CN109342662A - 落叶木本植物铅耐性的无损评价方法 - Google Patents

落叶木本植物铅耐性的无损评价方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种耐铅胁迫落叶木本植物的快速无损筛选方法，其特征在于包括如下步骤：(1)盆栽土壤准备；(2)盆栽土壤铅污染处理；(3)盆栽落叶木本植物的光合测定；(4)盆栽土壤铅含量测定；(5)落叶木本植物铅耐性的无损评价。本发明方法实现了在不破坏植物生长的条件下，对落叶木本植物铅耐受性的快速、无损、高效的评价，方法简单，准确性高。

Description

落叶木本植物铅耐性的无损评价方法
技术领域
本发明属于耐铅胁迫植物筛选技术领域，具体涉及一种落叶木本植物铅耐性的无损评价方法。
背景技术
铅是世界卫生组织鉴定的毒性极高的神经毒物，严重危害人体健康，有色金属矿的开采和冶炼是其进入生物圈的重要途径。据统计，我国矿区周边严重污染土中铅含量最高可达5000mg·kg-1，远超一级土壤环境标准所规定的35mg·kg-1。土壤中的铅能被植物吸收，再通过食物链的富集作用，迁移到动物、人体内，严重影响人类和其它生物的健康和生命。因此对铅污染土壤的治理和修复，是十分紧迫的任务。
植物修复是重金属污染环境治理的重要手段之一。实践过程中，采用植物修复技术治理重金属污染土壤去除重金属的同时也需要恢复植被与景观，有效地降低水土流失，控制重金属污染扩散对周边环境的影响。木本植物由于生物量大、根系扩展范围大，具有一定的富集重金属能力而受到青睐。因此筛选耐重金属胁迫木本植物的研究具有非常重要的意义。传统的研究方法常借助于野外采样或室内盆栽，通过对土壤和植物体内重金属含量、植物根系生长等植物耐性指标的离体化学分析获取植物耐受性的信息。传统研究方法中生长的植物遭受破坏，而且还耗时、费力、花费大。
植物光合过程对环境变化非常敏感，植物叶绿素荧光和光合作用被广泛应用于反映植物受环境胁迫和危害情况。前人将激光诱导植物荧光的方法主要用于生物因素(水分、光照、养分、温度等)对植物的胁迫，对重金属胁迫研究大都是定性的，有关定量的是对植物叶片重金属含量联系起来的。然而，铅是一种非生物性元素，植物吸收的铅绝大部分积累于根部，转移到茎叶的很少，而且不同植物种类(包括不同基因型)对铅的积累量不同，受胁迫程度也不一样。铅积累在根部，会对根吸收水分和养分产生影响，导致植物光合发生明显变化，那么，通过植物叶绿素荧光和光合速率相结合与土壤铅含量联系起来或许能反映植物耐受程度。
综上所述，传统研究方法存在耗时、费力、难以动态监测的问题，目前采用的激光诱导方法反映重金属胁迫的研究大都是定性，少数定量的方法通过植物叶片重金属含量与荧光强度比值关系来反映植物危害，对于铅这种难以在体内转运的重金属，很难通过现有的技术来反映植物胁迫程度。植物光合过程对环境变化非常敏感，叶绿素荧光与光合作用中各个反应过程紧密相关，因此任何逆境对光合作用各过程产生的影响都可以通过气体交换和叶绿素荧光技术反映出来。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种落叶木本植物铅耐性的无损评价方法，其实现了在不破坏植物生长的条件下，对落叶木本植物铅耐受性的快速、无损、高效的评价，方法简单，准确性高。
本发明的技术方案如下。
一种落叶木本植物铅耐性的无损评价方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)盆栽土壤准备
取无重金属污染史的红壤，自然风干数日后过筛，除去其中碎石、树根等杂物，即得盆栽土壤备用；
(2)盆栽土壤铅污染处理
将待评价铅耐受性的每个品种落叶木本植物种植于盆栽土壤中，当落叶木本植物度过缓苗期后，以不加重金属为对照，设计不同铅污染浓度梯度分别对每个品种落叶木本植物的每盆盆栽土壤进行铅污染处理；
(3)盆栽落叶木本植物的光合测定
铅污染处理10～20天后，取对照和不同浓度梯度铅污染处理的每盆落叶木本植物的长势一致、完全舒展的未受损叶片，测定其最大光化学效率Fv/Fm和净光合速率Pn；
(4)盆栽土壤铅含量测定
光合测定完成后，采集土壤样品，检测盆栽土壤铅含量；
(5)落叶木本植物铅耐性的无损评价
根据步骤(3)和步骤(4)的测定结果，构建每个品种落叶木本植物“盆栽土壤铅含量-Fv/Fm”和“盆栽土壤铅含量-Pn”的抛物线拟合方程；通过抛物线拟合方程分别求得每个品种落叶木本植物Fv/Fm、Pn的最大值，分别记为maxFv/Fm，maxPn；该最大值表示该植物在最大净光合速率和光化学活性上的潜在能力，最大程度地排除了叶片异质性影响而造成的数据失真，比起通常通过测定无污染处理组植物的所得到的值更准确的反映了叶片光合的性能；
根据每个品种落叶木本植物抛物线拟合方程求得的maxFv/Fm、maxPn及步骤(3)、步骤(4)相同铅污染浓度下实测的Fv/Fm、Pn，按下式求得相同铅污染浓度下每个品种落叶木本植物的最大光化学效率的下降率、净光合速率的下降率和总下降率：
F(Fv/Fm)＝(maxFv/Fm－Fv/Fm)/maxFv/Fm，
F(Pn)＝(maxPn－Pn)/maxPn，
F＝F(Fv/Fm)+F(Pn)＝(maxFv/Fm－Fv/Fm)/maxFv/Fm+(maxPn－Pn)/maxPn，
其中，F(Fv/Fm)为最大光化学效率的下降率，F(Pn)为净光合速率的下降率，F为总下降率，即可通过总下降率F值来评价、比较不同品种落叶木本植物的铅耐受性的强弱，下降率F值越大落叶木本植物的铅胁迫耐受性越弱，总下降率F值越小落叶木本植物的铅胁迫耐受性越强；
将相同铅污染浓度下的不同品种落叶木本植物的总下降率F值与植物对重金属的耐性指数TI进行相关性分析发现，不同品种落叶木本植物的F值与耐性指数TI呈负相关，即F值越大表明该植物对铅耐受性越弱，即F值越小表明该植物对铅耐受性越强。
作为优选技术方案，所述步骤(3)中采用便携式叶绿素荧光仪测定叶片的最大光化学效率Fv/Fm，采用便携式光合仪测定叶片的净光合速率Pn。
作为优选技术方案，所述步骤(3)中最大光化学效率Fv/Fm的测定时间段为上午8:30～11:30，测定前用叶夹进行40～60min的暗适应。
作为优选技术方案，所述步骤(3)中采用便携式光合仪器测定叶片的Pn值时设定光强范围为1000μmol·m-2·s-1～1200μmol·m-2·s-1、叶室温度范围为25～30℃、叶室湿度为30％～40％、测定时间段为上午9:30～11:30。
作为优选技术方案，所述步骤(3)中每株落叶木本植物选取5～10片完全舒展、成熟的未受损叶片测定其最大光化学效率Fv/Fm和净光合速率Pn。
本发明的优点在于：与传统通过田间样品采集、实验室化学分析相比，本发明通过叶绿素荧光参数和光合参数的快速测定，能在不破坏植物生长的条件下，对落叶木本植物铅耐受性的快速、无损、高效的评价，方法简单，准确性高。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的说明，需要指出的是以下实施方式仅是以例举的形式对本发明所做的解释性说明，但本发明的保护范围并不仅限于此，所有本领域的技术人员以本发明的精神对本发明所做的等效的替换均落入本发明的保护范围。
实施例1
榉树、栾树、毛红椿三种落叶木本植物的铅耐性无损评价方法，其包括如下步骤：
1.盆栽土壤准备
采取表层20cm的无重金属污染史红壤，自然风干数日后过5×5mm筛，除去其中碎石、树根等杂物。供试盆栽土壤的理化性质如下表：
表1供试盆栽土壤的理化性质
pH 总N含量(g·kg<sup>-1</sup>) 总有机碳含量(g·kg<sup>-1</sup>) 总P含量(g·kg<sup>-1</sup>) 总Pb含量(g·kg<sup>-1</sup>)
5.17 0.24 12.13 0.16 0.02
2.盆栽土壤铅污染处理
于每个种植盆中装盆栽土壤9kg，将榉树、栾树、毛红椿三种落叶木本植物种植于盆栽土壤中，待落叶木本植物度过缓苗期后，以不加重金属为对照，设计不同浓度梯度分别对榉树、栾树、毛红椿的每盆盆栽土壤进行铅污染处理；即将PbCl2分析纯试剂折合成每盆土中所需PbCl2的量，设置3个浓度梯度(以纯金属质量计算)，分别为500mg·kg-1(L1)、600mg·kg-1(L2)、900mg·kg-1(L3)，以不加重金属为对照(CK)，将PbCl2配成水溶液，按比例一次性均匀喷施到盆栽土壤中(未喷洒到植物表面且没有渗出液)。
3.盆栽落叶木本植物的光合测定
铅污染处理10～20天后，取对照和不同浓度梯度铅污染处理的每盆落叶木本植物的长势一致、完全舒展的未受损叶片，测定其最大光化学效率Fv/Fm和净光合速率Pn，具体如下：
(1)采用便携式叶绿素荧光仪，每盆选取5～10片长势一致、完全舒展的未受损叶片进行叶绿素荧光测定，测定时间为上午8:30～11:30，测定前用叶夹进行40min的暗适应，即测得Fv/Fm；
(2)采用便携式光合仪，选取叶片方法同上，测定时间为上午9:30-11:00，设定光强为1000μmol·m-2·s-1，叶室温度为25℃，叶室湿度为40％，即测得Pn。
4.盆栽土壤铅含量测定
光合测定完成后，采集土壤样品，依次经过风干、研磨、消煮、定容处理后制成液体，采用电感耦合等离子体质谱仪器检测盆栽土壤的铅含量；
5.铅耐性的无损评价
根据步骤3和步骤4的测定结果，分别构建榉树、栾树、毛红椿的“土壤铅含量-植物叶片Fv/Fm”和“土壤铅含量-植物叶片Pn值”的抛物线拟合方程，并计算求得榉树、栾树、毛红椿的maxFv/Fm，maxPn，具体见表2；
表2抛物线拟合方程
将相同铅污染浓度下的榉树、栾树、毛红椿实测Fv/Fm和Pn值依次代入公式F(Fv/Fm)＝(maxFv/Fm－Fv/Fm)/maxFv/Fm，F(Pn)＝(maxPn－Pn)/maxPn中，求得它们的最大光化学效率和净光合速率的下降率，并计算总下降率F＝F(Fv/Fm)+F(Pn)，据此可以根据总下降率F来评价和比较榉树、栾树、毛红椿三种落叶木本植物的铅胁迫耐受性强弱；同时，采用传统实验方法计算铅胁迫下植物耐性指数TI，并对相同铅污染浓度下，三个品种落叶木本植物(榉树、栾树、毛红椿)的总下降率F和植物耐性指数TI进行相关性分析，结果见表3；
植物耐性指数TI的具体测定方法如下：铅污染处理10～20天后，分别将3种树种破坏性取样。将植物根部取出，清除根部土壤，自来水冲洗后放置在烘箱中，设置温度为80℃烘干至恒重。TI＝100×重金属处理下的根重/对照组的根重。
表3总下降率F值和植物耐性指数TI及相关性分析结果
a当在任意梯度下，Fv/Fm和Pn的实测值大于各自的最大值时，表明该树种在当前浓度梯度下有较强的耐性。
b**表示在0.01水平上显著相关。
由表3可知，榉树、栾树、毛红椿的总下降率F与植物耐性指数TI均呈较好的负相关，即总下降率F值越大表明该植物对铅耐受性越弱，F值越小表明该植物对铅耐受性越强，因此可以用总下降率F值来作为评价落叶木本植物铅胁迫耐受性的指标；由表1可知，对于榉树，栾树，毛红椿三种落叶木本植物，在相同铅污染浓度下，他们的总下降率F从大至小依次为：毛红椿、栾树、榉树，因此它们的铅耐受性从强至弱依次为：榉树、栾树、毛红椿。本发明与传统实验室分析测试来估算木本植物对重金属铅的耐性，不仅结果一致，同时省时、无损和便捷。
实施例2
为验证本发明方法的稳定性和在野外检测的适用性，本实施例采用本发明方法对野外落叶木本植物的铅耐性进行了评价。
于2017年5月至9月在浏阳硫铁矿、宁乡锰矿、株洲攸县铁矿、湘潭锰矿4地选取落叶木本植物用便携式叶绿素荧光仪和光合测定仪进行测定，所得监测数据，计算出总下降率F值，同时采集土壤样品，回实验室进行铅含量分析。从表4结果来看，总下降率F值的趋势与耐性指数的趋势呈现负相关性，但是有的相关性指数没有达到显著性，这是因为野外重金属污染不是单纯的铅污染，是复合污染。总之，结果表明，本发明能比较准确评估落叶木本植物对重金属铅的耐受性，同时稳定性较高。
表4利用本发明方法对野外落叶木本植物铅耐性的无损评价结果

Claims (5)

1.一种落叶木本植物铅耐性的无损评价方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)盆栽土壤准备
取无重金属污染史的红壤，自然风干数日后过筛，除去其中碎石、树根等杂物，即得盆栽土壤备用；
(2)盆栽土壤铅污染处理
将待评价铅耐受性的每个品种落叶木本植物种植于盆栽土壤中，当落叶木本植物度过缓苗期后，以不加重金属为对照，设计不同铅污染浓度梯度分别对每个品种落叶木本植物的每盆盆栽土壤进行铅污染处理；
(3)盆栽落叶木本植物的光合测定
铅污染处理10～20天后，取对照和不同浓度梯度铅污染处理的每盆落叶木本植物的长势一致、完全舒展的未受损叶片，测定其最大光化学效率Fv/Fm和净光合速率Pn；
(4)盆栽土壤铅含量测定
光合测定完成后，采集土壤样品，检测盆栽土壤铅含量；
(5)落叶木本植物铅耐性的无损评价
根据步骤(3)和步骤(4)的测定结果，构建每个品种落叶木本植物“盆栽土壤铅含量-Fv/Fm”和“盆栽土壤铅含量-Pn”的抛物线拟合方程；通过抛物线拟合方程分别求得每个品种落叶木本植物Fv/Fm、Pn的最大值，分别记为maxFv/Fm，maxPn；
根据每个品种落叶木本植物抛物线拟合方程求得的maxFv/Fm、maxPn及步骤(3)、步骤(4)相同铅污染浓度下实测的Fv/Fm、Pn，按下式求得相同铅污染浓度下每个品种落叶木本植物的最大光化学效率的下降率、净光合速率的下降率和总下降率：
F(Fv/Fm)＝(maxFv/Fm－Fv/Fm)/maxFv/Fm，
F(Pn)＝(maxPn－Pn)/maxPn，
F＝F(Fv/Fm)+F(Pn)＝(maxFv/Fm－Fv/Fm)/maxFv/Fm+(maxPn－Pn)/maxPn，
其中，F(Fv/Fm)为最大光化学效率的下降率，F(Pn)为净光合速率的下降率，F为总下降率，即可通过总下降率F值来评价、比较不同品种落叶木本植物的铅耐受性的强弱，总下降率F值越大落叶木本植物的铅胁迫耐受性越弱，总下降率F值越小落叶木本植物的铅胁迫耐受性越强。
2.根据权利要求1所述的一种耐铅胁迫落叶木本植物的快速无损筛选方法，其特征在于，所述步骤(3)中采用便携式叶绿素荧光仪测定叶片的最大光化学效率Fv/Fm，采用便携式光合仪测定叶片的净光合速率Pn。
3.根据权利要求2所述的一种耐铅胁迫落叶木本植物的快速无损筛选方法，其特征在于，所述步骤(3)中最大光化学效率Fv/Fm的测定时间段为上午8:30～11:30，测定前用叶夹进行40～60min的暗适应。
4.根据权利要求2所述的一种耐铅胁迫落叶木本植物的快速无损筛选方法，其特征在于，所述(3)中采用便携式光合仪测定叶片的Pn值时设定光强范围为1000μmol·m-2·s-1～1200μmol·m-2·s-1、叶室温度范围为25～30℃、叶室湿度为30％～40％、测定时间段为上午9:30～11:30。
5.根据权利要求1～4任一所述的一种耐铅胁迫落叶木本植物的快速无损筛选方法，其特征在于，所述(3)中每株落叶木本植物选取5～10片完全舒展、成熟的未受损叶片测定其最大光化学效率Fv/Fm和净光合速率Pn。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190215

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