糖的丢失未防止多聚化，但产生与之前观察到的丢失来自Asn297的聚糖³相称的较低分子量的多聚体。N563A和N297A/N563A突变体以接近十二聚体的分子量运行(还参见图 17)。向这些突变体中添加N-X-T/S聚糖序列段以产生N-末端糖基化铰链 (D221N系列突变体)未影响多聚化，但增加所有突变体的分子量，并且明显显示出另外的糖可以与IgG1铰链的N-末端附接。图10B示出了与图A 中相同的突变体，但是在还原条件下运行。在Fc中观察到的降低的分子量代表N-连接的聚糖的顺序丢失。因此，N297A/N563A突变体具有最小的分子量，因为它没有聚糖与Fc附接，而D221N具有最大的分子量，因为它具有三个聚糖附接。该图还示出了聚糖的对比尺寸，Asn221和Asn563 聚糖比与Asn297附接的聚糖大(还参见图11和图17中的质谱数据)。N563A 碳水化合物的丢失导致两个可观察到的可以代表Asn297的差异化糖基化的Fc片段。图10C示出了N563A/C575A突变体产生在非还原条件下作为梯状多聚体运行的蛋白，而C575A和L448STOP突变体主要作为单体运行，其中观察到小比例的二聚体物质。图10D示出了D221N/N297A/C575A变体作为单体运行，而D221N/N563A/C575A突变体作为不同分子量的梯状条带运行，如图C中以N563A/C575A变体所观察到的。图10E示出了用来自IgA的十八氨基酸尾片段替代来自IgM的十八氨基酸尾片段的效果，产生几乎完全包含六聚体的多聚体的均一制备物(preparation)。所有蛋白在非还原或还原条件下以每个4％-8％丙烯酰胺梯度凝胶的泳道1μg蛋白运行，转移至硝化纤维素，并且用抗人类IgG-Fc(Sigma)印迹。

图11.示出了来自CHO-K1细胞表达的IgG1-Fc突变体的2AA标记的N-连接的聚糖的HILIC-UPLC分析的结果(参见图9)。通过凝胶中蛋白 PNG酶F消化从靶抗体糖型释放的2AA标记的N-连接的聚糖的正相 HILIC-UPLC分析。以下变异体的聚糖谱：(A)hexa-Fc、IgG1-Fc、N563A(上凝胶带)、N563A(下凝胶带)；(B)D221N、D221N/N297A、D221N/N563A、 D221N/N297A/N563A；(C)C575A、N563A/C575A、L448STOP。y轴显示相对荧光，并且x轴显示相对洗脱时间。插入的饼图代表两次分析重复的平均值；饼图总结各个位点上的低聚甘露糖型(深灰色)、半乳糖基化(浅灰色)和唾液酸化聚糖(灰色)的定量。定量基于图17和图20中的峰值列表。对应于该图的百分比可见于表3中。

图12.显示IgG1-Fc变体与聚糖受体的结合的图。图12A通过ELISA 示出了缺乏N297聚糖的突变体的结合在其结合DC-SIGN的能力上受到严重限制。在位置221处N-连接的糖的添加产生与其不存在Asn221的等效变体相比具有减少的结合DC-SIGN的能力的蛋白。图12B示出超唾液酸化(hyper-sialylated)D221N突变体结合Siglec-1的结合。N297A/N563A聚糖缺陷突变体未观察到结合(n＝2个独立实验)。

图13.显示单体IgG1-Fc C575A聚糖变体与Siglec-1结合的图。C575A 单体比hexa-Fc多聚体更好地结合Siglec-1。(n＝2个独立实验)。

图14.显示不同N-连接的聚糖和半胱氨酸残基对Fc化学计量的贡献的模型。Cys575的存在允许单体Fc的尾片段之间的最佳二硫键键合。尾片段聚糖Asn563控制嵌入中心冠状物的单体尾部的数目(在hexa-Fc的情况下为五-六个)，同时仍然允许Cys309分子间二硫键桥形成。Cys575允许不同单体的尾片段之间的二硫键键合，但是Asn563聚糖的不存在 (N563A突变体)允许许多更多的尾片段(在十二聚体的情况下多达十二个) 嵌入中心冠状物，同时仍然允许通过Cys309和/或Cys575的二硫键形成。Cys575的不存在阻止尾片段之间的二硫键键合，从而产生在Asn563处唾液酸化的单体。这些单体中的另外的Asn563尾片段聚糖必须解释对 Siglec-1所观察到的增加的结合。较大体积的Asn563聚糖及其预测的总负电荷可以导致两个单体之间的排斥，从而阻止每个单体Fc中两个Cys309 残基之间的二硫键形成。Asn563和Cys575两者的丢失(N563A/C575A突变体)意味着观察到的梯状多聚体必须通过Cγ2结构域中的Cys309介导的二硫键键合产生。该突变体中的单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体和其他中间体的存在(图10C)表明这些结构通过不同机制产生，最可能是经由在Cys309处顺序添加25kDa半聚体Fc单元产生。缺乏可观察到的梯状条带的L448STOP突变体暗示尾片段中的其他氨基酸参与导致单体相互作用，该单体相互作用然后促进通过Cys309和/或Cys575的二硫键键合。具有位于Fc的N-末端和C-末端两者的聚糖的单体(Asn221和Asn563) 可以允许与受体顺式结合。

图15.示出了从hexa-Fc变体释放的N-连接的聚糖的MALDI-TOF质谱分析。以上是对于hexa-Fc、IgG1-Fc、N297A(下带)、N563A(上带)； N563A(下带)、D221N、D221N/N297A、和D221N/N563A； D221N/N297A/N563A、C575A、N563A/C575A和L448STOP；N297A和 N297A/N563A的。通过PNG酶F消化从IgG-Fc释放N-连接的聚糖。示意图和分子图两者的残基的聚糖的符号表示根据功能糖组学协会(the Consortium for Functional Glycomics)遵循Harvey等人[参考文献1,4]的符号表示，。

图16.示出了源自电喷雾质谱的并且然后使用离子迁移率提取将其转化为单和双电荷离子的N-聚糖的质量、组成和结构的列表。

实施例

摘要

人类IgG1-Fc可以被工程化为与经典和非经典的Fc-受体结合的多聚体结构(hexa-Fc)，所述经典和非经典的Fc-受体包括具有高亲合力的FcγRI、 FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA、FcRL5和DC-SIGN。因此，它们在低亲和力受体的交联对于功能增强和临床效用是必需的应用中可能是抗体和单体Fc蛋白的有吸引力的替代物。在Asn297处附接的独特的N-连接的聚糖对IgG1-Fc的结构和功能的至关重要影响被充分记录；然而，这是否仍然适用于以增加的亲合力结合的多聚体Fc还是未知的。hexa-Fc含有在 Asn77(相当于IgG1的Fc中的Asn297)和Asn236(相当于IgM的尾片段中的Asn563)处的两个N-连接的位点。我们证明了在Asn297处的糖基化对于与Fc受体及补体的功能性相互作用是至关重要的，而在Asn563处的糖基化对于控制多聚化是必需的。当另外的被完全占据的N-连接的糖基化位点被引入在铰链的N-末端的位置1(相当于IgG1的Fc中的Asp221)处时，我们证明了Fc多聚体的总唾液酸含量被显著增强。此外，此类多聚体的 IgM尾片段中的Cys575的替代产生具有增强的唾液酸含量并且显示出不同受体结合谱的单体。因此，将另外N-连接的聚糖插入单体或多聚体的铰链和/或IgM尾片段产生具有增强的唾液酸化的分子，该分子可以适合于治疗炎症或作为病原体侵袭的阻断剂。

引言

多聚化Fc和Fc融合蛋白正越来越多地被探索用于新的药物和疫苗途径。一个潜在的有前景的领域(fertile area)是它们作为静脉注射免疫球蛋白(IVIG)疗法的生物模拟替代物的开发。IVIG是一种非常成功的生物制剂，被FDA批准用于治疗特发性血小板减少性紫癜(ITP)、川崎氏病、格林-巴利综合征、格雷夫斯眼病(Graves ophthalmopathy)和许多多发性神经病。临床医生越来越多地将IVIG视为治疗大多数其他疾病的最后手段，所述大多数其他疾病包括：贫血、关节炎、狼疮、移植排斥、流产、和慢性疼痛；尤其是当这些对常规疗法不敏感时。

IVIG的全球短缺和需求由于目前药物的许多其他不足之处而更加复杂，最重要的是IVIG的产生依赖于人类捐赠者，这引起安全问题并且大大增加成本。雪上加霜的是，<5％的注射产品(正确糖基化和/或低聚-Fc) 是有治疗活性的，导致需要高剂量(2g/kg)。因此，IVIG昂贵并且由于过量IVIG载量而引起的不良事件并不少见。因此，对于开发用于在临床使用的IVIG的合成替代物存在迫切需求。

IVIG的作用机制尚未被完全了解。虽然Fab’₂和Fc两者介导的机制都可能涉及，但在人类中，Fc片段的输注足以改善ITP。IVIG抑制有害炎症，通过占用低亲和力抑制受体和/或通过在体内形成允许IVIG以更大亲合力与这些受体相互作用复合物，从而介导更有效的抗炎作用。虽然经典的(1 型，例如FcγRIIB、FcγRIIIA)和非经典的(2型，例如FcγR，诸如DC-SIGN、 CD22、FcRL5)两者都涉及到其治疗效力，但涉及的确切受体或受体组合并不是明确已知的。

基于Fc复合物可以诱导耐受性的发现，正在积极研究许多不同的Fc 多聚化方法。一种利用人类IgG2铰链区的方法当引入到小鼠IgG2a-Fc中时产生不同分子量的梯状顺序多聚体。被称为“StradomersTM”的更高等级多聚体与低亲和力FcγR和SIGN-R1强烈结合，并且显示出保护动物免受胶原诱导的关节炎、ITP、炎性神经病和自身免疫性重症肌无力的侵害。

我们采取了一种替代的多聚化方法，通过将来自低聚IgM的18氨基酸尾片段与在位置309处的Leu至Cys取代基一起融合到IgG1-Fc中。这些分子形成明确的五聚体和六聚体结构，其与受体的结合显示出严重依赖于N-连接的糖基化。糖基化在增加溶解度和影响与聚糖受体和Fc受体两者的相互作用中是重要的。hexa-Fc含有在Cγ2结构域中的位置Asn297和 hexa-Fc的十八氨基酸IgM尾片段中的Asn563处的两个N-连接的糖基化位点。六聚体Fc还结合人类新生儿受体(human neonatal receptor)(FcRn)，已知这种相互作用对于维持长的体内半衰期和增强的免疫原性是至关重要的。已经在两项专利申请(WO2015132364和WO2015132365)中报道了类似分子在ITP小鼠模型中的效力。

糖基化对于内质网中正确的蛋白折叠以及将正确折叠的蛋白输出到高尔基体用于翻译后修饰是重要的。附接的聚糖也增加蛋白的溶解度，并且已经被证明显著影响IgG与聚糖受体和Fc受体两者的相互作用。Fc中唯一可用的碳水化合物附接位点(Asn297)的糖基化对于与1型和2型受体两者的相互作用是必需的。Asn297处的Fc聚糖通常是双线复杂型(biantennary complex types)，表现出核GlcNAc残基的高水平岩藻糖基化、部分半乳糖基化和二等分(bisecting)GlcNAc。在这些结构中，少于20％被唾液酸化。支化和末端结构(诸如唾液酸)水平低的原因被认为是由于对Fc 蛋白骨架对Asn297聚糖加工施加的限制。

在IVIG去糖基化后，Fc的抗炎特性丢失，而携带α2,6-唾液酸化的 Fc的IgG群体被鉴定为对控制炎症做出显著贡献。更高水平的唾液酸化也导致更长的血清保留时间。事实上，唾液酸化的Fc的效力已经产生通过破坏蛋白-Asn297碳水化合物界面的化学手段或通过Fc蛋白骨架的诱变程序来修饰Asn297上现有聚糖的动机。

此处我们已经将我们的研究集中在了解这两种N-连接的聚糖，与尾片段中存在的半胱氨酸残基的组合对hexa-Fc的结构和功能的贡献上。我们证明了，在Asn297处的N-聚糖(当与IVIG相比时其糖富含高甘露糖和半乳糖)对于hexa-Fc结合受体是必需的。然而，发现与尾片段Asn563附接的聚糖比附接在Asn297处的聚糖大并且更复杂，并且对于作为低聚体与受体结合不是至关重要的，但是对于确定所形成的低聚体的类型是必需的。 Asn297和Asn563两者的去除导致蛋白表达的显著下降，失去低聚化能力，并且完全丧失受体结合。这些发现显示出N-连接的糖基化和尾片段在维持 hexa-Fc的结构和功能中的重要性，并且因此显示出这些分子用于药物或疫苗应用的转化潜力(translational potential)。

另外地，通过以多种组合将多达三个另外的N-连接的糖基化位点引入到IgG1-Fc被暴露的区域中(图1和9)，我们采取了一种未被探索的修改糖基化的方法。Hexa-Fc通常包含Cγ2结构域中的位置Asn297和hexa-Fc的十八氨基酸IgM尾片段中的Asn563处的两个N-连接的糖基化位点。

我们首次证明了，将另外的N-连接的聚糖添加到IgG1-Fc铰链的N- 末端上以产生仍然能够形成多聚体、其然后与原型唾液酸依赖性受体 Siglec-1结合的一组超唾液酸化的(hyper-sialylated)分子(D221N系列突变体) 是可能的。通过将尾片段Cys575进一步诱变为丙氨酸，唾液酸化的多聚体可以被转化为与Siglec-1强烈结合的唾液酸化的单体。本研究阐明了多于一个(multiple)N-连接的聚糖在维持功能性Fc结构中的作用，并且提供了开发具有预定的效应功能的抗体治疗剂(therapeutics)的途径。

材料和方法

糖基化突变体的产生

先前已经描述hexa-Fc的产生^2,3。诱变由野生型载体 (pFUSE-hIgG1-Fc-TP-LH309/310CL)作为模板使用如下用于每种突变体的内部错配引物对，通过PCR重叠延伸构建以下突变体。

N297A/N563A：引物对N563A被用于N297A突变体质粒；

D221N/N297A：引物对N297A被用于D221N突变体质粒；

D221N/N563A：引物对N563A被用于D221N突变体质粒；

D221N/N297A/N563A：引物对N563A被用于D221N/N297A突变体质粒；

N563A/C575A：引物对C575A被用于N563A突变体质粒。

在重叠PCR中使用以下侧翼引物。这些是5’ -ACCCTGCTTGCTCAACTCT-3’和3’-TGGTTTGTCCAAACTCATCAA-5’，它们在被用于亚克隆到野生型载体中的EcoRI/BglII和NheI(都来自新英格兰生物实验室(New England Biolabs)位点上游或下游71或22个碱基对。将编码人类IgA尾片段(PTHVNVSVVMAEVDGTCY)的DNA通过 EUROFINS合成，并且作为AvrII/NheI片段克隆到 pFUSE-hIgG1-Fc-TP-LH309/310CL中。为了验证期望突变的掺入并且检查PCR引起的错误，使用同一组侧翼引物在两条链上对新表达质粒的整个编码序列进行测序。使用FuGene(Promega)用质粒转染CHO-K1细胞(欧洲细胞培养物保藏中心(EuropeanCollection of Cell Cultures))并选择阳性克隆，对hexa-Fc进行扩增和纯化，如先前所述的^2,3。

N-连接的聚糖的酶促释放.在还原条件下在 NuPAGE Bis-Tris 4％-12％预制凝胶(Life Technologies,UK)上通过SDS-PAGE分级分离重组蛋白(50μg)。用考马斯蓝染色后，将凝胶带切离，用交替的乙腈和水洗涤五次，并晾干。在含有500单位/mL蛋白N-糖苷酶F(PNGase F)(New England Biolabs,UK)的反应缓冲液(250μL的50mM NaHCO₃pH7.4)中使每个凝胶带再水化，并且在37℃孵育16h。所释放的聚糖通过用水洗涤三次从凝胶基质中提取，并且然后在SpeedVac Concentrator Plus(Eppendorf, UK)中干燥。

N-连接的聚糖的荧光标记.将PNG酶F释放的聚糖用2-氨基苯甲酸 (2-AA)荧光标记，如先前所述的³¹。简而言之，将聚糖重悬在30μL水中，随后添加80μL标记混合物(在甲醇中的3％w/v 2-AA、4.5％w/v氰基硼氢化钠、4％w/v三水合乙酸钠和2％w/v硼酸)。在80℃孵育1h后，将样品用1mL的97％v/v乙腈稀释，然后装载到Speed Amide-2盒(Speed Amide-2cartridges)(Applied Separations,UK)上，并且用2mL水洗脱以去除过量的标记物。

N-连接的聚糖的外切糖苷酶测序.使用以下外切糖苷酶顺序消化 2-AA标记的聚糖：来自产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的α2-3,6,8 神经氨酸酶(New EnglandBiolabs,UK)、来自脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的β1,4-半乳糖苷酶(New EnglandBiolabs,UK)、来自牛肾的α-L-岩藻糖苷酶(Sigma-Aldrich,UK)、来自木薯萎蔫病黄单胞菌(Xanthomonas manihotis)的β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶(New England Biolabs,UK)和来自刀豆 (Jack Bean)的α(1-2,3,6)-甘露糖苷酶(Sigma-Aldrich,UK)。来自Streptomycespicatus的内切糖苷酶H(endoH)(New England Biolabs,UK)用于定量低聚甘露糖结构。消化在37℃在孵育缓冲液(50mM磷酸钠，pH 5.0)中进行16h。使用聚偏二氟乙烯(PVDF)蛋白结合膜板(Millipore,UK)去除酶，然后 HILIC-UPLC分析。

HILIC-UPLC

在Waters ACQUITY 仪器上使用2.1mm×10mm(1.7μm粒径)ACQUITY乙烯桥杂化(Ethylene Bridged Hybrid)(BEH)聚糖柱(Waters, UK)通过HILIC-UPLC分离荧光标记的聚糖。运行以下梯度：时间＝0min(t ＝0)：22％A，78％B(流速为0.5mL/min)；t＝38.5：44.1％A，55.9％B(0.5 mL/min)；t＝39.5：100％A，0％B(0.25mL/min)；t＝44.5：100％A，0％B； t＝46.5：22％A，78％B(0.5mL/min)，其中溶剂A是50mM甲酸铵，pH 4.4，并且溶剂B是乙腈。使用250nm的激发波长和428nm的检测波长测量荧光。使用2-AA标记的葡萄糖均聚物梯状条带(ladder)(Ludger,UK)作为聚糖 UPLC分析的校准标准。使用Empower 3软件执行数据处理。低聚甘露糖型和复杂型聚糖的丰度百分比通过整合EndoH消化前后的相关峰面积并且随后归一化来计算。

受体和补体结合测定

先前已经描述了使突变体与四聚人类DC-SIGN、C1q和C5b-9结合的方法³。使用ELISA研究低聚Fc突变体与FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、 FcγRIIIA和FcγRIIIB(所有都来自R&D laboratories)的结合。将受体在碳酸盐缓冲液pH9(Sigma-Aldrich)中以2μg/ml在4℃包被至ELISA板(Nunc) 上过夜。然后将板在含有4％脱脂乳(Tesco)的PBS/0.1％吐温-20(PBST)中封闭。然后将板在PBS/0.1％吐温-20(PBST)中洗涤三次，然后以在PBST中的指定浓度添加Fc突变体，在40℃过夜。将板如以上所述洗涤，并且与 1:500稀释的碱性磷酸酶缀合的山羊Fab’₂抗人类IgG(Jackson Laboratories) 孵育2h。将板如以上所述洗涤，并且用100μl Sigmafast对硝基苯磷酸盐溶液(Sigma-Aldrich)显色15min。在405nm处读板并且用Graphpad棱镜绘制数据。

N-连接的聚糖的负离子ESIMS/MS分析

使用通过Nafion膜清洗的未标记的聚糖，通过负离子ESIMS/MS 确认聚糖的身份。静态纳米电喷雾质谱用Waters Synapt G2-Si HDMS离子迁移四极飞行时间仪器执行。通过内部制备的铂钯包被的硼硅酸盐毛细管输注1:1(v/v)甲醇:含有0.5mM磷酸铵的水(以确保磷酸盐加合物的最大形成)中的样品。离子源条件为：温度80℃；输注针电位，1.2kV；锥电压(cone voltage)100V。行波离子迁移池(氮气)以450m s^-1的波速和40V的波高操作。对于MS/MS数据采集，在低分辨率(约4m/z质量窗口)选择母离子，并且在传输池中用氩气碎片化。碰撞池上的电压随质量而调整，以给出碎片离子在质量尺度上的均匀分布。典型值为80-120V。将光谱(2s扫描)以 4GHz的数字化速率采集，并且累积，直到获得满意的信噪比。其他操作电压如由制造商推荐。仪器控制、数据采集和处理通过MassLynx软件4.1 版来执行，并且使用Waters Driftscope软件从总的图谱中提取单电荷聚糖离子，并且排除与靶聚糖无关的MS/MS碎片离子。根据由Domon和 Costello⁴提出的方案标记聚糖片段。

结果-1

糖基化影响hexa-Fc的低聚化状态

为了确定hexa-Fc中两种N-连接的聚糖对低聚化的贡献，我们使用先前描述的hexa-Fc作为模板，通过定点诱变创建一组突变体(图1)^2,3。将突变体IgG1-Fc转染到CHO细胞后，建立稳定的细胞系，并且将分泌的Fc 通过蛋白G亲和层析纯化。通过针对IVIG滴定的夹心ELISA确定的这些突变体的典型产量是野生型hexa-Fc＝2.87μg/ml；D221N＝9.2μg/ml； N297A＝0.87μg/ml；N563A＝1.57μg/ml；N297A/N563A＝0.72μg/ml； D221N/N563A＝0.63μg/ml；D221N/N297A＝0.25μg/ml； D221N/N297A/N563A＝2.9μg/ml，C575A＝20μg/ml。

然后纯化的IgG1-Fc突变体通过SDS-PAGE电泳和用(Fab)2抗人类 IgG-Fc的免疫印迹来分析(图2)。当在非还原条件下分析时(图2A)，hexa-Fc 作为低聚体迁移，对应于如先前描述的五聚体和六聚体^2,3。N297A突变体导致这些低聚形式的分子量轻微降低，与在Asn297处的聚糖丢失相称。

由于已经证明IgM中的尾片段聚糖(Asn563)的去除增强多聚物形成，主要是六聚体相比于五聚体增加，我们推断引入hexa-Fc的类似突变也将导致六聚体形成增强。出乎我们意料的是，>95％的其中尾片段聚糖被去除的N563A和D221N/N563A突变体两者分别作为约～650kDa和750kDa 的更高等级多聚体(HOP)迁移(图2A、C)，该HOP对应于通过尺寸排阻层析的十二聚体物质(图7)。Asn297和Asn563聚糖两者的去除产生不能形成低聚体并且CHO-K1细胞表达较差的分子。通过在还原条件下运行这些突变体，我们能够确定在每个位置处附接的各种聚糖的相对尺寸，使得 Asn221比Asn563大，Asn563继而比Asn297大(图2B)。

我们通过正相高效液相层析分析确认在D221N/N297A/N563A突变体中的Asn221处附接的聚糖确实更大并且更复杂(图8)。该分析还证明，与 Asn297附接的聚糖比与尾片段中的Asn563附接的聚糖小并且不如与尾片段中的Asn563附接的聚糖复杂，同时确认N297A/N563A双突变体中完全不存在聚糖(图8)。

N297聚糖对于hexa-Fc与受体的相互作用是至关重要的为了确定hexa-Fc上哪些N-连接的聚糖有助于受体结合，我们通过 ELISA研究该组N-糖基化突变体与可溶性重组四聚体人类DC-SIGN(图3) 和人类FcγR(图4)的相互作用。如先前公布的，hexa-Fc与DC-SIGN和经典的FcγR结合。Asn297的去除导致急剧丢失与DC-SIGN和FcγR的结合，而Asn563的去除仅具有轻微的影响(图3&4)。通过D221N/N297A突变体观察到Asn297聚糖对DC-SIGN结合的类似重要贡献(图3)。D221N/N297A 突变体而不是D221N分子缺乏与DC-SIGN的结合支持我们先前的观察，即在Asn297上存在的低聚甘露糖型聚糖对于与DC-SIGN的相互作用是至关重要的，并且当Fc作为低聚体存在时，Asn221或Asn563都不对结合做出贡献。

hexa-Fc的低聚结构允许与C1q强结合，并且允许C5b-9沉积。为了研究hexa-Fc上哪些N-连接的聚糖对C1q结合和C5b-9沉积是重要的，我们通过ELISA筛选了针对与C1q结合和C5b-9沉积的一组突变体(图5)。与C1q结合和随后C5b-9沉积严重依赖于Asn297聚糖的存在，因为N563A 或D221N/N563A突变体中的Asn563尾片段糖的去除对补体激活几乎没有影响(图5)。如在D221N突变体组中观察到的另外的聚糖与N-末端铰链的附接减少清楚地依赖于Asn297聚糖的存在的与C1q的总体相互作用(图5)。

十八氨基酸C-末端IgM尾片段，并且特别是Cys575，对低聚IgG1-Fc的形成是至关重要的

为了研究hexa-Fc的低聚化和功能所需的人类IgM尾片段的结构特征，我们产生三种另外的突变体；包括L448STOP、C575A和N563A/C575A(图 1)。通过引入终止密码子缺失整个尾片段完全阻止更高等级低聚体的形成，尽管仍然可以观察到非常小比例的二聚体(图2C)。在不存在尾片段下，所观察到的小比例二聚体仅可以通过在Cys309(hexa-Fc中存在的唯一其他可用的游离Cys残基)处的单体间二硫键桥接产生。类似地，用丙氨酸取代尾片段的倒数第二个残基Cys575导致仅分泌IgG-Fc单体(图2C)。对该C575A 突变体在约53kDa和58kDa处观察到的两种单体物质最可能代表差异化糖基化的单体，因为该分子中的两个N-连接的位点N297和N563是可用的。用丙氨酸取代Asn563以防止N-连接的碳水化合物附接到尾片段，导致形成更高等级低聚体，最有可能是十二聚体(图2A、C)。尾片段双突变体(N563A/C575A)中Asn563和Cys575两者的缺失导致～50kDa、100kDa、 150kDa、200kDa、250kDa、300kDa、350kDa和400kDa的不同分子量的梯状模式，最可能代表单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和六聚体，尽管从未观察到像对于N563A突变体所观察到的十二聚体那样大的分子(图2C)。这些最有可能是通过两个相邻单体的Cys309之间的二硫键形成而产生(图6)。

接下来，我们研究这些尾片段突变体在DC-SIGN结合和补体激活方面的功能。N563A/C575A突变体中形成的梯状低聚体在DC-SIGN结合(图 3)、FcγR结合(图4)和补体激活(图5A、B)方面完全胜任。N563A/C575A 双突变体中尾片段碳水化合物的不存在完全支持我们早先的观察，即 DC-SIGN结合完全依赖于Asn297。将C575A相对于野生型单体IgG-Fc进行比较，C575A突变体尽管几乎完全被表达为单体却仍然能够结合 DC-SIGN(图3)。另外，C575A突变体与所有FcgR的结合与野生型IgG1-Fc 或L448STOP对照大体上类似(图4)。尽管与多聚体相比，C575A突变体结合C1q较差(图5A)，但它不能激活补体，如通过C5b-9沉积所确定的(图 5B)。

讨论-1

我们先前证明了碳水化合物对于hexa-Fc与DC-SIGN结合和补体级联激活的重要性³。在本研究中，我们使用蛋白工程方法来确定低聚化和与受体结合所需的hexa-Fc的结构特征。我们首先研究在Cγ2结构域中的 Asn297和位于hexa-Fc的十八氨基酸IgM尾片段中的Asn563处发现的两个N-连接的糖基化位点的相对贡献。

聚合的人类IgA和IgM抗体因具有重链的被称为尾片段的十八氨基酸 C-末端延伸而不同于其他同种型，先前的研究已经涉及IgA和IgM两者中的单体亚单位的聚合。与这些早期的研究一致，我们发现如在L448STOP 突变体中的那样，从hexa-Fc中完全去除尾片段产生大部分是单体的蛋白，尽管观察到非常小比例的二聚体(图2C)。

有趣的是，已经证明了在Asn563处的尾片段碳水化合物的去除增强 IgM中的低聚体形成，同时减少IgA中的低聚化，并且因此我们想知道 Asn563的去除将对含有IgG1-Fc骨架的hexa-Fc具有什么影响。引人注目地，>95％的N563A和D221N/N563A突变体两者都被分泌为独立的(discrete) 十二聚体物质(分别为～650kDa和～700kDa)，并且未观察到如用IgM先前观察到的六聚体、五聚体或四聚体(图2A和C、图7)。与hexa-Fc相比，十二聚IgM、十二聚IgG或甚至十二聚IgA的形成可能是不可能的，鉴于由这些抗体类型的重链的每个单体中的Fc(IgM的Fc中的额外的Cμ2结构域)和相缔合的F(ab)₂臂的尺寸施加的另外限制。因此，尾片段中大体积 (bulky)碳水化合物的缺乏、Fc中Fab结构域和额外的恒定结构域两者的不存在，允许N563A或D221N/N563A突变体中更多的非结构化尾片段经由 Cys575形成单体间二硫键，从而允许十二聚体相比于先前描述的其他聚合态物质的最佳形成(图6)。尽管N563A或D221N/N563A突变体的价增加，但未观察到它们结合DC-SIGN或激活补体的能力的改进(图3和5)。

此外，N563A、D221N/N563A、和N563A/C575A突变体都显示出与 DC-SIGN的结合完全依赖于Asn297的存在。因此，这些突变体在多种治疗应用中可以具有有益的效用，在这些应用中，例如在疫苗应用中递送更多拷贝的抗原，对增加的价的需要无需以受体结合或补体激活为代价，。

本研究还扩展了我们关于糖基化对Fc活性影响的认识。在正常情况下，在所有IgG亚类的Cγ2结构域中的氨基酸297处存在单个N-连接的糖基化位点，我们和其他人已经证明，这对于与DC-SIGN的相互作用是至关重要的。因此，我们假设，将额外的N-连接的碳水化合物添加到Fc的暴露区域将增强与如DC-SIGN的聚糖受体的相互作用。因此，我们在Fc 多肽链的位置1处设计另外的N-连接的序列段(图1和2)，以产生D221N 系列突变体。我们首次证明了将N-连接的聚糖添加到IgG1-Fc的铰链的 N-末端上以产生仍然能够低聚化为六聚体的分子是可能的(图2A和C)。这是意料之外的，因为N-连接的聚糖通常不与天然IgG分子(或其他种类的抗体)的铰链附接，因为N-连接的聚糖被推测为干扰二硫键形成并因此干扰铰链充当柔性连接子的能力。由于该原因，天然抗体例如IgA倾向于将它们的铰链O-糖基化。尽管D221N突变体含有更大、更复杂的聚糖(图8)，但用D221N突变体组未观察到在hexa-Fc上与DC-SIGN(图3)或C1q(图4) 的结合的改进。然而，我们确实观察到D221N/N563A突变体与FcγRIIIA 的结合增强(图4)，这可能与其中IVIG是有益的并且其中已经证明治疗效力依赖FcgRIIIA的疾病相关。因此，我们预期插入D221N聚糖的基于 C575A的单体可以具有极佳的与DC-SIGN和FcγRIIIA两者的结合。

由于尾片段整体(in toto)去除(L448STOP突变体)导致小比例的二聚体的形成(图2C)，推测是经由hexa-Fc的Cγ2结构域中的Cys309通过单体间二硫键桥形成，所以我们在Asn563存在或不存在下设计两个另外的尾片段突变体，以探索尾片段Cys575对低聚化和经由Asn563的受体结合的作用(图1)。在不丢失Asn563聚糖的情况下，Cys575的去除产生主要形成为单体的分子(图2C)。C575A的单体(与单体IgG1-Fc对照相比)可以结合 DC-SIGN，并且与C1q结合较差，但是不能激活补体激活，如通过C5b-9 沉积所确定的。这证明，Asn563聚糖可以与受体相互作用，但是当Asn563 胜任性(competent)蛋白被表达为低聚体时，结合位点丢失，如用Asn563 胜任性突变体N297A和D221N/N297所观察到的。在二硫键介导的通过 Cys575的低聚化的不存在下，Asn563聚糖的存在推测抑制经由Cys309的另外二硫键桥接(图6)，同时允许在补体激活的不存在下与DC-SIGN相互作用。出乎意料地，Asn563和Cys575两者的去除仍然允许多种分子量的低聚体的形成，在任何其他游离半胱氨酸的不存在下，这些低聚体必须通过Cys309产生(图6)。在N563A/C575A低聚体的情况下，所有与DC-SIGN 的结合现在都通过经由Asn297上的聚糖的相互作用来贡献。有趣的是，这些N563A/C575A梯状低聚体通过与hexa-Fc相比较差地结合FcγRI，并且在占用所有其他低亲和力FcγRI方面并不比六聚体-Fc好，表明这些构建体用于在需要FcγRI的疫苗方法中使用时可能不是最佳的。在Cys575 和Asn563两者的不存在下，十八氨基酸尾片段内的其他氨基酸必须有利于单独Fc单体之间的相互作用，该相互作用然后允许经由Cys309的二硫键形成(图6)。

综上所述，我们的结果表明Asn563尾片段聚糖作为间隔区，将可以被掺入低聚体中的单体IgG1-Fc亚单位的数目限制为五或六个(图6)。作为低聚体，与DC-SIGN和C1q的结合完全依赖于在Asn297处附接的聚糖，因为在Asn563上存在的聚糖被包埋在低聚体中，仅在存在于单体IgG1-Fc，诸如本文描述的SEQ ID NO:2的蛋白的情况下时，才变得可用于受体相互作用。产生用于治疗应用的低聚Fc带来用单体Fc或Fc融合蛋白未发现的显著生物加工和安全问题，并且因此在D221N/C575A的情况下结合 DC-SIGN(和潜在的其他聚糖受体)和FcγRIIIA但不激活补体(如C575A突变体中那样)的重组单体Fc作为改进的IVIG生物模拟物可具有显著的治疗潜力。

结果-2

糖基化影响hexa-Fc的多聚化状态

为了确定hexa-Fc中两种N-连接的聚糖对多聚化和受体结合的贡献，我们使用先前描述的hexa-Fc作为模板，通过定点诱变创建一组糖基化突变体(图9)^2,3。我们还在N-末端插入另外的N-连接的附接位点(D221N)，以研究另外的糖基化对hexa-Fc功能的影响(图9)。

将这些突变的IgG1-Fc DNA转染到中国仓鼠卵巢(CHO)-K1细胞后，建立稳定的克隆细胞系，并且分泌的Fc通过蛋白A/G亲和层析纯化²。将纯化的IgG1-Fc蛋白通过SDS-PAGE和用抗人类IgG-Fc的免疫印迹来分析 (图10)。当在非还原条件下分析时(图10A)，hexa-Fc作为单体和对应于如先前描述的四聚体、五聚体和六聚体^2,3的多聚体迁移。N297A突变体导致所有这些多聚体形式的分子量轻微降低，与在Asn297处的聚糖丢失相称(图15D)，如先前所述的³。因此Asn297对多聚化没有贡献。

由于已经证明IgM中的尾片段聚糖(Asn563)的去除增强多聚体形成，主要是由于六聚体相比于五聚体增加，我们推断引入hexa-Fc的类似突变也将导致六聚体形成增强。如在N563A、N297A/N563A、D221/N563A和 D221/N297A/N563A突变体中，Asn563的去除导致形成更高等级多聚体 (HOO)，其分子量(～650-700kDa)对应于通过尺寸排阻层析确定的十二聚体形式(图10A，箭头所示，和图7对于N563A)。产生的多聚体类型不受 Asn221(D221N)处聚糖添加的影响，D221N分子的所有分子量都比不存在 Asn221的分子大(图10A和B)。

通过在还原条件下运行这些突变体，我们能够确定在每个位置处附接的多种聚糖的相对尺寸和占据率，表明Asn221和Asn563附接的聚糖比与 Asn297附接的聚糖大(图10B)。对多种糖型的分子量的这些观察还通过如下文所述的碳水化合物的HILIC-UPLC分析来确认(图11和图15)。

hexa-Fc蛋白的N-连接的糖谱

经由蛋白N-糖苷酶F(PNG酶F)从纯化的Fc构建体中释放聚糖。使用 AQUITY乙烯桥杂化(BEH)酰胺柱，经由亲水相互作用层析(HILIC) 对游离糖进行荧光标记和解析。来自在CHO-K1细胞中表达的Fc突变体的HILIC-UPLC光谱示于图11中。

来自IgG1-Fc的聚糖包含一系列岩藻糖基化的、双线的、复杂型的碳水化合物，这是对IgG观察到的典型的蛋白定向糖基化(图11A)。观察到的最丰富的物质是半乳糖基化结构，非常少的唾液酸化物质群(～2％)且完全不存在低聚甘露糖结构(表3)，这些发现与先前的观察大体上一致³。相比之下，hexa-Fc显示减少两倍的半乳糖基化的糖和增强的低聚甘露糖型 (Man₅GlcNAc₂、Man₆GlcNAc₂)结构，这与先前关于它们对DC-SIGN结合的假定贡献的观察一致(图11A和表3)。N563A和D221N/N563A多聚体中 Man₅GlcNAc₂和Man₆GlcNAc₂结构的丢失显示出这些低聚甘露糖结构被附接在尾片段中的Asn563处，而不是在如先前建模的Asn297处。

在hexa-Fc上检测到正常情况下在Fc上观察不到的三线物质(图11A、图15)。另外地，增加的末端唾液酸化在hexa-Fc上也是突出的。在hexa-Fc 的HILIC-UPLC光谱中也检测异常的二和三半乳糖基化的、二和三唾液酸化的物质。在小鼠血清糖蛋白中已经检测到类似的异常唾液酸化结构，并且如由CHO-K1细胞表达的蛋白所预期的那样，所有这些结构都经由α2,3 键附接。所有重组Fc蛋白的结构分配通过电喷雾质谱确认(图14和16)。 N563A突变体中这些唾液酸化结构的丢失显示出这些复杂结构必须位于 hexa-Fc中的尾片段Asn563聚糖上(图11A)。在还原条件下，N563A突变体表现为两条独立的带。这两条带的N-连接的聚糖分析揭示它们含有类似的糖谱，但比例不同(图11A)。

我们产生新的D221N系列突变体来研究N-连接的糖是否可以与铰链的暴露N-末端附接，以及此类糖基化对Asn297和Asn563处的糖基化加工的影响将是什么(图9)。将D221N添加到hexa-Fc支架上使总唾液酸含量加倍，同时减少低聚甘露糖型聚糖(表3和图11B)。D221N突变明显是广泛唾液酸化的主要驱动因素，因为D221N/N297A/N563A突变体中Asn297和Asn563两者的去除导致其聚糖组成为75％唾液酸化的重组多聚体，其中低聚甘露糖完全丢失，并且通常位于hexa-Fc中的Asn297上的半乳糖基化聚糖减少六倍(图11B和表3)。正如预期的那样，在糖基化缺陷型双突变体N297A/N563A上未能检测到聚糖，并且对于N297A突变体，仅观察到不能指定特定结构的微弱信号(图15)。

Asn297聚糖对于hexa-Fc与DC-SIGN而不是Siglec-1的相互作用是至关重要的

为了确定hexa-Fc上哪些N-连接的聚糖有助于受体结合，我们通过 ELISA研究一组N-糖基化突变体与可溶性重组四聚体人类DC-SIGN的相互作用(图12A)。如先前公布的，hexa-Fc结合DC-SIGN^2,3。Asn297的去除导致与该受体结合的显著丢失，而Asn563的去除(如在N563A突变体中) 仅具有轻微影响(图12A)。仍然结合DC-SIGN的N563A突变体(图11A) 中Man₅GlcNAc₂和Man₆GlcNAc₂的丢失突出表明低聚甘露糖结构对于多聚体的DC-SIGN相互作用来说不是必需的，而是涉及在Asn297处存在的其他聚糖结构。用D221N系列突变体观察到Asn297聚糖对DC-SIGN结合的类似重要贡献，与缺乏D221N插入的对照相比，所有D221N系列突变体都具有减少的与DC-SIGN的相互作用(图12A)。这表明，Asn221处 N-连接的聚糖的存在可以负面影响经由Asn297聚糖介导的相互作用。 D221N/N297A和D221N/N297A/N563A突变体(其聚糖分别为73％和75％唾液酸化的)两者与DC-SIGN的结合的缺乏也表明含有α2,3-连接的唾液酸的结构对人类DC-SIGN结合没有显著贡献，同时确认Asn297对结合的至关重要的作用。

虽然我们暂时表明低聚甘露糖可以对通过hexa-Fc(14％低聚甘露糖)的 DC-SIGN结合作出贡献³，但DC-SIGN结合中对于低聚甘露糖的需求明显不是必需的，因为两者都不含低聚甘露糖的N563A和N563A/C575A突变体仍然可以结合DC-SIGN(图15、表3)，虽然不如hexa-Fc那么好(图12A)。来自这两种突变体(其糖基化谱非常类似于单体IgG1-Fc)的数据显示出，除了Asn297上的低聚甘露糖之外的聚糖结构可以促进DC-SIGN结合(图 10A)。该发现也可以为我们先前的矛盾观察，即hexa-Fc的Endo H处理并没有消除DC-SIGN结合提供合理的解释。

D221N系列突变体的显著唾液酸化谱(图11B和表3以及图15)引导我们研究了与唾液酸依赖性人类受体Siglec-1的相互作用(图12B)。人类 Siglec-1(也称为唾液酸粘附素或CD169)是局限于单核细胞和巨噬细胞的细胞表面受体，具有对α2,3糖苷键的偏好。所有D221N组Fc蛋白都结合 Siglec-1，而不管Asn297或Asn563的存在或不存在(图12B)。事实上，通过D221N/N297A/N563A突变体的结合显示出Asn221足以与Siglec-1发生这种相互作用。正如预期的那样，碳水化合物的完全不存在(如在 N297A/N563A双敲除中发现的)或含唾液酸的聚糖的不存在(如在IgG1-Fc 单体中)产生不能与Siglec-1结合的蛋白(图12B)。我们还研究了与Siglec-2 (CD22)(一种对α2,6糖苷键具有结合偏好的受体)的结合，并且观察到这些α2,3连接的sialo-Fc与Siglec-2很少或没有结合(数据未示出)。

Asn297聚糖对于hexa-Fc与经典的Fcγ受体和补体的相互作用是至关重要的接下来，我们研究了hexa-Fc上的哪些N-连接的聚糖有助于Fcγ受体(FcγR)结合(图13)。如先前公布的，hexa-Fc以亲合力和特异性与研究的所有人类FcγR结合³。N297A或D221N/N297A突变体中Asn297的去除完全消除与所有人类FcγR的结合，证明在与FcγR的相互作用中对该Asn297 聚糖的明确要求。在Asn221处的N-末端聚糖的附接抑制与所有FcγR的结合，尽管尾片段中的N563A的去除恢复含D221N突变体(D221N/N563A) 与FcγR的结合，并且特别是与FcγRIIIA的结合。因此，N563A尾片段聚糖对于与FcγR结合是不被需要的。

hexa-Fc的多聚体结构也使能强烈激活经典的补体路径。为了研究 hexa-Fc上哪些N-连接的聚糖对C1q结合和C5b-9沉积是重要的，我们通过ELISA筛选一组突变体(图5A)。与C1q的结合和随后C5b-9沉积严重依赖于Asn297聚糖的存在。N563A或D221N/N563A突变体中Asn563尾片段碳水化合物的去除对补体激活几乎不具有影响，这与不存在Asn297 的所有突变体形成鲜明对比(图5A)。与缺乏Asn221的等效蛋白相比，将 N-连接的碳水化合物添加到铰链的N-末端(D221N和D221N/N563A)减少 C1q结合和补体激活两者(图5A)。因此，Asn297的存在对于多聚体中的补体激活是必需的。

十八氨基酸C-末端尾片段，并且特别是Cys575，在多聚IgG1-Fc的形成中是至关重要的

为了研究对于hexa-Fc的多聚化和功能所需的人类IgM尾片段的结构特征，我们产生另外的突变体，包括L448STOP、C575A、N563A/C575A、 D221N/N297A/C575A、D221N/N563A/C575A和hexa-Fc-IgA-tp，其中来自 IgM的十八氨基酸尾片段被来自人类IgA的氨基酸尾片段替代(图9)。通过引入终止密码子缺失整个尾片段(L448STOP)完全防止更高等级多聚体的形成，尽管仍然可以观察到非常小比例的二聚体和其他多聚体(图10C)。在整个尾片段的不存在下，观察到的小比例的多聚体和二聚体仅可以通过在Cys309处的单体间二硫键桥接来产生(图14)。类似地，用丙氨酸取代尾片段的Cys575残基导致大部分IgG-Fc单体的分泌，但也存在小比例的更高等级多聚体的迹象(图10C)。有趣的是，在D221处引入聚糖以及C575A 突变仅在Asn563存在下产生单体(图10D)。这表明Asn221铰链聚糖可以限制通过Cys309或尾片段介导的多聚化。

尾片段中Asn563和Cys575两者的缺失(N563A/C575A)导致从～50到大于400kDa的不同分子量的梯状模式(图10C)，最可能代表单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和六聚体，尽管未观察到与用含N563A突变体观察到的分子一致的分子(图10C)。这些梯状条带可能是通过两个相邻单体的Cys309之间的二硫键形成而产生的(图14)。将C575A突变引入D221N/N297A的骨架上(以产生D221N/N297A/C575A突变体)产生单体(图 10D)，而将C575A引入D221N/N563A骨架上产生类似的如先前用 N563A/C575A所观察到的(图10C)多聚体梯状模式(图10D)，。

用来自IgA的十八尾片段替代来自IgM的十八氨基酸尾片段产生均一的多聚体蛋白，这指示IgM尾片段中除了Asn563和Cys575之外的氨基酸参与决定多聚体组装物的总价和四元(quaternary)结构(图10E)。

Cys575的引入产生具有改变的糖基化谱和增强的与聚糖受体结合的单体

当与N563A/C575A比较时，C575A聚糖谱显示出尾片段中的Asn563 聚糖可以在C575A单体中被唾液酸化(图10C和11C)。C575A聚糖谱与用包含hexa-Fc的复杂多聚体观察到的类似(图11C和表3)，其中与IgG1-Fc 对照相比，唾液酸化增加约十六倍(表3)。显示出C575A单体在Siglec-1 结合方面完全胜任(图13)，并且与所有FcγR的结合大体上类似于IgG1-Fc 或L448STOP单体对照(图4B)。与hexa-Fc相比，C575A突变体结合C1q 较差(图5)，并且不能激活补体，如通过C5b-9沉积所确定的(图5)。

讨论-2

我们先前证明了碳水化合物在hexa-Fc与DC-SIGN结合和补体级联激活中的重要性。在本研究中，我们使用蛋白工程方法，通过研究在Cγ2结构域中的Asn297和位于hexa-Fc的十八氨基酸IgM尾片段中的Asn563处发现的两个N-连接的糖基化位点的相对贡献来确定对于多聚化和与受体结合所需的hexa-Fc的结构特征(图9)。

多聚化的人类IgA和IgM抗体因具有重链的被称为尾片段(tp)的十八氨基酸C-末端延伸而不同于其他同种型，，该先前的研究已经涉及IgA和IgM两者中的单体亚单位的多聚化。与这些早期的研究一致，我们发现如在L448STOP突变体中的那样，从hexa-Fc中完全去除尾片段产生大部分是单体的蛋白，尽管观察到非常小比例的二聚体(图10C)。此外，十八氨基酸的IgA尾片段而不是IgM尾片段的附接，导致多聚体的均一制备物，其中没有单体、二聚体或其他较低等级的多聚体形式可被检测到(图10E)。

已经证明了在Asn563处的尾片段碳水化合物的去除增强IgM中多聚体形成，同时减少IgA中的多聚化。因此，我们想知道Asn563的去除将对含有IgG1-Fc骨架和IgM-尾片段的hexa-Fc具有什么影响。引人注目地，来自Asn563中的此类缺陷突变体的大于95％的蛋白以接近十二聚体的～600kDa的分子量分泌(图10A和图7)。当来自IgA的十八氨基酸尾片段与CD4的C-末端融合时，存在十二聚体形成的先例，但是当IgM尾片段与人类IgG1-Fc融合时，十二聚体是否可出现先前尚未被文献记载。

与hexa-Fc相比，天然十二聚体IgM、IgG、IgE、或IgA的形成是不可能的，鉴于由这些抗体类型的重链的每个单体中的Fc(IgM和IgE的Fc 中的额外的Cμ2结构域)或相缔合的F(ab)₂臂的尺寸施加的另外限制。因此，尾片段中大体积碳水化合物的缺乏、IgM或IgE的Fc中Fab结构域和额外的C1恒定结构域两者的不存在，允许N563A或D22N/N563A突变体中更多的非结构化尾片段经由Cys575形成单体间二硫键，从而允许形成比先前描述的其他多聚体物质更高等级多聚体(图15)。尽管N563A或 D221N/N563A突变体的价增加，但未观察到它们结合DC-SIGN或激活补体的能力的改进(图12A和5A)。此外，N563A、D221N/N563A、和 N563A/C575A突变体都显示出与DC-SIGN的结合完全依赖于Asn297的存在。因此，这些突变体在多种治疗应用中可以具有有益的效用，在这些应用中，例如在疫苗应用中递送更多拷贝的抗原，对增加的价的需要无需以受体结合或补体激活为代价。

本研究还扩展了我们关于糖基化对Fc活性的认识。在正常情况下，在所有IgG亚类的Cγ2结构域中的氨基酸297处存在单个N-连接的糖基化位点，我们和其他人已经证明，这对于与FcγR和DC-SIGN的相互作用是至关重要的。因此，我们假设，将额外的N-连接的碳水化合物添加到Fc 的暴露区域将增强与聚糖受体的相互作用。我们已经在Fc多肽链的位置1处设计另外N-连接的序列肽段，以产生D221N系列突变体(图9)。我们首次证明了将N-连接的聚糖添加到IgG1-Fc的铰链的N-末端以产生仍然能够形成多聚体的分子是可能的(图10A)。这是意料之外的，因为N-连接的聚糖通常不与天然IgG分子(或其他种类的抗体)的铰链附接，因为N-连接的聚糖被推测为干扰二硫键形成以及铰链充当柔性连接子的能力。由于该原因，天然抗体诸如IgA可能将它们的铰链O-糖基化。尽管D221N突变体含有更大、更复杂的聚糖(图10和图11以及表3)，但用D221N突变体组未观察到在hexa-Fc上与DC-SIGN(图12A)或C1q(图5A)的结合的改进。在Asn221处引入的聚糖的存在似乎对FcγR结合具有不利影响，推测原因是干扰了位于下部铰链区内的FcγR结合位点。Asn221附接的聚糖比在Asn297处发现的聚糖大(图7和图11)，并且因此，如已经通过多聚体Fc 与抗原的融合显示的，它们的存在可以干扰FcγR结合。尽管对于D221N 六聚体可能是这种情况，但对于与FcγRIIIA的结合显著被改进的 D221N/N563A明显不适用此情况(图4A)。虽然我们还不知道更高等级多聚体的结构，但是该数据可以预期它们在结构上与hexa-Fc相比的细微差异。

由于尾片段整体去除(L448STOP突变体)导致小比例的二聚体的形成 (图10C)，推测是经由hexa-Fc的Cγ2结构域中的Cys309通过单体间二硫键桥形成，所以我们在Asn563存在或不存在下设计两个另外的尾片段突变体，以探索尾片段Cys575在多聚化和受体结合中的作用(图9)。在不丢失Asn563聚糖的情况下Cys575的去除产生主要形成唾液酸化单体的分子 (图10C和11C)。单体C575A突变体可以结合Siglec-1(图13)，并且在 DC-SIGN结合方面与D221N突变体相当，然而C575A单体仍然能够结合 FcγR，并且像IgG1-Fc对照单体一样，不能激活补体(图7)。

在二硫键介导的通过Cys575的多聚化的不存在下，Asn563聚糖的存在推测抑制经由Cys309的另外二硫键键合(图14)，因此有利于单体的形成，并且允许在补体激活的不存在下与聚糖受体诸如Siglec-1相互作用(图7和图13)。

出乎意料地，Asn563和Cys575两者的去除仍然允许多种分子量的多聚体的形成，在任何其他游离半胱氨酸的不存在下，这些多聚体必须通过 Cys309产生(图14)。在N563A/C575A多聚体的情况下，所有与DC-SIGN 的结合现在都是由于经由与Asn297附接的聚糖的相互作用。在Cys575和 Asn563两者的不存在下，十八氨基酸尾片段中的其他氨基酸必须允许单独 Fc单体之间的相互作用，该相互作用然后允许经由Cys309的二硫键形成 (图14)，这用L448STOP突变体是不可发生的，在L448STOP突变体中，整个尾片段被去除。除了Asn563和Cys575之外，其他尾片段残基参与确定hexa-Fc的最终四元结构的假设由以下发现支持：IgA尾片段而不是来自IgM的尾片段的使用导致改进六聚体IgG1-Fc的多聚化和产量(图10E)。

综上所述，我们的结果表明Asn563尾片段聚糖作为间隔区，将可以被掺入多聚体中的单体IgG1-Fc亚单位的数目限制为五或六个(图14)。作为多聚体，与聚糖受体的结合完全依赖于在Asn297处附接的聚糖，因为在Asn563处的聚糖被包埋在多聚体中，仅在存在于单体IgG1-Fc，诸如 C575A突变体的情况下时，才变得可用于影响受体相互作用。

IgG-Fc唾液酸化已经成为调节抗体的抗炎活性的重要但有争议的理念⁶。将该概念转化为有效的抗炎疗法受到难以产生适合人类使用的富含唾液酸化的产品的阻碍。迄今为止，所有方法都集中在对Fc中的位置 Asn297处唯一可用的N-连接的聚糖的化学或基因修饰上。我们描述两种增加Fc唾液酸含量的互补方法，第一种是将来自IgM的18氨基酸尾片段插入到IgG1-Fc的C-末端，其中在Cys575处进行半胱氨酸-至-丙氨酸取代 (图11和表3)，并且第二种是在Asn221处添加额外的N-聚糖。该D221N 方法导致比C575A显著更高的唾液酸化，但是这是否转化为更大的体内效力还需要被确定。因此，所有三个糖基化位点(Asn221、Asn297、和Asn563) 都被唾液酸化的单体可以产生用于在唾液酸依赖性疗法中使用的具有更大效力的分子。该方法不需要昂贵的Fc聚糖体外酶促或复杂的化学修饰，并且也不需要糖苷酶缺陷/转基因细胞系来制造它们。

尽管单体诸如C575A突变体中的C-末端尾片段唾液酸化可以对疗法有吸引力，但我们最近观察到，C-末端尾片段添加可以有利于与其他血浆蛋白的相互作用，并且因此基于铰链的增强唾液酸化的方法(如D221N突变体中)对于治疗性开发可能更容易驾驭。

产生商业多聚Fc引起了用单体Fc生产不存在的显著生物加工和安全问题。例如，已经证明了hexa-Fc中存在的高甘露糖型聚糖由于被细胞经由甘露糖受体摄取而增加IgG清除率。因此，本文开发的不含低聚甘露糖且还显示出与选择的聚糖受体的改进的结合的重组单体Fc例如作为IVIG 的替代物的可具有显著治疗潜力。此外，鉴于已知Fc-唾液酸化在减少IgG 抗体依赖性细胞的细胞毒性活性方面的作用，使用D221N/C575A突变来开发具有改变的效应功能的治疗抗体也可以是可能的。

尽管如此，多聚体Fc可以是有用的，例如当在疫苗中递送抗原或作为高亲合力受体阻断剂时。许多病原体依赖于聚糖感染宿主细胞，并且差异化糖基化的Fc-多聚体可以是有用的感染抑制剂。我们的超唾液酸化分子的一个直接应用可以是阻断逆转录病毒(包括HIV和人类T细胞白血病病毒)对淋巴细胞的Siglec-1依赖性转染(trans-infection)。我们预期这些突变体在人类细胞系例如HEK中的表达将产生具有α2,6键的超唾液酸化分子，该分子具有IVIG效力所涉及的α2,6依赖性受体如Siglec-2的改进的结合。此类受体模拟策略需要克服多于一个低亲和力聚糖结合位点的总和所产生的天然受体的高亲合力，现在可以通过D221N系列超唾液酸化多聚体实现。因此，通过在hexa-Fc内添加或去除糖基化和二硫键键合位点，可以产生效应功能的新组合。

参考文献

1.Yu，X.，Vasiljevic，S.，Mitchell，D.a.，Crispin，M.&Scanlan，C.N.Dissectingthe molecular mechanism of IVIg therapy：The interaction between serum IgG andDC- SIGN is independent of antibody glycoform or Fc domain.J.Mol.Biol.425，1253-1258 (2013).

2.Mekhaiel，D.N.A.et al.Polymeric human Fc-fusion proteins withmodified effector functions.Scientific Reports 1，(2011).

3.Czajkowsky，D.M.et al.Developing the IVIG biomimetic，Hexa-Fc，fordrug and vaccine applications.Sci.Rep.5，9526(2015).

4.B.Domon，C.E.Costello，A systematic nomenclature for carbohydratefragmentations in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates，Glycoconj J，5(1988)397-409.

表1

SEQ ID No.	也称为	与SEQ ID No：1相比的变化
			1	Hexa-Fc	无
2	C248A	在残基575处的半胱氨酸被丙氨酸取代

表2

在SEQ ID No：1中的残基编号	在SEQ ID No：2中的残基编号	本文中也称为
			Cys248	Cys248	Cys575、或IgM的位置575
N77	N77	N297
			N236	N236	N563
D1	D1	D221
			C89	C89	C309

表3

序列信息

SEQ ID NO:1–参考蛋白，也称为“Hexa-Fc或HexaGard”

SEQ ID NO:2–本发明的蛋白也称为“C248A”

SEQ ID NO:3–C248A的DNA序列

SEQ ID NO:4-比较蛋白“N236A/C248A”

SEQ ID NO:5-比较蛋白“N236A/C248A”的DNA序列

SEQ ID NO:6-比较蛋白“L448STOP”

SEQ ID NO:7–比较蛋白“L448STOP”的DNA序列

SEQ ID NO:17–在铰链区中具有另外的糖基化位点的本发明的蛋白(也称为“D1N/C248A”或“D221N/C575A”)。

Claims

1.一种蛋白，所述蛋白包含两条嵌合多肽链；其中每条嵌合多肽链包含Fc受体结合部分和免疫球蛋白尾片段区，所述Fc受体结合部分包含两个免疫球蛋白G重链恒定区；

其中与野生型免疫球蛋白的序列和糖基化相比，所述尾片段区的氨基酸序列和糖基化被修改以抑制所述蛋白的聚合。

2.根据权利要求1所述的蛋白，其中所述氨基酸序列的修改是半胱氨酸残基的丢失。

3.根据权利要求2所述的蛋白，其中所述半胱氨酸残基的丢失包括对应于SEQ ID NO:1的残基248的半胱氨酸的丢失。

4.根据权利要求3所述的蛋白，其中对应于SEQ ID NO:1的残基248的所述半胱氨酸残基被丙氨酸残基替代。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的蛋白，其中所述半胱氨酸残基的丢失包括对应于SEQ ID NO:1的残基89的半胱氨酸的丢失。

6.根据任一项前述权利要求所述的蛋白，其中与所述蛋白的糖基化位点附接的聚糖比相关对照蛋白上存在的聚糖大。

7.根据任一项前述权利要求所述的蛋白，其中终止于唾液酸(神经氨酸)的聚糖的比例比相关对照蛋白上存在的此类聚糖的比例大。

8.根据任一项前述权利要求所述的蛋白，其中所述尾片段基于选自由以下组成的组的免疫球蛋白的尾片段：IgM、IgA和IgE。

9.根据权利要求8所述的蛋白，其中所述尾片段基于IgM的尾片段。

10.根据任一项前述权利要求所述的蛋白，其中所述尾片段与天然免疫球蛋白尾片段共有至少70％的同一性。

11.根据任一项前述权利要求所述的蛋白，其中所述尾片段与SEQ ID NO:2的氨基酸残基232-249共有至少70％的同一性。

12.根据权利要求11所述的蛋白，其中所述尾片段与SEQ ID NO:2的氨基酸残基232-249共有至少90％的同一性。

13.根据任一项前述权利要求所述的蛋白，其中所述免疫球蛋白G重链恒定区源自选自由以下组成的组的免疫球蛋白：IgG1；IgG2；IgG3；和IgG4。

14.根据权利要求13所述的蛋白，其中所述免疫球蛋白G重链恒定区来源于IgG2。

15.根据任一项前述权利要求所述的蛋白，其中IgG来源的序列与它们所源自的天然IgG序列共有至少70％的序列同一性。

16.根据任一项前述权利要求所述的蛋白，所述蛋白包括SEQ ID NO:2。

17.根据任一项前述权利要求所述的蛋白，所述蛋白由SEQ ID NO:2组成。

18.根据权利要求1至15中任一项所述的蛋白，所述蛋白包括SEQ ID NO:17。

19.根据权利要求18所述的蛋白，所述蛋白由SEQ ID NO:17组成。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的蛋白，所述蛋白用于作为药物使用。

21.根据权利要求20所述的用于使用的蛋白，所述蛋白用于在静脉注射免疫球蛋白(IVIG)或皮下注射免疫球蛋白(SCIG)疗法中使用。

22.根据权利要求20或权利要求21所述的用于使用的蛋白，所述蛋白用于在预防和/或治疗自身免疫性疾病或炎性疾病中使用。

23.根据权利要求20至22中任一项所述的用于使用的蛋白，所述蛋白用于在预防和/或治疗选自由以下组成的组的自身免疫性疾病或炎性疾病种使用：自身免疫性血细胞减少症、格林-巴利综合征、重症肌无力、抗因子VIII自身免疫性疾病、皮肌炎、血管炎和葡萄膜炎。

24.根据权利要求20所述的用于使用的蛋白，所述蛋白用于作为疫苗使用。

25.根据权利要求24所述的用于使用的蛋白，其中所述蛋白与免疫调节剂缀合。

26.根据权利要求18或权利要求19所述的蛋白，所述蛋白用于在预防或治疗通过结合唾液酸依赖性受体介导的疾病中使用。

27.根据权利要求26所述的蛋白，所述蛋白用于在预防或治疗感染中使用。

28.根据权利要求27所述的蛋白，所述蛋白用于在预防或治疗逆转录病毒感染中使用。

29.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求1至28中任一项所述的蛋白，其中掺入所述组合物中的至少95％的所述蛋白呈单体形式。

30.一种预防或治疗自身免疫性疾病或炎性疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的根据权利要求1至19中任一项所述的蛋白提供至需要此类预防或治疗的受试者。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述受试者是人类受试者。

32.根据权利要求30或权利要求31所述的方法，其中所述蛋白被提供在静脉注射免疫球蛋白(IVIG)或皮下注射免疫球蛋白(SCIG)疗法中。

33.一种预防或治疗疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的根据权利要求1至19中任一项所述的蛋白作为疫苗提供给需要此类治疗的受试者。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述蛋白与免疫调节剂缀合。

35.一种预防或治疗通过结合唾液酸依赖性受体介导的疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的根据权利要求1至19中任一项所述的蛋白作为疫苗提供给需要此类治疗的受试者。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述疾病是感染。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述感染是逆转录病毒感染。

38.根据权利要求35至37中任一项所述的方法，其中所述蛋白是在权利要求18或权利要求19中所定义的。

39.一种核酸，所述核酸编码根据权利要求1至19中任一项所述的蛋白。

40.根据权利要求39所述的核酸，所述核酸用于作为药物使用。

41.一种产生根据权利要求1至17中任一项所述的蛋白的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达根据权利要求39所述的核酸。