CN109414151A - 癌症检测装置、癌症检测方法和用于癌症检测的染色剂 - Google Patents

癌症检测装置、癌症检测方法和用于癌症检测的染色剂 Download PDF

Info

Publication number
CN109414151A
CN109414151A CN201780036233.9A CN201780036233A CN109414151A CN 109414151 A CN109414151 A CN 109414151A CN 201780036233 A CN201780036233 A CN 201780036233A CN 109414151 A CN109414151 A CN 109414151A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cancer
coloring agent
living cells
related gene
detection device
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201780036233.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109414151B (zh
Inventor
沟口明
田中光司
片山直之
野阪哲哉
田中匡介
王淑杰
垣内爱加
崔煌植
木村志
木村一志
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
New Oji Paper Co Ltd
Original Assignee
Oji Paper Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/JP2017/006962 external-priority patent/WO2017146184A1/ja
Application filed by Oji Paper Co Ltd filed Critical Oji Paper Co Ltd
Publication of CN109414151A publication Critical patent/CN109414151A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109414151B publication Critical patent/CN109414151B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57496—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving intracellular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B1/00—Instruments for performing medical examinations of the interior of cavities or tubes of the body by visual or photographical inspection, e.g. endoscopes; Illuminating arrangements therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • G01N1/31—Apparatus therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/06—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of illumination
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • G01N2001/302—Stain compositions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/4833—Physical analysis of biological material of solid biological material, e.g. tissue samples, cell cultures

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Endoscopes (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

提供一种癌症检测装置(1)，其具有：用于将染色剂(45)涂布于活细胞群的涂布单元(40)，所述染色剂可以选择性地使活细胞中的癌症相关基因产物染成有彩色；用于已经对其涂布了所述染色剂(45)的活细胞群成像的成像单元(10)；以及用于基于通过上述成像所获得的图像中的所述活细胞群中癌相关基因的染色表达图样的状态来确定所述活细胞群的癌变的恶性水平的测定单元(52)。

Description

癌症检测装置、癌症检测方法和用于癌症检测的染色剂
技术领域
本发明涉及用于检测癌性活细胞的癌症检测装置和癌症检测方法，以及用于癌症检测中的染色剂。
背景技术
近年来，作为检查生物体(例如消化道)中病变的方法，有一种已知的方法用于对所述生物体内的细胞群的形态成像，以检查是否存在病变(例如癌细胞)。
作为该方法的一个实例，专利文献1描述了在生物体染色中使用特定的可食用染料(例如姜黄素和硫磺菊素(sulfuretin))使生物体内的预定细胞群染色，然后将多光子激光应用于染色的细胞群以容易地检测到癌细胞(因为癌细胞比健康细胞浓染)并进一步捕获生物体内单个细胞形态的荧光图像的方法。根据上述方法，由于当向其应用多光子激光时生物体中的染色的细胞群发射荧光，因此可以生成所述生物体中单个细胞形态和核形态的清晰图像。因此，可以精确地检查是否存在病变(例如癌细胞)以用于病理诊断。
引用列表
专利文献
专利文献1：国际公开号WO 2014/157703。
发明内容
技术问题
专利文献1中描述的方法可用于精确地检查活细胞癌变是否已经发生。然而，作为公共需求，需要尽快掌握活细胞的癌变。
本发明实现了上述需求，并且本发明的目的是提供一种能够在早期阶段掌握活细胞癌变的癌症检测装置等。
解决问题的方案
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面的癌症检测装置包括(1)将染色剂涂布于活细胞群的涂布单元，所述染色剂选择性地将活细胞的癌症相关基因产物染成有彩色，(2)对已经涂布了所述染色的活细胞群成像的成像单元，和(3)基于通过所述成像产生的图像中的活细胞群的染色状态通过所述表达图样(expression pattern)来评估所述活细胞群的癌变等级。用于所述成像的激光器可以是用于多光子激光显微镜的多光子激光器或用于共聚焦激光显微镜的连续波(CW)激光器。本文所用的癌变等级如此定义为：具有(癌细胞天生拥有的)高度转移和浸润能力的癌细胞具有高等级的癌变，并且对放射疗法和化学疗法有抗性的癌症具有高等级的癌变。
根据本方面，所述癌症检测装置基于所述活细胞群的癌症相关基因产物的染色状态来评估癌变等级，由此可以在早期阶段掌握所述活细胞群的癌变。进一步地，由于可以掌握癌变的程度，因此可以了解癌症患者的预后。
例如，所述涂布单元可以涂布使传递促进活细胞生长的信号的ras家族癌症相关基因产物染色的染色剂。
如在本方面中，使用将所述ras家族癌症相关基因产物染色的染色剂，允许了解所述活细胞生长的趋势，从而可以在早期阶段掌握所述活细胞群中癌细胞的发展。
例如，所述涂布单元可以涂布含有焰红染料、赤藓红、汞溴红、固绿FCF或磺基水杨酸甲氯环素的染色剂。
使用本方面所示的染色剂允许将所述ras家族癌症相关基因产物染色，从而可以在早期阶段掌握所述活细胞群中癌症的发展。
例如，所述涂布单元可以涂布使传递促进活细胞生长的信号的STAT3家族癌症相关基因产物染色的染色剂。
如在本方面中，使用将所述STAT3家族癌症相关基因产物染色的染色剂，允许了解所述活细胞生长的趋势，从而可以在早期阶段掌握所述活细胞群中癌细胞的发展。
例如，所述涂布单元可以涂布含有姜黄素类化合物的染色剂。
使用本方面所示的染色剂，允许将所述STAT3家族癌症相关基因产物染色，从而可以在早期阶段掌握所述活细胞群中癌细胞的发展。
例如，所述涂布单元可以将含有姜黄素类化合物的染色剂涂布于所述活细胞群，然后将含有焰红染料、赤藓红、汞溴红、固绿FCF或磺基水杨酸甲氯环素的染色剂涂布于所述活细胞群。
在涂布含有焰红染料、赤藓红、汞溴红、固绿FCF或磺基水杨酸甲氯环素的染色剂之前涂布含有姜黄素类化合物的染色剂，允许清楚地显现每个细胞的轮廓和细胞中核的形状，从而可以产生清晰的图像。
例如，所述涂布单元可以将使传递促进活细胞生长的信号的STAT3家族癌症相关基因产物染色的染色剂涂布至所述活细胞群，然后涂布使传递促进活细胞生长的信号的ras家族癌症相关基因产物染色的染色剂。
在涂布使所述ras家族癌症相关基因产物染色的染色剂之前，涂布使所述STAT3家族癌症相关基因产物染色的染色剂，允许清楚地显现所述STAT3家族癌症相关基因产物，从而可以产生清晰的图像。
例如，所述评估单元可以基于所述活细胞群的染色区域的面积进行评估。
根据本方面，可以基于所述染色区域的面积了解所述癌症相关基因的表达增强的状态，从而可以精确地掌握癌变等级。
例如，所述评估单元可以基于活细胞群的染色区域中的细胞数量进行评估。
根据本方面，可以基于所述染色区域中的细胞数量了解所述癌症相关基因的表达增强的状态，从而可以精确地掌握癌变等级。
例如，所述评估单元可以基于含有所述活细胞群的染色区域的固定面积中的染色细胞群的数量和平均直径进行评估。
根据本方面，可以基于所述固定面积中染色的细胞群的数量和平均直径了解所述癌症相关基因的表达增强的状态，从而可以精确地掌握癌变等级。
例如，所述成像单元可以用多光子激光或共聚焦激光照射已经涂布了所述染色剂的活细胞群，并对所述活细胞群成像。
如本方面中的，用多光子激光照射所述活细胞群，允许容易地在生物体内的粘膜表面下方的大于或等于10μm但小于或等于1000μm的深度范围内掌握癌变等级。进一步地，用共聚焦激光照射所述活细胞群允许容易地在生物体内粘膜表面下方的大于或等于10μm但小于或等于70μm的深度范围内掌握癌变等级。因此，可以在癌细胞群体出现在粘膜表面之前的超早期了解癌症患者的预后。
例如，所述成像单元可以对被所述染色剂染色并且直径大于或等于0.1mm但小于或等于0.4mm的细胞群体的癌症相关基因表达图样成像。
根据本方面，可以掌握处于癌前状态的活细胞的癌变等级，从而可以在癌细胞群体清楚地显现之前的早期阶段了解癌症患者的预后。
例如，所述涂布单元可以将多种不同的染色剂涂布到所述活细胞群以将多种癌症相关基因产物染成彼此不同的颜色，并且所述成像单元可以用分别对应于各种染色剂的多种激发光束照射染色成不同颜色的所述多种癌症相关基因表达图样，并对所述多种癌症相关基因表达图样成像。
根据所述染色剂用多个激发光束照射所述多种染色的癌症相关基因表达图样，允许精确地检测所述多种癌症相关基因表达图样。
例如，所述染色剂可以由至少两种类型的染色剂形成，并且可以选择与所述染色剂的类型一致的照射所述多种癌症相关基因表达图样的激发光束。
使用至少两种类型的染色剂以及用对应于所述染色剂的激发光束照射所述多种癌症相关基因表达图样，允许检测至少两种癌症相关基因表达图样。如上所述的检测所述多种癌症相关的基因表达图样，允许从不同角度掌握癌变等级。
例如，所述成像单元可以包括焦点位置控制单元并控制所述焦点位置控制单元以对存在于被所述染色剂染色的生物体中的表面下方的大于或等于10μm但小于或等于1000μm的深度范围内的癌症相关基因表达图样成像。
根据本方面，可以掌握在粘膜表面下方大于或等于10μm但小于或等于1000μm的深度范围内的生物体内部的癌变等级，由此可以在癌细胞群体出现在粘膜表面之前的早期阶段了解癌症患者的预后。
例如，可以控制所述焦点位置控制单元从被所述染色剂染色的生物体中的相同成像位置的表面以固定间隔改变焦点，以在不同深度的焦点位置处进行成像，多个捕捉的图像可以按照焦点位置信息顺序彼此叠加成立体图像，并且可以基于所述立体图像中的染色剂的渗透程度进行评估。
根据本方面，可以基于所述立体图像中的染色剂的渗透程度掌握生物体内部的癌变等级，从而可以在癌细胞群体出现在粘膜表面之前的超早期阶段了解患者的预后。
根据本发明另一方面的癌症检测方法包括将染色剂涂布到活细胞群的涂布步骤，所述染色剂选择性地使活细胞的癌症相关基因产物染成有彩色，对已经涂布了所述染色剂的活细胞群成像的成像步骤，以及基于通过所述成像产生的图像中的活细胞群的染色状态来评估活细胞群的癌变等级的评估步骤。
根据本方面，所述癌症检测方法基于所述活细胞群的癌症相关基因图样的染色状态来评估癌变等级，从而可以在早期阶段掌握所述活细胞群的癌变。进一步地，由于可以掌握癌变等级，因此可以了解癌症患者的预后。
根据本发明的另一方面的用于癌症检测的染色剂包含焰红染料、赤藓红、汞溴红、固绿FCF或磺基水杨酸甲氯环素，其使传递促进活细胞生长的信号的ras家族癌症相关基因产物染色，以及姜黄素类化合物，其使传递促进活细胞生长的信号的STAT3家族癌症相关基因产物染色，并且所述染色剂具有允许所述染色剂在染色开始后10分钟内渗透到所述活细胞的细胞质但不渗透到所述细胞的核的浓度。
由于只要从染色开始后经过的时间是10分钟或更短，根据本方面的用于癌症检测的染色剂渗透到细胞质中但不渗透到细胞核中，因此由细胞质包围的核可以清晰地显现，从而可以更清晰地进行癌变分析。
发明的有益作用
根据本发明，可以在癌性部分具有约1mm的直径的非常早期阶段或超早期阶段掌握活细胞的癌变。
进一步地，根据本发明的主要构成，可以分析癌症相关基因的表达图样，从而可以确定癌症肿瘤影响所述患者(至关重要的预后)的风险程度。
上文所述的观察靶标仅包括生物体消化道内壁上的粘膜表面中的上皮细胞、腺细胞、结缔组织和毛细血管。可替代地，在手术切除组织即刻后的20分钟内的新鲜组织可以用作观察材料以对类似于活组织图像的细胞形态图像成像。
附图简述
[图1A]图1A是显示活细胞中癌症相关基因产物正常起作用的状态的示意图。
[图1B]图1B是显示活细胞中癌症相关基因产物异常起作用的状态的示意图。图1B中的十字星标记各自表示在相应的癌症相关基因产物中发生的癌性突变。
[图1C]图1C是显示消化道内壁表面上活细胞群的逐步癌变过程的示意图。
[图1D]图1D显示人癌细胞生长曲线的实例。
[图2A]图2A显示与样品1相关的活细胞的癌症相关基因表达图样的图像：部分(a)显示用姜黄素染色的STAT3癌症相关基因表达图样的图像；部分(b)显示用焰红染料染色的ras家族癌症相关基因表达图样的图像；并且部分(c)是(a)+(b)叠加的图像。
[图2B]图2B显示与样品2相关的活细胞的癌症相关基因表达图样的图像，且所述图像以与图2A中相同的方式显示。
[图2C]图2C显示与样品3相关的活细胞的癌症相关基因表达图样的图像，且所述图像以与图2A中相同的方式显示。
[图3]图3显示与样品4相关的健康活细胞群的图像。
[图4A]图4A在上行中显示了3个面板(a)、(b)和(c)，其显示在生物体染色中用含有酸性红的染色剂和含有姜黄素类化合物的染色剂对实验室小鼠的消化道大肠内壁双重染色、使用共聚焦激光显微镜捕获所述消化道的内壁表面和从表面至约30μm的深度范围内的生物体内部的细胞图像，并数字化所述图像的操作结果。部分(a)显示在生物体染色中使用含有酸性红染色的染色剂染色的细胞的图像。部分(b)显示在生物体染色中使用含有姜黄素类化合物的染色剂染色的细胞的图像。部分(c)是(a)+(b)叠加的图像。下行中的3个面板(d)、(e)和(f)显示与上行相同的生物体染色中染色、用福尔马林固定、然后用荧光抗体技术成像的实验室小鼠消化道大肠相同部位的图像。部分(d)显示用Alexa-488标记的鬼笔环肽可视化细胞内肌动蛋白微丝。部分(e)显示同时使用抗STAT3抗体和Alexa-594标记的第二抗体将细胞内肌动蛋白微丝染色，以便显示癌症相关基因产物STAT3的分布。部分(f)是(d)+(e)叠加的图像。
[图4B]图4B显示在生物体染色中用姜黄素染色并用共聚焦激光显微镜成像的实验室小鼠的健康大肠粘膜的超早期癌细胞群的图像。
[图4C]图4C显示在生物体染色中用姜黄素染色、用多光子激光显微镜成像、并提取姜黄素染料染色的颜色区域的手术切除即刻后的人胃腺瘤样品的图像。
[图4D]图4D显示在生物体染色中用姜黄素和酸性红双重染色并在多光子激光显微镜下成像的手术切除即刻后的人胃腺瘤样品的图像。
[图4E]图4E显示用含有姜黄素的染色剂和含有酸性红的染色剂双重染色然后在多光子激光显微镜下成像的消化道内壁的图像。部分(a)显示健康消化道的图像，且部分(b)显示超早期阶段的癌症图像。
[图5A]图5A是显示大肠细胞排列的示意图，其是消化道的一个实例。
[图5B]图5B示意性地显示消化道中发展的超早期癌症中的癌细胞。
[图5C]图5C是显示消化道的内壁在多光子激光显微镜和共聚焦激光显微镜下成像，并进一步显示(a)在与粘膜表面一致的焦平面和(b)在所述粘膜表面下方约50μm深度的焦平面处捕获的细胞图像的实例的示意图。
[图6A]图6A显示通过使用在多光子激光显微镜下产生的图像同时分析被称为ACF(非典型隐窝病灶，其被认为是癌前状态的一种形式)的病变(中心部位中可见的环形结构)的两种图样类型(在生物体染色中用姜黄素染色的癌症相关基因STAT3表达图样和在生物体染色中用焰红染料染色的ras家族癌症相关基因表达图样)的情况。部分(a)显示在生物体染色中用姜黄素染色的STAT3癌症相关基因表达图样。部分(b)显示在生物体染色中用焰红染料染色的ras家族癌症相关基因表达图样。部分(c)是(a)+(b)叠加的图像。
[图6B]图6B是图6A的放大视图且显示通过使用在多光子激光显微镜下产生的图像同时分析被称为ACF(非典型隐窝病灶，其被认为是癌前状态的一种形式)的病变(中心部位中可见的环形结构)的两种图样类型(在生物体染色中用姜黄素染色的癌症相关基因STAT3表达图样和在生物体染色中用焰红染料染色的ras家族癌症相关基因表达图样)的情况。部分(a)显示在生物体染色中用姜黄素染色的STAT3癌症相关基因表达图样。部分(b)显示在生物体染色中用焰红染料染色的ras家族癌症相关基因表达图样。部分(c)是(a)+(b)叠加的图像。
[图7]图7显示已将插入管插入消化道的状态。图7的部分(a)显示插入所述插入管即刻后的状态，且图7的部分(b)显示消化道中形成空间的状态。
[图8]图8显示根据第一实施方案的癌症检测装置的涂布单元的实例。
[图9]图9的部分(a)显示将根据第一实施方案的癌症检测装置用于使消化道的内壁平整，且图9的部分(b)是显示所述癌症检测装置的前端侧端部的示意图。
[图10]图10是显示根据第一实施方案的癌症检测装置中的内窥镜的前端部的结构的示意图。
[图11]图11是显示根据第一实施方案的癌症检测装置的控制配置的框图。
[图12]图12是显示根据第一实施方案的癌症检测装置的功能的实例的流程图。
[图13]图13是显示根据第二实施方案的癌症检测装置的控制配置的框图。
[图14]图14是显示根据第二实施方案的癌症检测装置的示意图。
[图15]图15是显示根据第三实施方案的癌症检测装置的内窥镜的前端侧端部的示意图。
[图16]图16是显示整个内窥镜的示意图。
[图17]图17是显示所述癌症检测装置的控制配置的框图。
[图18]图18是显示根据第三实施方案的癌症检测装置的功能的实例的流程图。
[图19A]图19A是被含有姜黄素的染色剂和含有酸性红的染色剂染色的消化道内壁的合并图像。
[图19B]图19B是用含有姜黄素的染色剂和含有酸性红的染色剂染色的消化道内壁的合并图像，并显示成像轴和显影图像中的位置之间的位置关系。
[图20A]图20A显示说明在内壁表面(粘膜表面)下方的预定深度范围内的细胞形态并且表示提取的用所述姜黄素染料和酸性红染料染色的颜色区域的三维数据图像。
[图20B]图20B显示表示用所述姜黄素染料染色的并从图20A所示图像中提取的颜色区域的图像。
[图20C]图20C显示了表示用所述酸性红染料染色的并从图20A所示图像中提取的颜色区域的图像。
实施方案的描述
(成为本发明基础的发现1)
本发明以发现1和2为基础。在这些发现中，将首先描述本发明所依据的发现1和与发现1相关的本发明的主要构成。
首先将描述健康的活细胞转变为癌细胞以及随后所述癌细胞生长的癌变机制。图1A是显示活细胞中癌症相关基因产物表现正常的状态的示意图。在所述细胞中，有以正向和负向控制细胞分裂和生长的双向信号转导系统。即，存在具有加速细胞生长功能的生长促进信号和具有抑制生长功能的生长抑制信号系统。图1B是显示所述活细胞中癌症相关基因产物异常表现的状态的示意图。所述十字星标记各自表示在相应的癌症相关基因产物中发生的癌性突变。
活细胞由包含细胞生长基因的核和包围着所述核的细胞质形成。细胞包含多种类型的各自由蛋白质形成的癌症相关基因。如图1A所示，将所述癌症相关基因分类为属于ras(大鼠肉瘤)系统和STAT3(信号转导和转录激活因子3)系统的基因(所述基因各自传递生长促进信号)、APC(抗原呈递细胞)/β-连环素家族和p53(蛋白质53)系统(所述基因各自传递生长抑制信号)。即，将ras家族和STAT3家族癌症相关基因产物归类为传递细胞生长促进信号的加速(acceleration)系统中的基因产物，将APC/β-连环素家族和p53家族癌症相关基因归类为传递细胞生长抑制信号的制动系统中的基因产物。
将描述控制细胞分裂和生长的机制。首先，当细胞生长因子(EGF，其是一种细胞外生长控制物质)结合至位于活细胞的细胞膜上的受体时，ras家族和STAT3家族的癌症相关基因产物(其属于所述加速器系统)被激活。当所得的生长促进信号被传递到核时，核中的细胞生长所必需的基因组被激活。另一方面，在该细胞中，APC/β-连环素家族和p53家族的癌症相关基因产物(其属于制动系统)总是在一定程度上被激活，并且所得的生长抑制信号抑制了核中的细胞生长基因的激活以试图抑制细胞生长。在活细胞中的癌症相关基因正常起作用的情况下，促进细胞生长的作用和抑制细胞生长的作用以良好平衡的方式起作用，从而所述生物体内的细胞适度生长。
如图1B所示，相反地，在ras家族或STAT3家族癌症相关基因产物异常起作用的情况下，ras家族或STAT3家族的癌症相关基因产物(其属于生长促进信号系统)具有更高的活性，使得与所必需的相比，细胞生长增强更多。另外，例如，在APC/β-连环素家族或p53家族癌症相关基因产物异常起作用的情况下，APC/β-连环素家族或p53家族的癌症相关基因产物(其属于生长抑制信号系统)具有更低的活性，使得抑制细胞生长的功能降低。如上所述，当多种类型的癌症相关基因中的任何一种差异地或异常地起作用时，健康细胞不能适度生长，并且开始增强异常细胞生长(例如癌细胞中的生长)。
图1C是显示消化道内壁表面上活细胞群的逐步癌变过程的示意图。在图1C中，将活细胞群的癌变过程分为依次显示的第一阶段、第二阶段、第三阶段和第四阶段。
第一阶段是癌变即将在活细胞群的一部分中开始的阶段。认为第一阶段发生在APC/β-连环素家族癌症相关基因的活性程度降低并且因此抑制细胞生长的功能降低时。在此阶段，显示出细胞生长略微增强，并且至少已经发生了癌前状态(其最终可以转化为癌细胞)。
第二阶段是癌变已进展超过第一阶段的另一癌前状态。在第二阶段中，认为ras家族癌症相关基因的活性升高，使得细胞生长已经增强。还认为有可能STAT3家族癌症相关基因有可能在此阶段被激活。癌细胞群体具有小尺寸，其具有例如大于或等于0.1mm且小于或等于0.4mm的直径。癌细胞群体的直径是具有与所述癌细胞群体面积相同的面积的圆的直径。此阶段不是立即危及患者生命的阶段，但期望制定治疗计划或以其他方式采取措施以为将来作准备。
认为ACF(非典型隐窝病灶，其将在后面描述并被认为是癌症前状态的一种形态)是由与细胞群相对应的特有名称来定义的，所述细胞群属于所述第一和第二阶段且具有清晰的形态特征，其特征在于通常具有圆形形状的腺体的开口或内腔具有细长的狭缝状形状，并且与正常状态下的数量相比，腺细胞中的杯状细胞的数量减少。
第三阶段是将活细胞群的一部分浸润并且癌细胞显现的阶段。在p53家族癌症相关基因的活性下降使得抑制细胞生长的功能降低时，认为第三阶段发生。在此阶段，其中p53系统和APC/β-连环素家族二者的制动系统癌症相关基因产物的活性下降，从而抑制细胞生长的功能大大降低，癌细胞的生长以加速的节奏进展，且癌细胞浸润周围组织。当达到第三阶段时，处于第三阶段的部分的直径达到0.5mm或以上，并且如果不采取措施而不管第三阶段，则导致个体死亡的癌症形成。
第四阶段是在第三阶段形成的癌细胞转化为癌症之后，进一步发生基因突变并且所述癌症已经进展成恶性癌症(其有可能进一步导致细胞生长、浸润和转移)的阶段。此阶段是所述癌症转移到除消化道以外的远端器官的阶段，并且是危及患者生命的危险阶段。认为第一阶段进展到第四阶段的速度取决于所述癌症相关基因的活性状态。
图1D显示人癌细胞生长曲线的实例。
如图1D所示，癌细胞的数量通常依照预定的生长曲线而增加。例如，所述生长曲线具有对应于癌症即将开始的阶段(癌细胞群体的直径小于0.2mm的时期)的三年的小梯度，而生长曲线的梯度在四年及更晚之后(癌细胞群体的直径大于或等于0.5mm的时期)增加。然后，所述生长曲线的梯度在七年及更晚之后下降。一般而言，临床上发现和治疗癌症的时间是在七年或更晚之后。其原因是如果其直径不增加至大于或等于10mm的值，则不能检测到癌细胞群体。
值得注意的事实是，细胞数量指数增加到由虚线A表示的生长曲线范围上。指数增加意味着应该在癌细胞的第一至第三阶段发生的癌性基因突变已经完成，并且癌细胞以固定的均匀速度反复分裂。如果可以在指数增加的早期阶段(超早期癌症)，即在所述癌症相关基因表达图样中发生异常但癌细胞群体本身具有1mm或以下的小直径的阶段，检测到癌细胞群体，则所述癌症可以永久治愈，因为超早期癌变部位足够小且可以容易地完全去除。如上所述，如果可以在超早期以癌症相关基因表达图样异常的形式掌握癌变的等级，则可以在所述癌症发展到危险阶段之前，永久地治愈所述癌症。
在上述背景下，本发明人试图通过用多光子激光显微镜或共聚焦激光显微镜对活细胞群的癌症相关基因表达图样成像并可视化所述癌症相关基因的活性状态来掌握癌变的等级。
为了可视化活细胞的癌症相关基因表达图样，本发明人使用含有可食用染料的染色剂将癌症相关基因产物染成有彩色，并对染色的癌症相关基因产物成像。可食用染料是允许施用于人的天然染料或人造染料(例如，食用色素染料或以补充剂的形式施用的染料)。
具体地，制备含有姜黄素类化合物(姜黄素，C21H20O6)的染色剂作为选择性地使STAT3家族癌症相关基因产物染色的染色剂。另外，制备含有焰红染料(C20H2Br4Cl4Na2O5)的染色剂作为选择性地使ras家族癌症相关基因表达图样染色的染色剂。
更具体地，制备含有1wt％姜黄素的含姜黄素的溶液作为含有姜黄素类化合物的染色剂，并制备含有1wt％焰红染料的含有焰红染料的溶液作为含有焰红染料的染色剂。替代性地，含有姜黄素类化合物的染色剂可以为用生理盐水溶液以1/5到1/100范围的比例稀释的姜黄素溶液(例如，未稀释的液体是含有5％姜黄素、45％甘油和50％乙醇的液体)。替代性地，含有1％焰红染料的染色剂可以为没有变化或浓度为100％或以1/10的比例稀释的焰红染料溶液(未稀释的液体为10mg/mL)。
含有姜黄素类化合物的染色剂用于使活细胞中表达的STAT3家族癌症相关基因产物染色，然后将所述染色的产物用生理盐水溶液洗涤约10秒三次。含有焰红染料的染色剂用于使活细胞中的ras-家族癌症相关基因表达图样染色，然后用生理盐水溶液洗涤染色的图样约10秒三次。由此进行的双重染色允许同时分析STAT3家族和ras家族癌症相关基因产物的表达量。每种染色剂的染色时间在2至5分钟的范围内。由于只要从染色开始后经过的时间是10分钟或更短，上述浓度允许所述染色剂渗透到细胞质中但不允许所述染色剂渗透到细胞的核中，因此由细胞质包围的核可以清晰地显现，从而可以更清晰地进行分析。
用多光子激光显微镜(奥林巴斯公司制造的FV1000MPE)对上述被染色剂染色的STAT3家族和ras家族癌症相关基因产物的表达图样染色。激光的波长为840nm。成像靶标是实验室小鼠的大肠的内壁，并且观察到大肠的内壁被分成多个癌细胞发展的部位(样品1、2和3)和没有癌细胞发展的健康细胞部位(样品4)。
图2A显示了与样品1相关的实验室小鼠大肠的一群活细胞群体的癌症相关基因表达图样的图像：部分(a)显示STAT3家族癌症相关基因产物的图像，其中被含有姜黄素类化合物的染色剂染色的癌细胞比健康细胞更深；部分(b)显示被含有焰红染料的染色剂染色的ras家族癌症相关基因表达图样的图像；部分(c)是(a)+(b)叠加的图像。后面将描述的图2A、图2B和2C以及图3各自都是单色图像，但其本质上是彩色图像。
在图2A的部分(a)中，STAT3家族癌症相关基因产物以绿色荧光颜色表示。以绿色荧光颜色染色的区域与整个屏幕的比率，即STAT3家族癌症相关基因表达占优势的细胞占据的区域的比例，为30％。
在图2A的部分(b)中，ras家族癌症相关基因以红色荧光颜色表示。以红色荧光颜色染色的区域与整个屏幕的比率，即ras家族癌症相关基因表达占优势的细胞占据的区域的比例，为80％。
在图2A的部分(c)中，STAT3家族癌症相关基因产物和ras家族癌症相关基因表达图样共存的区域以黄色荧光颜色表示，仅存在STAT3家族癌症相关基因表达的区域以绿色荧光颜色表示，以及仅存在ras家族癌症相关基因表达的区域以红色荧光颜色表示。以黄色荧光颜色染色的区域与整个屏幕的比率为10％。
在与样品1相关的实验室小鼠大肠的一群活细胞群体中，STAT3家族癌症相关基因表达占优势的细胞所占区域的比例为30％，ras家族癌症相关基因表达占优势的细胞所占据的区域的比例为80％，并且上述两种类型的细胞共存的区域的比例为10％。认为与样品1相关的该群活细胞群体的状态是依据癌变等级的图1C中所示的第二或第三阶段(超早期癌症)。即，该群活细胞群体的阶段诊断如下：STAT3家族和ras家族二者呈阳性的细胞占10％；该群的这些细胞已经进展超越了至少第二阶段；这些细胞的群体具有至少为0.2mm的直径(见图1D)；因此估计该群活细胞群体可能已经进入第三阶段(超早期癌症)。
图2B显示了与样品2相关的一群活细胞群体的癌症相关基因表达图样的图像，并且所述图像以与图2A中相同的方式显示。
在图2B的部分(a)中，以绿色荧光颜色染色的区域与整个屏幕的比率，即STAT3家族癌症相关基因表达区域的比例，为50％。在图2B的部分(b)中，以红色荧光颜色染色的区域与整个屏幕的比率，即ras家族癌症相关基因表达区域的比例，为90％。在图2B的部分(c)中，以黄色荧光颜色染色的区域与整个屏幕的比率，即STAT3家族癌症相关基因和ras家族癌症相关基因共存的区域的比例，为20％。在该群活细胞中，STAT3家族和ras家族癌症相关基因是激活的，并且识别了基因表达多样化的癌变，如样品1中所示(参见图2A)。与样品2相关的该群活细胞群体的阶段诊断如下：STAT3家族和ras家族二者呈阳性的细胞占20％；该群的这些细胞已经进展超越了至少第二阶段；该群体的这些细胞具有至少0.2mm的直径(见图1D)；因此估计该群活细胞群体可能已经进入第三阶段(超早期癌症)。
图2C显示了与样品3相关的一群活细胞群体的癌症相关基因表达图样的图像，并且所述图像以与图2A中相同的方式显示。
在图2C的部分(a)中，以绿色荧光颜色染色的区域与整个屏幕的比率，即STAT3家族癌症相关基因表达区域的比例，为30％。在图2C的部分(b)中，以红色荧光颜色染色的区域与整个屏幕的比率，即ras家族癌症相关基因表达区域的比例，为75％。在图2C的部分(c)中，以黄色荧光颜色染色的区域与整个屏幕的比率，即STAT3家族癌症相关基因和ras家族癌症相关基因共存的区域的比例，为5％。在与样品3相关的该群活细胞中，ras家族癌症相关基因是未激活的，使得所述癌细胞中的基因表达不如样品1中那样多样化(参见图2A)。
与样品3相关的该群活细胞群体的阶段诊断如下：STAT3家族和ras家族二者呈阳性的细胞占5％；该群的这些细胞已经进展超越了至少第二阶段；这些细胞的群体具有约0.1mm的直径(见图1D)。鉴于STAT3家族阳性细胞以许多岛状部分的形态散布的状态，预期所述细胞的移动性已经增强并且浸润已经增加，因此估计所述细胞可能已经进入第三阶段(超早期癌症)。对许多癌症相关基因产物的表达状态的详细的细胞水平分析允许癌症阶段诊断和癌变等级诊断。认为基于癌细胞的分散性评估转移，且认为细胞群体的大小指示生长能力。
例如，如图2C的部分(a)中所示，认为每单位面积的单个癌症群体各自具有小的直径但存在大量分散的癌症群体的情况指示转移性进展。如上所述，可以将转移性癌症具有小的平均尺寸(直径)的事实纳入分析方法中。在这种情况下，期望将转移水平分为三至五个阶段，并且将确定的转移水平与癌变等级(例如由ras和STAT3染色面积表示的癌变等级)一起描述。
图3显示与样品4相关的实验室小鼠的大肠的一群健康活细胞的图像。在图3的部分(a)至(c)中，屏幕中不存在绿色、红色或黄色荧光颜色，而是该屏幕以暗色表示。在与没有癌细胞的样品4相关的该群活细胞中，表达的STAT3家族和ras家族癌症相关基因产物的量没有提高。
如上所述的一群活细胞中的癌症相关基因的表达的分析允许确定癌变等级。即，根据本发明的主要构成可以在早期发现超早期癌症，所述超早期癌症具有如此小的病变尺寸，其小到现有的检测装置(例如内窥镜)不能检测到甚至超早期癌症的存在，并且通过评估癌细胞的等级可以了解所述癌症患者的预后。如上所述，通过在早期阶段完全去除癌性部位可以永久性地治愈所述癌症。
图4B显示在生物体染色中用姜黄素染色并用共聚焦激光显微镜成像的健康的大肠粘膜和结肠直肠癌的图像，并且显示各个细胞的轮廓和细胞中核的形状可以清楚地可视化，因为姜黄素载入细胞质中但不载入细胞核中，从而可以可靠地进行病理诊断。因为不同于图4B的部分(a)，在图4B的部分(b)中由于结肠直肠癌部位而不能看到隐窝，因此图4B的部分(b)可用于癌症评估。
进一步地，图4C的部分(a)显示在生物体染色中用姜黄素体外染色的并用多光子激光显微镜成像的手术切除的人胃腺瘤新鲜样品的图像。图4D的部分(a)显示在生物体染色中用姜黄素和酸性红体外双重染色的手术切除的人胃腺瘤新鲜样品的图像。由于可以清楚地可视化各个细胞的轮廓和细胞核的形状，因此在这种情况下也可以可靠地进行病理诊断。在图4C和4D的右侧部分(b)中绘制的曲线图显示用滤光器1和滤光器2标记的阴影带表示用于测量荧光的滤光器的波长宽度，E2表示从姜黄素发出的荧光的特征，E7表示酸性红发出的荧光特征。因此，在图4D的部分(a)中，由所述双色染色提供的荧光波长的差异以颜色差异的形式表示。图4D显示单色图像，因此认为所述图像显示出对比度的差异，但实际上其被捕获为在波长方面明显可分辨的图像。在图4C和4D中，用II标记和癌变即将开始的区域各自是一种细胞学异型，并且腺体中的细胞核排列成两行，并且由于癌症，分裂即将开始。即，细胞核的显现允许清楚地掌握以细胞为基础的癌症即将开始的情况。
作为选择性使癌症相关基因表达图样染色的实例，本发明人已经确定将含有姜黄素类化合物的染色剂用于选择性地使STAT3家族癌症相关基因产物染成有彩色。图4A显示本质上是彩色图像的单色图像。可以用共聚焦激光显微镜和多光子激光显微镜二者产生所述图像。
图4A的部分(a)、(b)和(c)是通过用1％姜黄素溶液使肠内壁染色和之后用1％酸性红(C27H29N2NaO7S2)使已用姜黄素染色的内壁染色而产生的双染色的活的实验室小鼠的肠内壁的活细胞群样品的图像。将共聚焦激光显微镜用作成像设备。
图4A的部分(a)中，用酸性红染色的区域以深红色显示，使得可以可视化大肠腺体周围的毛细血管和结缔组织(网状结构)的结构。在图4A的部分(b)中，用姜黄素类化合物染色的区域以深绿色显示。图4A的部分(c)是(a)+(b)叠加的图像。基于图4A的部分(c)，认为超早期癌症已经在用姜黄素类化合物重染的区域中发展，因为用酸性红染色的所述腺体和腺体周围的毛细血管和结缔组织的结构(隐窝结构)消失且被扰乱。
图4A的上行中的三个面板显示：(b)存在由白线矩形包围的细胞群，并且其中生物体染色中被含有姜黄素类化合物的染色剂染色的癌细胞比健康细胞染色深，并且封闭位点与(a)在生物体染色中使用含有酸性红的染色剂染色的细胞群图像的相同位点的比较，显示其中围绕腺体的用酸性红染色的毛细血管的网状图样(隐窝图样)消失。因此，确定含有用姜黄素染色剂重染的细胞群的位置是超早期癌症。图4A的下行中的三个面板(d)、(e)和(f)显示，与上行相同的生物体染色中成像的，用福尔马林固定的，然后在荧光抗体技术中成像的实验室小鼠的消化道大肠的相同部位的图像。部分(d)显示用Alexa-488标记的鬼笔环肽可视化胞内肌动蛋白微丝。部分(e)显示同时用抗STAT3抗体和Alexa-594标记的第二抗体染色的(使得显示出癌症基因产物STAT3的分布)胞内肌动蛋白微丝。部分(f)是(d)+(e)叠加的图像。
通过用福尔马林固定上述实验室小鼠的肠，然后用与STAT3家族癌症相关基因产物结合的抗STAT3抗体将所述肠免疫染色，并对与部分(a)、(b)和(c)中的白框包围的位置相同的位置成像而产生图4A的部分(d)、(e)和(f)。在部分(d)至(f)中，所述样品用福尔马林固定，并因此略微收缩。
通过对上部三个面板中的白色矩形成像获得下行中的三个系列。上行中部分(b)中显示的在生物体染色中用姜黄素重染的细胞群的分布与下行中部分(e)中显示的具有高度表达的癌症相关基因产物STAT3的细胞群的分布一致，这表明用姜黄素对所述活细胞进行生物体染色可以检测到癌症相关基因产物STAT3。
进一步地，在下行的三个面板中，部分(e)中显示的具有高度表达的癌症相关基因产物STAT3的细胞群的分布与部分(d)中的胞内肌动蛋白微丝的分布的比较，表明STAT3高度表达的细胞群具有稀疏的肌动蛋白微丝分布，这表明细胞间结合是稀疏的。基于通常癌细胞中的细胞间结合是稀疏的事实，所述STAT3高度表达的细胞群由癌细胞形成。
总之，下行的三个面板证明在缺乏肌动蛋白微丝的中心部分细胞群中已经发生癌变癌变，并且该细胞群与高度表达癌症相关基因产物STAT3的细胞群一致。进一步地，上行的三个面板证明高度表达癌症相关基因产物STAT3的细胞群由在姜黄素生物体染色中比健康细胞染色更重的超早期癌细胞形成。
用共聚焦激光显微镜捕获这些图像，并且可以用多光子激光显微镜捕获类似的图像。
图4A的部分(d)主要显示通过肌动蛋白荧光可视化的细胞轮廓。图4A的部分(e)显示用抗STAT3抗体免疫染色的细胞。图4A的部分(f)是(d)+(e)叠加的图像，并且显示在屏幕的中心部位中的岛状部位中白色肌动蛋白反应的量减少，以及绿色STAT3家族蛋白免疫反应的量增加。因此，认为岛状部位中已经表达了大量STAT3家族癌症相关基因产物。
参考图4A中的图像，由于图4A的部分(c)中癌细胞已经发展的区域与图4A的部分(f)中检测到STAT3家族癌症相关基因产物的区域一致，因此表明超早期癌症已经发展，并且活细胞中用姜黄素类化合物重染的区域中已经表达了与所述超早期癌症相关的癌症相关基因产物。如上所述，亮度和荧光颜色的差异或几何图样的差异允许基于图像检测超早期中的癌症相关基因的表达和在基于计算机的自动诊断中分析癌变等级。所述自动诊断采用例如基于高度可信的亮度鉴定表达位置和分析隐窝结构的常规分布，以基于该结构的消失程度和混合的荧光颜色的状态来确定癌变等级的方法。在使用几何图样的方法中，所述图样以器官为基础变化。在图4A的部分(c)的实例中，可以想到采用例如计算500平方微米(暗洞图样)的固定面积内的暗部位的数量的方法来量化暗部位的密度。自动诊断可以进一步用于基于人工智能的诊断，用于从存储的大量癌症相关基因表达图样和健康细胞图样的图像中识别。除了隐窝结构的洞图样之外，不仅取决于暗部位和亮部位的重复次数，还取决于生物体染色剂渗透到活细胞的深度、共聚焦和多光子激光显微镜中的成像深度和波长、染色剂之间的差异和其他因素，所述几何图样在一些情况下成像为不同的图案，例如在图4E的部分(a)和(b)中，其显示了实验室小鼠的染色的肠的图像。可以采用基于腺体和毛细血管测量岛状图样的密度，识别岛状图样的扰乱(例如，在图4E的部分(a)中)以及任何其他诊断方法。进一步地，距离测量，例如暗部位之间的间隔、暗部位的直径和图4A的部分(c)中的其他因素，以及岛状图案中的间隔，岛状图案的直径以及图4E的部分(a)中的其他因素可用于评估所述图样的扰乱。
如上所述，大量癌症相关基因产物的表达状态的详细细胞水平分析允许癌症阶段诊断和癌变等级诊断。认为基于癌细胞的分散性评估转移，并且细胞群体的尺寸指示生长能力。
例如，认为每个单位面积的单个癌症群体各自具有小的直径但是存在大量分散的岛状群体的情况表明转移进展。如上所述，可以将转移性癌症具有小的平均尺寸的事实纳入分析方法中。
(成为本发明的基础的发现2)
接下来将描述成为本发明的基础的发现2，以及与发现2相关的本发明的主要构成。
首先将描述生物体内部结构与癌细胞之间的关系。
生物体内部包含消化道、呼吸系统、肾/泌尿系统、子宫-卵巢生殖系统和其他器官、脑脊髓神经系统和其他身体部位。消化道的实例可包括食道、胃、小肠和大肠。
图5A是显示大肠的细胞排列的示意图，该示意图是消化道112的实例。例如，大肠的内壁由分泌粘液的腺体130和上皮120形成，所述上皮120位于比腺体130更靠近内壁表面(粘膜表面)113的部位并且当与食物进行接触时吸收水。上皮120由沿着内壁表面113排列的多个上皮细胞121形成。上皮细胞121各自具有细胞核125和细胞质126。腺体130的成形使得部分上皮120以罐的形式凹陷。腺体130由多个腺细胞131形成，并且腺细胞131各自具有细胞核135和细胞质136。将腺体130的凹陷部位称为腺体130的隐窝138。在上皮细胞121内的部位和腺细胞131周围的部位形成基底膜137、毛细血管132和结缔组织133。在上皮细胞121的表面形成从腺体130分泌的薄粘液层，且上皮细胞121受该粘液层的保护。
图5B示意性地显示了在消化道112中发展的癌细胞群体152。通常认为在消化道112中发展的超早期癌细胞群体152在消化道112的的内壁表面(粘膜表面)113下方的约1mm或更小深度的位置处发展。如果在不遗漏癌细胞群体的情况下可以在消化道的大范围粘膜上发现尚未到达并渗透到粘膜的肌层160中的早期癌细胞群体152，则可以减少导致晚期癌症(所述癌细胞群体增殖超过粘膜160的肌肉层并扩散到另一器官的状态)的条件的数量。
图5C是显示消化道112的内壁在多光子激光显微镜和共聚焦激光显微镜下成像的示意图。为了用激光L照射作为成像靶标的消化道112的内壁，将多光子激光显微镜和共聚焦激光显微镜的物镜16布置成面向消化道112的内壁表面113，如图5C所示。图5C是如下示意图：图5C的左半部分显示消化道的内壁在多光子激光显微镜或共聚焦激光显微镜下成像，并且图5C的右半部分显示(a)为沿着线a-a截取的横截面的平面且与粘膜表面一致的焦平面处捕获的细胞图像的实例；以及(b)为沿着线b-b截取的横截面的平面且位于粘膜表面下方约50μm的深度的焦平面处捕获的细胞图像的实例。多光子激光显微镜允许在从粘膜表面至约500μm深度或1000μm深度的范围内成像，并且共聚焦激光显微镜允许在从粘膜表面至约50μm深度或100μm深度的范围内成像。
为了主要成像上皮细胞121，将物镜16布置成使得物镜16的焦点与内壁表面(粘膜表面)113一致。作为结果，上皮细胞121和其他部分成像为如图5C的部分(a)所示，所述部分(a)是沿图5C中的a-a线截取的示意图。另一方面，为了主要成像腺细胞131、毛细血管132和结缔组织133，将物镜16布置成使得物镜16的焦点与内壁表面(粘膜表面)113下方10μm或更大的深度处的位置一致。作为结果，腺细胞131、毛细血管132和结缔组织133成像为如图5C的部分(b)所示，所述部分(b)是沿图5C中的线b-b截取的示意图。
例如，如果可以在癌前状态(图1C中所示的第二阶段)中检测到出现在细胞核125或135中的癌症相关基因表达图样的大小和形状或腺体130的隐窝138，则可以在超早期(其中所述癌症细胞群体的直径大于或等于0.5mm但小于或等于1mm)确定癌变等级。
图6A显示了活细胞的癌症相关基因表达图样的图像。图6B是图6A的放大视图。图6A和6B显示本质上是彩色图像的单色图像。
图6A显示通过使用在多光子激光显微镜下产生的图像同时分析被称为ACF(非典型隐窝病灶，其被认为是癌前状态的一种形式)的病变(中心部位中见到的环形结构)的两种图样类型(在生物体染色中用姜黄素染色的癌症相关基因STAT3表达图样和在生物体染色中用焰红染料染色的ras家族癌症相关基因表达图样)的情况。部分(a)显示在生物体染色中用姜黄素染色的STAT3癌症相关基因表达图样的图像。部分(b)显示在生物体染色中用焰红染料染色的ras家族癌症相关基因表达图样的图像。部分(c)是(a)+(b)叠加的图像。
图6A和6B显示通过在多光子激光显微镜(奥林巴斯公司制造的FV1000MPE)下对用染色剂45染色的癌症相关基因表达图样实际成像产生的图像。激光的波长为840nm，成像靶标为实验室小鼠。染色剂与发现1中所示的染色剂相同，含有姜黄素化合物(姜黄素，C21H20O6)的染色剂与选择性地使STAT3家族癌症相关基因产物染色的染色剂相同，并且含有焰红染料的染色剂(C20H2Br4Cl4Na2O5)与选择性地使ras家族癌症相关基因表达图样染色的染色剂相同。
图6A和6B各自显示其中已经将部分隐窝138染成绿色并且STAT3家族癌症相关基因产物已经在隐窝138中表达的状态。将图6A和6B的中心部位的结构称为ACF(非典型隐窝病灶)癌前状态。图6A和6B中的中心部分的结构形成其中排列有腺细胞的腺体样结构。中心部分中的腺体的开口或内腔在健康的结肠直肠粘膜中具有圆形形状，而图6A和6B中的中心部位的结构具有细长的狭缝形开口，并且腺细胞中的杯状细胞的数量比健康状况下的有所减少。因此，中心部分的结构具有明显的ACF形态学特征。在癌前状态ACF中，识别到(a)在生物体染色中用姜黄素染色的STAT3癌症相关基因表达的轻微增强和(b)在生物体染色中用焰红染料染色的ras家族癌症相关基因表达的中度增强。此外，处于健康状态的隐窝138各自具有近乎圆形的形状，而在图6A和6B所示的ACF癌前状态中，彼此相邻的两个隐窝138各自具有细长的变形的形状，由此可以确定所述活细胞处于异常状态。如上所述，检测癌前状态中的每种癌症相关基因表达图样的大小和形状允许在早期确定癌变等级和了解癌症患者的预后。
(第一实施方案)
下面将参考所述附图详细描述第一实施方案。
以下描述的实施方案均是本发明优选的具体实施例。数值、形状、材料、组成部件、组成部件的排列位置、组成部件彼此连接的形式、步骤、步骤的顺序以及下列实施方案中所示的其他因素通过实施例的方式提出并且不旨在限制本发明。本发明由权利要求书限定。因此，在下列实施方案中的组成部件中，将未在任何独立权利要求中描述的组成部件描述为任意的组成部件。进一步地，在附图中，基本相同的配置具有相同的参考特性，并且将省略或简化这些配置的重复描述。
1.癌症检测装置的整体配置
根据本实施方案的癌症检测装置是能够在癌症的早期阶段发现消化道、呼吸系统、肾/泌尿系统、子宫-卵巢生殖系统、脑脊髓神经系统和其他身体部位中发展的癌细胞的装置。所述癌症检测装置不仅可以进行癌症检测，还可以治疗已经在生物体内发展的癌细胞。进一步地，所述癌症检测装置不仅可以处理生物体内部的样品，还可以处理保持样品完整的手术切除样品即刻后约20分钟内的新鲜离体样品，并且可以在病理学上诊断癌症并按照与用于生物体内部的相同方法分析癌症相关基因的表达。例如，需要将样品冷冻，切成薄的样品，并用相关领域中的苏木精和伊红(HE)染色，使得病理学上诊断切除残余物中是否存在癌细胞并且该过程需要至少20分钟。另一方面，根据本实施方案的方法允许在3至5分钟内(快速术中诊断)没有遗漏病变地准确诊断。进一步地，除生物体之外，根据本发明的癌症检测装置和检测方法甚至可应用于切离的培养状态的ips细胞、ES细胞、MUSE细胞或任何其他细胞。
进一步地，根据本实施方案的癌症检测装置是内窥镜形状的检测装置。将参考检测生物体中消化道的情况进行下列描述。
1.1.检测准备的配置
首先将描述用于检测准备的癌症检测装置的配置。
由于实际消化道的内壁具有不规则性，因此希望在通过使用所述癌症检测装置成像内壁之前使消化道变宽以使消化道可成像。为此，根据本实施方案的癌症检测装置包括使消化道变宽的插入管。
图7显示插入管20已经插入消化道112的状态。图7的部分(a)显示插入插入管20即刻后的状态，图7的部分(b)显示在消化道112中形成空间S的状态。
如图7的部分(a)所示，插入管20具有供应口42，通过该供应口供应流体，以及回收口43，通过回收口43回收所述供应的流体。插入管20进一步设有第一球囊21和第二球囊22。当所述流体(气体或液体)注入球囊21和22和从球囊21和22排出时，第一球囊21和第二球囊22膨胀和收缩。第一气囊21设在从供给口42朝向插入管20的前端偏移的位置，第二气囊22设在从回收口43朝向插入管20的后端(在前端对面)偏移的位置。如图7的部分(b)所示，引起第一球囊21和第二球囊22在消化道112中膨胀，会产生夹在第一球囊21和第二球囊22之间的封闭空间S。
1.2.癌症检测装置的基本配置
接下来将参考图8至11描述癌症检测装置1的基本配置。图8显示所述癌症检测装置1的涂布单元40的实施例。
根据本实施方案的癌症检测装置1包括涂布单元40，其将染色剂45涂布到封闭空间S中的消化道112的内壁上。
如图8所示，癌症检测装置1将染色剂45从包含染色剂45的涂布单元40经由插入管20和供应口42供应到所述空间S中，以将染色剂45涂布到消化道112的内壁上。用所涂布的染色剂45将消化道112的活细胞中的癌症相关基因产物染成有彩色。
染色剂45可以是例如由含有姜黄素类化合物的染色剂或含有焰红染料的染色剂形成的单一染色剂。然而，希望使用两种染色剂，含有姜黄素类化合物的染色剂和含有焰红染料的染色剂。使用含有姜黄素类化合物的染色剂45允许掌握STAT3家族癌症相关基因表达图样的状态，使用含有焰红染料的染色剂45允许掌握ras家族癌症相关基因产物的表达状态。
当然，姜黄素类化合物不仅包括姜黄素，还包括高度水溶性的姜黄色素(curcuminoid)(几种类型的姜黄素衍生物的混合物)。
代替上文所述的焰红染料，使ras家族癌症相关基因表达图样染色的染色剂可以是含有任何下列材料的染色剂：
赤藓红(C20H8I4O5)
汞溴红(C20H8Br2HgNa2O6)
固绿FCF(C37H34N2Na2O10S3)
磺基水杨酸甲氯环素(C29H27ClN2O14S)
在染色之前，可以清洁消化道112的内部并且可以经由供应口42和回收口43去除消化道112中的粘液。
图9的部分(a)显示癌症检测装置1用于使消化道112的内壁平整。
如图9的部分(a)所示，染色剂45涂布到生物体中的细胞群后，(例如)经由供应口42供应气体以使消化道112膨胀。作为结果，消化道112的内壁伸展且平整。期望平整化的内壁表面113的不规则性具有高度差，例如小于或等于0.2mm。使消化道112的内壁平整化，允许精确地掌握在内壁表面113下方的预定深度的位置处的内壁表面113和活细胞群中癌细胞相关基因的状态。
图9的部分(b)是显示图11中的癌症检测装置1的内窥镜2的前端侧末端部分的示意图。图10是显示内窥镜2的前端处的旋转部分的结构的示意图。图11是显示癌症检测装置1的控制配置的框图。
除上述涂布单元40外，癌症检测装置1还包括包括内窥镜2的成像单元10和控制成像单元10和涂布单元40的移动的控制单元50。控制单元50包括评估癌变等级的评估单元52和存储信息的存储单元51，所述信息用作在评估癌变等级时的评估参考。将在后面描述评估单元52和存储单元51。
癌症检测装置1进一步包括激光振荡器60、光学部件65和图像处理单元70。
自激光振荡器60发射的激光L从作为光学部件65的二向色镜66反射，进一步从内窥镜2中的镜19反射，并将所述激光涂布到生物体。用所述激光L照射的活细胞中的癌症相关基因产物产生荧光，且所述荧光从镜19反射，穿过二向色镜66，并用光检测器35检测。将用光检测器35检测的光转换为电信号，并且图像处理单元70根据电信号形成图像。将二维扫描器67内置在激光振荡器60和二向色镜66之间的空间中(图11)。二维扫描器67用X-Y方向的辐射激光扫描成像目标区域的固定区域，以允许作为点的激光形成平面图像。由于荧光的颜色依据染色剂而改变，因此光检测器35由多个光检测器形成，并且将分色滤光器安排在光检测器35的上游侧以用于分色。替代地，可以通过使用CMOS(互补金属氧化物半导体)装置或CCD(电荷耦合装置)作为光电检测器35来分色。
将多光子激光显微镜中使用的激光振荡器60配置为具有从几十到几百飞秒范围的脉冲宽度和从几十到几百兆赫兹范围的脉冲频率。本实施方案中的激光L是双光子激光，其是一种多光子激光，激光振荡器60使用例如能够发射具有800nm波长和最大3.2W功率的光的脉冲激光。在所述成像操作中，所述激光输出具有0.16至0.32W范围的功率的激光。将所述波长设置在800nm或更长可以防止属于紫外区域(波长短于400nm)的光子在半波长光中产生，所述半波长光在多光子激发过程中产生。共聚焦激光显微镜中使用的激光振荡器60是例如输出具有用于典型共聚焦激光显微镜的可见波长的光的连续波(CW)激光器。
作为光学部件65的二向色镜66反射具有与所述激光L相同波长的光并透射具有其他波长的光。因此，从激光振荡器60发射的激光L从分色镜66反射朝向镜19。另一方面，所述癌症相关基因产物中产生的荧光从镜19反射，然后穿过二向色镜66，并到达光检测器35。光学部件65可以替代地由例如棱镜或λ\4波片(plate)形成。
成像单元10包括内窥镜2和光检测器35，并将激光L涂布到生物体的内部(活细胞群)，以对从生物体染色剂发出的荧光的细胞内荧光强度和生物体染色剂的细胞内分布形态进行成像，所述细胞内荧光强度和细胞内分布形态反映了特定的癌症相关基因产物表达图样。成像单元90包括焦点位置控制单元，并控制所述焦点位置控制单元以对被所述染色剂染色的癌症相关基因表达图样成像。
光检测器35检测将激光L涂布到所述活细胞时产生的荧光，并根据所述荧光的强度将荧光转换成电信号。光检测器35可以例如是光电倍增器或CCD半导体图像传感器。
如图10所示，内窥镜2包括内管12和外管13，所述外管13围绕内管12的外表面的一部分。内管12和外管13的一部分插入到生物体。内管12的长度为例如50mm，外径的范围为例如3mm至10mm。将线性运动致动器连接到内管12，内管12可相对于外管13在轴向X上移动约25mm。将超声波马达也连接到内管12，并且内管12可相对于外管13旋转360°以上。内管12在轴向X上或旋转方向R上的活动由控制单元50控制。
成像头11设置在内窥镜2的内管12的前端侧端部。如图9的(b)部分所示，成像头11连同内管12一起插入生物体中，以使得成像头11和内管12穿过插入管20的方式。控制成像头11以基于内管12在轴向X和旋转方向R上的活动而在生物体中移动。
成像头11包括物镜16、焦点改变器18、垫片(spacer)17和镜19。
如上所述，镜19是将从激光振荡器60输出的激光L改变方向为朝向物镜16或者将从所述癌症相关基因产物发出的荧光改变方向为朝向光检测器35的部件。
将物镜16设置成面向生物体的内壁表面113。所使用的物镜16可以是直径范围从3mm到5mm的透镜，其允许物镜16可以容易地插入生物体中。
焦点改变器18是例如压电促动器，并且在光轴方向上移动物镜16以改变物镜16的焦点的位置。焦点改变器18在控制单元50的控制下操作，并且可以在内壁表面113的表面下方0至1000μm的深度范围内调整焦点。
垫片17具有例如环形形状并设置在物镜16和内壁表面113之间的空间的周围。垫片17是这样一个部件：其不仅用于防止物镜16与生物体的内壁接触，还用于保持物镜16和内壁表面113之间的固定距离。
图像处理单元70以所述电信号和所述坐标位置相互关联地存储来自光检测器35的经转换的电信号(荧光强度)和从控制单元50发送的成像单元10的坐标位置，并处理关于所述电信号和所述坐标位置的数据以产生数字图像。将生成的数字图像显示在例如监视器上，打印出来或记录在控制单元50中的存储单元51中。成像单元10的坐标位置可以例如以距所述患者的参考位置(例如喉咙或肛门)的距离和成像头11的旋转角度的形式表示。
控制单元50例如由CPU、ROM和RAM形成。控制单元50经由内管12控制成像头11的活动。具体地，控制单元50控制成像头11不仅以沿着消化道112的消化内壁的内周的旋转方向R还以消化道112的管道纵向(沿消化道的X轴)移动。控制单元50还通过控制焦点改变器18的活动来改变物镜16在光轴方向上的位置，以控制在生物体中实现聚焦的位置。控制单元50还可以通过控制激光振荡器60来调节激光功率。
如上所述，控制单元50包括评估单元52和存储单元51，所述评估单元52评估癌变等级，所述存储单元51存储用作在评估癌变等级时的评估参考的信息。
存储单元51存储关于癌变等级的信息和关于活细胞群的染色状态的信息，其中所述两条信息彼此相关。癌变的等级表示为例如如图1C所示的根据每种癌症相关基因的活性状态划分的第一至第四阶段。关于活细胞群的染色状态的信息包含例如上述每个阶段中活细胞群的染色区域(染成有彩色的区域)中的细胞的面积或数量。染色区域中的细胞的面积或数量对应于所使用的染色剂的类型而变化，因此需要对应于要使用的染色剂预先获得。
评估单元52通过比较捕获的图像的染色状态与存储在存储单元51中的染色状态的信息来评估癌变等级。例如，评估单元52比较捕获的图像中的染色区域中的细胞的面积或数量与存储在存储单元51中的每个阶段中的染色区域中的细胞的面积或数量，以确定活细胞群的染色状态所属的阶段。
根据本实施方案的癌症检测装置1包括涂布单元40(其将染色剂45涂布于活细胞群，所述染色剂45选择性地使活细胞群的癌症相关基因表达图样染成有彩色)、成像单元10(对已经涂布了染色剂45的活细胞群成像)和评估单元52(其基于捕获的图像中的所述活细胞群的染色状态来评估所述活细胞群的癌变等级)。作为图像信息，除了染色区域中的细胞的面积或数量外，还使用染色区域的亮度或荧光颜色的差异或染色区域的几何图样的差异。所述自动诊断采用例如基于高度可信的亮度鉴定表达位置并基于混合荧光颜色的状态确定癌变等级的方法。使用几何图样的方法，尽管所述图样在器官基础上变化，但可以是一种用于使暗部(暗洞图样)的密度数字化的方法，如参考图4A的部分(c)和图4E的部分(a)所述的一种用于使岛状图样的密度数字化和识别所述岛状图案的扰乱的方法，或任何其他诊断方法。进一步地，使用暗部之间的间隔，暗部的直径，岛状图案中的间隔，岛状图案的直径或任何其他测量的距离，以评估和诊断所述图样的扰乱。
这样配置的癌症检测装置1基于所述活细胞群的癌症相关基因表达图样的染色状态来评估癌变等级，由此可以在早期掌握所述活细胞群的癌变。进一步地，由于可以掌握癌变的等级，可以了解癌症患者的预后。
进一步地，所述癌症检测装置1可以在用染色剂45染色的癌症相关基因表达图样中对平均直径至少大于或等于0.1mm但小于或等于0.4mm的细胞群体中的癌症相关基因表达图样成像。因此，可以掌握癌前状态中的活细胞的癌变等级，从而可以在癌细胞群体152清楚显现之前的超早期阶段了解癌症患者的预后。癌症相关基因表达图样的直径是具有与所述癌症相关基因表达图样的面积相同的面积的圆的直径。通过测量固定区域中存在的每个染色细胞群的上述直径并将这些直径除以染色细胞群的数量来计算平均直径。
进一步地，根据本实施方案的癌症检测装置1可以对用染色剂45染色的并且存在于大于或等于10μm但小于或等于1000μm的深度范围内的癌症相关基因表达图样成像。因此，可以掌握在粘膜表面下方大于或等于10μm但小于或等于1000μm的深度范围内的生物体内部的癌变等级，由此可以在所述癌细胞群体出现在粘膜表面之前的超早期阶段无遗漏部分地检测到癌细胞群体152，并且可以了解癌症患者的预后(图19A)。例如，如图19A所示，可以将在消化道粘膜表面以下10μm至50μm的深度范围内的细胞形态学荧光图像转换成消化道圆周周围的全周全景图像。作为结果，由于保证了全周成像，基于所述图像可以实现“无遗漏部分地癌症检测”。图19B显示癌症检测装置1A的内窥镜2。
癌症检测装置1A的内窥镜2包括内管12和外管13，所述外管13围绕内管12的外表面的一部分。将线性运动致动器连接到内管12，且内管12可沿轴向X相对于外管13移动。还将超声波马达连接到内管12，并且内管12可相对于外管13旋转360°以上。内管12在轴向X或旋转方向R上的活动由控制单元50控制。癌症检测装置1A允许了解病变相对于预定位置(例如在大肠的情况下是肛门和在胃的情况下是口)的轴向X上的距离和旋转方向R上的角度，由此可以识别病变的位置。
2.癌症检测装置的功能的实施例
接下来将描述根据本实施方案的癌症检测装置1的作用的实例。图12是显示癌症检测装置1的功能的实例的流程图。
在图8中，涂布染色剂45之前，首先经由供应口42(未显示)将清洁液体供应至封闭空间S中。从而清洁消化道112的内壁表面113。然后，经由回收口43吸取并回收所述清洁液体。然后，经由供应口42将链霉蛋白酶液体供应至封闭空间S中。由此去除已经黏附到消化道112的内壁表面113的过量的黏液。然后，经由回收口43吸取并回收所述链霉蛋白酶液体。
然后，涂布单元40将含有姜黄素类化合物的染色剂45涂布于活细胞群(S11a：涂布步骤)。具体地，含有姜黄素类化合物的染色剂45经由供应口42供应到封闭空间S中，以用所述染色剂45填充封闭空间S。然后将所述染色剂45放置2至5分钟，并且然后用所述清洁液体清洁空间S。由此用含有姜黄素类化合物的染色剂45将消化道112中的活细胞群中的STAT3家族癌症相关基因产物染色。
然后使用含有含有焰红染料的染色剂45的涂布单元40将含有焰红染料的染色剂45涂布于所述活细胞群(S11b：涂布步骤)。具体地，经由供应口42将含有焰红染料的染色剂45供应至封闭空间S中，以用所述染色剂45填充封闭空间S。然后将所述染色剂45放置2至5分钟，然后用所述清洁液体清洁所述空间S。由此用所述含有焰红染料的染色剂45使消化道112中的活细胞群中的ras家族癌症相关基因表达图样染色。两种类型的染色剂45的涂布导致消化道112内壁中的活细胞群被双重染色。
然后，成像单元10对被两种染色剂染色的活细胞群的癌症相关基因表达图样成像(S12：成像步骤)。具体地，控制单元50在控制成像头11不仅沿着消化道112的内壁在旋转方向R上而且在消化道112的管道纵向上(沿着消化道的X轴)的移动的同时进行成像。
然后，评估单元52基于捕获的图像中的染色状态来评估癌变等级和癌症患者的预后(S13：评估步骤)。
具体地，确定用染色剂45染色的染色区域中的细胞的面积和数量。通过基于预定阈值评估是否已经对捕获图像的每个像素进行了染色并且用相应的面积替换被确定为已经被染色的像素的数量，来确定各个染色区域的面积。每个染色区域中的细胞数量是基于所述细胞的核的数量或染色区域中由细胞膜分开的隔室的数量来确定的。然后将得到的面积或细胞数量的数据与存储在存储单元51中的表示面积或细胞数量的数据进行比较，以评估癌症患者的癌变等级和预后。
例如，当用含有焰红染料的染色剂45染色的染色区域的面积大于或等于0.0075mm2但小于3mm2时，可以认为ras家族癌症相关基因产物的表达已经增强，并因此可以确定癌变等级是第二阶段(参见图1C)或更晚阶段。例如，当用含有焰红染料的染色剂45染色的染色区域中的细胞数量大于或等于8但小于512时，可以认为ras家族癌症相关基因产物的表达已经增强，并因此可以确定癌变等级是第二阶段或更晚阶段。此外，所述第二阶段和后续阶段可以进一步划分为用于评估癌变等级和癌症患者的预后的子阶段。
如上所述，可以基于ras家族癌症相关基因产物的表达状态来评估癌变等级，但不是必需的。代替地，可以通过使用含有姜黄素类化合物的染色剂45基于STAT3家族癌症相关基因的活性状态来评估癌变等级。仍然代替地，可以使用预定的染色剂使APC/β-连环素家族或p53家族癌症相关基因表达图样染色，并且可以检查生长抑制信号的幅度是否已经降低，用于评估癌变等级和癌症患者的预后。
根据本实施方案的基于多光子激光显微镜的癌症检测装置1还可以用于利用所述激光去除癌性部分(癌细胞群体)。
例如，当成像单元10产生的图像包含癌性部分的情况下，与多光子激光显微镜下的成像功率相比，激光L的功率增加，并且将具有增加功率的激光L应用到癌性部分以特异性地仅去除(蒸腾)癌性部分。去除操作中的激光功率是成像操作中的功率的10至20倍，或者在2W至3W的范围内。因此，可以在癌性部分的早期阶段可靠地去除癌性部分。
(第二实施方案)
根据第二实施方案的癌症检测装置是静止型的检测装置，并且在体外检测患者的情况下，或者在从患者中取出即刻后的约20分钟内的组织细胞的情况下使用。
如图13所示，根据本实施方案的癌症检测装置201包括激光振荡器213、光束直径调节器215、二维扫描器217、二向色镜219、物镜221、聚焦光深度调节器223、光检测器225、荧光图像生成单元227、监视器229和控制单元231。
将所使用的激光振荡器213配置为具有从几十到几百飞秒的范围的脉冲宽度和从几十到几百兆赫兹的范围的脉冲重复频率，并且将其进一步配置成能够调整脉冲激光的功率或输出用于典型的共聚焦激光显微镜的具有可见波长的光的CW激光器。
在使用用于多光子激光的脉冲激光器的情况下，光束直径调节器215是根据来自控制单元231的光束直径调节信号改变脉冲激光的光束直径的光束扩展器。
二维扫描器217例如由两片检流镜(galvanometric mirror)形成，并且在垂直于光轴的两个轴向上改变所述脉冲激光的聚光位置。
当用所述脉冲激光照射所述活细胞时，二向色镜219分离活细胞中癌症相关基因产物中产生的荧光。
物镜221将从激光振荡器213发射的脉冲激光聚焦在所述活细胞中，并将所述癌症相关基因产物中产生的荧光聚焦成多光子吸收现象。聚焦光深度调节器223可以基于控制信号在光轴方向上移动物镜221，使得可以调节激光聚焦的聚焦光位置。
光检测器225检测所述癌症相关基因产物中产生的荧光，并根据荧光强度将所述荧光转换成电信号。
二维扫描仪217的扫描状态和由聚焦光深度调节器223提供的调节的聚焦光位置(深度方向上的位置)是表示聚焦光位置的坐标的参数，并且荧光图像生成单元227存储表示这些坐标的参数和从光检测器225发送的电信号(即荧光强度)，其中这些坐标参数和电信号彼此相关，并处理关于这些参数和电信号的数据以产生荧光图像。产生的荧光图像显示在监视器229上。控制单元231包括活动控制单元233、检测脉冲强度设置单元235、照射范围设置单元239和照射时间设置单元241。活动控制单元233控制激光振荡器213、光束直径调节器215、二维扫描器217和聚焦光深度调节器223的活动。检测脉冲强度设置单元235设置适合于获取癌症相关基因表达图样的荧光图像的脉冲激光强度，以检测活细胞。
照射范围设置单元239设定用所述脉冲激光照射活细胞的范围。然后，活动控制单元233控制二维扫描器217和聚焦光深度调节器223的活动，以使所述脉冲激光在设定的照射范围内的设定深度照射和聚焦。照射时间设置单元241设定用所述脉冲激光照射活细胞的时间。活动控制单元233控制来自激光振荡器213的脉冲激光的功率，以使所述待照射的脉冲激光仅持续设定的时间。
本实施方案中的控制单元231包括与第一实施方案中相同的存储单元51和评估单元52。即，癌症检测装置201基于捕获的图像中的活细胞群的染色状态来评估所述活细胞群的癌变等级和预后。
基于所述活细胞群中癌症相关基因表达图样的染色状态来评估癌变等级的癌症检测装置201，可以在早期掌握所述活细胞群的癌变。此外，允许基于所述癌症相关基因的表达状态掌握癌变等级的癌症检测装置201允许了解癌症患者的预后。
癌症检测装置201包括治疗脉冲强度设置单元237，其可以设定足够强的脉冲激光强度以破坏所述活细胞以进行其治疗。因此，可以在早期对所发现的癌细胞群体进行癌症治疗。除了上述之外，根据本实施方案的癌症检测装置201可以以各种其他形式执行。
例如，如图14所示进行癌症检测，可以将光束直径调节器215、二维扫描器217、由二向色镜219、物镜221和它们之间的光路形成的光学系统，以及聚焦光深度调节器223设置在激光辐射头243中，并且可以进一步设置患者所躺的患者固定台245和移动装置247。
此外，例如，在从患者身上刮下活细胞群的一部分并且将刮下的活细胞群放置在托盘(样品支架)上的状态中，可以使用癌症检测装置201对所述活细胞群成像并评估癌变等级。在这种情况下，可以在刮下所述活细胞群之前或者刮下所述活细胞群之后但在成像之前将所述染色剂45涂布到所述活细胞群。(第三实施方案)
1.癌症检测装置的基本配置
下面将参照图15至18描述根据第三实施方案的癌症检测装置301的基本配置，其是使用输出具有用于典型共聚焦激光显微镜的可见波长的光的CW激光器的情况。
图15是显示图17中的癌症检测装置301的内窥镜2的前端侧端部的示意图。图16是显示整个内窥镜2的示意图。图17是显示癌症检测装置301的控制配置的框图。
如图17所示，癌症检测装置301包括具有内窥镜2的成像单元10、控制单元50和图像处理单元70。癌症检测装置301进一步包括激光振荡器60C和光学部件65C。癌症检测装置301还进一步包括涂布单元40，其将所述染色剂涂布于生物体的内部(参见图8)。
自激光振荡器60C发射的激光L1从作为光学部件65C的二向色镜66C反射，进一步从内窥镜2中的镜19C反射，并应用于生物体。用所述激光L1照射的活细胞产生荧光，且所述荧光从镜19C反射，经过二向色镜66C，并用光检测器35C检测。将使用光检测器35C检测到的光转换为电信号，并且图像处理单元70根据电信号形成图像。由于所述荧光的颜色对应于所述染色剂而改变，所以光检测器35C可以由多个光检测器形成，并且分色滤光器可以安排在光检测器35C的上游侧以进行分色。上述部件的活动、功能和作用与图11中的大致相同，但因为共聚焦激光器显微镜在原理上与多光子激光显微镜不同，所述部件的编号后缀有“C”，代表CW激光器的第一个字母用于区分目的。激光振荡器60C包括多个激光器，所述激光器允许将激光L1的波长在405至980nm的波长范围内逐步改变，并且根据测量靶标中发生的荧光反应的特性来选择所述波长。所述激光器可各自以脉冲或连续振荡操作。在脉冲操作的情况下，操作频率至少为几十千赫兹，且占空(duty)范围为5％至50％。考虑到产生清晰图像的成像扫描频率，如此选择所述频率和占空范围。本实施方案中的激光L1是共聚焦激光，并且激光振荡器60C使用例如能够发射强度峰波长为488nm、594nm或647nm且最大功率为30mW的光的激光器。在所述成像操作中从所述激光器发射的激光的功率范围为5至10mW，但不是必需的。激光振荡器60C可以根据染色程度和荧光强度的程度来调节激光L1的强度。作为光学部件65C的二向色镜66C反射具有与激光L1相同波长的光并透射具有其他波长的光。因此，从激光振荡器60C发射的激光L1从分色镜66C反射朝向镜19C。另一方面，所述活细胞中产生的荧光从镜19C反射，然后穿过二向色镜66C，并到达光检测器35C。光学部件65C可以替代地由例如棱镜或λ4波片形成。
成像单元10包括内窥镜2和光检测器35C，并将激光L1应用到所述生物体内部，以对所述生物体中的细胞形态成像。
光检测器35C检测当激光L1应用于所述活细胞时产生的荧光，并根据所述荧光强度将所述荧光转换成电信号。光检测器35C例如可以是光电倍增器或CCD半导体图像传感器。配置小孔或任何其他部件作为提供共聚焦激光功能的部件。
如图16所示，内窥镜2包括内管12和外管13，所述外管13围绕内管12的外表面的一部分。将内管12和外管13的一部分插入所述生物体中。内管12的长度为例如)50mm，外径的范围为(例如)3mm至10mm。将线性运动致动器连接到在内管12，并且内管12可相对于外管13在轴向X上移动约25mm。将超声波马达进一步连接到内管12，并且内管12可相对于外管13旋转360°以上。内管12在轴向X或旋转方向R上的活动由控制单元50控制。
将成像头11C设置在内窥镜2的内管12的前端侧端部。如图15所示，以成像头11C和内管12经过插入管20的方式将成像头11C连同内管12一起插入所述生物体。如此控制成像头11C以使其基于内管12在轴向X和旋转方向R上的活动而在所述生物体中移动。
成像头11C包括物镜16C、焦点改变器18、垫片17和镜19C。
如上所述，镜19C是将从激光振荡器60C输出的激光L1改变方向为朝向物镜16C或者将从所述活细胞发射的荧光改变方向为朝向光检测器35C的部件。
将物镜16C如此设置以使其面向所述生物体的内壁表面113。物镜16C具有例如10mm的直径、10倍的放大率、5μm的分辨率和3mm×3mm的成像视场。代替地，物镜16C具有12mm的直径、40倍的放大率、10μm的分辨率和7.5mm×7.5mm的视场。成像视场越宽，成像越好。还代替地，物镜16C可以如此设置使得具有上述任一直径的透镜的一部分被切掉或者物镜16C的直径减小至3mm至5mm范围的值，使得所述物镜容易地插入生物体内同时保持相同分辨率。。可以将物镜16C如此设置使其相对于内壁表面113倾斜。利用物镜16C倾斜进行所述成像允许同时观察到上皮120和腺体130的细胞形态。
焦点改变器18例如是压电致动器或电磁致动器，并且使物镜16C在光轴方向上移动以改变物镜16C的焦点的位置。焦点改变器18在控制单元50的控制下操作，并且可以在内壁表面(粘膜表面)113以下的0至75μm深度范围内调整焦点。改变焦点的位置允许对消化道112的内壁表面113以下的预定深度处的生物体的状态成像。
垫片17具有例如环形形状，并且设置在物镜16C和内壁表面113之间空间的周围。垫片17是不仅用于防止物镜16C与所述生物体的内壁接触也是用于维持物镜16C和内壁表面113之间的固定距离的部件。通过成像开始之前将垫片17更换为另一个或者使用致动器或任何其他装置添加距离可改变机构，将物镜16C和内壁表面(粘膜表面)113之间的距离设置在适当值，例如大于或等于1mm但小于或等于10mm的值。控制单元50控制成像头11C(内管12)的移动，同时垫片17与内壁表面113接触，并维持物镜16C至内壁表面113的固定距离。
控制单元50由例如CPU、ROM和RAM形成。控制单元经由内管12控制成像头11的活动。具体地，控制单元50控制成像头11C不仅以沿着消化道112的内壁的内周的圆周方向上而且以消化道112的管道纵向上(沿着消化道的轴)的移动。控制单元50通过控制焦点改变器18的活动进一步改变物镜16C在光轴方向上的位置以控制在生物体中实现聚焦的位置。控制单元50可以通过控制激光振荡器60C进一步调整激光功率。
图像处理单元70存储来自光检测器35C的转换的电信号(荧光强度)和从控制单元50发送的成像单元10的坐标位置，其中所述电信号和坐标位置彼此相关，并处理关于所述电信号和所述坐标位置的数据以生成数字图像。将生成的数字图像例如显示在监视器上，打印出来或记录在存储设备上。可以将成像单元10的坐标位置例如以距患者的参考位置(例如喉咙或肛门)的距离和成像头11的旋转角度的形式表示。
根据本实施方案的基于共聚焦激光内窥镜的癌症检测装置301包括成像单元以及控制成像头11C的操作的控制单元50，所述成像单元包括插入生物体的成像头11且通过将激光应用于所述生物体经由成像头11对所述生物体成像。成像头11C包括物镜16C和能够改变物镜16C的焦点在所述生物体的深度方向上的位置的焦点改变器18，并且控制单元50引起焦点改变器18以这样的方式操作：所述焦点的位置具有所述生物体中粘膜表面以下的深于或等于10μm但浅于或等于100μm(合意的是深于或等于10μm但浅于或等于70μm)的预定深度。成像单元10将所述激光应用于生物体中存在的且用选择性地将所述细胞群染色成有彩色的染色剂45染色的细胞群，并且在预定深度对染色的细胞群成像。
将描述一种物镜16C和所述粘膜表面之间维持的固定位置关系的控制焦点的方法。图17中的参考字符171表示第二激光振荡器，其发射连续的平行光作为参考光L2，其例如具有680nm的波长和约5mW的功率。分束器、半镀银镜或任何其他组件导致来自第二激光振荡器171的光沿着来自激光振荡器60C的光的光路行进。图17中，为了便于理解，用从激光振荡器60C的光的光路略微偏移的虚线绘制参考光L2的光路。上述参考光L2沿着与癌症检测激光L1的路径大致相同的路径行进，但是越过分束器173沿着不同的光路行进并进入焦点控制光学单元174。在物镜16C的焦点的位置变化的情况下，柱面透镜、分束器和其他组件形成能够检测所述焦点位置的变化量的光学部件结构。参考字符175表示通常被分成2或4个面板的光检测器。(例如使用差分放大器)将用这样配置的光检测器检测到的光转换成与物镜16C和粘膜表面之间的位置关系的变化成比例的电信号。上述物镜位置的控制在例如光盘装置中使用，并且完全适用于内窥镜装置。为了将上述位置控制应用于癌症检测装置，需要注意的一点是，用于成像的激光L1和参考光L2优选地具有不同的波长，使得所述两种光束容易彼此分离。将所述两种光束的波长彼此分离至少100nm，实现了允许所述两种光束令人满意地彼此分离的成像系统和焦点控制系统的光学特性。在设置上述焦点控制系统的情况下，将偏压施加于所述控制系统，允许精确调整所述焦点的位置。逐步改变所述偏压允许将激光L1在深度方向上聚焦的位置的自动控制。
光学部件11C、35C、65C、66C、172、173和174的透射率或反射率很大程度上取决于激光束L1和L2的波长。因此，根据所述激光束的波长模块化光学部件并制备多个模块可以容易地处理所述激光束的波长对应于待用的染色剂或待检测的身体部位而变化的情况。
如上所述，甚至包括共聚焦内窥镜的癌症检测装置301可以获得在所述生物体的内壁表面(粘膜表面)113下方的深于或等于10μm但是浅于或等于70μm的深度的图像。因此，可以容易地发现病变，并且选择所述激光束的波长和强度允许在所述患者无负担(例如用所述激光照射的细胞的光学损害)的情况下获取图像。
癌症检测装置的作用
接下来将描述根据本实施方案的癌症检测装置301的功能。图18是显示癌症检测装置301的功能的实例的流程图。在根据本实施方案的癌症检测装置301中，将两种不同的染色剂45涂布于活细胞群以将两种癌症相关基因表达图样染成彼此不同的颜色，并对染色的癌症相关基因表达图样成像。
在涂布染色剂45之前，首先经由供应口42(未显示)将清洁液体供应至封闭空间S中。从而清洗消化道112的内壁表面113。然后，经由回收口43吸取和回收所述清洗液体。然后，经由供应口42将链霉蛋白酶液体供应至封闭空间S中。由此去除黏附于消化道112的内壁表面113的过量的黏液。经由回收口43吸取和回收所述链霉蛋白酶液体。
然后，涂布单元40将含有姜黄素类化合物的染色剂45涂布于所述活细胞群(S11a：涂布步骤)。具体地，含有基于姜黄素化合物的染色剂45经由供应口42供应至封闭空间S中，以用所述染色剂45填充封闭空间S。然后，将所述染色剂45放置2至5分钟，并且用所述清洁液体清洁所述空间S。从而用含有姜黄素类化合物的染色剂45将消化道112中的活细胞群中的STAT3家族癌症相关基因产物染色。
然后使用含有含有焰红染料的染色剂45的涂布单元40将含有焰红染料的染色剂45涂布于所述活细胞群(S11b：涂布步骤)。具体地，经由供应口42将含有焰红染料的染色剂45供应至封闭空间S中，以用所述染色剂45填充封闭空间S。然后将所述染色剂45放置2至5分钟，然后用所述清洁液体清洗所述空间S。从而用所述含有焰红染料的染色剂45使消化道112中的活细胞群中的ras家族癌症相关基因表达图样染色。
然后，成像单元10对用上述两种染色剂45染色的活细胞群的癌症相关基因表达图样成像(S12：成像步骤)。具体地，用具有两种不同波长的激发光束照射染色成两种不同颜色的癌症相关基因表达图样，以允许成像单元10对多种癌症相关基因表达图样成像。在本实施方案中，辐射作为激发光束的具有488nm波长的激发光L1，用于引起被含有姜黄素类化合物的染色剂染色的癌症相关基因表达图样发射荧光，并且辐射作为激发光束的具有594nm波长的激发光L1，其用于引起被含有焰红染料的染色剂染色的癌症相关基因表达图样发射荧光。然后，用所述两种类型的激光L1顺序地照射染色成所述两种颜色的癌症相关基因表达图样，并用光检测器35C检测通过所述照射产生的荧光。
然后，评估单元基于捕获的图像中的染色状态来评估癌变等级和所述癌症患者的预后(S13：评估步骤)。
如上所述，用对应于相应的染色剂45的激发光束照射用所述两种染色剂45染色的各自癌症相关基因表达图样，以用于检测多个癌症相关基因的活性状态和评估癌变等级。进一步地，用具有上述的单一波长的激光L1照射各个癌症相关基因表达图样，允许稳定检测从所述癌症相关基因表达图样发射的荧光。
以上描述是参考使用所述两种染色剂45和与其对应的激发光束来检测两种癌症相关基因表达图样的情况进行的，但不是必须的。可以使用三种或更多种染色剂45和与其对应的激发光束来检测三种或更多种癌症相关基因表达图样。所述染色剂45不限于姜黄素类化合物或焰红染料，替代性地可以为High Red V80、硫磺菊素、赤藓红、表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-gallate)、吲哚菁绿(indocyanine green)、二甲花翠素(malvidin)、β-胡萝卜素、High Red BL、6-姜醇、杨梅酮(myricetin)、tricenidine或petunidine。
例如，使用将制动系统基因APC/β-连环素家族或p53家族的癌症相关基因表达图样染色的染色剂45允许检查细胞生长抑制信号的幅度是否已经下降。因此，可以检测制动系统基因，并且可以评估癌症患者的预后。
如上所述，用许多种染色剂45染色癌症相关基因表达图样，并用对应于相应的染色剂45的激发光束照射每种染色的癌症相关基因表达图样，允许检测许多种癌症相关基因。因此，可以从不同角度分析癌变等级，由此可以增加评估预后的可能性。
接下来将描述基于癌性部位和健康部位之间的食用色素的渗透性差异来确定癌性部位和健康部位。
将参考图20A，20B和20C描述在多光子激光显微镜(由奥斯巴林公司制造的FV1000MPE)下同时改变焦点深度对生物体中的细胞形态成像以及在预定位置切割多个捕获的图像以产生剖面图像(层析图像)的情况。使用实验室小鼠作为所述生物体。
图20A至20C显示说明在内壁表面(粘膜表面)下方的预定深度范围内的细胞形态的图像，具体地，通过从粘膜表面(深度0)至150μm的深度以2-μm的间隔进行成像并将捕获的总共75幅图像相互叠加获得的三维数据图像，。在图20A至20C的每一个中，部分(a)显示在垂直于内壁表面113的方向上观察的平面图中的细胞群的图像，部分(b)显示沿线b-b截取的部分(a)的剖面图像，并且部分(c)显示沿线c-c截取的部分(a)的剖面图像。
作为用于染色细胞群的染色剂，使用含有姜黄素的染色剂和含有酸性红的染色剂(红色#106)二者。将染色时间设定为5分钟。所述染色时间是使染色剂与细胞群接触并且允许染色剂的染料渗透到细胞本身或所述细胞之间的间隙中的时间。
图20A至20C显示通过同时对相同的细胞群成像并对图像滤波以提取不同的颜色(波长)而获得的图像。图20A显示了表示提取的用姜黄素染料和酸性红染料二者染色的颜色区域的图像。图20B显示了表示提取的用姜黄素染料染色的颜色区域的图像。图20C显示了表示提取的用酸性红染料染色的颜色区域的图像。图20A至20C显示了本质上是彩色图像的单色图像，并且由所述染色剂进行染色的趋势的差异导致用姜黄素染料染色的区域以绿色荧光颜色显示以及用酸性红染料染色的区域以浅红色或近橙色荧光色显示，由此更明显地表示颜色差异。
图20A至20C显示癌组织和健康粘膜组织，并表明所述染料在渗透性方面彼此不同。如图20B所示，姜黄素染料在癌组织中显示出比在健康粘膜组织中更高的渗透性。具体地，在姜黄素染料的情况下，在所述癌组织中组织染色的深度约为40μm，而在所述健康粘膜组织中深度约为20μm。如图20C所示，酸性红染料在所述癌组织中显示出比在所述健康粘膜组织中更低的渗透性。具体地，在酸性红染料的情况下，在所述癌组织中组织染色的深度约为40μm，而在所述健康粘膜组织中深度约为70μm。
如上所述，染料的渗透性根据细胞形态是癌组织还是健康粘膜组织而变化。基于上述特征认为，对剖面图像中显示的细胞群体染色的深度的测量允许鉴定所述细胞群，即健康细胞群或癌细胞群。癌症检测装置在成像时在细胞表面下方进行深度方向控制，以基于所述细胞群已经染色的深度来评估在所述剖面图像中显示的细胞群是否疑似病变。例如，当已用姜黄素染料染色的细胞群的深度大于已用姜黄素染料染色的健康粘膜组织的深度(例如，至少1.5倍)时，控制单元50确定癌细胞已经发展，而当所述两个深度彼此相似时(例如，差异小于1.5倍)，控制单元50确定没有癌细胞已经发展。此外，当已用酸性红染料染色的细胞群的深度小于已用酸性红染料染色的健康粘膜组织的深度(例如，至少0.6倍)时，控制单元50确定癌细胞已经发展，而当所述两个深度彼此相似时(例如，差异至少为0.6倍)，控制单元50确定没有癌细胞已经发展。值得注意的是在基于例如单染色或双染色评估癌细胞是否存在之后，基于剖面图像的上述评估增加了所述评估的可靠性。在本实施例中，使用以高渗透程度染色STAT3-家族癌症相关基因产物的姜黄素和以高程度渗透到健康细胞的酸性红。用焰红染料、赤藓红或任何其他以高渗透程度渗透到ras家族癌症基因产物的染色剂允许在染色剂渗透程度方面比较STAT3家族和ras家族的进展程度。
(其他实施例)
已经描述了根据本发明实施方案的癌症检测装置1、201和301，但是本发明不限于上述实施方案及其变型。例如，上述实施方案及其变型如下改变的方面也可以落入本发明的范围内。
例如，在第一实施方案中，为了使癌症相关基因表达图样染色，逐一使用染色剂用于顺序染色，但不是必需的。可以预先将多种染料彼此混合以产生含有多种染料的混合染色剂，并且可以使用所述混合染色剂进行同时染色。进一步地，含有粘膜清洁剂、染色剂和其他物质的口服清洁液可用于染色消化道。在上面的描述中，已经以两种方式描述了所述染色：使癌症相关的基因表达图样染色；以及使癌症相关基因产物染色。癌症相关基因表达图样不仅是癌症相关基因产物染色操作的结果，还是癌症相关基因产物已经增加到一定程度的状态作为观察目标的结果。
在第一实施方案中，在成像之前，用两种不同颜色的染色剂使生物体染色，但不是必须的。在成像之前，可以用三种或更多种不同颜色的染色剂使生物体染色。
在第一和第二实施方案中，多光子激光用作癌症检测装置1的激光，但不是必须的，并且可以替代地使用共聚焦激光。仍可替代地，也可以使用典型的CW激光显微镜或单色荧光显微镜，只要适当选择要使用的波长即可。从深度方向成像和分辨率的角度来看，期望使用波长范围为600nm至1600nm的多光子激光。然而，在使用波长范围为400至700nm的共聚焦激光显微镜或使用发射波长范围为400至700nm的光或者波长范围为400至700nm的单色光的典型CW激光的荧光显微镜下通过熟练地选择透镜或波长以获得允许能够观察染色细胞的细胞核的放大率或分辨率而在一定程度上实现上述分析落入本发明的范围内。进一步地，上面已经描述了改变照射样品的激光的波长以及对应于从染色剂发射的荧光的波长而改变用于图像形成的滤光器。
根据第一和第二实施方案的癌症检测装置1、201和301也可应用于消化道以外的管腔器官(例如支气管、膀胱和泌尿管)，并且可以进一步可视化肾脏、肝脏、大脑、视网膜和其他细胞结构，虽然存在对样品表面下方1mm或更小深度的可视化范围的限制。
进一步地，上述图像不限于静止图像，且可以替代为运动图像或静止图像和运动图像的组合。例如，可以在预备诊断、术后常规检测和其他场合捕获运动图像，而静止图像可以用于精确诊断。成像时的放大倍率也不限于落入上述范围内。
生物体染色中待染色的细胞组织可以是体内细胞组织或在通过外科手术切除细胞组织或以其他方式从所述生物体中分离出来即刻后的20分钟内的新鲜的离体细胞组织。
进一步地，已经在假设癌症检测装置包括染色单元、包含内窥镜的成像单元、存储单元和评估单元的情况下描述了上述每个癌症检测装置，但是癌症检测装置不一定包括染色单元和评估单元二者。另一个设备进行染色的配置和其中存储单元中的内容与另一设备或计算机共享并且所述其他设备或计算机进行分析和评估的配置落入本发明的范围内。进一步地，取决于待分析部位，成像单元不一定包括内窥镜，且可以替代地包括具有固定物镜的显微镜，因为说明书描述了上述两种情况。因此，后一种情况当然落入本发明的范围内。
工业实用性
将根据本发明的癌症检测装置用于发现消化道、呼吸系统、肾/泌尿系统、子宫-卵巢生殖系统、脑脊髓神经系统和其他身体部位中的早期癌症。
符号说明
1、1A、201、301 癌症检测装置
2 内窥镜
10 成像单元
11、11C 成像头
12 内管
13 外管
16、16C 物镜
17 垫片
18 焦点改变器
19、19C 镜
20 插入管
21 第一球囊
22 第二球囊
35、35C 光检测器
40 涂布单元
42 供应口
43 回收口
45 染色剂
50、231 控制单元
51 存储单元
52 评估单元
60、60C 激光振荡器
65、65C 光学部件
66、66C 二向色镜
67 二维扫描器
70 图像处理单元
112 消化道
113 消化道内壁表面(粘膜表面)
120 上皮
121 上皮细胞
125 上皮细胞的细胞核
126 上皮细胞的细胞质
130 腺体
131 腺细胞
132 毛细血管
133 结缔组织
135 腺细胞的细胞核
136 腺细胞的细胞质
137 基底膜
138 隐窝
152 癌细胞群体
160 粘膜的肌肉层
L、L1 激光
L2 参考光
S 封闭空间

Claims (21)

1.一种癌症检测装置，其包含：
涂布单元，其将染色剂涂布于活细胞群，所述染色剂选择性地使活细胞的癌症相关基因产物染成有彩色；
成像单元，其对已经涂布了所述染色剂的所述活细胞群成像；和
评估单元，其基于通过所述成像产生的图像中的所述活细胞群的染色状态评估所述活细胞群的癌变等级。
2.根据权利要求1的癌症检测装置，
其中所述涂布单元涂布使传递促进所述活细胞生长的信号的ras家族癌症相关基因产物染色的染色剂。
3.根据权利要求2的癌症检测装置，
其中所述涂布单元涂布含有焰红染料、赤藓红、汞溴红、固绿FCF或磺基水杨酸甲氯环素的染色剂。
4.根据权利要求1至3中任一项的癌症检测装置，
其中所述涂布单元涂布使传递促进所述活细胞生长的信号的STAT3家族癌症相关基因产物染色的染色剂。
5.根据权利要求4的癌症检测装置，
其中所述涂布单元涂布含有姜黄素类化合物的染色剂。
6.根据权利要求1至5中任一项的癌症检测装置，
其中所述涂布单元将含有姜黄素类化合物的染色剂涂布于所述活细胞群，然后将含有焰红染料、赤藓红、汞溴红、固绿FCF或磺基水杨酸甲氯环素的染色剂涂布于所述活细胞群。
7.根据权利要求1至5中任一项的癌症检测装置，
其中所述涂布单元将使传递促进所述活细胞生长的信号的STAT3家族癌症相关基因产物染色的染色剂涂布于所述活细胞群，然后涂布使传递促进所述活细胞生长的信号的ras家族癌症相关基因产物染色的染色剂。
8.根据权利要求1至7中任一项的癌症检测装置，
其中所述评估单元基于所述活细胞群的染色区域的面积进行所述评估。
9.根据权利要求1至8中任一项的癌症检测装置，
其中所述评估单元基于所述活细胞群的染色区域的染色细胞的数量进行所述评估。
10.根据权利要求1至9中任一项的癌症检测装置，
其中所述评估单元基于含有所述活细胞群的染色区域的固定面积中的染色细胞群的数量和平均直径进行所述评估。
11.根据权利要求1至10中任一项的癌症检测装置，
其中所述成像单元通过用多光子或共聚焦激光照射已经涂布了所述染色剂的所述活细胞群而对所述活细胞群成像。
12.根据权利要求1至11中任一项的癌症检测装置，
其中所述成像单元对被所述染色剂染色且具有大于或等于0.1mm但小于或等于0.4mm直径的癌症相关基因表达图样成像。
13.根据权利要求1至12中任一项的癌症检测装置，
其中所述涂布单元通过将多种不同的染色剂涂布于所述活细胞群，使多种癌症相关基因表达图样染成彼此不同的颜色，并且
所述成像单元通过用分别对应于各种染色剂的多种激发光束照射以所述不同颜色染色的所述多种癌症相关基因表达图样，对多种所述癌症相关基因表达图样成像。
14.根据权利要求13的癌症检测装置，
其中所述染色剂是至少两种类型的染色剂，并且
照射所述多种癌症相关基因表达图样的激发光束是对应于所述染色剂的类型选择的。
15.根据权利要求1至14中任一项的癌症检测装置，
其中所述成像单元包括焦点位置控制单元，并控制所述焦点位置控制单元对被所述染色剂染色的存在于生物体表面下方深于或等于10μm但浅于或等于1000μm的深度处的所述癌症相关基因表达图样成像。
16.根据权利要求15的癌症检测装置，
其中，在所述被染色剂染色的生物体内的同一成像位置，控制所述焦点位置控制单元从表面起以固定的间隔改变焦点以在不同深度的焦点位置进行成像，将多个捕获的图像按照焦点位置信息顺序彼此叠加成立体图像，并且基于所述立体图像中所述染色剂的渗透程度进行所述评估。
17.一种癌症检测方法，其包含：
将染色剂涂布于活细胞群的涂布步骤，所述染色剂选择性地使活细胞的癌症相关基因产物染成有彩色；
对已经涂布了所述染色剂的活细胞群成像的成像步骤；和
基于通过所述成像产生的图像中的所述活细胞群的染色状态评估所述活细胞群的癌变等级的评估步骤。
18.根据权利要求17的癌症检测方法，
其中在所述评估步骤中，基于所述活细胞群的染色区域的面积进行所述评估。
19.根据权利要求17或18的癌症检测装置，
其中在所述评估步骤中，基于所述活细胞群的染色区域中的染色细胞的数量进行所述评估。
20.根据权利要求17至19中任一项的癌症检测方法，
其中在所述评估步骤中，基于含有所述活细胞群的染色区域的固定面积中的染色细胞群的数量和平均直径进行所述评估。
21.用于癌症检测的染色剂，其含有：
使传递促进活细胞生长的信号的ras家族癌症相关基因产物染色的焰红染料、赤藓红、汞溴红、固绿FCF或磺基水杨酸甲氯环素，或使传递促进所述活细胞生长的信号的STAT3家族癌症相关基因产物染色的姜黄素类化合物，并且
其具有这样的浓度，使得在染色开始后10分钟内该染色剂渗透到活细胞的细胞质但不渗透到细胞核。
CN201780036233.9A 2016-05-18 2017-05-18 癌症检测装置、癌症检测方法和用于癌症检测的染色剂 Active CN109414151B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016099997 2016-05-18
JP2016-099997 2016-05-18
JPPCT/JP2017/006962 2017-02-23
PCT/JP2017/006962 WO2017146184A1 (ja) 2016-02-23 2017-02-23 レーザ内視鏡装置
PCT/JP2017/018755 WO2017200066A1 (ja) 2016-05-18 2017-05-18 がん検査装置、がん検査方法、および、がん検査用の染色剤

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109414151A true CN109414151A (zh) 2019-03-01
CN109414151B CN109414151B (zh) 2022-11-25

Family

ID=60325950

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780036233.9A Active CN109414151B (zh) 2016-05-18 2017-05-18 癌症检测装置、癌症检测方法和用于癌症检测的染色剂

Country Status (5)

Country Link
US (2) US11555819B2 (zh)
EP (1) EP3459424A4 (zh)
JP (2) JPWO2017200066A1 (zh)
CN (1) CN109414151B (zh)
WO (1) WO2017200066A1 (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11140318B2 (en) * 2016-02-23 2021-10-05 Mie University Laser endoscope device
JP7267606B2 (ja) * 2017-11-28 2023-05-02 国立大学法人三重大学 検出方法
JP7420346B2 (ja) * 2019-01-09 2024-01-23 国立大学法人九州大学 三次元形状情報生成装置、細胞判定システム
JPWO2020241633A1 (zh) * 2019-05-27 2020-12-03
CN114945825A (zh) 2019-10-23 2022-08-26 国立大学法人大阪大学 癌症判定装置、癌症判定方法以及程序
WO2021152784A1 (ja) * 2020-01-30 2021-08-05 株式会社インキュビット 手術支援システム
CN116209429A (zh) * 2020-09-17 2023-06-02 科研制药株式会社 用于放大内窥镜、超放大内窥镜的诊断精度提升用组合物
KR102449858B1 (ko) * 2021-07-08 2022-09-30 가톨릭대학교 산학협력단 암 세포 판정을 위한 핵이미지 선별 장치 및 핵이미지 선별 방법

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005518553A (ja) * 2001-09-06 2005-06-23 ジェノミック プロファイリング システムズ インコーポレイティッド 細胞およびウイルスの迅速かつ高感度な検出方法
JP2007195533A (ja) * 2006-01-27 2007-08-09 Toshiki Minami 細胞の評価方法、これを用いたる測定成分のがん化評価方法、がん診断キットおよびコンピュータ可読媒体
EP2611930A1 (en) * 2010-09-02 2013-07-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the treatment and the diagnosis of cancer
WO2014157645A1 (ja) * 2013-03-29 2014-10-02 ソニー株式会社 レーザ走査型観察装置及びレーザ走査方法
WO2014157703A1 (ja) * 2013-03-29 2014-10-02 国立大学法人三重大学 生体染色剤
WO2015190225A1 (ja) * 2014-06-12 2015-12-17 コニカミノルタ株式会社 診断支援情報生成方法、画像処理装置、診断支援情報生成システム及び画像処理プログラム

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070172911A1 (en) * 2006-01-13 2007-07-26 Michael Farrell Biological sample processing composition and method
EP2450710B1 (en) * 2006-07-14 2020-09-02 The Regents of The University of California Cancer biomarkers and methods of use thereof
EP2059786A2 (en) 2006-08-04 2009-05-20 Philips Intellectual Property & Standards GmbH A method of in vivio detection and/or diagnosis of cancer using fluorescence based dna image cytometry
WO2008093528A1 (ja) * 2007-02-01 2008-08-07 Kurume University 癌の生体染色剤
US20100081666A1 (en) * 2008-07-14 2010-04-01 Wyeth Src activation for determining cancer prognosis and as a target for cancer therapy
JP2011530082A (ja) * 2008-08-04 2011-12-15 ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション 細胞ミクロ構造の共焦点画像化のための染料適用
JP5482057B2 (ja) * 2009-09-29 2014-04-23 オリンパス株式会社 細胞核を構成する構造体の解析方法
US8977017B2 (en) * 2011-09-15 2015-03-10 The General Hospital Corporation System and method for support of medical diagnosis

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005518553A (ja) * 2001-09-06 2005-06-23 ジェノミック プロファイリング システムズ インコーポレイティッド 細胞およびウイルスの迅速かつ高感度な検出方法
JP2007195533A (ja) * 2006-01-27 2007-08-09 Toshiki Minami 細胞の評価方法、これを用いたる測定成分のがん化評価方法、がん診断キットおよびコンピュータ可読媒体
EP2611930A1 (en) * 2010-09-02 2013-07-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the treatment and the diagnosis of cancer
WO2014157645A1 (ja) * 2013-03-29 2014-10-02 ソニー株式会社 レーザ走査型観察装置及びレーザ走査方法
WO2014157703A1 (ja) * 2013-03-29 2014-10-02 国立大学法人三重大学 生体染色剤
WO2015190225A1 (ja) * 2014-06-12 2015-12-17 コニカミノルタ株式会社 診断支援情報生成方法、画像処理装置、診断支援情報生成システム及び画像処理プログラム

Also Published As

Publication number Publication date
WO2017200066A1 (ja) 2017-11-23
US11555819B2 (en) 2023-01-17
US11852632B2 (en) 2023-12-26
CN109414151B (zh) 2022-11-25
JP7060891B2 (ja) 2022-04-27
EP3459424A4 (en) 2020-01-22
US20230037210A1 (en) 2023-02-02
JPWO2017200066A1 (ja) 2019-03-22
US20190285638A1 (en) 2019-09-19
EP3459424A1 (en) 2019-03-27
JP2021063815A (ja) 2021-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109414151A (zh) 癌症检测装置、癌症检测方法和用于癌症检测的染色剂
JP2024037188A (ja) 腫瘍の視覚化および除去のためのデバイス、システム、および方法
Williams et al. Strategies for high resolution imaging of epithelial ovarian cancer by laparoscopic nonlinear microscopy
Inoue et al. Technology insight: laser-scanning confocal microscopy and endocytoscopy for cellular observation of the gastrointestinal tract
CN101909509B (zh) 多路径、多放大率、非共焦荧光发射内窥镜装置和方法
CN107076724B (zh) 生物体染色剂
CN109310296A (zh) 内窥镜成像装置及方法
US20120302892A1 (en) Portable optical fiber probe-based spectroscopic scanner for rapid cancer diagnosis
CN108697315A (zh) 激光内窥镜装置
CN102892348A (zh) 多光谱光子成像的方法和装置
WO2013103475A2 (en) Portable optical fiber probe-based spectroscopic scanner for rapid cancer diagnosis
CN110366678A (zh) 基于激光发射的显微镜
König et al. Multiphoton microscopy in surgical oncology-a systematic review and guide for clinical translatability
Cho et al. Multiphoton microscopy: an introduction to gastroenterologists
Papageorgiou et al. Real-time cancer detection with an integrated lensless fluorescence contact imager
US11860100B2 (en) Methods for ultraviolet excitation microscopy of biological surfaces
Aggarwal et al. Multiphoton microscopy to identify and characterize the transition zone in a mouse model of Hirschsprung disease
Hoffman The advantages of using fluorescent proteins for in vivo imaging
Jiang et al. Diagnostic application of multiphoton microscopy in epithelial tissues
KR102579826B1 (ko) 인공지능 기반 진단 보조 정보 제공 방법, 장치 및 시스템
KR102643066B1 (ko) 인공지능 기반 의사 컬러링을 활용한 진단 보조 정보 제공 방법, 장치 및 시스템
JP2008069107A (ja) 内視鏡用組織蛍光染色剤
JP4847795B2 (ja) 内視鏡用組織蛍光染色剤組成物
Hu et al. Dynamic optical contrast imaging for real-time delineation of tumor resection margins using head and neck cancer as a model
Melino Miniaturisation and testing of an optical interference block for fluorescence imaging in capsule endoscopy

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant