CN109355238A - 一种阴沟肠杆菌株及其在降解褐藻中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及海藻废物资源利用领域，具体地说是一种阴沟肠杆菌株及其在降解褐藻中的应用。所述阴沟肠杆菌株按1%‑5%的接种量接种于褐藻中，在28‑32℃，pH为7‑11，搅拌转速180‑240 rpm，通气量为0.1‑0.4 VVM条件下发酵培养即可实现对褐藻的降解。本发明发酵过程稳定可控，发酵周期短，产物功效显著，适于规模化生产。

Description

一种阴沟肠杆菌株及其在降解褐藻中的应用
技术领域
本发明涉及海藻废物资源利用领域，具体地说是一种阴沟肠杆菌株及其在降解褐藻中的应用。
背景技术
褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸及其C5差向异构体α-L-古洛糖醛酸聚合而成的线性高分子多糖。褐藻胶裂解酶通过β消去机制能将褐藻胶降解成具有独特生物活性的褐藻寡糖。褐藻寡糖因具有独特的生理活性如促进生长、增强植物抗性、抑菌等而日益受到人们的关注。
目前海藻的工业需求量不断增加，而海藻多糖的利用率却一直不高，致使海藻废物的数量一直增加，海藻废物的主要成分是褐藻胶，褐藻胶是大分子物质，结构复杂，难以降解，致使海藻废弃物难以回收处理，利用褐藻胶裂解酶将海藻废弃物中的大分子褐藻胶降解为具有高附加价值的小分子褐藻胶寡糖，不仅解决了废物污染难以回收的问题又能够释放有机质，促进海洋有机质的循环。
褐藻寡糖的用途比较广泛，可以作为饲料添加剂应用在饲料领域，相比于传统的添加剂，褐藻寡糖具有能改变动物消化道微生物菌相、提高动物日增重、增加饲料转化率等优点，进而将海藻废物资源化利用将成为现阶段主要的严峻问题。
发明内容
本发明目的在于解决现阶段海藻废物资源化利用的问题，进而提供一种阴沟肠杆菌株及其在降解褐藻中的应用。
本发明采用的技术方案是：
一种阴沟肠杆菌株，阴沟肠杆菌株(Enterobacter cloacae) TW16已于2018年07月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为：CGMCC No.16119。
所述菌株于海水培养基中-80℃下保存。
所述阴沟肠杆菌株在降解褐藻中的应用。
具体为，所述阴沟肠杆菌株按1 %-5 %的接种量接种于褐藻中，在28-32℃，pH为7-11，搅拌转速180-240 rpm，通气量为0.1-0.4 VVM的条件下发酵培养即可实现对褐藻的降解。
一种利用所述阴沟肠杆菌株生产寡糖的方法，将所述阴沟肠杆菌株按照1 %-5 %的接种量接种于褐藻中发酵培养即可实现对褐藻的降解，获得褐藻寡糖。
所述阴沟肠杆菌株按1 %-5%的接种量接种于褐藻中，在28-32℃，pH为7-11，搅拌转速180-240rpm，通气量为0.1-0.4 VVM的条件下发酵培养即可获得褐藻寡糖。
所述发酵培养时间为6-10小时。
本发明所具有的优点：本发明菌株性能稳定，在规模化生产过程中，性能优越，发酵过程稳定可控，发酵周期短，适于规模化生产。
附图说明
图1为本发明实施例提供的褐藻胶裂解酶产生菌TW 16 菌株5 L发酵罐发酵曲线。
图2为还原糖浓度随时间的变化曲线。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
实施例1、阴沟肠杆菌株的分离筛选及鉴定
解淀粉芽孢杆菌SY-SF-01，由黄海采集的腐烂海带中分离获得。
分离方法：取黄海采集的腐烂海带进行分离，通过透明圈法和CuSO4法，筛选出能够生产褐藻胶裂解酶的菌株。并反复诱导，选取产酶活性最好的一株菌株获得纯系菌株。
筛选方法：
取黄海采摘回来的腐烂海带样品，使用研钵将其研碎制成样品液，取一定量按照梯度稀释五个梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5五个梯度），每个梯度选取100 μL，涂布于以海藻酸钠为唯一碳源的选择性固体培养基平板上，30 ℃下恒温培养48 h，待平板长出菌落后，依据单菌落周围形成透明圈的大小，判断菌株降解褐藻胶能力大小。
将上述降解能力强的菌株按照现有方式进一步分离纯化，而后将得到的产褐藻胶裂解酶的菌株接种海藻酸钠为唯一碳源的选择性固体培养基中，30℃摇床200 rpm发酵1天。使用硫酸铜法和TLC法初步判断菌株降解褐藻酸钠的活性，所得菌株保藏命名为TW16。所述菌株于海水培养基中-80 ℃下保存。
所述海藻酸钠为唯一碳源的选择性固体培养基(ALG培养基)为海藻酸钠2-10 g、（NH4）2SO4 2-10g、MgSO4 1-5g，K2HPO4 1-5 g，琼脂15-25 g，加去离子水至1000 mL，pH 7.2-7.4。
鉴定方法
将上述获得菌株进行测序，获得菌株的16S rDNA序列后，运用NCBI中的Blast程序与数据库中的细菌16S rDNA序列进行相似性比对，并用 MEGA 5.1 软件构建(Neighbor -Joining)系统发育树，分析各菌株的进化关系，确定细菌种类，即可确认为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae) TW16；而后将其于2018年07月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为：CGMCC No.16119。
实施例2 阴沟肠杆菌株在降解褐藻胶中（5 L发酵）的效果
将阴沟肠杆菌株(Enterobacter cloacae) TW16按2%的接种量接种于海水培养基中在30 ℃摇床200 rpm发酵1 d，获得种子液。
海水培养基：海水蛋白胨2-10 g、酵母浸粉5-15 g、琼脂15-25 g，加海水至1000mL，pH 7.2-7.4。
取上述种子液按照2%的接种量接种至5 L 的ALG培养基，而后在温度30℃，pH为7.4，通气量为0.1 VVM条件下培养，所述培养过程做3组平行实验，同时取相同时间下三次试验的平均值，采用吸光度法测量菌株的褐藻寡糖降解能力（参见图1）。
由图1 中OD235值为发酵液稀释5倍后的测量结果可见，菌株在9 h左右发酵所得的褐藻寡糖浓度达到最大，并随着发酵时间延长，其产生的褐藻寡糖被迅速利用，经过计算测量9 h的发酵液中褐藻寡糖含量约为0.28 g/L。
实施例3
与实施例2不同之处在于：
将种子液按照10%接种至5 L 的ALG培养基中，而后在温度30 ℃，通气量为0.2 VVM条件下发酵,并且控制发酵过程中pH值维持在7.0，培养至24 h。所述培养过程中在10 h左右发酵所得的褐藻寡糖浓度达到最大，发酵10小时测定寡糖含量约为0.25 g/L。
实施例4
与实施例3不同之处在于：
将种子液按照10%接种至30 L 的ALG培养基中，而后在温度30 ℃，转速200 rpm，通气量为0.2 VVM条件下发酵,并且控制发酵过程中pH值维持在7.0，培养至24 h。所述培养过程中在48 h左右发酵所得的还原糖浓度达到最大，发酵48小时测定还原糖含量约为0.31 g/L。
由图2可见在 30 L发酵过程中，菌株在48 h左右发酵所得的还原糖浓度达到最大，并随着发酵时间延长，其产生的褐藻寡糖被迅速利用，经过计算测量48 h的发酵液中褐藻寡糖含量约为0.31 g/L。

Claims (6)

1.一种阴沟肠杆菌株，其特征在于：该菌株(Enterobacter cloacae)已于2018年7月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCCNo.16119。
2.一种按权利要求1所述的阴沟肠杆菌株在降解褐藻中的应用。
3.按权利要求2所述的阴沟肠杆菌株在降解褐藻中的应用，其特征在于：所述阴沟肠杆菌株按1%-5%的接种量接种于褐藻中，在28-32 ℃，pH为7-11，搅拌转速180-240 rpm，通气量为0.1-0.4 VVM的条件下发酵培养。
4.一种利用权利要求1所述的阴沟肠杆菌株生产寡糖的方法，其特征在于：所述菌株按照1%-5%的接种量接种于褐藻中发酵培养，实现对褐藻的降解，获得褐藻寡糖。
5.按权利要求4所述的方法，其特征在于：所述阴沟肠杆菌株按1%-5%的接种量接种于褐藻中，在28-32 ℃，pH为7-11，搅拌转速180-240 rpm，通气量为0.1-0.4 VVM的条件下发酵培养，获得褐藻寡糖。
6.按权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述发酵时间为6-10小时。
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