CN109414465A - 益生菌组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)菌株。特别地，本发明涉及一种包含弯曲乳杆菌菌株连同另外的乳杆菌属组合的组合物以及其在治疗口腔炎性病况中的用途。

Description

益生菌组合物及其用途
技术领域
本发明涉及弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)菌株。具体地，本发明涉及包含弯曲乳杆菌菌株与另外的乳杆菌组合的组合物以及其在治疗口腔中炎症性病况的用途。
背景技术
人类微生物组计划提供了一些见解，即我们身体内部和外部的生物膜与人类共同进化并对健康起着重要作用。口腔也是如此，其中微生物群不起被动作用，而是积极地促进口腔健康的维持。然而，微生物组的某些生态变化允许病原体显现并引起口腔疾病。根据生态斑块假说，龋齿和牙周炎分别是环境诱导的耐酸和蛋白水解物种过度生长的结果。
细菌疗法是当将无害效应物菌株植入宿主的微生物群落中以通过干扰和/或抑制其他微生物、特别是病原体来维持或恢复天然微生物组时使用的术语。这可能会开辟具有较少有害副作用的对抗传染性疾病的替代方法，并且还可以帮助治疗似乎与细菌无关的疾病，例如哮喘、肥胖和糖尿病。益生菌，定义为“活的微生物，当以足够的量施用时，赋予宿主健康益处(WHO)，通常被认为是细菌疗法的候选者。潜在的作用机制尚未完全理解，但似乎清楚的是有局部(直接)和全身(间接)作用。根据Reid(2011)，潜在的途径是：i)与病原体共聚集和生长抑制，ii)细菌素和过氧化氢的产生，iii)通过对粘附位点和营养的拮抗活动进行竞争性排斥，iv)全身免疫调节。
体外研究显示了对共聚集和生长抑制的影响，并且临床研究显示了对牙龈炎症的临床参数的影响(Twetman,2012)，但对口腔中的免疫调节作用仍知之甚少。然而研究表明，短期摄入益生菌乳酸杆菌之后可以减少龈沟液中的促炎性细胞因子TNF-α(Twetman etal.,2009)并且浓度分泌型IgA可能被上调(Ericson et al.,2013)。
因此，需要有助于维持口腔健康的组合物。特别地，需要在口腔中显示出免疫调节作用并且可以用于治疗和预防如牙龈炎症或牙周炎等牙周病的组合物。
发明内容
鉴于上述现有技术做出本发明，并且本发明的目的是提供一种益生菌组合物，其可用于维持口腔健康或者用于预防或治疗口腔中的炎性病况，如牙龈炎症。
为了解决该问题，本发明提供了包含弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)菌株EB10(DSM 32307)的组合物及其使用方法。即，本发明的发明人已经发现，包含弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)的本发明的组合物能够抑制已知与牙周病如牙龈炎相关的病原体细菌菌株的生长。本发明的组合物还在未成熟的单核细胞衍生的树突细胞的体外测定中显示出高比率的IL10/12。来自体内研究的数据表明，包含弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)的本发明的组合物在4周的时间内减少了龈沟液(GCF)的体积。因此，体内研究提供了证据表明，本发明的组合物能够调节牙龈炎症的至少一种临床标志物。
本发明的第一方面提供了弯曲乳杆菌菌株EB10。根据布达佩斯条约用于专利保藏的目的，弯曲乳杆菌菌株EB10(在本文中也称为P2-2)于2016年5月4日保藏于DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏中心(因霍芬大街7B，D-38124，布伦瑞克，德国)。弯曲乳杆菌菌株EB10的保藏号是DSM 32307。
本发明的第二方面涉及包含弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)的培养物。
本发明的第三方面涉及包含弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)的组合物。
第四方面涉及包含本发明的组合物的营养保健品。
第五方面涉及包含本发明的组合物的营养补充剂。
本发明的第六方面提供了含有本发明的组合物的容器。
本发明的第七方面涉及包含多个本发明的容器试剂盒。
本发明的进一步方面提供了一种维护受试者口腔健康的方法，所述方法包括步骤：
-向有此需要的受试者提供治疗有效量的本发明的组合物。
本发明的再进一步的方面提供了一种减少受试者牙龈炎症的方法，所述方法包括步骤：
-向有此需要的受试者提供治疗有效量的本发明的组合物。
附图说明
图1显示了通过测定来自三个不同供体的未成熟单核细胞衍生的树突细胞获得的一组益生菌候选菌株的IL10/12比率(有关进一步的详细信息，请参见实施例3)。
图2显示了在来自三个不同供体的未成熟单核细胞衍生的树突细胞上测定的由选定的益生菌候选菌株(PB-01、L33、P2-2和P3-1)诱导的IL10和IL12表达。包括NCFM作为参考。有关进一步的详细信息，请参见实施例3。
图3显示了在来自三个不同供体的未成熟单核细胞衍生的树突细胞上测定的由选定的益生菌候选菌株(PB-01、L33、P2-2和P3-1)获得的IL10/12比率。有关进一步的详细信息，请参见实施例3。
图4显示了龈沟液(GCF)的体积作为干预时间的函数(益生菌对安慰剂)。有关进一步详细信息，请参见实施例4(体内研究)。1：基线，2：两周，3：3周。
图5显示了从指示为P2-2的细菌菌株弯曲乳杆菌(于2016年5月4日以菌株名称弯曲乳杆菌菌株EB10—保藏号DSM 32307保藏于DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏中心(布伦瑞克，德国))分离的基因组DNA的AscI消化(在37℃下过夜50U)。
图6显示了与安慰剂治疗相比，益生菌组合物对龈沟液的影响。星号(*)表示双向混合模型ANOVA的应用，其确认了在GCF上干预与时间之间存在统计学上显著的相互作用，p<0.05。
图7显示了在暴露于不同益生菌菌株和随后的鸡尾酒(cocktail，混合物)诱导的Th1响应后，IL10(左侧条)和IL12p70(右侧条)的ELISA测量结果。
图8显示了在暴露于不同剂量和混合的益生菌菌株及随后的鸡尾酒诱导的Th1响应后，IL10(左侧条)和IL12p70(右侧条)的ELISA测量结果(供体-16)。
图9显示了在暴露于不同剂量和混合的益生菌菌株及随后的鸡尾酒诱导的Th1响应后，IL10(左侧条)和IL12p70(右侧条)的ELISA测量结果(供体-17)。
图10显示了在暴露于不同益生菌菌株和随后的鸡尾酒诱导的Th17响应后，IL10(左侧条)和IL23(右侧条)的ELISA测量结果。
表1显示了用于临床研究的益生菌菌株的评分。个体益生菌菌株的评分与实施例6中定义的标准相关。评分的标度从0到4，并且被定义为相对评分，其中相对于获得潜在的抗炎效果，4是最佳的。
具体实施方式
在描述本发明的实施方式时，为了清楚起见，将采用特定术语。然而，本发明并不旨在限于如此选择的特定术语，并且应理解的是，每个特定术语包括以类似方式操作以实现类似目的的所有技术等同物。
本发明人对一组候选细菌菌株进行了琼脂覆盖干扰测定以识别候选菌中能够抑制已知与牙周病相关的病原体细菌菌株的生长的细菌菌株。
该组候选细菌菌株包括细菌菌株S1-P1、S1-P2、S1-P3、P2-1、P2-2、P2-3、P3-1、P3-2、P5-1，它们是从健康个体获得的口腔拭子样品中分离出来的。该组候选细菌菌株进一步包括DSM15224、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株WCFS-1、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)菌株EB01(DSM 14869)和唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)菌株L33JCM 1231(ATCC SD5208)(参见实施例1)。细菌菌株P2-2也称为弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)。
实施例2中公开了琼脂覆盖干扰测定的结果。发明人发现，即使以低密度接种(101CFU)，几种菌株也具有抑制病原体菌株生长的能力。
随后将候选细菌菌株组进行体外免疫调节测定，其中评估了候选细菌菌株刺激未成熟单核细胞衍生的树突细胞以分泌IL-10和IL-12的能力。高的IL10/12比率可能与针对牙龈炎症的防护作用相关。益生菌细菌菌株嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophillus)NCFM(ATCC 700396)包括在研究中作为参考。实施例3中公开了免疫调节测定的结果。
在测定的14个菌株中，有9个菌株显示IL10/12的比率高于5，并且4个菌株显示IL10/12的比率高于50。本发明人发现，尽管几种菌株表现出对已知与牙周病有关的病原体细菌菌株的生长抑制，但这种能力不一定与高的IL10/12比率相关，因此不一定针对炎症的防护作用相关。例如，候选菌株DSM15224、P5-1、WCFS-1和L33抑制病原体细菌菌株的生长，即使以低密度接种所述候选菌株亦如此，但未能在免疫调节测定中显示出高的IL10/12比率。
选择菌株弯曲乳杆菌菌株P3-1、弯曲乳杆菌P2-2(DSM 32307)和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)PB01(DSM 14870)进行进一步研究(基于表1中总结的评分)。发明人发现，弯曲乳杆菌菌株P3-1无法大规模生产用于临床试验，因此进一步研究限于弯曲乳杆菌P2-2(DSM 32307)和鼠李糖乳杆菌PB01(DSM 14870)。
选择细菌菌株弯曲乳杆菌P2-2(DSM 32307)(也称为弯曲乳杆菌菌株EB10)与鼠李糖乳杆菌PB01(DSM 14870)一起用于临床试验。实施例4公开了临床研究的结果。数据表明，包含弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)的组合物在4周的期间能够减少龈沟液(GCF)的体积，龈沟液(GCF)是牙龈炎症的临床标志物。因此，临床研究支持使用包含弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)的组合物作为抗炎组合物，其可以用于预防或治疗口腔中的炎性病况，如牙周病，特别是牙龈炎。
本发明的第一方面提供了弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)。根据布达佩斯条约用于专利保藏的目的，分离的弯曲乳杆菌菌株EB10于2016年5月4日保藏于DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏中心(布伦瑞克，德国)。弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)在本文中也称为弯曲乳杆菌菌株P2-2。使用该菌株的16S rRNA基因的PCR扩增片段进行16S序列分析。通过NCBI将序列在序列数据库中搜寻(blast)，证实了与弯曲乳杆菌16S rRNA具有100％的同一性的698个碱基序列。
弯曲乳杆菌EB10(DSM 32307)最初是从口腔中分离出来的，即分离自健康人类供体的口腔粘膜。由独立的实验室使用包括16S rRNA基因序列分析和关于菌株表征的PFGE在内的最新的基因型方法遗传表征了弯曲乳杆菌菌株EB10并且适当地归类为弯曲乳杆菌(有关PFGE数据，请参见实施例6)。
使用显微镜评估了弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)的形态。弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)显示为扁平的灰色菌落。细胞是长杆，形成两个细胞的链或更多细胞的短链，非孢子形成。
在一个实施方式中，分离的弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)以其纯的分离形式提供。在另一个实施方式中，弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM32307)以基本分离的形式提供。
本发明的第二方面提供一种微生物培养物、培养肉汤或发酵物，其包含本发明的弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)。包含在微生物培养物、培养肉汤或发酵物中的弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)细胞最初基本上是存活的。基本上是存活的是指，微生物培养物、培养肉汤或发酵物中存在的微生物的至少50％在其刚制备之后是存活的，如至少75％，优选至少85％，如至少90％，例如至少95％。
细菌的成活力可以通过将细菌接种在合适的培养基(例如标准大小的陪替氏培养皿中的固化琼脂)上并确定形成的菌落数来确认。该测量结果，菌落形成单位(或CFU)用于量化组合物中存活的(活的)细菌的量(反映细菌复制的能力)。
当被受试者摄入足够的量时(例如，以本文所述的配方的形式)，包含在本发明的微生物培养物、培养肉汤、发酵物和组合物中的细菌赋予受试者健康益处。由此可见，该细菌是非致病性的，并且在该摄入量下不赋予任何有害影响。该细菌也被称为益生菌。
在本发明的一个实施方式中，微生物培养物、培养肉汤或发酵物是纯的或基本上纯的，在这个意义上，存在的唯一或基本上唯一生物体是弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM32307)。
在另一个实施方式中，微生物培养物、培养肉汤或发酵物包含至少一种其他益生菌微生物，优选益生细菌。优选地，至少其他益生细菌是乳酸杆菌属。更优选地，微生物培养物、培养肉汤或发酵物包含鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)。在又另一个实施方式中，微生物培养物、培养肉汤或发酵物进一步包含唾液乳杆菌菌株LS33(ATCC SD5208)。在一个实施方式中，存在于微生物培养物、培养肉汤或发酵物中的细菌基本上由弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)组成，基本上由弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)和鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)组成，基本上由弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)和唾液乳杆菌菌株LS33(ATCC SD5208)组成，或基本上由弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)和鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)和唾液乳杆菌菌株LS33(ATCC SD5208)组成。存在于微生物培养物、培养肉汤或发酵物中的微生物优选是平衡的，使得弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)的数量不被微生物培养物、培养肉汤或发酵物中包括的其他细胞超过。例如，微生物培养物、培养肉汤或发酵物中的CFU可以均匀地分布在存在的微生物之间。
在另一个实施方式中，CFU的至少50％是弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM32307)，如CFU的至少60％，例如至少70％，如至少80％，例如至少90％，如至少95％是弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)。在进一步的实施方式中，CFU的约50％是弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM32307)且CFU的约50％是鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)。在又进一步的实施方式中，CFU的约50％是弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)而CFU的约50％是唾液乳杆菌菌株LS33(ATCC SD5208)。
第三方面提供了包含弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)的组合物。在本发明的一个实施方式中，该组合物是纯的或基本上纯的，在这个意义上，存在的唯一或基本唯一的有机体是弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM32307)。
在另一个实施方式中，组合物包含至少一种其他的益生微生物，优选益生细菌。优选地，至少其他的益生细菌是乳酸杆菌属。更优选地，组合物包含鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)。在又另一个实施方式中，组合物进一步包含唾液乳杆菌菌株LS33(ATCCSD5208)。在一个实施方式中，存在于组合物中的细菌基本上由弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM32307)组成，基本上由弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)和鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM14870)组成，基本上由弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)和唾液乳杆菌菌株LS33(ATCCSD5208)组成，或基本上由弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)和鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM14870)和唾液乳杆菌菌株LS33(ATCC SD5208)组成。存在于组合物中的微生物优选是平衡的，以便弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)的数量不被包括在组合物中的其他细菌超过。例如，组合物中的CFU可以在存在的微生物之间均匀分布。
在另一个实施方式中，CFU的至少50％是弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM32307)，如CFU的至少60％，例如至少70％，如至少80％，例如至少90％，如至少95％是弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)。在进一步的实施方式中，CFU的约50％是弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM32307)且CFU的约50％是鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)。在又进一步的实施方式中，CFU的约50％是弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)且CFU的约50％是唾液乳杆菌菌株LS33(ATCC SD5208)。
最初的菌落形成单位(CFU)以及组合物的持续稳定性和成活力受到各种因素的影响。在制造时测试的益生菌组合物的稳定性将取决于多种因素的组合。包装、温度和湿度的变化将影响益生菌产品在服用前的成活力。有助于保持益生菌菌株的新鲜度和成活力的保护因素包括冷藏、抗性包装和在凉爽干燥的地方储存。如果益生菌组合物保持在非常温暖或潮湿的条件下，则组合物中的CFU下降。因此，持续的稳定性和成活力取决于限制它们暴露于刺激的环境条件如温暖和潮湿。
在本发明的一个实施方式中，组合物包含至少105CFU的乳杆菌属/克所述组合物，如至少106CFU乳杆菌属/克所述组合物，例如至少107CFU乳杆菌属/克所述组合物，如至少108CFU乳杆菌属/克所述组合物，例如至少109CFU乳杆菌属/克所述组合物，如至少1010CFU乳杆菌属/克所述组合物。
在本发明的一个实施方式中，组合物包含105至1013CFU乳杆菌属/克所述组合物。在本发明的另一个实施方式中，组合物包含106至1012CFU乳杆菌属/克所述组合物。在又另一个实施方式中，组合物包含107至1011CFU乳杆菌属/克所述组合物。在进一步的实施方式中，组合物包含108至1010CFU乳杆菌属/克所述组合物，如109乳杆菌属/克所述组合物。
在优选的实施方式中，组合物包含弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)和鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)。在一个实施方式中，组合物包含至少107CFU弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)/克所述组合物，如至少108CFU弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)/克所述组合物，例如至少109CFU弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)/克所述组合物，如至少1010CFU弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)/克所述组合物。
在进一步的实施方式中，组合物进一步包含鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)，例如至少107CFU鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)/克所述组合物，如至少108CFU鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)/克所述组合物，例如至少109CFU鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM14870)/克所述组合物，如至少1010CFU鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)/克所述组合物。
在又进一步的实施方式中，组合物进一步包含唾液乳杆菌菌株LS33(ATCCSD5208)，例如至少107CFU唾液乳杆菌菌株LS33(ATCC SD5208)/克所述组合物，如至少108CFU唾液乳杆菌菌株LS33(ATCC SD5208)/克所述组合物，例如至少109CFU唾液乳杆菌菌株LS33(ATCC SD5208)/克所述组合物，如至少1010CFU唾液乳杆菌菌株LS33(ATCC SD5208)/克所述组合物。
本发明的组合物的乳杆菌菌株可以以任何合适的形式提供，这取决于组合物的配方。在优选的实施方式中，乳杆菌属是冻干或喷雾干燥的形式。
赋形剂
在本发明的一个实施方式中，组合物进一步包含至少一种赋形剂。在另一个实施方式中，至少一种赋形剂选自填充剂、粘合剂、上光剂、甜味剂和调味剂。
在本发明的上下文中，术语“填充剂(bulking agent)”是指增加组合物的体积或重量并同时保持其实用性和功能完整的添加剂。在本发明的一个实施方式中，组合物包含至少一种选自木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、肌醇和甘露醇微晶纤维素和异麦芽酮糖醇中的填充剂。
在本发明的上下文中，术语“粘合剂”是指将组合物的组分保持在一起，稳定形式或形状或使混合物聚结的粘合材料。在本发明的一个实施方式中，组合物包含至少一种选自麦芽糖糊精和羧甲基纤维素钠中的粘合剂。
在本发明的上下文中，术语“上光剂”指天然或合成物质，其提供蜡状均匀的涂层以保护组合物。在本发明的一个实施方式中，组合物包含至少一种选自脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯、二氧化硅、硬脂酸、蜂蜡、小烛树蜡、巴西棕榈蜡、虫胶、微晶蜡、结晶蜡、羊毛脂、氧化聚乙烯蜡、松香酯、石蜡中的上光剂。
本发明的组合物还可以包含至少一种甜味剂。在一个实施方式中，至少一种甜味剂是低热量甜味剂。
在一个实施方式中，低热量甜味剂选自由增量甜味剂和强力甜味剂组成的列表。在又一个实施方式中，低热量甜味剂是糖醇。在进一步的实施方式中，低热量甜味剂选自由木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、异麦芽酮糖醇、肌醇和甘露醇组成的列表。
组合物可以包含低热量甜味剂的组合，如上述糖醇的组合。或者，组合物还可以包含一种或多种增量甜味剂和一种或多种强力甜味剂的组合。
在一个实施方式中，组合物包含选自由糖精、阿斯巴甜、甜叶菊、甜菊糖醇糖苷如甜菊糖、三氯蔗糖和乙酰磺胺酸如乙酰磺胺酸钾(Ace-K)组成的列表中的强力甜味剂。在另一个实施方式中，甜味剂选自莱鲍迪甙、阿斯巴甜、纽甜、糖精和爱德万甜(advantame)组成的组。
本发明的组合物包含至少一种调味剂。可以包含多于一种调味剂以提供更复杂的品尝体验。在一个实施方式中，所述至少一种调味剂是选自由以下各项组成的组中的至少一种调味剂：柠檬酸、柠檬调味剂、蜜瓜调味剂、蓝莓调味剂、桃调味剂、草莓调味剂、覆盆子调味剂、可乐调味剂、巧克力调味剂、薄荷调味剂、樱桃调味剂、酸橙调味剂、橙调味剂、香草调味剂、橘子调味剂、甘草调味剂、杏调味剂、桉树调味剂、绿茶调味剂、姜调味剂和越桔调味剂。组合物中调味化合物的量可以变化。在一个实施方式中，至少一种调味剂在组合物中的量为1至10％w/w。
在优选的实施方式中，本发明的组合物包含：
(i)木糖醇和微晶纤维素、异麦芽酮糖醇形式的填充剂，
(ii)麦芽糖糊精和羧甲基纤维素钠形式的粘合剂，
(iii)脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯及二氧化硅形式的上光剂，
(iv)甜菊糖醇糖苷形式的甜味剂，和
(v)柠檬酸和柠檬调味剂的形式的调味剂。
组合物还可以包含益生元，其刺激摄取该组合物的受试者的GI中的微生物的增殖。在一个实施方式中，组合物进一步包含选自由以下各项组成的组中的至少一种益生元：唾液酸-低聚糖(SOS)、果糖-低聚糖(FOS)、半乳糖-低聚糖(GOS)、异麦芽糖-低聚糖(IMO)、木糖-低聚糖(XOS)、阿拉伯糖-木糖低聚糖(AXOS)、甘露聚糖低聚糖(MOS)、大豆的低聚糖、糖基蔗糖(GS)、乳蔗糖(LS)、唾液酸-乳糖(SL)、岩藻糖基-乳糖(FL)、乳-N-新四糖(LNNT)、乳果糖(LA)、帕拉金糖-低聚糖(PAO)、麦芽糖-低聚糖、树胶和/或其水解产物、果胶、淀粉和/或其水解产物。
本发明的组合物的配制
组合物可以任何适合的配方提供。优选地，组合物以适于口服施用的配方提供。在一个实施方式中，组合物为片剂、胶囊、粉末、泡腾片、泡腾粉、颗粒、微胶囊化产品、悬浮液、喷雾剂、凝胶或乳膏的形式。在优选的实施方式中，组合物被配制成片剂，优选咀嚼片。
在一个实施方式中，本发明的组合物被配制为药物组合物，其包含至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。
本发明的组合物的用途
本发明的一个方面提供了用作药物的组合物。发明人已经发现本发明的组合物能够在4周的期间减少作为牙龈炎症临床标志物的龈沟液(GCF)的体积。体外研究进一步证明，本发明的组合物显示出高的IL10/12比率，其表明了针对炎症如牙龈炎症的防护作用。
由此，数据提供了将包含弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)的组合物作为抗炎组合物的支持，其可用于预防或治疗口腔中的炎性病况，如牙周病，特别是牙龈炎。
因此，本发明的一个方面涉及用于治疗炎性病症的本发明的组合物。在一个实施方式中，所述炎性疾病是口腔中的炎性病况。在进一步的实施方式中，炎性病况是牙周病，如牙龈炎或牙周炎。在优选的实施方式中，炎性病况是牙龈炎。
组合物可以作为每日一次剂量施用。因此，组合物可以相应地配制为例如一个日剂量单位。组合物还可以每日两次剂量施用，每日三次剂量施用或甚至每日施用数次。因此，可以根据施用方案配制组合物。在本发明的一个实施方式中，组合物可以每日施用两次。
在一个实施方式中，组合物包含至少107CFU乳杆菌属/每日剂量，如在107至1010CFU乳杆菌属/每日剂量的范围内，如108至109CFU乳杆菌属/每日剂量。
在一个实施方式中，组合物包含至少107CFU弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)/每日剂量，例如至少5x 107CFU弯曲乳杆菌菌株EB10/每日剂量，如在107至1010CFU弯曲乳杆菌菌株EB10/每日剂量的范围内，如108至109CFU弯曲乳杆菌菌株EB10/每日剂量。
在另一个实施方式中，组合物进一步包含鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)。在一个实施方式中，组合物进一步包含至少107CFU鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)/每日剂量，例如至少5x 107CFU鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)/每日剂量，如在107至1010CFU鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)/每日剂量的范围内，如108至109CFU鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)/每日剂量。
在一个实施方式中，组合物包含至少107CFU弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)/每日剂量，如至少5x 107CFU弯曲乳杆菌菌株EB10/每日剂量，以及至少1x 107CFU鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)/每日剂量，如至少5x 107CFU鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM14870)/每日剂量。
在另一个实施方式中，组合物进一步包含唾液乳杆菌菌株LS33(ATCC SD5208)。在一个实施方式中，组合物进一步包含至少107CFU唾液乳杆菌菌株LS33(ATCC SD5208)/每日剂量，例如至少5x 107CFU唾液乳杆菌菌株LS33(ATCC SD5208)/每日剂量，如在107至1010CFU唾液乳杆菌菌株LS33(ATCC SD5208)/每日剂量范围内，如108至109CFU唾液乳杆菌菌株LS33(ATCC SD5208)/每日剂量。
在一个实施方式中，组合物包含至少107CFU唾液乳杆菌菌株LS33(ATCC SD5208)/每日剂量，如至少5x 107CFU唾液乳杆菌菌株LS33(ATCC SD5208)/每日剂量，以及至少1x107CFU唾液乳杆菌菌株LS33(ATCC SD5208)/每日剂量，如至少5x 107CFU唾液乳杆菌菌株LS33(ATCC SD5208)/每日剂量。
在一个实施方式中，组合物包含至少107CFU弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)/每日剂量，如至少5x 107CFU弯曲乳杆菌菌株EB10/每日剂量，以及至少1x 107CFU唾液乳杆菌菌株LS33(ATCC SD5208)/每日剂量，如至少5x 107CFU唾液乳杆菌菌株LS33(ATCCSD5208)/每日剂量。
在本发明的一个实施方式中，用于根据本发明的用途的组合物被口服施用。为此，可以以片剂、胶囊、粉末、泡腾片、泡腾粉、颗粒、微胶囊化产品、悬浮液、喷雾剂、凝胶或乳膏的形式提供该组合物。在优选的实施方式中，组合物配制成片剂，优选咀嚼片。
本发明的一个方面涉及一种维持受试者口腔健康的方法，所述方法包括步骤：
-向有此需要的受试者提供治疗有效量的根据本发明所述的组合物。
本发明的另一方面涉及一种减少受试者中牙龈炎症的方法，所述方法包括步骤：
-向有此需要的受试者提供治疗有效量的根据本发明所述的组合物。
本发明的又另一方面涉及一种减少受试者中龈沟液(GCF)体积的方法，所述方法包括步骤：
-向有此需要的受试者提供治疗有效量的根据本发明所述的组合物。
在一个实施方式中，方法包括进一步的步骤：在治疗期间取样并且监测龈沟液(GCF)的体积，例如通过参考治疗开始前龈沟液(GCF)的体积。
上述方法优选包含每日施用本发明的组合物。在一个实施方式中，提供给受试者的组合物包含至少107CFU乳杆菌属/每日剂量，如在107至1010CFU乳杆菌属/每日剂量的范围内，如108至109CFU乳杆菌属/每日剂量。
在一个实施方式中，组合物包含至少107CFU弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)/每日剂量，例如至少5x 107CFU弯曲乳杆菌菌株EB10/每日剂量，如在107至1010CFU弯曲乳杆菌菌株EB10/每日剂量的范围内，如108至109CFU弯曲乳杆菌菌株EB10/每日剂量。
在另一个实施方式中，组合物进一步包含鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)。在一个实施方式中，组合物进一步包含至少107CFU鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)/每日剂量，例如至少5x 107CFU鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)/每日剂量，如在107至1010CFU鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)/每日剂量的范围内，如108至109CFU鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)/每日剂量。
在一个实施方式中，组合物包含至少107CFU弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)/每日剂量，如至少5x 107CFU弯曲乳杆菌菌株EB10/每日剂量，以及至少1x 107CFU鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)/每日剂量，如至少5x 107CFU鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM14870)/每日剂量。
补充剂
在本发明的上下文中，营养补充剂(或膳食补充剂)是一种用于摄食的产品，其含有“膳食成分”，旨在为饮食增加(补充)营养价值。
本发明的一个方面提供一种营养补充剂，其包含本发明的组合物。
在本发明的上下文中，术语“营养保健品”是指源自食物来源的产品，除了食物中的基本营养价值外，还具有本文所述的额外健康益处。本发明的营养保健品可以有助于维持受试者的口腔健康，并降低在口腔中获得炎性病况(如牙周病，例如牙龈炎)的风险。本发明的营养保健品还可以减少龈沟液(GCF)的体积(其是牙龈炎症的一种临床标志物)并从而有助于预防或治疗牙龈炎症。
本发明的一个方面提供了一种包含本发明的组合物的营养保健品。在一个实施方式中，营养保健品以功能性食品的形式提供。功能性食品是包括全食品并且用本发明的组合物强化的类别。在另一个实施方式中，营养保健品以医疗食品的形式提供。在合格的医生的监督下，医疗食品被配制成在内部消费或施用。
营养补充剂可以多种形式提供，如片剂(如咀嚼片)、泡腾片、泡腾粉、胶囊、软凝胶、软胶囊、液体或粉末。
本发明的营养补充剂可以有助于维持受试者的口腔健康并降低在口腔中获得炎性病况(如牙周病，例如牙龈炎)的风险。本发明的营养补充剂还可以减少龈沟液(GCF)的体积(其是牙龈炎症的临床标志物)并从而有助于预防或治疗牙龈炎症。
包装
本发明的组合物通常装在容器中，该容器优选是密封的，这提供了氧气和湿气屏障以保持组合物的完整性。
因此，本发明的一个方面涉及一种含有本发明的组合物的容器。合适容器的非限制性实例包括泡罩包装(如片剂的泡罩包装)、棒、袋、小袋(pouch)或胶囊。在优选的实施方式中，容器是铝箔或聚乙烯棒，其通常通过焊接密封。棒通常被配置为易于撕开。棒可以具有撕开缺口。因此，在摄取组合物后可以将棒丢弃。优选地，如为片剂的棒状或泡罩包装形式的容器包含单剂量的组合物。
容器可以包含干燥剂，以促使或维持组合物的干燥状态(干燥)。干燥剂可以是固体以外的形式，并且可以通过其他原理工作，例如化学键合水分子。
干燥剂可以是适用于食品或药物应用的任何干燥剂。干燥剂的实例包括二氧化硅、活性炭和分子筛。
在本发明的进一步方面，提供了一种试剂盒，其中试剂盒包含多个容器，每个容器包含本发明的组合物。优选地，试剂盒的每个容器包含单剂量的组合物。试剂盒的每个容器可以包含相同的组合物。或者，容器可以包括不同的组合物，例如，该组合物可以包含不同的调味剂。
在描述本发明的实施方式时，没有明确地描述所有可能实施方式的组合和置换。尽管如此，仅在相互不同的从属权利要求中陈述或在不同实施方式中描述的某些措施的事实并不表示这些措施的组合不能有利地加以利用。本发明设想了所述实施方式的所有可能的组合和置换。
术语“包含(comprising)”、“包括(comprise)”和“含有(comprises)”在本文中，在每个例子中，本发明人意旨可可选地分别用术语“由……组成(consisting of)”、“由……组成(consist of)”和“由……组成(consists of)”来替换。
在以下非限制性项目中进一步描述了本发明：
项目1.弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)菌株EB10(DSM 32307)。
项目2.一种包含弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)的培养物。
项目3.根据项目2所述的培养物，其包含至少一种其他的乳酸杆菌属(Lactobacillus sp.)。
项目4.根据项目2或3所述的培养物，其进一步包含鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)菌株PB01(DSM 14870)。
项目5.一种包含弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)的组合物。
项目6.根据项目5所述的组合物，其包含至少一种其他的乳酸杆菌属。
项目7.根据项目5或6所述的组合物，其进一步包含鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM14870)。
项目8.根据项目6或7所述的组合物，其中组合物包含105至1013CFU乳杆菌属/克所述组合物。
项目9.根据项目5至8中任一项所述的组合物，其中组合物包含106至1012CFU乳杆菌属/克所述组合物。
项目10.根据项目5至9中任一项所述的组合物，其中组合物包含107至1011CFU乳杆菌属/克所述组合物。
项目11.根据项目5至11中任一项所述的组合物，其中组合物包含108至1010CFU乳杆菌属/克所述组合物，如109乳杆菌属/克所述组合物。
项目12.根据项目5至11中任一项所述的组合物，其包含弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM32307)和鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)。
项目13.根据项目5至12中任一项所述的组合物，其包含至少107CFU弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)/克所述组合物。
项目14.根据项目13所述的组合物，其包含至少107CFU鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)/克所述组合物。
项目15.根据前述项目是任一项所述的组合物，其中所述乳杆菌属是冻干或喷雾干燥的形式。
项目16.根据前述项目中任一项所述的组合物，其进一步包含至少一种赋形剂。
项目17.根据项目16所述的组合物，其中至少一种赋形剂选自由以下各项组成的组：填充剂、粘合剂、上光剂、甜味剂和调味剂。
项目18.根据项目17所述的组合物，其中所述填充剂是选自由以下各项组成的组中的至少一种填充剂：木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、肌醇和甘露醇微晶纤维素和异麦芽酮糖醇。
项目19.根据项目17或18所述的组合物，其中所述粘合剂是选自由以下各项组成的组中的至少一种粘合剂：麦芽糖糊精和羧甲基纤维素钠。
项目20.根据项目17至19中任一项所述的组合物，其中所述上光剂是选自由以下各项组成的组中的至少一种上光剂：脂肪酸的单甘油酯和甘油二酯、二氧化硅、硬脂酸、蜂蜡、小烛树蜡、巴西棕榈蜡、虫胶、微晶蜡、结晶蜡、羊毛脂、氧化聚乙烯蜡、松香酯、石蜡。
项目21.根据项目17至20中任一项所述的组合物，其中所述甜味剂是选自由以下各项组成的组中的至少一种甜味剂：甜叶菊、甜菊糖醇糖苷如甜菊甙和莱鲍迪甙、阿斯巴甜、三氯蔗糖、纽甜、乙酰磺胺酸钾(Ace-K)、糖精和advantame。
项目22.根据项目17至21中任一项所述的组合物，其中所述调味剂是选自由以下各项组成的组中的至少一种调味剂：柠檬酸、柠檬调味剂、蜜瓜调味剂、蓝莓调味剂、桃调味剂、草莓调味剂、覆盆子调味剂、可乐调味剂、巧克力调味剂、薄荷调味剂、樱桃调味剂、酸橙调味剂、橙调味剂、香草调味剂、橘调味剂、甘草调味剂、杏调味剂、桉树调味剂、绿茶调味剂、姜调味剂和越桔调味剂。
项目22.根据前述项目中任一项所述的组合物，其包含：
(i)木糖醇和微晶纤维素、异麦芽酮糖醇形式的填充剂，
(ii)麦芽糖糊精和羧甲基纤维素钠形式的粘合剂，
(iii)脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的及二氧化硅形式的上光剂，
(iv)甜菊糖醇糖苷形式的甜味剂，和
(v)柠檬酸和柠檬调味剂的形式的调味剂。
项目23.根据前述项目中任一项所述的组合物，其中组合物为片剂、胶囊、粉末、泡腾片、泡腾粉、颗粒、微胶囊化产品、悬浮液、喷雾剂、凝胶或乳膏的形式。
项目24.根据前述项目中任一项所述的组合物，用于作为药物施用。
项目25.根据前述项目中任一项所述的组合物，用于在炎性病况的治疗中使用。
项目26.根据项目25所述的用于使用的组合物，其中所述炎性疾病是口腔中的炎性病况。
项目27.根据项目25所述的用于使用的组合物，其中所述炎性病况是牙周病，如牙龈炎或牙周炎。
项目28.根据项目24至27中任一项所述的用于使用的组合物，其中组合物包含107至1010CFU乳杆菌属/每日剂量，如108至109CFU乳杆菌属/每日剂量。
项目29.根据项目28所述的用于使用的组合物，其中组合物包含至少5x 107CFU弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)/每日剂量。
项目30.根据项目28或29所述的用于使用的组合物，其中组合物包含至少5x107CFU鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)/每日剂量。
项目31.根据项目24至30中任一项所述的用于使用的组合物，其中组合物每日施用两次。
项目32.根据项目24至31中任一项所述的用于使用的组合物，其中组合物是口服施用的。
项目33.一种包含根据前述项目中任一项所述的组合物的营养保健品。
项目34.一种包含根据前述项目中任一项所述的组合物的营养补充剂。
项目35.一种含有根据前述项目中任一项所述的组合物的容器。
项目36.根据项目35所述的容器，其中容器选自由以下各项组成的列表：泡罩包装、棒、袋、小袋或胶囊。
项目37.根据项目35或36所述的容器，其包含一个剂量的所述组合物。
项目38.一种包含多个根据项目35至37中任一项所述的容器的试剂盒。
项目39.一种用于维持受试者口腔健康的方法，所述方法包括步骤：
-向有此需要的受试者提供治疗有效量的根据前述项目中任一项所述的组合物。
项目40.根据项目39所述的方法，其中组合物包含至少107CFU乳杆菌属/每日剂量，如在107至1010CFU乳杆菌属/每日剂量的范围内，如108至109CFU乳杆菌属/每日剂量。
项目41.根据项目39或40所述的方法，其中组合物包含弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM32307)。
项目42.根据项目41所述的方法，其中组合物进一步包含鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)。
项目43.根据项目39至42中任一项所述的方法，其中组合物包含至少5x 107CFU弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)/每日剂量。
项目44.根据项目43所述的方法，其中组合物包含至少5x 107CFU鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)/每日剂量。
项目45.一种用于减少受试者中牙龈炎症的方法，所述方法包括步骤：
-向有此需要的受试者提供治疗有效量的根据前述项目中任一项所述的组合物。
项目46.一种用于减少、缓解或预防受试者中与牙龈炎症相关的牙周病的方法，所述方法包括步骤：
-向有此需要的受试者提供治疗有效量的根据前述项目中任一项所述的组合物。
项目47.一种用于减少受试者中龈沟液的方法，所述方法包括步骤：
-向有此需要的受试者提供治疗有效量的根据前述项目中任一项所述的组合物。
实施例
实施例1
细菌菌株
候选益生菌菌株
菌株ID 保藏号
S1-P1 发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)
S1-P2 发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)
S1-P3 副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)
DSM15224 nd
P2-1 鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)
P2-2 弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus) DSM 32307<sup>*</sup>
P2-3 弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)
P3-1 弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)
P3-2 弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)
P5-1 鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus curvatus)
WCFS-1 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
PB01 鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus) DSM 14870
EB01 加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri) DSM 14869
LS33 唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)菌株JCM 1231 ATCC SD5208
*)根据布达佩斯条约用于专利保藏的目的，弯曲乳杆菌(Lactobacilluscurvatus)菌株EB10(在本文中也称为P2-2)于2016年5月4日保藏于DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏中心(布伦瑞克，德国)。
菌株S1-P1、S1-P2、S1-P3、P2-1、P2-2、P2-3、P3-1、P3-2、P5-1是从健康个体获得的口腔拭子样品中分离出的。
在本体外研究中使用了六种口腔病原体细菌菌株：
与龋齿有关的两种病原体菌株：变形链球菌(Streptococcus mutans)ChDC YM3116S核糖体RNA基因(CCUG 17824)和格氏链球菌(Streptococcus gordonii)(CCUG 25608)。
与牙龈炎有关的四种病原体菌株：牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)(ATCC 33277)、中间普雷沃氏菌(Prevotella intermedia)菌株OH5061(CCUG 27725)、伴放线菌集聚杆菌(Aggregatibacteractinomycetemcomitans)HK1651和具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)(ATCC 49256)。
已显示两种链球菌菌株参与了龋齿的起始和发展。特别是变形链球菌是酸性生物膜的主要指示菌株之一。中间普雷沃氏菌和具核梭杆菌都属于“橙色复合体”，它存在于生物膜中，通常先于“红色复合体”中的细菌。红色复合体最常见于牙周袋深处。牙龈啉酶单胞菌属于‘红色复合体’。伴放线菌集聚杆菌与罕见病况侵袭性牙周炎的发展有关。中间普雷沃氏菌和牙龈卟啉单胞菌由于生成挥发性硫化合物而被认为造成口臭。
实施例2-琼脂覆盖干扰测定
培养
最初将实施例1的乳杆菌在MRS琼脂(Oxoid Ltd.,Hampshire,UK)上培养16-20小时。然后将每种细菌的不同菌落转移到4.5ml MRS(Oxoid Ltd.,Hampshire,UK)肉汤中再培养16-20小时。在补充有半胱氨酸、甲萘醌和马血的TSA板(Oxoid Ltd.,Hampshire,UK)上将病原体培养16-20小时，并且在第二天，将每种细菌的纯菌落转移到2ml BHI肉汤(OxoidLtd.,Hampshire,UK)中并且再培养16-20小时。在厌氧室中以37°进行细菌的培养。
琼脂覆盖干扰测试
将乳杆菌的肉汤培养物的光密度在630nm下调节至1.8(Genesis 10uv,ThermoScientific,Madison,WI,USA)。然后将培养物以10倍步骤连续稀释。在抑制测定中使用未稀释的悬浮液和对应于105、103和101CFU/ml的细胞悬浮液。将1毫升每种乳杆菌悬浮液加入到24ml熔融的无菌MRS琼脂中(约45℃)并且浇铸平板。将未添加乳杆菌的平板用作对照平板。当琼脂凝固时，将平板在厌氧气氛中培养过夜。次日(20h后)，将23ml补充有半胱氨酸、甲萘醌和马血的TSA琼脂(Oxoid Ltd.,Hampshire,UK)的第二层浇铸在具有生长的乳酸杆菌的MRS琼脂之上。使平板在室温下干燥3小时。用相同培养基稀释在BHI肉汤中生长的病原体的肉汤培养物，并在500nm处测量OD并调节至0.2。用Steer's复制因子(CMI-Promex ICN,Pedricktown,NJ,USA)将病原体的悬浮液压印在平板上。将平板在室温下放置1小时以干燥，随后在厌氧室中于37℃下培养过夜。然后将添加有乳杆菌的平板上病原体的生长与对照平板上的进行比较。根据Simark-Mattsson et al.[2007]将琼脂覆盖测试的结果进行分类：评分0＝完全抑制(无可见的菌落)，评分1＝轻微抑制(至少一个可见的菌落，但绝对少于对照平板上的数量)和评分2＝无抑制(与对照平板上的生长相同)。平板的评估由两名独立观察员进行，如果存在分歧，则在讨论后达成共识。在三种不同的场合重复所有生长抑制测定。
在变形链球菌和格氏链球菌的病原体菌株上进行的琼脂覆盖干扰的结果。
在中间普雷沃氏菌菌株、伴放线菌集聚杆菌和具核梭杆菌的病原体菌株上进行的琼脂覆盖干扰的结果。
实施例3-免疫调节-体外研究
在培养基中，将来自三个不同供体的未成熟单核细胞衍生的树突细胞暴露于100μg/mL实施例1的益生菌候选物24小时。将益生细菌菌株嗜酸乳杆菌NCFM(ATCC 700396)包括作为参考。随后，在细胞培养上清液中，使用ELISA分别测量益生菌诱导的IL-10和IL-12分泌。
早期的一项研究表明，IL10/12平衡的体外益生菌免疫调节可以预测TNBS诱导的结肠炎小鼠模型体内的保护作用(B.Foligne et al.,World J Gastroenterol 2007,13:236-243)。这种相关性已经被其他人证实，并且已经显示出用于预测由益生菌介导的潜在抗炎调节的一般价值。
通过在来自三个不同供体的未成熟单核细胞衍生的树突细胞上测定获得的一组益生菌候选菌株的IL10/12比率示于图1中。
数据显示，在测定的14种菌株中，9个菌株显示IL10/12的比率高于5并且4个菌株显示出IL10/12的比率高于50。
获得的PB01、P2-2、P3-1、LS33和NCFM的数据进一步详细示于图2和图3中。数据表明，PB01和LS33益生菌上清液中的IL10/12比率非常相同(平均～20)，相比之下，NCFM上清液中的比率较低(三次测量)。P2-2和P3-1中的IL10/12平衡甚至比PB01和LS33更加显著，达到了大于100的水平。
在Foligne et al.的研究中，在用LS33处理24小时的PBMC上清液中，与NCFM相比，相对较高的IL10/12比率(中位数～20)与小鼠结肠炎模型中的保护作用相关，NCFM在体外诱导较低的IL-10/12比率(中位数～2)并且在体内不提供保护。
本体外研究表明，PB01、P2-2和P3-1可以发挥与LS33相同的抗炎特性，因为两种益生菌都在体外诱导了未成熟的树突细胞分泌相似的IL-10和IL-12水平。
实施例4-临床试验研究
目的
本研究的目的是研究含有益生菌候选菌株的片剂对牙龈炎症程度的影响。
研究设计
本研究计划和实施为双盲安慰剂对照随机试验，有两个平行臂。干预期计划为4周。将该研究计划提交伦理委员会批准。
研究组
参与者是在牙科学院的诊所的患者中以及通过www.forsogsperson.dk招募的。在口头和书面告知之后，邀请并招收了50名18至50岁的参与者。在知情同意后，通过计算机程序将参与者随机分配到益生菌组或安慰剂组。
纳入标准是：
i)存在至少两个口腔边缘部位，其具有中度至重度牙龈炎症并且探测深度≤5mm
ii)探测时出血(BOP)
排除标准是：
i)习惯性摄入益生细菌
ii)定期吸烟
iii)怀孕
iv)在基线前最后两个月内摄入抗生素
v)低刺激的唾液率(0.8ml/min)
vi)多个未经治疗的开放性龋齿病变的积极衰变。
方法
干预：在知情同意、基线检查和取样后，将参与者随机分配到研究组之一，并给予益生菌片或安慰剂片。
益生菌片以109CFU/片的剂量含有鼠李糖乳杆菌PB01和弯曲乳杆菌EB10。安慰剂片剂的大小和组成相同，但没有添加益生菌菌株。两种片剂均由Bifodan A/S提供。指示参与者在早晨和晚上刷牙后30分钟各服用一片。将片剂包装在具有颜色编码的相同罐中。向调查都隐瞒编码直到分析完成。
在基线登记后，参与者被指示每天服用两片药片，持续四周，并要求他们保持摄入量的日志。在两周、四周和六周后进行随访登记。
临床程序：每次就诊时，收集GCF并记录噬斑指数(PI)、牙龈指数(GI)和探测出血(BOP)。
GCF：为了收集GCF，从每个参与者中选择来自上门牙、犬齿或前磨牙的两个对侧口腔部位。除去选定牙齿上的视觉龈上噬斑，并用用棉球干燥这些部位。使用轻轻插入牙龈沟20秒的取样纸条带(periopaper strips)(ProFlow,Amityville,NY,USA)收集GCF。使用Peritron 8000(Proflow)记录GCF的体积并且表达为μL。然后将条带转移到塑料管中并储存在-80℃直至进一步分析。
统计方法：使用SPSS软件(v 22.0；Chicago,Ill,USA)处理数据。通过Wilcoxon配对双侧检验将每组内的随访值与基线进行比较，并且通过Wilcoxon未配对检验分析组间的差异。用卡方检验对比分类数据。p-值<0.05被认为是统计显著的。
科学重要性
数据表明，在GCF上干预与时间之间存在统计学上显著的相互作用，p<0.05(双向混合模型ANOVA)，参见图4和图6。
因此，该研究提供的证据表明，益生菌片剂影响了牙龈炎症的至少一种临床标志物和/或促炎性(pro-inflammatory)细胞因子和抗炎性(anti-inflammatory)细胞因子，这可以获得牙龈炎的新的补充治疗。
实施例5–片剂
实施例6-细菌菌株的表征
在37℃下使用50U的AscI消化将细菌菌株标示为P2-2的弯曲乳杆菌(在本文中也称为EB10)、弯曲乳杆菌P3-1和鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)分离的DNA消化过夜。将AscI消化的DNA加载到1.1％琼脂糖上，并在0.5X TBE缓冲液中运行(脉冲时间:2-30s,5.3V/cm)。结果如图5所示。
实施例7-Th1和Th17响应的抑制
根据先前描述的程序(Gad et al.FEMS Immunol Med Microbiol 2011,63:93-107)从三个不同的供体建立人树突细胞。根据先前描述的程序(Gad et al.FEMS ImmunolMed Microbiol 2011,63:93-107；Jensen&Gad,Journal of Inflammation 2010,7:37)，测量益生菌菌株抑制或减少鸡尾酒诱导的促炎性Th1-和Th17响应的能力。将益生菌菌株(100μg冷冻干燥的丸粒)暴露于树突状细胞6小时，之后加入Th1鸡尾酒(Gad et al.FEMSImmunol Med Microbiol 2011,63:93-107)或Th17鸡尾酒(Jensen&Gad,Journal ofInflammation 2010,7:37)并且培养24小时。作为这些实验中的对照，使用未暴露于益生菌菌株的树突细胞。培养24小时之后，通过先前描述的ELISA(Gad et al.FEMS Immunol MedMicrobiol 2011,63:93-107)，相对于Th1响应测量IL-10和IL-12p70的分泌，并且相对于Th17响应测量IL-23和IL-12p70的分泌。三个供体的这些测量结果分别显示在图7和图10中。
为了评估益生菌菌株减少Th1或Th17促炎性响应的能力，定义了以下标准。希望在暴露于未成熟DC后的高IL-10/IL12p70比率。在益生菌暴露及后续鸡尾酒诱导的Th1响应后，希望低的IL12p70水平和增加的IL-10/IL12p70比率。在益生菌暴露及后续鸡尾酒诱导的Th17响应后，希望低水平的IL23和增加的IL-10/IL-23。随后对这些标准的实现进行评分，如表1所示，以没有益生菌暴露的样品作为参考。
除了这些实验，还使用选定的菌株(P2-2、P3-1和PB01)进行了剂量响应研究，以观察益生菌剂量以及混合菌株对减少鸡尾酒诱导的Th1响应的能力的影响。该实验在两个不同供体中的结果显示在图8和图9中。
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Claims (15)

1.弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)菌株EB10(DSM 32307)。
2.一种包含弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)菌株EB10(DSM 32307)的培养物。
3.根据权利要求2所述的培养物，包含至少一种另外的乳酸杆菌属(Lactobacillussp.)，如鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株PB01(DSM 14870)。
4.一种包含弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)菌株EB10(DSM 32307)的组合物。
5.根据权利要求4所述的组合物，包含至少一种另外的乳酸杆菌属(Lactobacillussp.)，如鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株PB01(DSM 14870)。
6.根据权利要求4或5所述的组合物，其中，所述组合物包含105至1013CFU乳杆菌属/克所述组合物，如106至1012CFU乳杆菌属/克所述组合物，例如107至1011CFU乳杆菌属/克所述组合物，如108至1010CFU乳杆菌属/克所述组合物，如109乳杆菌属/克所述组合物。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的组合物，包含弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)和鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)，如至少107CFU弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)/克所述组合物和至少107CFU鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)/克所述组合物。
8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述组合物为片剂、胶囊、粉末、泡腾片、泡腾粉、颗粒、微胶囊化产品、悬浮液、喷雾剂、凝胶或乳膏的形式。
9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，用于作为药物使用。
10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，用于在口腔中的炎性病况如炎性病况的治疗中使用。
11.根据权利要求10所述的用于使用的组合物，其中，所述炎性病况为牙周病如牙龈炎或牙周炎。
12.根据权利要求10至11中任一项所述的用于使用的组合物，其中，所述组合物包含107至1010CFU乳杆菌属/每日剂量，如108至109CFU乳杆菌属/每日剂量。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的用于使用的组合物，其中，所述组合物包含至少5x107CFU弯曲乳杆菌菌株EB10(DSM 32307)/每日剂量并且可选地所述组合物进一步包含至少5x 107CFU鼠李糖乳杆菌菌株PB01(DSM 14870)/每日剂量。
14.一种营养保健品或营养补充剂，包含根据前述权利要求中任一项所述的组合物。
15.一种维持受试者口腔健康的方法，所述方法包括步骤：
-向有此需要的受试者提供治疗有效量的根据前述权利要求中任一项所述的组合物。
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