CN109395086A - 一种氧化石墨烯基复合纳米药物载体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种氧化石墨烯基复合纳米药物载体及其制备方法。所述药物载体，是表面修饰壳寡糖和γ‑聚谷氨酸的单层氧化石墨烯；氧化石墨烯、壳寡糖和γ‑聚谷氨酸的质量比为20‑80:200‑400:20‑40。该药物载体，呈层片状结构，厚度1‑6 nm，直径400‑700 nm，饱和载药量为1.1402‑1.1883 mg/mg，包封率为95.02%‑99.02%。上述药物载体可以负载抗癌、抗肿瘤活性成分。本发明提供的氧化石墨烯基复合纳米药物载体，具有较高的载药量和包封率、较低的生物毒性、细胞的亲和性及控制释放等特点，非常适合运载抗癌药物，在生物医药领域具有广泛的应用前景。

Description

一种氧化石墨烯基复合纳米药物载体及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种可运载抗癌药物的氧化石墨烯纳米药物载体。
背景技术
目前癌症已经成为危害人类健康的头号杀手，在众多治疗手段中，药物化疗是治疗癌症的重要手段，特别是治疗中晚期癌症。传统化疗方法存在药物稳定性差、难以跨过人体生理屏障、生物利用率低、靶向性差和毒副作用大等缺点，在让病人忍受极大痛苦后，治疗效果还不尽人意。目前肿瘤的药物治疗仍不理想，其主要原因之一就是药物对病灶的选择性低，如果将抗癌药物与运载药物的特殊载体相联而制成前药，使该药到达特定的病灶，则可以显著提高抗癌疗效。基于纳米材料的药物载体由于具有较高的药物载药量和包封率、以及控制释放等优点，在生物医学领域有广泛的应用前景。
氧化石墨烯［graphene oxide ，（GO）］为单层的氧化石墨，平面上含有羧基、羟基、环氧基等，表面丰富的官能团赋予其新的特性，如分散性、亲水性、与聚合物的兼容性等。研究发现，通过π-π共轭、静电作用等非共价键作用能有效地将化学药物、DNA、RNA等固定在氧化石墨烯上。GO含大量羧基、羟基与环氧基等含氧基团，水溶性好，但因静电屏蔽效应和非特异性蛋白吸附，生理环境中易聚集沉淀，限制GO在生物医药领域的应用。故需对GO进行修饰，改善GO的理化性质，增强生理环境中的稳定性。
壳寡糖［Chitosan oligosaccharide，（CO）］又称壳聚寡糖、低聚壳聚糖，是水溶性较好、功能作用大、生物活性高的低分子量产品。它具有壳聚糖所没有的较高溶解度，全溶于水，容易被生物体吸收利用等诸多独特的功能，其作用为壳聚糖的14倍。CO是自然界中唯一带正电荷阳离子碱性氨基低聚糖，是动物性纤维素。研究证明：CO具有提高免疫，抑制肿瘤细胞生长，促进肝脾抗体形成，促进钙及矿物质的吸收，增殖双歧杆菌、乳酸菌等人体有益菌群，降血脂、降血压、降血糖、调节胆固醇，减肥，预防成人疾病等功能，可应用于医药、功能性食品等领域。CO不但具备水溶性，使用方便，而且抑制腐败菌的性能效果显著，兼备多种功能作用。利用CO修饰GO，可以增加GO的水溶性。
γ-聚谷氨酸［Poly-γ-glutamic acid，（γ-PGA）］是一种典型的聚电解质，由D-谷氨酸和L-谷氨酸通过γ-谷氨酰胺键聚合而成的氨基聚合物，相对分子量一般在10万―100万。与其他聚合高分子化合物相比，γ-PGA在体内能降解为谷氨酸单体，为人体所必需，生物相容性优良，低免疫原性，无毒副作用，这是其它材料所不可比拟的。γ-PGA水溶液在粘度等诸方面表现出特殊的性质。其最大特点是氨基酸基团能增加材料与细胞的亲和性。
目前，负载抗癌药物的纳米载体大多数为氧化石墨烯和壳聚糖复合载体或者是壳聚糖和γ-聚谷氨酸复合载体，具有较高载药量，但是因其水溶性和稳定性等方面存在缺点，从而影响其发展。
发明内容
针对目前抗癌药物复合载体水溶性差、稳定性不好的问题，本发明提供一种氧化石墨烯基复合纳米药物载体，具有较高的的生物相容性，水溶性及较低的生物毒性，且稳定性好、不易团聚。
本发明还提供了一种上述药物载体的制备方法，过程简单、收率高。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种氧化石墨烯基复合纳米药物载体，是表面修饰壳寡糖和γ-聚谷氨酸的单层氧化石墨烯。所述的氧化石墨烯（GO）、壳寡糖（CO）和γ-聚谷氨酸（γ-PGA）的质量比为20-80:200-400:20-40。
所述γ-聚谷氨酸的平均分子量为40 KDa。所述壳寡糖的平均分子量为800-1000Da。
所述复合纳米药物载体的包封率为95.02%-99.02%，饱和载药量为1.1402-1.1883mg/mg。
所述复合纳米药物载体，呈层片状结构，厚度1-6 nm，直径400-700 nm。
一种上述复合纳米药物载体的制备方法，包括以下步骤：
（1）酸性条件下，单层氧化石墨烯的悬浮液与EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐）、NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）在MES（2-（N-吗啉代）乙磺酸）缓冲液中保温反应，然后离心分离获得沉淀；
（2）将步骤（1）获得的沉淀以壳寡糖的PBS缓冲溶液（磷酸盐缓冲液）重悬，然后在中性条件下保温反应，产物洗涤、透析后干燥获得表面修饰壳寡糖的单层氧化石墨烯；
（3）酸性条件下，γ-聚谷氨酸溶液与EDC、NHS在MES缓冲液中保温反应，获得活化液；
（4）中性条件下，将表面修饰壳寡糖的单层氧化石墨烯溶液与步骤（3）中的活化液混合在PBS缓冲液中保温反应，产物洗涤、透析后干燥获得表面修饰壳寡糖和γ-聚谷氨酸的单层氧化石墨烯，即复合纳米药物载体。
步骤（1）中，所述氧化石墨烯、EDC与NHS的质量比为20-80:48-160:30-240。步骤（1）中，离心速度为12000 r/min。所述单层氧化石墨烯的悬浮液的浓度为1-4 mg/mL。
步骤（1）和（3）中，所述pH为5.5-6.0。所述保温温度为37℃。所述MES缓冲液的浓度为0.1 mol/L，pH为5.5-6.0。
步骤（2）中，沉淀与壳寡糖的质量比为20-80:200-400。
步骤（2）中，壳寡糖的PBS缓冲溶液的浓度为10-20 mg/mL。
步骤（3）中，所述γ-聚谷氨酸溶液与EDC、NHS的质量比为20-40:115.2-192:72-120。
步骤（3）中，γ-PGA溶液的浓度为2-4 mg/mL。
步骤（2）和（4）中，PBS缓冲液的浓度为0.1 mol/L，pH为7.2-7.5。
步骤（2）和（4）中，反应条件为37℃，pH 7.2-7.5。所述透析液为超纯水。
步骤（4）中，表面修饰壳寡糖的单层氧化石墨烯与γ-聚谷氨酸的质量比为20-50:20-40。
步骤（2）和（4）中，透析袋的截留分子量为8 KDa-14 KDa。
单层氧化石墨烯可以采用本领域常规方法制备获得。优选的，采用以下方法：将氧化石墨烯分散于水中，超声粉碎；然后离心溶液，获得单层氧化石墨烯悬浮液。更优选的，超声功率为418-598 W，超声时间为1-1.5 h。氧化石墨烯的浓度为1-4 mg/mL。离心速度为8000-12000 r/min，时间为30-40 min。
上述复合纳米药物载体可以负载抗癌、抗肿瘤活性成分。所述抗癌、抗肿瘤活性成分选自阿霉素。
优选的，负载活性成分的复合纳米药物载体上可以采用以下方法，包括：
将复合纳米药物载体超声分散于PBS缓冲液（pH 7.2-7.5）中，再加入活性成分溶液在室温下避光搅拌反应，离心除去未负载的药物，即可获得负载活性成分的氧化石墨烯基复合纳米药物载体。
一种包含负载活性成分的上述氧化石墨烯基复合纳米药物载体的抗癌、抗肿瘤药物。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的氧化石墨烯基复合纳米药物载体，在结合单层氧化石墨烯、壳寡糖和γ-聚谷氨酸各自优点的基础上，制备得到水溶性、分散性和生物相容性优越的新型纳米给药系统，具有较高的载药量和包封率、较低的生物毒性、细胞的亲和性及控制释放等特点，非常适合运载抗癌药物，在生物医药领域具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为GO和GO-CO-γ-PGA在超纯水中的分散液照片；
图2为GO-CO-γ-PGA的透射电镜图；
图3为GO、GO-CO的红外光谱图；
图4为GO-CO-γ-PGA的红外光谱图；
图5为GO-CO-γ-PGA的核磁共振氢谱图；
图6为GO-CO-γ-PGA的X射线光电子能谱图；
图7为GO-CO-γ-PGA的X射线光电子能谱图；
图8为GO-CO-γ-PGA的紫外可见吸收光谱图；
图9为不同药物载体的载药量曲线；
图10为GO-CO-γ-PGA-DOX在不同pH下阿霉素的释放量曲线；
图11为不同药物载体对Hela细胞的毒性分析；
图12为不同氧化石墨烯基复合纳米药物载体-DOX对Hela细胞的毒性分析。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 氧化石墨烯基复合纳米药物载体的制备
1.1 制备方法
（1）单层GO悬浮液制备：取80 mg GO溶于20 mL超纯水中，采用超声波细胞粉碎机粉碎，在598 W下，超声1 h。将超声后的溶液离心，转速为8000 r/min，离心40 min，除去未剥离的氧化石墨烯，即获得GO悬浮液（约4 mg/mL）；
（2）GO-CO的制备：取20 mL步骤（1）中的GO悬浮液，利用0.1 mol/L MES buffer（pH5.5）将pH调至5.5，再加入160 mg EDC和240 mg NHS，超声10 min，封口，置于摇床，37℃，反应15 min，然后将反应液置于离心机，转速为12000 r/min，离心10 min，除去上清，得GO沉淀；
（3）将400 mg CO溶于20 mL 0.1 mol/L PBS buffer中（pH 7.5），超声10 min，获得CO溶液。以该CO溶液重悬GO沉淀，利用0.1 mol/L PBS buffer（pH 7.5）将混合液pH调至7.2，超声10 min，封口，置于摇床，37℃，反应10 h，反应后离心洗涤，截留分子量为8 KDa-14KDa，透析2天，冷冻干燥得到GO-CO；
（4）GO-CO-γ-PGA的制备：取20 mg γ-PGA溶于10 mL超纯水中，利用0.1 mol/L MESbuffer（pH 5.5）将pH调至5.5，加入192 mg EDC和120 mg NHS，超声10 min，封口，置于摇床，37℃，反应15 min，获得γ-PGA活化液；
（5）取步骤（3）中的40 mg GO-CO溶于10 mL超纯水中，超声10 min。将γ-PGA活化液加入到GO-CO溶液中，利用0.1 mol/L PBS buffer（pH 7.5）将混合液调至7.5，超声10 min，封口，置于摇床，37℃，反应10 h，反应后12000 r/min离心洗涤，截留分子量为8 KDa-14 KDa，透析2天，冷冻干燥得到GO-CO-γ-PGA粉末1；
将得到的GO-CO-γ-PGA粉末取5 mg分散于5 mL超纯水中，状态如图1所示：GO-CO-γ-PGA在水中呈高度分散状态，稳定性好。GO-CO-γ-PGA水溶液的透射电镜图如图2所示：制备的药物载体呈层片状结构，厚度3.0-4.0 nm，直径约500 nm，且具有较好的分散性。
1.2 理化性质
（1）红外光谱（FTIR）
将单片层氧化石墨烯（GO）、GO-CO与GO-CO-γ-PGA进行红外光谱检测，结果如图3和图4所示：图3中，GO的特征峰为1726 cm-1处的C=O伸缩振动峰（GO中的-COOH），1624cm-1处的C=C伸缩振动峰。与GO相比，GO-CO出现了2912 cm-1处的C-H伸缩振动峰，1633 cm-1处的C=O伸缩振动峰（酰胺Ⅰ带）和1530 cm-1处的N-H弯曲振动峰（酰胺Ⅱ带），而1726 cm-1处的-COOH吸收峰消失，说明GO与CO以酰胺键的形式成功连接。图4中，GO-CO-γ-PGA的特征峰为1641 cm-1的C=O伸缩振动峰（酰胺Ⅰ带），与GO-CO相比，1555 cm-1处的N-H弯曲振动峰（酰胺Ⅱ带）的峰强明显增加，说明γ-PGA的羧基与GO-CO中CO的氨基以酰胺键相偶联。
（2）核磁共振氢谱图（1H NMR）
GO-CO-γ-PGA的1H NMR谱图如图5所示：在δ=1.817处出现γ-PGA的β-CH2的特征峰，在δ=2.219处出现γ-PGA的γ-CH2的特征峰，在δ=3.32-3.9处出现CO的葡糖胺骨架，在δ=4.046处出现γ-PGA的α-CH的特征峰，且γ-PGA的特征峰受氧化石墨烯上的抗磁环电流的影响，由低场向高场移动，说明GO-CO与γ-PGA连接成功。
（3）X射线光电子能谱(XPS)
GO-CO-γ-PGA的X射线光电子能谱图(XPS)如图6和图7所示：GO-CO中含有C、N、O三种化学元素，与GO相比，在397.0 eV出现新峰，是N1s结合能的特征峰，N元素来自壳寡糖，说明GO与CO成功连接。图6展示了GO-CO中包含的化学键。284.8 eV为C-C键和C=C键的键能，C-C和C=C结合能相近。286.6 eV为C-O键和C-N键的键能，两者结合能相近，后者略小。288.0 eV为C=O键和O=C-N键的键能，C=O和O=C-N结合能相近，O=C-N是表示酰胺键，由于二者能量相近，所以是一个峰，没有分开。
（4）紫外可见吸收光谱（UV-Vis）
GO-CO-γ-PGA、γ-PGA、GO、CO、GO-CO的紫外可见吸收光谱如图8所示：GO的特征峰为230 nm，CO的特征峰为301 nm，GO-CO在211 nm、230 nm、301 nm处有明显的吸收峰，说明GO和CO连接成功。γ-PGA的特征峰为222 nm，GO-CO-γ-PGA的在203 nm、230 nm、301 nm处有明显的吸收峰，相比较GO-CO特征吸收峰发生了蓝移，说明GO-CO与γ-PGA成功连接。
对比例1 CO-γ-PGA复合纳米药物载体的制备
（1）取20 mg γ-PGA溶于10 mL超纯水中，利用0.1mol/L MES buffer（pH 6.0）将pH调至6.0，加入192 mg EDC和120 mg NHS，然后超声10 min，封口，置于摇床，37℃，反应15min，获得γ-PGA活化液；
（2）取400 mg CO溶于20 mL 0.1mol/L PBS buffer（pH 7.4）中，超声10 min。将CO溶液加入到γ-PGA活化液中，利用0.1mol/L PBS buffer（pH 7.4）将混合液调至7.4，超声10min，封口，置于摇床，37℃，反应10 h，反应后离心洗涤，截留分子量为8 KDa-14 KDa，透析2天，冷冻干燥得到CO-γ-PGA粉末1。透射电镜下，该CO-γ-PGA载体呈圆球形，其粒径在300-400 nm。
对比例2 石墨烯纳米药物载体的制备
（1）取80 mg GO溶于20 mL超纯水中，采用超声波细胞粉碎机粉碎，在598 W下，超声1h；
（2）将超声后的溶液离心，转速为8000 r/min，离心40 min，除去未剥离的氧化石墨烯，即获得GO悬浮液，冷冻干燥得到GO粉末。透射电镜下，该载体呈层片状结构，其直径在400-500 nm，形态较规整。
实施例2 不同药物载体的载药量和包封率、释放速率
将实施例1、对比例1和对比例2制备的药物载体负载阿霉素（DOX），然后采用高效液相色谱测定其载药量、包封率，并测定实施例1制备的载体负载阿霉素在不同pH下的释药量。
2.1 载药量和包封率
（1）高效液相色谱条件：
流动相：甲醇、0.01 mol/L的磷酸二氢铵及冰醋酸，三者体积比为：甲醇：0.01 mol/L的磷酸二氢铵：冰醋酸=62:38:0.5；
检测波长：258 nm。
色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18
（2）载药量和包封率的检测
准确配制一系列浓度梯度的DOX标准溶液，DOX浓度范围为0.0625-1 mg/mL，利用高效液相色谱测定各个浓度下的峰面积，并将其与相应的浓度绘制DOX的浓度-峰面积的标准曲线。
分别称取5 mg实施例1、对比例1、对比例2获得的药物载体超声分散于5 mL PBSbuffer（pH=7.4）中，加入DOX溶液浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL，在室温下避光搅拌反应24 h，通过高速离心机离心除去未负载的药物，利用高效液相色谱仪得到上清中药物峰面积，根据DOX的浓度-峰面积的标准曲线得出上清液药物浓度，并按照下面的公式计算载药量和包封率：
实施例1、对比例1和对比例2中药物载体的载药量如图9所示：随着药物DOX浓度的增加，三种药物载体的载药量逐渐增大。当药物浓度达到1.2 mg/mL时，各载体的载药量均已达到饱和。其中实施例1中药物载体的最大载药量为1.1883 mg/mg，1中药物载体的最大载药量为0.9001 mg/mg，对比例2中药物载体的最大载药量0.6011 mg/mg，说明实施例1中药物载体具有较高的载药量。
实施例1、对比例1和对比例2中药物载体的包封率如表1所示：
表1 3种药物载体的包封率
药物载体 包封率/%
实施例1 99.02
对比例1 75.01
对比例2 50.09
由表1数据可知，当药物载体的载药量达到饱和时，实施例1中药物载体的包封率为99.02%，对比例1中药物载体的包封率为75.01%，对比例2中药物载体的包封率为50.09%，说明实施例1中药物载体的包封率优于其他两个载体。
2.2 释放阿霉素的速率
分别称取5 mg实施例1中药物载体制备的GO-CO-γ-PGA-DOX加入5 mL的PBS中（pH=7.4和pH=5.0），超声溶解后装入透析袋，置于500 mL的烧杯中，再加入300 mL的pH=7.4或pH=5.0的PBS，于37 ℃恒温震荡箱中进行药物释放，每隔一段时间取4 mL释放液，根据药物浓度-吸光度标准曲线，测出ti时刻取出缓冲液中DOX的浓度Cti进而按下式求出该时刻的累积释放率：
其中，Vti为ti时刻取出的释放液的体积，V为总的缓冲液的体积。
实施例1中药物载体制备的GO-CO-γ-PGA-DOX在不同pH下的释放速率如图10所示：在酸性条件下DOX释放率远高于中性条件，当释放时间达到72h时，DOX在酸性条件下释放了40%，在中性条件下只释放了7%。这说明，GO-CO-γ-PGA-DOX表现出pH响应药物释放，可以在肿瘤部位释放大量药物，减轻对正常细胞的损伤。
实施例3 氧化石墨烯基复合纳米药物载体的制备
（1）单层GO悬浮液制备：取60 mg GO溶于20 mL超纯水中，采用超声波细胞粉碎机粉碎，在598 W下，超声1.5 h。将超声后的溶液离心，转速为8000 r/min，离心40 min，除去未剥离的氧化石墨烯，即获得GO悬浮液（约3 mg/mL）；
（2）GO-CO的制备：取20 mL步骤（1）中的GO悬浮液，利用0.1 mol/L MES buffer（pH6.0）将pH调至6.0，再加入120 mg EDC和180 mg NHS，超声10 min，封口，置于摇床，37℃，反应15 min，然后将反应液置于离心机，转速为12000 r/min，离心10 min，除去上清，得GO沉淀；
（3）将250 mg CO溶于20 mL 0.1 mol/L PBS buffer中（pH 7.4），超声10 min，获得CO溶液。以该CO溶液重悬GO沉淀，利用0.1 mol/L PBS buffer（pH 7.4）将混合液pH调至7.4，超声10 min，封口，置于摇床，37℃，反应10 h，反应后离心洗涤，截留分子量为8 KDa-14KDa，透析2天，冷冻干燥得到GO-CO；
（4）GO-CO-γ-PGA的制备：取30 mg γ-PGA溶于10 mL超纯水中，利用0.1 mol/L MESbuffer（pH 6.0）将pH调至6.0，加入210 mg EDC和130 mg NHS，超声10 min，封口，置于摇床，37℃，反应15 min，获得γ-PGA活化液；
（5）取步骤（3）中的40 mg GO-CO溶于10 mL超纯水中，超声10 min。将γ-PGA活化液加入到GO-CO溶液中，利用0.1 mol/L PBS buffer（pH 7.4）将混合液调至7.4，超声10 min，封口，置于摇床，37℃，反应10 h，反应后12000 r/min离心洗涤，截留分子量为8 KDa-14 KDa，透析2天，冷冻干燥得到GO-CO-γ-PGA粉末2。透射电镜下，该载体呈层片状结构，厚度2.0-3.0 nm，直径500-600 nm，且具有较好的分散性。载药量为1.1823 mg/mg，包封率为98.52%。持续释放药物可达72 h，具有良好的缓释性能。
实施例4 氧化石墨烯基复合纳米药物载体的制备
（1）单层GO悬浮液制备：取50 mg GO溶于20 mL超纯水中，采用超声波细胞粉碎机粉碎，在598 W下，超声1 h。将超声后的溶液离心，转速为8000 r/min，离心40 min，除去未剥离的氧化石墨烯，即获得GO悬浮液（约2.5 mg/mL）；
（2）GO-CO的制备：取20 mL步骤（1）中的GO悬浮液，利用0.1 mol/L MES buffer（pH6.0）将pH调至6.0，再加入100 mg EDC和150 mg NHS，超声10 min，封口，置于摇床，37℃，反应15 min，然后将反应液置于离心机，转速为12000 r/min，离心10 min，除去上清，得GO沉淀；
（3）将300 mg CO溶于20 mL 0.1 mol/L PBS buffer中（pH 7.2），超声10 min，获得CO溶液。以该CO溶液重悬GO沉淀，利用0.1 mol/L PBS buffer（pH 7.2）将混合液pH调至7.2，超声10 min，封口，置于摇床，37℃，反应10 h，反应后离心洗涤，截留分子量为8 KDa-14KDa，透析2天，冷冻干燥得到GO-CO；
（4）GO-CO-γ-PGA的制备：取25 mg γ-PGA溶于10 mL超纯水中，利用0.1 mol/L MESbuffer（pH 6.0）将pH调至6.0，加入230 mg EDC和160 mg NHS，超声10 min，封口，置于摇床，37℃，反应15 min，获得γ-PGA活化液；
（5）取步骤（3）中的40 mg GO-CO溶于10 mL超纯水中，超声10 min。将γ-PGA活化液加入到GO-CO溶液中，利用0.1 mol/L PBS buffer（pH 7.2）将混合液调至7.2，超声10 min，封口，置于摇床，37℃，反应10 h，反应后12000 r/min离心洗涤，透析2天，冷冻干燥得到GO-CO-γ-PGA粉末3。透射电镜下，该载体呈层片状结构，厚度1.0-2.0 nm，直径600-700 nm，且具有较好的分散性。药物载药量为1.1402 mg/mg，包封率为95.02%，持续释放药物可达72h，具有良好的缓释性能。
实施例5 载体的体外细胞毒性
采用MTT法研究3种药物载体对HeLa细胞毒性作用。将HeLa培养在96孔板中，培养24h后，加入GO-CO-γ-PGA的浓度分别为200、150、100、50、25、12.5 μg/mL。将细胞培养24 h后，每孔加入15 μL的MTT(5 mg/mL)继续培养4-5 h。仔细除去上清液后，向各孔中加入100 μL的二甲基亚砜，将96孔板震荡5分钟，使甲瓒晶体充分溶解后，利用酶标仪测量570 nm处的吸光度，根据下式计算细胞存活率：
。
3种药物载体对HeLa细胞的毒性如图11所示。由图11可知，三种方法制备的GO-CO-γ-PGA使Hela细胞存活率达到80%以上，说明3种药物载体的细胞毒性较低，生物相容性较好。
实施例6 负载阿霉素的药物载体的靶细胞的活性
采用MTT法研究3种氧化石墨烯基复合纳米药物载体-DOX对HeLa细胞毒性作用。将HeLa培养在96孔板中，培养24h后，加入GO-CO-γ-PGA-DOX的浓度分别为50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL。将细胞培养24 h后，每孔加入15 μL的MTT(5 mg/mL)继续培养4-5 h。仔细除去上清液后，向各孔中加入100 μL的二甲基亚砜，将96孔板震荡5分钟，使甲瓒晶体充分溶解后，利用酶标仪测量570 nm处的吸光度。根据下式计算细胞存活率，3种氧化石墨烯基复合纳米药物载体对HeLa细胞的毒性如图12所示：
由图12可知，随着GO-CO-γ-PGA-DOX浓度的增加，Hela细胞的相对存活率逐渐降低，其中，实施例1制备的GO-CO-γ-PGA-DOX-1对Hela细胞的抑制作用最强。

Claims (10)

1.一种氧化石墨烯基复合纳米药物载体，其特征在于，其为表面修饰壳寡糖和γ-聚谷氨酸的单层氧化石墨烯；所述的氧化石墨烯、壳寡糖和γ-聚谷氨酸的质量比为20-80:200-400:20-40。
2.根据权利要求1所述的药物载体，其特征在于，所述γ-聚谷氨酸的平均分子量为40Kda；所述壳寡糖的平均分子量为800-1000 Da。
3.根据权利要求1-2任一所述的药物载体，其特征在于，呈层片状结构，厚度1-6 nm，直径400-700 nm。
4.一种如权利要求1-3任一药物载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）酸性条件下，单层氧化石墨烯的悬浮液与EDC、NHS在MES缓冲液中保温反应，然后离心分离获得沉淀；
（2）将步骤（1）获得的沉淀以壳寡糖的PBS缓冲溶液重悬，然后在中性条件下保温反应，产物洗涤、透析后干燥获得表面修饰壳寡糖的单层氧化石墨烯；
（3）酸性条件下，γ-聚谷氨酸溶液与EDC、NHS在MES缓冲液中保温反应，获得活化液；
（4）中性条件下，将表面修饰壳寡糖的单层氧化石墨烯溶液与步骤（3）中的活化液混合在PBS缓冲液中保温反应，产物洗涤、透析后干燥获得表面修饰壳寡糖和γ-聚谷氨酸的单层氧化石墨烯，即复合纳米药物载体。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述氧化石墨烯、EDC与NHS的质量比为20-80:48-160:30-240；
步骤（2）中，沉淀与壳寡糖的质量比为20-80:200-400；
步骤（3）中，所述γ-聚谷氨酸溶液与EDC、NHS的质量比为20-40:115.2-192:72-120；
步骤（4）中，表面修饰壳寡糖的单层氧化石墨烯与γ-聚谷氨酸的质量比为20-50:20-40。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述单层氧化石墨烯的悬浮液的浓度为1-4 mg/mL；
步骤（2）中，壳寡糖的PBS缓冲溶液的浓度为10-20 mg/mL；
步骤（3）中，γ-PGA溶液的浓度为2-4 mg/mL。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）和（3）中，所述pH为5.5-6.0；所述保温温度为37 ℃；所述MES缓冲液的浓度为0.1 mol/L，pH为5.5-6.0；
步骤（2）和（4）中，PBS缓冲液的浓度为0.1 mol/L，pH为7.2-7.5；反应条件为37℃，pH7.2-7.5。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，离心速度为12000 r/min；
步骤（2）和（4）中，透析袋的截留分子量为8 KDa-14 KDa。
9.一种包含负载活性成分的如权利要求1-3任一所述的药物载体的抗癌、抗肿瘤药物。
10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述活性成分为阿霉素。
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