CN109414028A - 改良的焙烤组合物 - Google Patents

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CN109414028A CN201780042881.5A CN201780042881A CN109414028A CN 109414028 A CN109414028 A CN 109414028A CN 201780042881 A CN201780042881 A CN 201780042881A CN 109414028 A CN109414028 A CN 109414028A
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Abstract

已经发现，酶的组合，特别是嗜热丝氨酸蛋白酶和脂肪酶的组合，能够改善焙烤产品的松软性。本文提供了包含这些酶的组合物、酶的这种组合的用途、以及使用嗜热丝氨酸蛋白酶和脂肪酶的组合制备焙烤产品的方法。

Description

改良的焙烤组合物
技术领域
本发明涉及焙烤产品(bakery product，烘焙产品)的松软性(short bite)的改良。
背景技术
当购买焙烤产品时，消费者考虑一系列参数，诸如外观、柔软性、湿度或香味。焙烤产品可以食用的方式也是必要的，焙烤产品应该例如容易被咬下，而不必广泛咀嚼它，因为该特定方面被认为是产品新鲜度的特性。消费者还更喜欢购买具有最低可能(标记的)添加剂的面包。
在老化期间，焙烤产品的特性改变。特别地，香型改变，产品变得更硬、更干燥，并且变得更难以咀嚼，因此焙烤产品被认为是“不太新鲜的”。
焙烤产品的松软性可以被定义为咬入或撕掉一片焙烤产品的容易度。这通过破坏样品所需的力和将样品嚼碎至准备吞咽的黏稠度的咀嚼次数来反映。在某种程度上，松软性与咀嚼性相反。此外，松软性与柔软性非常不同。实际上，面包的柔软性通过压缩样品直至某一变形所需的力来反映。柔软性也与硬度相反。因此，面包在没有松软性的同时可以是柔软的，反之亦然。
目前已经提出了一些方法来改善焙烤产品的松软性。EP0776604描述了不饱和甘油单酯用以产生具有松软性的可微波松脆面包卷的用途。WO2009138447描述了中间热稳定或热稳定丝氨酸或金属蛋白酶用以改善焙烤产品的松软性的用途。
然而，已经观察到这些方法具有它们的局限性。在欧洲，添加甘油单酯或其它乳化剂需要对焙烤产品特异性标记E号码，其中的一些防止了一些消费者购买该产品。
使用中间热稳定或热稳定的丝氨酸或金属蛋白酶在某种程度上改良了焙烤产品的松软性，但是这种松软性的改良以某种方式受限，因为高含量的酶往往对其他焙烤产品性质(例如，易碎性和回弹性)有害。
因此，需要进一步改善松软性的新方法和产品。
发明内容
发明人已经发现，在焙烤应用，特别是在面包制作中使用在高于70℃的温度下具有最佳活性的嗜热(thermophilic，喜温)丝氨酸蛋白酶以及脂肪酶的组合对松软性具有协同效应。
因此，在第一方面，本发明涉及一种组合物，该组合物包含：
-至少一种第一酶，其中所述第一酶是在高于70℃的温度下，优选在高于80℃的温度下具有最佳活性的嗜热丝氨酸蛋白酶；和
-至少一种第二酶，其中所述第二酶是脂肪酶。
在特定实施方式中，本文所公开的组合物提供了所述第一酶是嗜热丝氨酸蛋白酶，其中最佳温度下的蛋白酶活性与25℃下的蛋白酶活性之间的比率高于10，优选高于15。
在特定实施方式中，本文所公开的组合物提供了所述第一酶是中性或碱性嗜热丝氨酸蛋白酶。
在特定实施方式中，如本文所公开的组合物提供了所述第一酶是优选从水生栖热菌(Thermus aquaticus)中分离的Taq蛋白酶，优选为水细胞溶解酶(aqualysin，水合细胞溶素，水溶素)I或水细胞溶解酶II，更优选为水细胞溶解酶I，甚至更优选为从水生栖热菌LMG8924中分离的水细胞溶解酶I。
在特定实施方式中，本文所公开的组合物提供了所述第一酶以100至1200单位/100kg面粉，优选200至900单位/100kg面粉，更优选350至700单位/100kg面粉的量存在。
在特定实施方式中，如本文所公开的组合物提供了所述第二酶是由酶条目(entry)EC 3.1.1.3定义的三酰基甘油脂肪酶或三酰基甘油酰基水解酶，优选选自从疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、米根霉(Rhizopus oryzae)和米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)获得的脂肪酶。
在特定实施方式中，本文所公开的组合物提供了所述第二酶按以下量存在：5至100LU来自疏棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶/100kg面粉；0.023至0.360LU来自米根霉的脂肪酶/100kg面粉；和50至200LU来自米黑根毛霉的脂肪酶/100kg面粉。
因此，在又一方面，本发明涉及本文所公开的组合物在焙烤应用中的用途。
在特定实施方式中，本文所公开的组合物用于面包改良剂中。
在特定实施方式中，本文所公开的组合物用于软焙烤产品和硬皮焙烤产品，优选面包、软面包卷、甜甜圈、小圆面包、可微波的小圆面包、丹麦甜糕饼、羊角面包、汉堡包卷、比萨饼和皮塔饼以及蛋糕。
因此，在又一方面，本发明涉及一种包含本文所公开的组合物的面包改良剂。
因此，在又一方面，本发明涉及一种用于制备烘焙产品的方法，包括在烘焙之前向面团(dough)或面糊(batter)添加下述的步骤：
-至少一种第一酶，其中所述第一酶是在高于70℃的温度下、优选在高于80℃的温度下具有最佳活性的嗜热丝氨酸蛋白酶；和
-至少一种第二酶，其中所述第二酶是脂肪酶。
在特定实施方式中，本文所公开的方法提供了所述烘焙产品显示出改良的松软性，优选地其中，与不使用所述第一酶或第二酶制备的参考烘焙产品相比，破坏使用至少一种第一酶和使用至少一种第二酶制备的烘焙产品所需的最大力降低至少15％，至少一种第一酶是在高于70℃的温度下、优选高于80℃的温度下具有最佳活性的嗜热丝氨酸蛋白酶，至少一种第二酶是脂肪酶。
因此，在特定实施方式中，本文所公开的组合物用于制备具有改良松软性的烘焙产品，其中优选地，与不使用所述第一酶或第二酶制备的参考烘焙产品相比，破坏所制备的烘焙产品所需的最大力降低至少15％。
在特定实施方式中，如本文所公开的方法提供了没有观察到对面团流变性、面包屑结构和所得焙烤产品的体积的不利影响。
因此，在又一方面，本发明涉及一种由包含如本文所公开的组合物的面团或面糊制备的烘焙产品。
附图说明
图1(A到C)表示借助于质地分析仪(texture analyser)进行松软性的评估的不同方面。图1A表示配备有比萨饼拉伸装备(具有销的2个探针的质地分析仪。图1B表示实际测量设定，其中小圆面包附接至比萨饼拉伸装备，并且其中上探针以恒定速度向上移动直到小圆面包破裂。图1C示出了测量的典型图，其中以克(g)表示的所需力是以时间(s)的函数测量的。
具体实施方式
在描述本发明的当前产品、组合物、用途和方法之前，应理解，本发明不限于所描述的特定产品、组合物、用途和方法或组合，因为这些产品、组合物、用途和方法以及组合当然可以变化。还应当理解的是，本文中使用的术语不旨在是限制性的，因为本发明的范围将仅由所附权利要求限定。
如本文所使用，单数形式“一个”、“一种”和“该”既包括单数对象又包括复数对象，除非上下文明确另外指出。
本文所使用的术语“包含”、“含”和“由…组成”与“包括”、“包括有”或“含有”、“具有”是同义的，并且是包含性的或开放式的，并且不排除另外未列举的构件、元件或方法步骤。应当理解的是，本文所使用的术语“包含”、“含”和“由…组成”包括术语“由…组成(consisting of)”、“由…组成(consists)”和“由…组成(consists of)”。
由端点表述的数值范围包括归入相应范围内的所有数字和分数，以及所述的端点。
当提及可测量值诸如参数、量、持续时间等时，如本文所使用的术语“约”或“大约”是指涵盖指定值的+/-10％或更小、优选+/-5％或更小、更优选+/-1％或更小、还更优选+/-0.1％或更小的变化，在适当情况下，这样的变化适于执行所公开的发明。应当理解的是，修饰语“约”或“大约”所引用的值本身也是特别地并且优选地公开的。
虽然术语“一个或多个”或“至少一个”，诸如一组成员中的一个或多个或至少一个成员本身是清楚的，但通过进一步的示例，该术语特别包括对所述成员中的任一个，或指所述成员中的任何两个或更多个的引用，例如所述成员的任何≥3、≥4、≥5、≥6或≥7等，以及直到所有所述成员。
在本说明书中引用的所有参考文献都完整地并入本文作为参考。特别地，本文具体提及的所有参考文献的教导通过引用并入本文。
除非另外定义，否则在公开本发明中使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。借助于进一步的指导，包括术语定义以更好地理解本发明的教导。
在下面的段落中，更详细地限定了本发明的不同方面。如此限定的每个方面可以与任何其它一个或多个方面组合，除非清楚地相反指示。特别地，任何指明为优选或有利的特征均可以与任何其他指明为优选或有利的特征组合。
整个说明书中对“一个实施方式”或“一种实施方式”的引用表示结合该实施方式描述的特定特征、结构或特性包含在本发明的至少一个实施方式中。因此，在整个说明书中各个地方出现的短语“在一个实施方式中”或“在一种实施方式中”不一定，但是可以都指相同的实施方式。此外，正如本领域技术人员易于从本公开看出的，在一个或多个实施方式中，特定特征、结构或特性可以以任何适当的方式被组合。此外，虽然本文描述的一些实施方式包括某些但不是其他的被包含在其他实施方式中的特征，但是不同实施方式的特征的组合也在本发明的范围内，并且形成不同的实施方式，如本领域技术人员是可以理解的。例如，在所附权利要求中，所要求保护的实施方式中的任一个可以以任何组合来使用。
发明人惊奇地发现，通过使用新的酶组合，特别是嗜热丝氨酸蛋白酶和脂肪酶的组合，可以获得与在单独使用时添加酶所预期的松软性改良相比更显著的松软性的改良。
松软性，有时也称为与咀嚼性和/或韧性相反，用于指定破坏焙烤产品的样品所需的力和/或使焙烤产品样品嚼碎至准备吞咽的黏稠度的咀嚼次数。松软性可以通过经训练的口味品尝小组人员容易地测量，并且可以使用任意松软性标度合理地定量。这样的技术在食品工业中是公知的，并且通常被称为感官测试。在这种方法中，组织初始训练会话以使小组成员熟悉待测试产品的范围。在该会话中，列出参考标准以训练小组成员识别待测量产品属性之间的差异。在第二步骤中，小组成员接收他们必须在从0到10的标度上对松软性评分的数字或产品。
也可以借助于质地分析仪来评估松软性。在这种方法中，小圆面包被附接到比萨饼拉伸装备(具有销的2个探针(参见图1A))。上探针将以恒定速度向上移动并且以这种方式破坏小圆面包(参见图1B)。由质地分析仪测量以克(g)表示的所需力。在整个过程中，所需力将增加，直到小圆面包破裂，力才减小。该测量的典型图在图1C中示出。所测量的最大力(Fmax)是用于评估松软性的常见参数。
发明人惊奇地发现，在烘焙前在面团中同时使用足够量的嗜热丝氨酸蛋白酶和足够量的脂肪酶显示出对烘焙产品中松软性的改良的出乎意料的协同效应。
实际上，由两种类型的酶的组合给出的松软性比单独采用的酶的效果的总和大。当嗜热丝氨酸蛋白酶的量x与脂肪酶的量y组合所给出的效果大于由嗜热丝氨酸蛋白酶的量x给出的效果和由脂肪酶的量y给出的效果之和时，存在协同作用。
因此，在第一方面，本发明涉及一种组合物，该组合物包含：
-至少一种第一酶，其中所述第一酶是嗜热丝氨酸蛋白酶；和
-至少一种第二酶，其中所述第二酶是脂肪酶。
在特定实施方式中，所述第一酶是在高于70℃的温度下、优选高于75℃的温度下、且更优选高于80℃的温度下具有最佳活性的嗜热丝氨酸蛋白酶。
已经进一步发现，当本文提及的嗜热丝氨酸蛋白酶在高于70℃的温度下，优选高于75℃的温度下，且更优选高于80℃的温度下具有最佳活性时，尤其存在本文提及的协同效应。
如本文所用，术语“蛋白酶”通常是指水解肽键的酶(也称为肽酶或蛋白酶)，所述肽键将氨基酸在优选如酶条目EC 3.4所定义的多肽链中连接在一起。根据它们的催化残基将它们分类为几个类别。在这些类别中，丝氨酸蛋白酶(或丝氨酸内肽酶)是在蛋白质中切割肽键的蛋白酶，其中丝氨酸用作活性位点处的亲核氨基酸。丝氨酸蛋白酶由酶条目EC3.4.21定义。丝氨酸蛋白酶可以根据它们的底物特异性进一步细分类为胰蛋白酶样、胰凝乳蛋白酶样、类凝血酶、弹性蛋白酶样或枯草杆菌蛋白酶样。
在本发明的上下文中，使用天青蛋白交联的酪蛋白(AZCL-酪蛋白)作为底物测量蛋白酶活性。蛋白酶的水解产生水溶性染色片段，并且这些片段的释放速率(例如，590nm处的吸光度增加)可直接与酶活性(普罗塔酶(Protazyme)AK片剂，Megazyme，爱尔兰)相关。在实施例中给出关于蛋白酶活性测量的更多细节。蛋白酶活性也可用本领域技术人员已知的用于蛋白酶活性的其它测定来测量。其中之一是使用酪蛋白作为底物，随后用Folin&Ciocalteu的酚试剂检测释放的氨基酸的量热法。
如本文所用，术语“嗜热”，特别是如本文所用的“嗜热蛋白酶”，是指在升高的温度下成活性的蛋白酶。特别地，嗜热蛋白酶在高于70℃的温度下，优选高于75℃的温度下，且更优选高于80℃的温度下具有最佳活性。
如本文所用，术语“脂肪酶”通常是指由酶条目EC 3.1.1.3定义的三酰基甘油脂肪酶或三酰基甘油酰基水解酶。脂肪酶在本文中定义为催化三酰基甘油的水解以产生游离脂肪酸、二酰基甘油、单酰基甘油和甘油的酶。用于本文定义的组合物的脂肪酶可包括酶侧活性，例如磷脂酶活性。
在本发明的上下文中，使用棕榈酸对硝基苯酯(pNPP)作为底物并根据本文所述的方法测量脂肪酶活性。酶活性也可用本领域技术人员已知的用于脂肪酶活性的其它测定来测量(综述参见例如Stoytcheva M.&al,2012,Current Analytical Chemistry,第8卷,第400页)。
特别地，使用棕榈酸对硝基苯酯(pNPP)作为底物测量脂肪酶活性。因脂肪酶水解棕榈酸对硝基苯酯引起的黄色对硝基苯酚的释放是通过分光光度法在414nm处测量的。一个脂肪酶毫单位(LmU)定义为在45℃和pH 7.5下从棕榈酸对硝基苯酯中每分钟释放1纳摩尔(nmol)对硝基苯酚所需的酶的量。在实施例中给出关于脂肪酶活性测量的更多细节。酶活性也可用本领域技术人员已知的用于脂肪酶活性的其它测定来测量(综述参见例如Stoytcheva M.&al,2012,Current Analytical Chemistry,第8卷,第400页)。
在特定实施方式中，本文所公开的组合物提供了所述第一酶是嗜热丝氨酸蛋白酶，其中最佳温度下的蛋白酶活性与25℃下的蛋白酶活性之间的比率高于10，优选高于15。通过提供所述比率高于10，如本文所用的嗜热丝氨酸蛋白酶提供了获得对松软性的改良效果。
在特定实施方式中，如本文所公开的组合物提供了所述第一酶通过合成或通过基因工程，通过从天然存在的真核生物或原核生物体中提取而获得。在特定实施方式中，本文所公开的组合物提供了所述第一酶是中性或碱性嗜热丝氨酸蛋白酶。虽然真菌蛋白酶对高温敏感，但细菌中性和碱性蛋白酶更能耐受较高的热处理。
在特定实施方式中，如本文所公开的组合物提供了所述第一酶是优选从水生栖热菌中分离的Taq蛋白酶，优选为水细胞溶解酶I或水细胞溶解酶II，更优选为水细胞溶解酶I，甚至更优选为从水生栖热菌LMG8924中分离的水细胞溶解酶I。
在特定实施方式中，本文所公开的组合物提供了所述第一酶优选水细胞溶解酶I以100至1200单位/100kg面粉，优选200至900单位/100kg面粉，更优选350至700单位/100kg面粉的量存在。有利地，将水细胞溶解酶I以100至1200单位/100kg面粉，优选200至900单位/100kg面粉，更优选350至700单位/100kg面粉加入面团/面糊中，使用本文所述的方法获得酶活性。
在特定实施方式中，如本文所公开的组合物提供了所述第二酶是由酶条目EC3.1.1.3定义的三酰基甘油脂肪酶或三酰基甘油酰基水解酶，优选选自从疏棉状嗜热丝孢菌、米根霉和米黑根毛霉获得的脂肪酶。
在特定实施方式中，本文所公开的组合物提供了所述第二酶以以下量存在：5至100LU、优选15至75LU、更优选20至60LU来自疏棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶/100kg面粉；0.023至0.360LU、优选0.09至0.18LU来自米根霉的脂肪酶/100kg面粉；以及50至200LU、优选90至160LU、更优选约138LU来自米黑根毛霉的脂肪酶/100kg面粉，使用本文所述的方法获得酶活性。
在特定实施方式中，如本文所公开的组合物提供了所述第一酶的单位量对所述第二酶的单位量的比率在5和35之间(对于Taq蛋白酶和来自疏棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶)，在1950和7800之间(对于Taq蛋白质和来自米根霉的脂肪酶)，和/或在2和8之间(对于Taq蛋白酶和来自米黑根毛霉的脂肪酶)。
在特定实施方式中，本文所公开的组合物是面包改良剂、法式糕点混合物或法式糕点预混物，优选面包改良剂。
在烘焙期间，通常向面团中加入“面包改良剂”(也称为“面团调节剂”、“面团改良剂”或“改良剂”或“面粉处理剂”)以改良烘焙产品的质地、体积、风味和新鲜度，以及改良面团的可加工性和稳定性。通常，面包改良剂包括或由以下组成：一种或多种酶(如例如淀粉酶、木聚糖酶、磷脂酶、氧化酶、脂氧合酶、脱氢酶和漆酶)、一种或多种氧化剂或还原剂(例如抗坏血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸)、一种或多种乳化剂(如例如甘油单酯(或甘油单酯和甘油二酯的混合物)、甘油单酯衍生物(例如琥珀酰化的乳酰化或乙酰化甘油单酯、甘油单酯的二乙酰酒石酸酯(DATEM)、单硬脂酸甘油酯(GMS)、丙二醇单酯…)、脱水山梨糖醇乳化剂(脱水山梨糖醇单硬脂酸酯)、聚山梨醇酯、硬脂酰乳酸钠(SSL)、聚甘油酯、蔗糖酯和卵磷脂)、一种或多种脂质材料(如例如人造黄油、黄油、油、起酥油)、一种或多种维生素(如例如泛酸和维生素E)、一种或多种树胶、和/或一种或多种纤维来源(如例如燕麦纤维)。法式糕点混合物通常包含除了水、脂肪(油、黄油、人造黄油)和蛋以外的所有法式糕点产品配方的成分。法式糕点预混物典型地是法式糕点混合物，其中已经除去全部或部分的面粉和糖。
在特定实施方式中，本文所公开的组合物是包含面粉以及至少一种第一酶和至少一种第二酶的面团或面糊，其中所述第一酶是优选地在高于70℃的温度下，优选高于75℃的温度下，且更优选在高于80℃的温度下具有最佳活性的嗜热丝氨酸蛋白酶；其中所述第二酶是脂肪酶。
特别地，所述第二酶以以下量存在：5至100LU、优选15至75LU、更优选20至60LU来自疏棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶/100kg面粉；0.023至0.360LU、优选0.09至0.18LU来自米根霉的脂肪酶/100kg面粉；以及50至200LU、优选90至160LU、更优选约138LU来自米黑根毛霉的脂肪酶/100kg面粉，使用本文所述的方法获得酶活性。
在又一实施方式中，本文所公开的组合物可进一步包括适当量的以下物质：一种或多种酶(如例如淀粉酶、木聚糖酶、磷脂酶、氧化酶、脂氧合酶、脱氢酶和漆酶)、一种或多种氧化剂或还原剂(如例如抗坏血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸)、一种或多种乳化剂(如例如甘油单酯(或甘油单酯和甘油二酯的混合物)、甘油单酯衍生物(例如琥珀酰化的乳酰化或乙酰化甘油单酯、甘油单酯的二乙酰酒石酸酯(DATEM)、单硬脂酸甘油酯(GMS)、丙二醇单酯…)、脱水山梨糖醇乳化剂(脱水山梨糖醇单硬脂酸酯)、聚山梨醇酯、硬脂酰乳酸钠(SSL)、聚甘油酯、蔗糖酯和卵磷脂)、一种或多种脂质材料(如例如人造黄油、黄油、油、起酥油)、一种或多种维生素(如例如泛酸和维生素E)、一种或多种树胶、和/或一种或多种纤维来源(如例如燕麦纤维)。
在又一实施方式中，本文所公开的组合物包含：
-至少一种第一酶，其中所述第一酶是在高于70℃的温度下，优选高于75℃的温度下，更优选高于80℃的温度下具有最佳活性的嗜热丝氨酸蛋白酶；
-一种或多种甘油单酯；和
-至少一种第二酶，其中所述第二酶是脂肪酶。
如本文所用，术语“甘油单酯”通常是指由通过酯键与脂肪酸连接的甘油分子组成的一类甘油酯。
甘油单酯是在焙烤应用中使用的许多类型的乳化剂之一：其中有甘油单酯(或甘油单酯和甘油二酯的混合物；食品添加剂国际编码系统(INS)称为E471或美国食品与药物管理局称为184.1505)、甘油单酯衍生物(例如琥珀酰化的乳酰化或乙酰化甘油单酯、甘油单酯的二乙酰酒石酸酯(DATEM)、单硬脂酸甘油酯(GMS)、丙二醇单酯…)、脱水山梨糖醇乳化剂(脱水山梨糖醇单硬脂酸酯)、聚山梨醇酯、硬脂酰乳酸钠(SSL)、聚甘油酯、蔗糖酯和卵磷脂。
此外，在又一方面，本发明涉及本文所公开的组合物在焙烤应用中的用途。在本发明的上下文中，焙烤应用是指与面包和法式糕点产品相关的应用。特别地，所述焙烤产品是软焙烤产品和/或硬皮焙烤产品，优选面包、软面包卷、甜甜圈、小圆面包、可微波的小圆面包、丹麦甜糕饼、羊角面包、汉堡包卷、比萨饼和皮塔饼以及蛋糕。
在特定实施方式中，提供了本文所公开的组合物在面包改良剂、法式糕点混合物或法式糕点预混物中的用途。
因此，本发明的目的是提供根据本发明的组合物用以改良焙烤产品的松软性的用途，其包括在烘焙之前向面团添加本文所公开的足够量的一种或多种嗜热丝氨酸蛋白酶和足够量的一种或多种脂肪酶。
在特定实施方式中，本文所公开的组合物用于改良焙烤产品中的松软性。
在又一方面，本文公开了一种用于制备烘焙产品的方法，包括在烘焙之前向面团或面糊添加下述的步骤：
-至少一种第一酶，其中所述第一酶是嗜热丝氨酸蛋白酶；和
-至少一种第二酶，其中所述第二酶是脂肪酶。
特别地，所述第一酶是在高于70℃的温度下，优选高于75℃的温度下，且优选高于80℃的温度下具有最佳活性的嗜热丝氨酸蛋白酶。
在本发明的上下文中，使用天青蛋白交联的酪蛋白(AZCL-酪蛋白)作为底物测量蛋白酶活性。蛋白酶的水解产生水溶性染色片段，并且这些片段的释放速率(例如，590nm处的吸光度增加)可直接与酶活性(普罗塔酶AK片剂，Megazyme，爱尔兰)相关。在实施例中给出关于蛋白酶活性测量的更多细节。蛋白酶活性也可用本领域技术人员已知的用于蛋白酶活性的其它测定来测量。其中之一是使用酪蛋白作为底物，随后用Folin&Ciocalteu的酚试剂检测释放的氨基酸的量热法。
在本发明的上下文中，使用棕榈酸对硝基苯酯(pNPP)作为底物并根据本文所述的方法测量脂肪酶活性。酶活性也可用本领域技术人员已知的用于脂肪酶活性的其它测定来测量(综述参见例如Stoytcheva M.&al,2012,Current Analytical Chemistry,第8卷,第400页)。
在特定实施方式中，本文所公开的方法提供了所述第一酶是嗜热丝氨酸蛋白酶，其中最佳温度下的蛋白酶活性与25℃下的蛋白酶活性之间的比率高于10，优选高于15。通过提供所述比率高于10，本文所用的嗜热丝氨酸蛋白酶提供了获得对松软性的改良效果。
在特定实施方式中，本文所公开的方法提供了所述第一酶通过合成或通过基因工程，通过从天然存在的真核生物或原核生物体中提取而获得。在特定实施方式中，本文所公开的组合物提供了所述第一酶是中性或碱性嗜热丝氨酸蛋白酶。
在特定实施方式中，本文所公开的方法提供了所述第一酶是优选从水生栖热菌中分离的Taq蛋白酶，优选为水细胞溶解酶I或水细胞溶解酶II，更优选为水细胞溶解酶I，甚至更优选为从水生栖热菌LMG8924中分离的水细胞溶解酶I。
在特定实施方式中，本文所公开的方法提供了将所述第一酶优选水细胞溶解酶I以100至1200单位/100kg面粉，优选200至900单位/100kg面粉，更优选350至700单位/100kg面粉的量添加到面团或面糊。有利地，将水细胞溶解酶I以100至1200单位/100kg面粉，优选200至900单位/100kg面粉，更优选350至700单位/100kg面粉添加到面团/面糊，使用本文所述的方法获得酶活性。
在特定实施方式中，本文所公开的方法提供了所述第二酶是由酶条目EC 3.1.1.3定义的三酰基甘油脂肪酶或三酰基甘油酰基水解酶，优选选自从疏棉状嗜热丝孢菌、米根霉和米黑根毛霉获得的脂肪酶。
在特定实施方式中，本文公开的方法提供了所述第二酶以以下量添加到面团或面糊：5至100U、优选15至75U、更优选20至60U来自疏棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶/100kg面粉；0.023至0.360U、优选0.09至0.18U来自米根霉的脂肪酶/100kg面粉；以及50至200U、优选90至160U、更优选约138U来自米黑根毛霉的脂肪酶/100kg面粉，使用本文所述的方法获得酶活性。
在本文所公开的方法的特定实施方式中，合适量的酶可以在其制备期间或在成分混合之前直接添加到面团或面糊。在其它实施方式中，酶可以作为(面包)改良剂、法式糕点混合物或预混物的一部分添加，优选作为面包改良剂的一部分添加。特别地，在醒发(proofing)前加入酶或面包改良剂。
在特定实施方式中，本文公开了一种用于制备烘焙产品的方法，包括在烘焙之前向面团或面糊添加下述的步骤：
-至少一种第一酶，其中所述第一酶是在高于70℃的温度下，优选高于75℃的温度下，更优选高于80℃的温度下具有最佳活性的嗜热丝氨酸蛋白酶；
-至少一种第二酶，其中所述第二酶是脂肪酶；和
-一种或多种甘油单酯。
在特定实施方式中，本文所公开的方法提供了所述烘焙产品显示出改良的松软性，优选地其中，与不使用所述第一酶或第二酶制备的参考烘焙产品相比，破坏使用至少一种第一酶和使用至少一种第二酶制备的烘焙产品所需的最大力降低至少15％，至少一种第一酶是在高于70℃的温度下，优选高于75℃的温度下，优选高于80℃的温度下具有最佳活性的嗜热丝氨酸蛋白酶；至少一种第二酶是脂肪酶。在特定实施方式中，与不使用所述第一酶或第二酶制备的参考烘焙产品相比，破坏使用所述第一酶和第二酶制备的烘焙产品所需的最大力降低至少20％。在特定实施方式中，在烘焙之后当天测定松软性。
在特定实施方式中，本文所公开的方法提供了所述烘焙产品显示出改良的松软性，优选地其中，与不使用所述第一酶或所述第二酶制备的参考烘焙产品相比，破坏使用至少一种第一酶和使用至少一种第二酶制备的烘焙产品所需的最大力降低至少15％，至少一种第一酶是在高于70℃的温度下，优选高于75℃的温度下，且优选高于80℃的温度下具有最佳活性的嗜热丝氨酸蛋白酶；至少一种第二酶是脂肪酶。在特定实施方式中，与使用所述第一酶或所述第二酶制备的参考烘焙产品相比，破坏使用所述第一酶和第二酶制备的烘焙产品所需的最大力降低至少20％。这表明，所述第一酶和所述第二酶的组合提供协同作用，其提供比预期改良的松软性更好的效果。在特定实施方式中，在烘焙之后当天测定松软性。
在特定实施方式中，本文所公开的方法提供了没有观察到对面团流变性、面包屑结构和所得焙烤产品的体积的不利影响。
此外，在又一方面，本发明涉及由包含本文所公开的组合物的面团或面糊制备的烘焙产品。
在本发明的上下文中，烘焙产品是本领域已知的焙烤或法式糕点产品，例如选自包括以下的组的那些：面包、软面包卷、百吉饼、甜甜圈、丹麦甜糕饼、汉堡包卷、比萨饼、皮塔饼、意大利面包、海绵蛋糕、冰激凌蛋糕、磅饼、松饼、纸杯蛋糕、蒸糕、华夫饼、巧克力糕饼、蛋糕甜甜圈、酵母发酵的甜甜圈、法国长棍面包、面包卷、薄脆饼干、小面包、饼干、派皮、甜面包干以及其它烘焙产品。更优选地，本发明涉及面包、法国长棍面包和面包卷。特别地，所述烘焙产品是软焙烤产品和硬皮焙烤产品，优选面包、软面包卷、甜甜圈、小圆面包、可微波的小圆面包、丹麦甜糕饼、羊角面包、汉堡包卷、比萨饼和皮塔饼以及蛋糕。
实施例
实施例1：酶活性确定
在天青蛋白交联的酪蛋白(AZCL-酪蛋白)上测量蛋白酶活性。它通过染色和交联酪蛋白以产生在水中水合但不溶于水的材料来制备。蛋白酶的水解产生水溶性染色片段，并且这些片段的释放速率(例如，590nm处的吸光度增加)可直接与酶活性(普罗塔酶AK片剂，Megazyme，爱尔兰)相关。在60℃下在100mM Na2HPO4.2H2O中温育普罗塔酶AK片剂(pH7.0)5分钟。加入等份的酶(1.0ml)，并使反应继续精确的10分钟。通过加入磷酸三钠(10ml,2％w/v,pH 12.3)终止反应。将试管在室温下静止约2分钟并过滤内容物。在590nm处对照底物空白测量滤液的吸光度。
活性表示为：
mU(毫单位)/ml＝(34.2*(Abs590酶-Abs590空白)+0.6)/稀释度。一个单位对应于1000mU。
使用棕榈酸对硝基苯酯(pNPP)作为底物测量脂肪酶活性。因脂肪酶水解棕榈酸对硝基苯酯引起的黄色对硝基苯酚的释放是通过分光光度法在414nm处测量的。一个脂肪酶毫单位(LmU)定义为在45℃和pH 7.5下从棕榈酸对硝基苯酯中每分钟释放1纳摩尔(nmol)对硝基苯酚所需的酶的量。为了进行测试，将120μl 1mM pNPP溶液(在pH 7.5下含有0.69M丙酮和0.0049M Triton X-100的0.05M磷酸钠缓冲液)与60μl酶样品混合，并在45℃下温育30分钟。
在96孔微量滴定板中对照底物空白，在414nm处测量吸光度。
活性表示为：
LmU/ml＝(((Abs酶-Abs空白)/30)x0.18))/(13380x0.06))x样品稀释度x1000000
[30＝以分钟计的反应时间；0.18＝以ml计的反应体积13380＝在414nm处的摩尔消光系数(M-1cm-1)；0.06＝以ml计的酶样品体积；1000000用以转换为LmU/ml]
一个脂肪酶单位(LU)对应于1000个脂肪酶毫单位(LmU)
实施例2：软的小圆面包
使用表1的面团组合物制备软的小圆面包。所用的酶如下：
-TlLip：在米曲霉(Aspergillus oryzae)(诺帕酶-诺维信，丹麦)中表达的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶。
-TaProt：水生栖热菌Taq1蛋白酶(水细胞溶解酶I)如WO2009138447A1中所述。该酶具有80℃的最佳温度活性。
表1
*含有面粉、脂肪酸的甘油单-和二酯的单-和二乙酰酒石酸酯(E472e)、右旋糖、抗坏血酸、酶(α淀粉酶、木聚糖酶)
在蜗旋混合器型Diosna(SP24)中将成分在低速下混合2分钟并在高速下混合6分钟。最终面团温度为27℃。在团块醒发5分钟后，在焙烤温度(25℃)和湿度(50-55％)下10分钟期间将1500g面团弄圆并醒发。使用Eberhardt制模机制定50g面团块。将这些面团块在35℃下在95％相对湿度下在Koma醒发箱(proofbox)中醒发85分钟。然后，在没有蒸汽的MiweCondo台式烘箱中的9分钟期间在250℃下烘焙该小圆面包。对于本领域技术人员显而易见的是，可以通过使用其它供应商的设备来获得相同的最终结果。
在烘焙之后当天用配备有在20mm/s的速度下使用的比萨饼拉伸装备的TA-XT2TM质地分析仪评估小圆面包的松软性。这允许力(破坏小圆面包所需的最大力，以克(g)表示)的测量。因为诸如面粉批次、环境温度和湿度以及烘焙和测试之间的时间等因素可以影响所述参数，因此将测量结果与使用相同成分、平行烘焙和测试的参考进行比较。对于每个测试，评估10个小圆面包。测量的标准偏差为33。置信区间是通过将标准偏差与史蒂特氏定律系数相乘来计算的，该史蒂特氏定律系数是通过使用5％的α风险值和等于5的自由度数获得的。置信区间是85。
如果同时使用两种成分的效果大于单独采用的成分的效果之和，则两种成分起协同作用，考虑95％置信区间。换句话说，当(x g酶A+y g酶B)的效果大于x g酶A的效果和y g酶B的效果之和时，存在协同作用。
用TA-XT2TM质地分析仪进行的松软性测量的结果列于表2中。
表2
REF P L 2P 2L PL P2L 2PL 2P2L
最大力(g) 867 811 825 727 784 647 624 594 580
与REF相比力的实际减小 - -56 -42 -140 -83 <u>-220</u> <u>-243</u> <u>-273</u> <u>-287</u>
对于酶组合，力的理论减小 - - - - - -98 -139 -182 -223
结果显示，当酶组合起来时获得的力的实际减少低于理论值的置信区间的下限时(附加效应)，表明对松软性的协同效应。
小圆面包的松软性也在烘焙后当天通过经训练的焙烤专家小组进行评估。要求他们根据0到10点的直线标度(其中0是低端(耐嚼)，10是高端(松软))的参考来标记产品。感官松软性测量的标准偏差为0.3。置信区间是使用5％的α风险值和等于5的自由度数(number of degrees of liberty)通过将标准偏差与史蒂特氏定律系数相乘来计算的。置信区间是0.5。
结果列于表3中。
表3
结果显示，当酶组合起来时获得的松软性的实际增加高于理论值的置信区间的上限时(附加效应)，表明对松软性的协同效应。
实施例3a：其他脂肪酶(1)
使用表4中列出的酶组合根据配方和实施例2的方法制备软的小圆面包。所用的酶如下：
-RmLip：在米曲霉中表达的米黑根毛霉脂肪酶(Palatase 2000L-诺维信，丹麦)。
-TaProt：如实施例1
表4
酶 REF2 LB PB LBPB
TaProt(单位) 7 7
RmLip(LU) 2.76 2.76
用与实施例1相同的方法评估小圆面包的松软性。质地分析的标准偏差和置信区间分别等于38和97。感官分析的标准偏差和置信区间分别等于0.2和0.5。
结果示于表5(质地分析)和表6中(感官分析)
表5
REF2 LB PB LBPB
最大力(g) 850 726 796 542
与REF2相比力的实际减小 - -124 -54 <u>-308</u>
对于酶组合，力的理论减小 - - - -178
表6
REF2 LB PB LBPB
松软性(感官评分) 5.5 7.0 6.1 8.5
与REF2相比松软性的实际增加 - +1.5 +0.6 <u>+3.0</u>
对于酶组合，松软性的理论增加 - - - +2.1
观察到酶组合的协同效应
实施例3b：其它脂肪酶(2)
使用表7中列出的酶组合根据配方和实施例1的方法制备软的小圆面包。所用的酶如下：
-RoLip：米根霉脂肪酶(Bakezyme L 80000B–DSM)
-TaProt，如实施例1
表7
酶 REF3 LC PC LCPC
TaProt(单位) 7 7
RoLip(LU) 0.0028 0.0028
用与实施例1相同的方法评估小圆面包的松软性。
结果示于表8中。
表8
REF3 LC PC LCPC
最大力(g) 850 738 796 655
与REF3相比力的实际减小 - -112 -54 <u>-195</u>
对于酶组合，力的理论减小 - - - -166
松软性(感官评分) 5.5 6.8 6.1 8.0
与REF3相比松软性的实际增加 - +1.3 +0.6 <u>+2.5</u>
对于酶组合，松软性的理论增加 +1.9
用第三脂肪酶观察到协同效应。
实施例4：其它蛋白酶
使用表9和10中列出的酶组合根据配方和实施例1的方法制备软的小圆面包。所用的酶如下：
-TlLip：在米曲霉(诺帕酶-诺维信)中表达的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶。
-SuProt：来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的丝氨酸蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶-P5380-1G，Sigma Aldrich)该酶具有60℃的最佳温度活性。
-ThProt：来自嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的金属蛋白酶(嗜热菌蛋白酶-P1512-1G，Sigma Aldrich)
表9
酶 REF4 LD PD LDPD
TILip(LU) 0.6 0.6
SuProt(单位) 10.4 10.4
表10
酶 REF5 LE PE LEPE
TILip(LU) 0.6 0.6
ThProt(单位) 1.05 1.05
用实施例1中的质地分析方法来评估小圆面包的松软性。
结果示于表11和12中。
表11
REF4 LD PD LDPD
最大力(g) 689 644 631 631
与REF4相比力的实际减小 - -45 -58 -58
对于酶组合，力的理论减小 - - - -103
表12
REF5 LE PE LEPE
最大力(g) 654 588 591 559
与REF5相比力的实际减小 - -66 -63 -95
对于酶组合，力的理论减小 - - - -129
用具有65℃的最佳温度活性的蛋白酶和用金属蛋白酶没有观察到协同效应。

Claims (14)

1.一种组合物，包含：
-至少一种第一酶，其中，所述第一酶是在高于70℃的温度下、优选在高于75℃的温度下、并且更优选在高于80℃的温度下具有最佳活性的嗜热丝氨酸蛋白酶；以及
-至少一种第二酶，其中，所述第二酶是脂肪酶。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述第一酶是嗜热丝氨酸蛋白酶，其中，最佳温度下的蛋白酶活性与25℃下的蛋白酶活性之间的比率高于10，优选高于15。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述第一酶是中性或碱性嗜热丝氨酸蛋白酶。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中，所述第一酶是优选从水生栖热菌(Thermus aquaticus)中分离的Taq蛋白酶，优选为水细胞溶解酶I或水细胞溶解酶II，更优选为水细胞溶解酶I，甚至更优选为从水生栖热菌LMG8924中分离的水细胞溶解酶I。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中，所述第一酶以100至1200单位/100kg面粉、优选200至900单位/100kg面粉、更优选350至700单位/100kg面粉的量存在。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中，所述第二酶是由酶条目EC3.1.1.3定义的三酰基甘油脂肪酶或三酰基甘油酰基水解酶，优选地选自从疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、米根霉(Rhizopus oryzae)和米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)获得的脂肪酶。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中，所述第二酶以下述量存在：5至100LU来自疏棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶/100kg面粉、0.023至0.360LU来自米根霉的脂肪酶/100kg面粉、以及50至200LU来自米黑根毛霉的脂肪酶/100kg面粉。
8.根据权利要求1至7所述的组合物在焙烤应用中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，用于面包改良剂。
10.根据权利要求8或9所述的用途，用于软焙烤产品和硬皮焙烤产品，优选面包、软面包卷、甜甜圈、小圆面包、可微波的小圆面包、丹麦甜糕饼、羊角面包、汉堡包卷、比萨饼和皮塔饼、以及蛋糕。
11.面包改良剂，包含根据权利要求1至7中任一项所述的组合物。
12.一种用于制备烘焙产品的方法，包括在烘焙之前向面团或面糊添加下述的步骤：
-至少一种第一酶，其中，所述第一酶是在高于70℃的温度下、优选在高于80℃的温度下具有最佳活性的嗜热丝氨酸蛋白酶；以及
-至少一种第二酶，其中，所述第二酶是脂肪酶。
13.根据权利要求1至7所述的组合物在制备具有改良的松软性的烘焙产品中的用途，其中，优选地，与不使用所述第一酶或所述第二酶制备的参考烘焙产品相比，破坏制备的所述烘焙产品所需的最大力降低至少15％。
14.烘焙产品，由包含根据权利要求1至7中任一项所述的组合物的面团或面糊制备。
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