CN109364257A - 一种动态性及稳定性兼备的多肽杂化高分子纳米药物制备方法 - Google Patents
一种动态性及稳定性兼备的多肽杂化高分子纳米药物制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种动态性及稳定性兼备的多肽杂化高分子纳米药物制备方法，制备方法包括：以具有β‑折叠结构的多肽序列为自组装的非共价超分子基元和光诱导拓扑聚合的共价聚合基元前体为基础，将具有抗癌、抗炎、抗菌类药物通过共价键连接在多肽超分子基元上，利用光诱导聚合得到兼具共价键和非共价键的杂化高分子，调节共价与非共价超分子基元在共组装时的组分比例，得到分子动态性及化学稳定性可调、可优化的杂化高分子纳米药物，在抗肿瘤、抗炎和抗菌等领域具有广泛的用途。本发明的优点是：该多肽杂化高分子纳米药物具有智能可调节性、定量化给药模式以及细胞示踪和药物治疗兼备的医学功能，制备方法简单、易于工业化生产和应用领域范围广阔。
Description
技术领域
本发明涉及超分子纳米药物技术领域，具体涉及一种动态性及稳定性兼备的多肽杂化高分子纳米药物制备方法。
技术背景
具有良好生物相容性的高分子材料在纳米药物领域，尤其是在疾病诊断和治疗中具有广阔的应用前景。然而，目前药物治疗和生物示踪所采用的生物医用高分子材料尚有很多缺点，诸多的高分子纳米药物载体技术在基础理论研究以及临床转化等关键技术层面受到合成过程复杂、包载率定量化困难等问题的困扰，从而造成了纳米药物成分不易固定，构成的纳米载体尺寸变化较大，几何形貌不均匀，药物释放动力学不稳定等技术性难题，也是现代药物制剂技术的一个技术瓶颈。到目前为止，高分子纳米药物载体的制备方法有通过形成共价键连接形成聚合物包封的方法，以及通过“自下而上”自组装的方法等途径来实现。共价键合成的高分子药物载体通常具有更高的机械强度，化学稳定性和均一的理化性质等优点。然而，共价键高分子形成的纳米药物具有不易控制的降解速率，缺乏类似生命体动态可逆性的性质等优点，在深入的生物医学领域应用受到很大的限制。
非共价键构成的超分子聚合物药物载体一般是通过氢键、范德华力、亲疏水、π-π堆积、静电作用、金属配位等弱相互作用的驱动下形成高度有序复杂的组装结构。由于非共价键作用相对共价键键能低，易发生解离，超分子聚合物具有动态、可逆的特性，当外部环境变化时，超分子聚合物可以重新组装以形成更加稳定的结构。因此，超分子聚合物被赋予了诸多高分子聚合物所不具备的特殊性质，如可逆可降解、自适应、自修复、刺激响应性等。然而，通过非共价键(键能0.5-10kJ/mol)诱导形成的超分子聚合物和共价键(键能60-120kJ/mol)构成的高分子聚合物相比，由于非共价键键能小，通过单一作用很难得到结构稳定且分子量较高的超分子聚合物。因此，通过合理设计、构筑超分子聚合物的组装基元，结合共价高分子聚合物机械稳定的特点，制备具有微观尺度精细、具有动态可逆性和稳定性兼备、生物功能丰富的杂化高分子纳米药物具有重要意义和应用前景。
发明内容
本发明目的是克服现有技术中存在的上述缺陷，提供一种动态性及稳定性兼备的多肽杂化高分子纳米药物制备方法，以在模拟细胞外动态可逆以及稳定的环境的同时，提高仿生杂化高分子的生物相容性，利用共价键的稳定性及共轭结构在细胞膜表面形成明亮的红色荧光，可用于细胞示踪，利用非共价键的动态性，将药物携带进入细胞膜，提高药物的生物利用度。该制备方法简单，反应条件温和，操作简便。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
一种动态性及稳定性兼备的多肽杂化高分子纳米药物制备方法，包括如下步骤：
S1：设计合成氮端为碳原子数不同的脂肪酸(CH3(CH2)nCOOH，n＝6-20)修饰多肽序列和氮端为含有丁二炔结构的脂肪酸修饰多肽序列，该类多肽序列可经过自组装形成具有β-折叠结构的组装体；其中包括共价键连接的具有可进行光催化拓扑聚合的自组装基元、非共价键的超分子多肽自组装基元和具有药物治疗功能的非共价超分子多肽自组装基元；多肽合成方法由固相合成的方法实现，以哌啶作为脱保护剂，1-羟基苯并三氮唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐和N,N-二异丙基乙胺为缩合剂；
S2：将步骤S1所述的共价多肽自组装基元、非共价多肽自组装基元和具有药物治疗功能的非共价多肽自组装基元在水溶液中进行共组装，退火后得到一系列具有特定组装结构的超分子纳米药物；
S3：将步骤S2得到的超分子纳米药物在紫外光照射下进行拓扑聚合反应，得到共价键-非共价键协同作用的杂化高分子纳米药物，经过光诱导拓扑聚合后，该杂化高分子纳米药物形成共轭结构的分子骨架，具有明亮的红色荧光，可在细胞膜表面形成稳定的红色荧光成像分子，而非共价结构可通过分子运动释放出来，具有药物传输的功能。
在本发明的进一步实施方式中，步骤S1中，所述超分子多肽自组装基元包括具有β- 折叠结构的氮端为不同碳链长度的脂肪酸修饰多肽序列，例如：谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸- 缬氨酸-二十二烷基酸酯、谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十烷基酸酯、谷氨酸-缬氨酸- 谷氨酸-缬氨酸-十八烷基酸酯、谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-棕榈酸酯、谷氨酸-缬氨酸- 谷氨酸-缬氨酸-月桂酸酯、谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸- 缬氨酸-二十二烷基酯、谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-二十烷基酯、谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-月桂酸酯、谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸- 甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-十八烷基酸酯、谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-棕榈酸酯和谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-月桂酸酯等；
所述可进行光催化拓扑聚合的共价自组装基元前体包括有β-折叠结构的氮端为含有丁二炔结构的脂肪酸修饰多肽序列，例如：谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-10,12-二十五二炔酸酯和谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-10,12-二十五二炔酸酯；
具有药物治疗功能的非共价超分子多肽自组装基元主要是β-折叠结构的氮端为不同碳链长度的脂肪酸修饰多肽序列，例如：吲哚美辛、乙酰水杨酸、甲氨蝶呤和苯丁酸氮芥功能化的赖氨酸-谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酯、赖氨酸-谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十烷基酯、赖氨酸-谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-十八烷基酯、赖氨酸-谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-棕榈酸酯、赖氨酸-谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-月桂酸酯、赖氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-二十二烷基酯、赖氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-二十烷基酯、赖氨酸-谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-月桂酸酯、赖氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸- 甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-十八烷基酸酯、赖氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-棕榈酸酯、赖氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-月桂酸酯；
在本发明的进一步实施方式中，步骤S2中：共价多肽自组装基元和非共价多肽自组装基元共组装的物质的量(即摩尔比)为99:1到1:99，具有药物治疗功能的非共价多肽自组装基元占上述共价多肽自组装基元和非共价多肽自组装基元总的摩尔数的比在0.1％到10％之间；所述自组装溶液的物质的量浓度在0.1微摩尔每升到5000微摩尔每升；所述自组装溶液的退火温度在10-100℃之间，所述的退火时间为1-48小时，所述的溶剂为有机溶剂或水，所述的有机溶剂包括乙醇、异丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲亚砜和二甲基甲酰胺中的一种或几种；所述水为超纯水，去离子水和Milli-Q水。
在本发明的进一步实施方式中，步骤S3中：进行光催化拓扑聚合的光波长在200-380 纳米之间，反应体系所在温度范围在0-100℃之间，所述的反应时间为0.1-100小时。
第二方面，本发明提供了上述方法制备得到的动态性及稳定性兼备的多肽杂化高分子纳米药物。
第三方面，本发明通过步骤S3所得到的多肽杂化高分子纳米药物同时兼备红色荧光的纳米荧光示踪分子的功能，包括上述动态性及稳定性兼备的多肽杂化高分子纳米药物的所有步骤，并在S3中的反应后，所得到的共价高分子共轭骨架部分具有红色荧光，可在细胞膜表面形成稳定的红色细胞成像分子。
第四方面，本发明提供了上述方法制备得到的具有荧光示踪和药物治疗双重功能的纳米杂化高分子纳米药物。
第五方面，本发明提供的上述具有荧光示踪和药物治疗的纳米杂化高分子组装材料在抗炎、抗肿瘤和抗菌等领域具有应用价值。
本发明的优点和有益效果：
(1)本发明采用的多肽序列具有良好的生物相容性和生物活性，多肽作为生物体内重要的生物活性物质，可以通过调控组装序列的分子结构以及组装环境因素，实现对自组装过程的热力学和动力学控制。(2)本发明所用的多肽组装基元所构成的软物质材料具有生物降解性、低免疫原性和低毒性，对外界环境刺激具有快速响应性等优点。(3)本发明所用的光催化拓扑聚合反应条件非常温和，无需加热，得到的杂化高分子微观形貌能够保持完好无损，并且成功规避了采用过渡金属配合物催化引起的重金属难以除去，引起生物毒性等问题。(4)本发明得到的杂化高分子纳米药物兼具分子动态性和化学稳定性，可以通过调节可进行光催化拓扑聚合的自组装基元以及非共价自组装基元的共组装时加入的摩尔比控制杂化高分子纳米药物的动态可逆性和结构稳定性，并且，稳定的共价键分子骨架起着细胞膜示踪的作用，而动态的非共价键可将药物分子携带进入细胞进行药物治疗。(5)本发明得到的杂化高分子通过细胞毒性的测定发现，该类杂化高分子材料对正常的小鼠成纤维细胞以及人宫颈癌细胞毒性都很小，浓度达到100微摩尔每升时小鼠胚胎成纤维细胞和宫颈癌细胞存活率均在85％以上，具有良好的生物相容性。(6)本发明得到的杂化高分子纳米药物通过激光共聚焦显微镜可以看见细胞膜周围呈现红色荧光，并能在12 小时内得到保持；通过检测宫颈癌细胞表达的炎症因子环氧合酶-2可见，由于杂化高分子纳米药物的加入，环氧合酶-2表达明显降低。(7)本发明提供的动态性及稳定性兼备的多肽杂化高分子纳米药物的制备方法简单，反应条件温和，操作简便，易于工业化，制备得到的多肽杂化高分子纳米药物可以应用于抗炎、抗癌、抗菌等方面的药物治疗以及示踪。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例中的部分共价、非共价多肽序列以及药物功能化非共价基元分子结构式图；(1：谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-10,12-二十五二炔酸酯；2：谷氨酸-缬氨酸 -谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酯；3：苯丁酸氮芥-赖氨酸-谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酯；4：荧光素-赖氨酸-谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酯5：吲哚美辛-赖氨酸-谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酯；6：甲氨蝶呤-赖氨酸-谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酯)。
图2为本发明实施例中的杂化高分子纳米药物透射电子显微镜图；
图3为本发明实施例中的杂化高分子纳米药物生物相容性检测；
图4为本发明实施例中的光催化拓扑聚合过程中紫外-可见光检测光谱图；
图5为本发明实施例中的宫颈癌细胞中经加入杂化高分子纳米药物后对环氧化酶-2的抑制率。
图6为本发明实施例中的经加入杂化高分子后6小时细胞膜表面激光共聚焦显微镜图和药物胞吞情况图，其中，A为细胞明场，B为绿色荧光成像，C为细胞膜红色荧光成像，D为绿色和红色荧光叠加图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。
下面结合具体实施例对本发明提供的一种动态性及稳定性兼备的多肽杂化高分子纳米药物制备方法作进一步说明。
实施例1
S1：通过固相合成的方法合成：谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯、谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-10,12-二十五二炔酸酯和吲哚美辛-赖氨酸-谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯三种多肽序列，投料均为0.25毫摩尔，产率95％，通过高效液相色谱分离提纯，产物纯度≥98％。
S2：将谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯、谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-10,12-二十五二炔酸酯和吲哚美辛-赖氨酸-谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯三种多肽基元以摩尔比为0.5:99:0.5的配方下，在水溶液中(pH值7.0)进行热退火自组装，退火温度100℃，组装时间48小时，将得到的纳米组装结构在场发射透射电子显微镜下观察可见纳米带状结构，如图2所示。
S3：将S2得到的共组装体在25℃下，紫外灯功率在2.0瓦，220纳米紫外光照射8.0小时，得到杂化高分子纳米药物。在紫外灯照射的第0秒到第30000秒间，通过紫外分光光谱仪检测聚合反应过程，如图3所示。
实施例2
S1：通过固相合成的方法合成：谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯、谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-10,12-二十五二炔酸酯和吲哚美辛-赖氨酸-谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯三种多肽序列，投料均为0.25毫摩尔，产率95％，通过高效液相色谱分离提纯，产物纯度≥98％。
S2：将谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯、谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-10,12-二十五二炔酸酯和吲哚美辛-赖氨酸-谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯三种多肽基元以摩尔比为70:25:5的配方下，在水溶液中(pH值7.0)进行热退火自组装，退火温度100℃，组装时间20小时，将得到的纳米组装结构在场发射透射电子显微镜下观察可见纳米带状结构，如图2所示。
S3：将S2得到的共组装体在25℃下，紫外灯功率在2.0瓦，220纳米紫外光照射8.0小时，得到杂化高分子纳米药物。在紫外灯照射的第0秒到第30000秒间，通过紫外分光光谱仪检测聚合反应过程。
实施例3
本实施例提供的是一种动态性及稳定性兼备的多肽杂化高分子纳米药物制备方法，制备过程包括：
S1：通过固相合成的方法合成谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯、谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-10,12-二十五二炔酸酸酯和苯丁酸氮芥-赖氨酸-谷氨酸-缬氨酸- 谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯三种多肽序列，投料均为0.25毫摩尔，产率95％，通过高效液相色谱分离提纯，产物纯度≥98％。
S2：将谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯、谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-10,12-二十五二炔酸酯和苯丁酸氮芥-赖氨酸-谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯三种多肽基元以摩尔比为99:0.5:0.5的配方下，在水溶液中(pH值7.0)进行热退火自组装，退火温度100℃，组装时间24小时。
S3：将S2得到的共组装体在25℃下，紫外灯功率在4瓦，220纳米紫外光照射5小时，得到杂化高分子纳米药物。
实施例4
本实施例提供的是一种动态性及稳定性兼备的多肽杂化高分子纳米药物制备方法，制备过程包括：
S1：通过固相合成的方法合成谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯、谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-10,12-二十五二炔酸酯和甲氨蝶呤-赖氨酸-谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯三种多肽序列，投料均为0.25毫摩尔，产率95％，通过高效液相色谱分离提纯，产物纯度≥98％。
S2：将谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯、谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-10,12-二十五二炔酸酯和甲氨蝶呤-赖氨酸-谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯三种多肽基元以摩尔比为0.5:99:0.5的配方下，在水溶液中(pH值8.0)进行热退火自组装，退火温度80℃，组装时间1小时。
S3：将S2得到的共组装体在25℃下，紫外灯功率在6.0瓦，220纳米紫外光照射1.0小时，得到杂化高分子纳米药物。
实施例5
本实施例提供的是一种动态性及稳定性兼备的多肽杂化高分子纳米药物制备方法，制备过程包括：
S1：通过固相合成的方法合成谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸- 缬氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯、谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸- 缬氨酸-缬氨酸-10,12-二十五二炔酸酯和吲哚美辛-赖氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸- 甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯三种多肽序列，投料均为0.25毫摩尔，产率95％，通过高效液相色谱分离提纯，产物纯度≥98％。
S2：将谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯、谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-10,12-二十五二炔酸酯和吲哚美辛-赖氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯三种多肽基元以摩尔比为75:20:5的配方下，在水溶液中(pH 值5.0)进行热退火自组装，退火温度80℃，组装时间24小时。
S3：将S2得到的共组装体在25℃下，紫外灯功率在3.0瓦，220纳米紫外光照射10.0小时，得到杂化高分子纳米药物。
实施例6
本实施例提供的是一种动态性及稳定性兼备的多肽杂化高分子纳米药物制备方法，制备过程包括：
S1：通过固相合成的方法合成谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸- 缬氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯、谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸- 缬氨酸-缬氨酸-10,12-二十五二炔酸酯和甲氨蝶呤-赖氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸- 甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯三种多肽序列，投料均为0.25毫摩尔，产率95％，通过高效液相色谱分离提纯，产物纯度≥98％。
S2：将谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯、谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-10,12-二十五二炔酸酯和甲氨蝶呤-赖氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯三种多肽基元以摩尔比为0.5:99:0.5的配方下，在水溶液中 (pH值6.0)进行热退火自组装，退火温度100℃，组装时间40小时。
S3：将S2得到的共组装体在25℃下，紫外灯功率在4.0瓦，360纳米紫外光照射10小时，得到杂化高分子纳米药物。
实施例7
本实施例提供的是一种动态性及稳定性兼备的多肽杂化高分子纳米药物制备方法，制备过程包括：
S1：通过固相合成的方法合成谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸- 缬氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯、谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸- 缬氨酸-缬氨酸-10,12-二十五二炔酸酯和甲氨蝶呤-赖氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸- 甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯三种多肽序列，投料均为0.25毫摩尔，产率95％，通过高效液相色谱分离提纯，产物纯度≥98％。
S2：将谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯、谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-10,12-二十五二炔酸酯和甲氨蝶呤-赖氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯三种多肽基元以摩尔比为99:0.5:0.5的配方下，在水溶液中 (pH值6.0)进行热退火自组装，退火温度100℃，组装时间24小时。
S3：将S2得到的共组装体在25℃下，紫外灯功率在4.0瓦，360纳米紫外光照射12小时，得到杂化高分子纳米药物。
实施例8
本实施例提供的是一种动态性及稳定性兼备的多肽杂化高分子纳米药物制备方法，制备过程包括：
S1：通过固相合成的方法合成：谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯、谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-10,12-二十五二炔酸酯和吲哚美辛-赖氨酸-谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯三种多肽序列，投料均为0.25毫摩尔，产率95％，通过高效液相色谱分离提纯，产物纯度≥98％。
S2：将谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯、谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-10,12-二十五二炔酸酯和吲哚美辛-赖氨酸-谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯三种多肽基元以摩尔比为60:35:5的配方下，在水溶液中(pH值7.0)进行热退火自组装，退火温度55℃，组装时间1小时。
S3：将S2得到的共组装体在25℃下，紫外灯功率在8瓦，360纳米紫外光照射12小时，得到杂化高分子纳米药物。
实施例9
本实施例提供的是一种动态性及稳定性兼备的多肽杂化高分子纳米药物制备方法，制备过程包括：
S1：通过固相合成的方法合成：谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯、谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-10,12-二十五二炔酸酯和吲哚美辛-赖氨酸-谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯三种多肽序列，投料均为0.25毫摩尔，产率95％，通过高效液相色谱分离提纯，产物纯度≥98％。
S2：将谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯、谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-10,12-二十五二炔酸酯和吲哚美辛-赖氨酸-谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酸酯三种多肽基元以摩尔比为60:35:5的配方下，在水溶液中(pH值7.0)进行热退火自组装，退火温度55℃，组装时间1小时。
S3：将S2得到的共组装体在25℃下，紫外灯功率在8瓦，360纳米紫外光照射12小时，得到杂化高分子纳米药物。
实施例10
将本发明实施例2制备得到的动态性及稳定性兼备的多肽杂化高分子纳米药物，通过功能性实验来系统评价。
细胞毒性和环氧合酶-2等细胞因子的检测
实验方法：通过细胞计数板(CCK-8)的方法对杂化高分子的细胞毒性进行检测：在96孔板中接种细胞悬液(100微升/孔)。将培养板放在标准培养箱中预培养(在37℃，5％CO2)。向每孔加入10微升CCK-8溶液。将培养板在培养箱内孵育1-4小时，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
利用环氧化酶-2抑制剂筛选试剂盒检测环氧化酶-2：使用96孔黑板设置对照孔和样品孔。加入待测样品100微升，混匀，37℃孵育10分钟。各孔中加入环氧合酶-2探针溶液5微升。各孔中快速加入环氧化酶-2底物工作液5微升，混匀。37℃避光孵育5分钟后进行荧光测定。激发波长为535纳米，发射波长为587纳米。
实验结果：具体结果如图4所示。该杂化高分子材料的细胞毒性很低，对小鼠成纤维细胞和人宫颈癌细胞两种细胞的测试均可见，浓度高达100微摩尔每升时细胞存活率均在 85％以上；环氧化酶-2的检测表明该杂化高分子纳米药物可以有效抑制宫颈癌细胞过表达环氧化酶-2，可作为抗炎和抗癌药物的辅助用药。
实施例11
将本发明实施例1制备得到的动态性及稳定性兼备的多肽杂化高分子纳米药物，通过激光共聚焦显微镜观察动态-稳定性差异在细胞示踪和药物治疗的应用
实验方法：利用激光共聚焦显微镜的方法，将细胞接种到共聚焦细胞培养皿中，密度为每皿1-9×104个细胞，培养24小时。加入100.0微升浓度5.0微摩尔每升的杂化高分子纳米药物，并在37℃下与细胞一起培养6小时。用0.1摩尔每升的磷酸盐缓冲溶液冲洗3 次后，用4％多聚甲醛固定细胞20分钟，用磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，再用4，6-二脒基 -2-苯基吲哚(1微克每毫升)染色3分钟，磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，将培养皿密封避光置于4℃冰箱中。
实验结果：结果如图5所示，杂化高分子纳米药物通过激光共聚焦显微镜可以看见细胞膜周围呈现明亮红色荧光，并能在12小时内得到保持，形成稳定的细胞膜外示踪纳米层，而由超分子聚合形成动态小分子药物能够在6小时内通过细胞膜进入细胞质和细胞核，起到治疗效果。
需要说明的是，除了上述实施例1至实施例11列举的情况，选用其他的原料配比和制备方法参数也是可行的。
现有技术中，纳米药物在制备过程中，由于制备条件及原材料差异，批次间有较大差异，对抗炎和抗肿瘤效果均有不同程度的影响；本发明提供的杂化高分子兼具动态性和稳定性，利用稳定性骨架可以作为细胞示踪材料，利用动态性药物可以进行药物传输，可以有效克服现有材料的缺点。
Claims (3)
1.一种动态性及稳定性兼备的多肽杂化高分子纳米药物制备方法，包括如下步骤：
S1：设计合成氮端为碳原子数不同的脂肪酸(CH3(CH2)nCOOH，n＝6-20)修饰多肽序列和氮端为含有丁二炔结构的脂肪酸修饰多肽序列，该类多肽序列可经过自组装形成具有β-折叠结构的组装体；其中包括共价键连接的具有可进行光催化拓扑聚合的自组装基元、非共价键的超分子多肽自组装基元和具有药物治疗功能的非共价超分子多肽自组装基元；多肽合成方法由固相合成的方法实现，以哌啶作为脱保护剂，1-羟基苯并三氮唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐和N,N-二异丙基乙胺为缩合剂；
S2：将步骤S1所述的共价多肽自组装基元、非共价多肽自组装基元和具有药物治疗功能的非共价多肽自组装基元在水溶液中进行共组装，退火后得到超分子纳米药物；
S3：将步骤S2得到的超分子纳米药物在紫外光照射下进行拓扑聚合反应，得到共价键-非共价键协同作用的杂化高分子纳米药物，经过光催化聚合后，该杂化高分子纳米药物形成共轭结构的分子骨架，具有明亮的红色荧光，可在细胞膜表面形成稳定的红色荧光成像分子，而非共价结构可通过分子运动释放出来，具有药物传输的功能。
2.根据权利要求1所述的动态性及稳定性兼备的多肽杂化高分子纳米药物制备方法，其特征在于：
步骤S1中，所述超分子多肽自组装基元是具有β-折叠结构的氮端为不同碳链长度的脂肪酸修饰多肽序列，包括：谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酯、谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十烷基酯、谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-十八烷基酯、谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-棕榈酸酯、谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-月桂酸酯、谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-二十二烷基酯、谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-二十烷基酯、谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-月桂酸酯、谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-十八烷基酸酯、谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-棕榈酸酯和谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-月桂酸酯；
所述可进行光催化拓扑聚合的共价自组装基元前体是具有β-折叠结构的氮端为含有丁二炔结构的脂肪酸修饰多肽序列，包括：谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-10,12-二十五二炔酸酯和谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-10,12-二十五二炔酸酯；
所述具有药物治疗功能的非共价超分子多肽自组装基元是β-折叠结构的氮端为不同碳链长度的脂肪酸修饰多肽序列经以下药物分别功能化的超分子基元，包括：吲哚美辛、乙酰水杨酸、甲氨蝶呤和苯丁酸氮芥功能化的赖氨酸-谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十二烷基酯、赖氨酸-谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-二十烷基酯、赖氨酸-谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-十八烷基酯、赖氨酸-谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-棕榈酸酯、赖氨酸-谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-月桂酸酯、赖氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-二十二烷基酯、赖氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-二十烷基酯、赖氨酸-谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-月桂酸酯、赖氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-十八烷基酸酯、赖氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-棕榈酸酯和赖氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-缬氨酸-缬氨酸-月桂酸酯；
所述步骤S2中，共价多肽自组装基元和非共价多肽自组装基元共组装的物质的量为99:1到1:99，具有药物治疗功能的非共价多肽自组装基元占上述共价多肽自组装基元和非共价多肽自组装基元总的摩尔数的比例在0.1％到10％之间；所述自组装溶液的物质的量浓度在0.1微摩尔每升到5000微摩尔每升；所述自组装溶液的退火温度在10-100℃之间，所述的退火时间为0.1-100小时，所述的溶剂为有机溶剂或水，所述的有机溶剂包括乙醇、异丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲亚砜和二甲基甲酰胺中的一种或几种；所述水为超纯水、去离子水或Milli-Q水；
所述步骤S3中，进行光催化拓扑聚合的光波长在200-380纳米之间，反应体系所在温度范围为0-100℃之间，所述的反应时间为0.1-100小时。
3.权利要求1或2所述方法制备得到的动态性及稳定性兼备的多肽杂化高分子纳米药物。
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