CN109415428A - 选择性去糖基化的维生素d结合蛋白(gcmaf)，胆钙化醇(骨化醇)和制备方法 - Google Patents

选择性去糖基化的维生素d结合蛋白(gcmaf)，胆钙化醇(骨化醇)和制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及选择性去糖基化的维生素D结合蛋白(GcMAF)和胆钙化醇(骨化醇)的二聚体复合物。本发明还涉及制备这种复合物的方法，其中维生素D结合蛋白与骨化醇反应并在反应之前或之后选择性地去糖基化。最后使用截留值大于60kDa的分子筛将所得产物与具有较大分子量的杂质，特别是选择性去糖基化过程的酶，分离。

Description

选择性去糖基化的维生素D结合蛋白(GCMAF)，胆钙化醇(骨化 醇)和制备方法
技术领域
本发明涉及选择性去糖基化的维生素D结合蛋白(GcMAF)，胆钙化醇(骨化醇)和制备方法。
背景技术
已知胆钙化醇，也称为骨化醇，是人体中维生素D最重要的生理形式。因此，它经常用于膳食补充剂。它在体内转化为骨化三醇。骨化三醇与骨化醇的不同之处在于它在1和25位具有两个羟基。
骨化醇，以及骨化二醇和骨化三醇都是疏水性的；因此，维生素D通过维生素D结合蛋白在血液中运输，维生素D结合蛋白也称为Gc-球蛋白(Gc＝组特异性组分)。当维生素D结合蛋白被选择性地去糖基化时，人们获得了一种有效的巨噬细胞活化分子。这可以从引文0001即专利WO WO 01/85194 A的段落[0009]中已知。因此，该分子在下文中称为GcMAF(MAF＝巨噬细胞活化因子)。从上述文献中已知GcMAF治疗肿瘤是有效的。其认为GcMAF活化巨噬细胞，然后巨噬细胞攻击肿瘤细胞(上述文献的第[0010]段)。
另一方面，还已知骨化三醇有助于治疗肿瘤，特别是前列腺癌(所述文献的第[0064]段)。
因此，在所述文献中，还提出向癌症患者施用包含GcMAF和骨化三醇的组合物(段落[0016])，特别是患有前列腺癌和乳腺癌的患者(段落[0066])。由于没有指出具体的制备方法，因此假设两种组合物彼此分开存在并且彼此不化学键合。
根据引文0002，即专利WO WO2014/02956A：制备GcMAF，骨化三醇和不饱和脂肪酸的三聚体复合物。GcMAF首先与骨化三醇反应，从而产生二聚体复合物GcMAF-骨化三醇作为中间产物。
在本发明的上下文中，现已令人惊讶地发现，复合物GcMAF-骨化醇优于复合物GcMAF-骨化三醇：其吞噬活性更高，并且形成更少的超氧自由基阴离子(O2 ·-)。
发明内容
因此，本发明涉及选择性去糖基化的维生素D结合蛋白(GcMAF)和胆钙化醇(骨化醇)的二聚体复合物，特别是作为医药产品。
如在本发明的上下文中进一步确定的，功效在很大程度上取决于纯化的质量。因此，本发明还涉及制备这种复合物的方法，其中维生素D结合蛋白与骨化醇反应并在反应之前或之后选择性地去糖基化，其中所得产物最终与具有较大分子量的杂质分离，特别是选择性去糖基化过程的酶，使用截留值大于60kDa的分子筛，并且优选使用截留值至多10kDa的分子筛与裂解的糖残基分离。
根据本发明上下文进行的测量，已知的复合物GcMAF-骨化三醇的吞噬活性实际上与单独的GcMAF的吞噬活性相同；相反，复合物GcMAF-骨化醇具有明显更高的吞噬活性。
减少超氧自由基阴离子的产生是一个优点：虽然超氧自由基阴离子会损害肿瘤细胞，这在肿瘤治疗中只起很小的作用，但它们也会对健康细胞和巨噬细胞造成同样程度的损害，这甚至否定了超氧阴离子自由基的直接作用。
血液中维生素D的标准测试，即ELISA测试，对于骨化二醇(在25位具有羟基)具有选择性。在该试验中，首先必须将骨化二醇与维生素D结合蛋白分离，因为复合物Gc-骨化二醇不与ELISA试验的受体位点结合。由于ELISA测试的受体位点与人体中的维生素D受体相似，因此可以得出结论，该复合物也不与这些维生素D受体结合。这同样适用于复合物GcMAF-骨化三醇。然而，令人惊讶的是，已发现复合物GcMAF-骨化醇确实与ELISA试验的受体位点结合，因此也与人体的维生素D受体结合；这可能是其具有卓越效果的原因。
本发明实施例
现在将通过以下描述进一步详细解释本发明。
首先描述制备方法：根据本发明所述的复合物由Gc-蛋白质或重组Gc-蛋白质与胆钙化醇结合产生。
通过琼脂糖4B或氰基活化的磁珠或其他裂解可能性方法产生固定化酶。
使用的缓冲液或溶液：
偶联缓冲液：将16.8g碳酸氢钠和58.44g氯化钠溶于2l水中0.2M甘氨酸缓冲液：将15.01g甘氨酸溶于1l水中8M氢氧化钠浓缩液：将32g氢氧化钠溶于100ml水中0.1M乙酸盐缓冲液：将5.76ml冰醋酸(100％)加入1l水中，在其中溶解29.22g(0.5M)氯化钠，并逐滴加入8M氢氧化钠浓缩液至pH 4.0(至少50滴)水：渗透纯化(也适用于操作；电导率<0.2μS/cm)
A.)氰基活化的琼脂糖4B：
1)将1.2g氰基活化的琼脂糖4B悬浮于240ml 1M氯化钠(冷的；1l中含83.3g)中30min。将其转移至色谱柱并用60ml水冲洗。此后，通过色谱柱平衡60ml偶联缓冲液。重新缓冲后，将15ml偶联缓冲液中的凝胶转移到两个7.5ml管中，并以3000rpm离心2min。将上清液移除至4.5ml。
2.)凝胶现在被激活用于各自结合：
含有2mg半乳糖苷酶的1ml偶联缓冲液或
含有5U神经氨酸酶的1ml偶联缓冲液
将每种物质各自加入两个4.5ml凝胶中，并在26℃下旋转2h。
3.)用甘氨酸阻断琼脂糖残留的活化氰基：
将具有酶的两种凝胶转移至色谱柱，并使用5x 5ml偶联缓冲液除去未结合的酶。(也可通过离心：6000rmp，从凝胶中去除缓冲液，用偶联缓冲液清洗，反复离心；共5次)
最后：
将2x 5ml偶联缓冲液转移至15ml管中，并以3000rpm离心2min。
然后各加入10ml 0.2M甘氨酸，pH8.0，并在4-6℃下静置20h；旋转几次。
4.)未结合甘氨酸的酶活化凝胶的纯化：
将管离心并除去上清液。
通过进行5次加入偶联缓冲液，以3000rpm离心2min并除去上清液的操作来纯化酶凝胶。
此后，加入乙酸盐缓冲液代替偶联缓冲液，重复相同的步骤5次。
用加入0.05％叠氮化钠的5ml 1M氯化钠溶液清洗5次后进行储存。
最后，将凝胶转移到无菌管中并在4-6℃下储存(＝准备使用)
B.)氰基活化磁珠(CN-MB)：
1.)在100ml 1M氯化钠(冷的；1l中含有83.3g)中清洗1.2g CN-MB几次(通过离心和磁力结合)。此后，用水清洗并用偶联缓冲液平衡。
重新缓冲后，将1.2g CN-MB转移至两个0.5ml管中并以3000rpm离心2min。除去上清液。
2.)磁珠现在被活化用于各自结合：
1ml含有2mg半乳糖苷酶的偶联缓冲液
1ml含有5U神经氨酸酶的偶联缓冲液
将每种物质各自加入0.6g CN-MB中并在26℃下旋转2h。
3.)用甘氨酸阻断磁珠的剩余活化氰基：
两种CN-MB酶都通过磁体抑制，并除去上清液。加入1ml偶联缓冲液，振摇，再次磁性结合氰基活化磁珠酶并除去上清液。重复4次。通过此操作将去除未结合的酶。
然后各加入1ml 0.2M甘氨酸，pH8.0，并在4-6℃下静置20h；旋转几次。
4.)未结合甘氨酸的酶活化磁珠的纯化：
原理：磁性结合和去除纯化缓冲液
每次加入1ml偶联缓冲液，共5次；此后，加入1ml乙酸盐缓冲液，重复相同的步骤5次。
用加入0.05％叠氮化钠的1ml 1M氯化钠溶液清洗五次后，将半乳糖苷酶和唾液酸酶-磁珠在4-6℃下储存在0.5ml这样的溶液中(＝准备使用)。
用通过半乳糖苷酶和唾液酸酶(或神经氨酸酶)或氰基活化磁珠活化的氰基-琼脂糖4B裂解半乳糖或唾液酸(神经氨酸)。
使用的缓冲液：
0.1M磷酸盐缓冲液，pH6.0和7.0
将1ml Gc-蛋白质溶于1ml 0.1M磷酸盐缓冲液中，pH6.0。
将其中400μg在室温下在250ml水中透析(透析管；过滤管)；
持续时间：24h，更换3次。
A.)神经氨酸酶裂解：
将纯化的Gc-蛋白质与固定化神经氨酸酶(唾液酸酶)在10ml管中接触，如上所述，用3ml活化的琼脂糖或0.5ml活化磁珠，并在37℃，500rpm下温育2h。温育后
a.)对于神经氨酸酶活化的琼脂糖凝胶：以6000rpm离心2min，然后去除900μl。
将唾液酸酶凝胶与1ml 0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.0混合(＝再次清洗一次)，再以6000rpm离心2min，再次除去900μl。再清洗两次，离心，然后去除。合并去除的上清液。
b.)对于神经氨酸酶活化的磁珠：抑制磁珠并去除900μl。
向MB中加入1ml 0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.0，混合，再次去除900μl。此步骤进行三次，纯化去除的上清液。
a)和b)的裂解产物的纯化步骤：通过过滤器(10,000Da过滤器)以6000rpm离心5min，以除去裂解的糖残余物。
将上清液置于4ml 0.1M磷酸盐缓冲液中pH 7.0，再次过滤。此步骤进行三次。将上清液置于1ml 0.1M磷酸盐缓冲液中pH 7.0。
B.)用半乳糖苷酶裂解与用唾液酸酶或神经氨酸酶通过活化的琼脂糖或磁珠裂解相似。
裂解产物的分离，重新缓冲，纯化
a)对于琼脂糖：
将过滤残留物用1ml 0.9％氯化钠溶液悬浮。然后，以6000rpm离心2ml，并去除1ml。
将剩余物用1ml 0.9％氯化钠溶液悬浮，再以6000rpm离心2min，并去除1ml。此步骤重复两次。
b)对于磁珠：
将过滤残留物用1ml 0.9％氯化钠溶液悬浮。在此之后，只需用磁铁将磁珠抑制，然后除去蛋白质(＝α-球蛋白-N乙酰葡糖胺)。然后，每次加入1ml 0.9％氯化钠溶液，混合，施加磁铁，除去上清液。此步骤重复3次。
将所有组分一起在10,000Da过滤器中以6000rpm离心8min以浓缩溶液。(或者，可以进行压力透析。)
向残余物中加入4ml 0.9％氯化钠溶液，再以6000rpm过滤10min。残留物约为500μl。
再次加入4ml 0.9％氯化钠溶液，再以6000rmp过滤10min；将残留物溶于1ml 0.9％氯化钠溶液中。
结果：唾液酸分离；半乳糖分离；没有DNA，RNA。
最后，使用离心的方法，通过100,000Da过滤器进行过滤。GcMAF位于滤液中(约53kDa)，固定化材料的可能存在的酶在过滤残留物中分离。此产物最高纯度超过99.5％。
此后，加入胆钙化醇以形成复合物GcMAF-胆钙化固醇。使用10,000Da分子过滤器将所得复合物与过量的胆钙化醇分离(以6000rpm离心3x 10min，用10mM磷酸盐缓冲溶液PBS，pH7.4,清洗)。所需复合物的蛋白质测定显示为398ng/ml。
然而，也可以首先使胆钙化醇与Gc-蛋白反应，然后如上所述分离糖残基。
对于随后的对比试验，用骨化三醇代替胆钙化醇进行相同方法的制备。产量为440ng/ml复合物。
吞噬作用活化的测定如Hammarstrom S和Kabat EA在“Studies on specificityand binding properties of the blood group A reactive hemagglutinin from Helixpomatia",Biochemistry 10:1684-1692,1971.中所述。
将腹膜小鼠细胞在24孔板中涂覆到盖玻片上。药物处理3h后，测试培养物的吞噬活性。使用溶血兔血清(抗羊红血球C12HSB细胞，Serotec有限公司，英国)调理绵羊红细胞(SRBC)。将RPMI 1640培养基(无血清)中的经调理的绵羊红细胞SRBC(0.5％)覆盖到每个巨噬细胞涂覆的盖玻片上并培养90min。通过将盖玻片浸入低渗溶液(1/5磷酸盐缓冲溶液PBS)中来溶解非内化的血红细胞。巨噬细胞用甲醇固定，空气干燥，用吉姆萨(Giemsa)染液染色。用显微镜确定每个细胞吞噬血红细胞的数量；每个数据点计数250个巨噬细胞。数据表示为吞噬作用指数，其定义为用吞噬血红细胞的巨噬细胞的百分比乘以每个巨噬细胞的平均血红细胞数。
结果如下：
[表0001]
表1
物质 巨噬细胞活性
GcMAF-骨化醇 83.5
GcMAF-骨化三醇 73.2
GcMAF，如上所述制备 73.0
GcMAF，从德国Metavectrum购买 68
自制GcMAF的较高活性可能是由于更好的纯化，特别是使用100,000Da过滤器最终过滤。
从人全血液中测定单核细胞中超氧阴离子自由基的形成如下：
通过肝素化全血的密度梯度离心进行外周单核细胞的分离。用磷酸盐缓冲溶液PBS(不含钙/镁)将血液1∶2稀释，并铺在15ml Histopaque-1077上。此后，将该细胞悬浮液在700×g和20℃下离心30min。用巴斯德吸管小心地除去处于间期的单核细胞，用30ml磷酸盐缓冲溶液PBS(不含钙/镁)补足，并以350×g离心5min。滗析上清液，将细胞置于RPMI1640培养基中并在流式细胞仪中计数。将细胞调节至105单核细胞/升。对于测试批次，将1ml细胞悬浮液移液到每个5ml管中。脂多糖LPS 100ng/ml用作对照。测试物质(GcMAF，GcMAF-骨化醇或GcMAF-骨化三醇)的浓度为50pg/ml。将细胞在CO2培养箱中温育总共3h。温育结束前15min，各加入5μl CD45-V450抗体和1μl 1mM MitoSOX储备溶液。此后，将细胞悬浮液用各2ml RPMI培养基补足，并在室温下以350×g离心5min。滗析上清液，将细胞重悬于500μl RPMI培养基中。在流式细胞仪中测量和分析细胞。如Saharuddin Bin Mohamad，Hideko Nagasa Wa，Yoshihiro Uto和Hitoshi Hori在“Preparation of Gc Protein-Derived Macrophage Activating Factor(GcMAF)and its StructuralCharacterization and Biological Activities”，Anticancer Research 22：4297-4300(2002)中所述，基于平均荧光强度进行评估。
超氧化物形成测定
使用的方法是Johnston等人描述的方法的修改版本。简言之，在处理样品3h后，用磷酸盐缓冲溶液PBS(-)清洗板两次，用pH 7.4的，加入1.5ml 50μM细胞色素C的Krebs-Ringer磷酸盐缓冲液清洗一次，在每个孔中加入最终浓度为5μg/ml的佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)，并在湿润的培养箱中培养90min。
使用冰浴终止反应。将培养基置于Eppendorf管中并以8000g离心。使用不含细胞的板混合物作为测量基准，在540nm比色(U-2000，Hitachi公司)下，光谱测定上清液550nm的光密度。使用等式E550nm＝2.1·10-1M-1cm-1测定还原的细胞色素C的浓度。
结果如下：
[表0002]
表2
物质 超氧化物活性
GcMAF-骨化醇 142
GcMAF-骨化三醇 188
GcMAF，如上所述制备 199
GcMAF，从德国Metavectrum购买 150
可以看出，根据本发明的复合物的超氧化物活性是所有测试物质中最低的，并且与纯GcMAF的超氧化物活性相当。因此，骨化醇与GcMAF的结合可显着增加其巨噬细胞活性，但并不意味着必须接受超氧化物活性增加的缺点以实现增加巨噬细胞活性。
根据本发明的复合物可以口服给药。口服给药后测定血液中的维生素D含量，从35.9nM(给药前)升至44.25nM(给药后12h)。因此，根据本发明的复合物在口服给药时被身体吸收。而且，根据本发明的复合物无毒。
口服本发明的复合物后，单核细胞也显着增加，随后转化为巨噬细胞。

Claims (4)

1.选择性去糖基化的维生素D结合蛋白(GcMAF)和胆钙化醇(骨化醇)的二聚体复合物。
2.权利要求1所述的复合物为药物。
3.权利要求1所述复合物的制备方法，其特征在于：维生素D结合蛋白与骨化醇反应并在反应之前或之后选择性地去糖基化，使用截留值大于60kDa的分子筛把所得产物最终与具有较大分子量的杂质，特别是选择性去糖基化过程的酶，分离。
4.权利要求3所述的方法，其特征在于：使用截留值至多10kDa的分子筛将所述产物与裂解的糖残基分离。
CN201780031169.5A 2016-04-21 2017-04-21 选择性去糖基化的维生素d结合蛋白(gcmaf)，胆钙化醇(骨化醇)和制备方法 Active CN109415428B (zh)

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