CN104568887A

CN104568887A - 一种植物微域叶绿素荧光法测定重金属对植物胁迫的方法

Info

Publication number: CN104568887A
Application number: CN201510021373.1A
Authority: CN
Inventors: 成杰民; 胡光鲁
Original assignee: Shandong Normal University
Current assignee: Shandong Normal University
Priority date: 2015-01-16
Filing date: 2015-01-16
Publication date: 2015-04-29

Abstract

本发明属于重金属污染分析技术领域，涉及一种植物微域叶绿素荧光法测定重金属对植物胁迫的方法，先将植物叶片和石英玻璃片一同放在避光盒中，再取待测植物叶片的代表性部位，调节测定环境温度为20℃，在避光或红光条件下，选择氙灯作为植物荧光直接激发源，采用平行光源，记录光致发光强度；最后确定植物叶片受重金属胁迫或危害的表现量；其测定工艺简单，设计原理可靠，使用操作方便，测定准确率高，应用范围广，测定环境友好。

Description

一种植物微域叶绿素荧光法测定重金属对植物胁迫的方法

技术领域：

本发明属于重金属污染分析技术领域，涉及一种快速检测土壤中重金属对植物危害的方法，具体涉及一种采用植物新鲜叶片微域叶绿素荧光法快速检测土壤中重金属对植物胁迫的方法。

背景技术：

随着金属矿产资源的开采利用，重金属元素通过大气和污水灌溉进入农田，严重影响农作物产量和农产品品质，危及人体健康。因此，不论从食品安全和土壤环境管理角度、还是从污染土壤修复角度，重金属在土壤-植物系统中的迁移转化研究都是必不可少的。传统的研究方法是借助大量的盆栽实验和烦琐的化学分析来完成。即通过加入不同浓度的重金属模拟污染土壤，盆栽植物，然后通过对土壤和植物体内重金属的存在形态和含量等的化学分析获取研究信息。显而易见，传统的研究方法，不仅需要大量的盆栽实验获取大量的植物样本，而且生长的植物要遭到破坏。除此之外，还要进行耗时、费力、花费大的化学分析。因此，寻找一种简便、快速、有效、经济的测定方法，在不损害植物生长的条件下研究土壤植物系统中的重金属迁移转化动态，对于推动土壤环境化学研究的深入发展具有重大的理论意义和现实意义。

通常，植物通过短波刺激主要产生蓝(F440)、绿(F520)、红(F690)和远红外(F735)四个荧光谱带，当植物生长受到干旱、寒冷、光强度、病原侵害等胁迫时，发出植物荧光强度会减少，不同的谱带衰减差异往往与影响因素有关；当植物受到污染土壤中重金属的危害时，植物体内重金属含量往往会升高，破坏叶片的叶绿素结构并降低叶绿素含量。因此，植物叶绿素荧光可以用来直接反映植物受重金属的胁迫和危害情况，或许也能用来间接地反映引起植物荧光变化的重金属的量(植物吸收重金属的量)。短波激发源是该方法的关键，目前，用于激发植物叶绿素荧光的激发源是多种多样的，激发波长也各不相同，最多的是利用He-Ne激光源激发源，其激发波长为632.8nm；或氩离子激光器的激发波长为448nm等。由于以往所用的激发波长较长，能量较低，所以只能获得F450nm和690nm或690nm和735nm两个荧光波带，只能用F450/F690或F690/F735反映植物生理学胁迫程度(干旱、寒冷、光强度、病原侵害等)。

目前，已有研究成果使用He-Cd激光器激发波长为325nm，获得了450nm、690nm和735nm三个植物荧光波带，用F450/(F690+F735)比值直接反映植物受重金属胁迫和危害程度；以He-Cd激光器作为激发光源，激发植物叶绿素荧光，同时获得3个植物荧光波带，并用F450/(F690+F735)比值定量的反映植物受重金属胁迫程度的研究已由本申请人于2011年申请的201110198388.7号专利公开了相关的技术内容，但是He-Cd激光器激发波长为单一的325nm，虽能同时获得了450nm、690nm和735nm三个植物荧光波带，但实验条件要求较高，对禾本科植物叶片测定较为准确，对于茄果类叶片、阔叶树木叶片等，操作不当易带来较大的误差。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计一种不破坏植物生长、便于快速、准确、动态监测的激光诱导植物荧光测定土壤重金属对植物胁迫和危害的新方法，以新鲜植物叶片为检测对象，以氙灯为短波激发源，激发植物叶绿素荧光，获得450nm、690nm和735nm三个植物荧光波带；再以F450/(F690+F735)比值作为植物对重金属吸收的定量基础，在不损害植物生长的前提下，测定植物荧光，通过植物叶绿素荧光的衰减间接地反映植物受土壤中重金属的危害，以推动环境化学研究的深入发展和重金属污染植物的适时动态监测。以氙灯作为激发光源与以往的以He-Cd激光器激发波长为325nm作为激发光源相比，激发波长不是单一的，而是可调的，这样根据不同的植物叶片，可以通过微调激发光源的激发波长，实现获得较窄450nm、690nm和735nm三个植物荧光波带；再以峰值F450/(F690+F735)计算时，误差较小，使得该方法更广泛地应用于各类植物叶片的测定。

为了实现上述目的，本发明涉及的测定工艺步骤包括：

(1)待测植物样品的采集与预处理：先选择无明显伤害的植物叶片，用不锈钢剪刀剪下所需待测植物叶片部位，所采叶片面积应大于测定所需面积2倍以上，将待测植物叶片放在石英玻璃板上，用洗耳球吹去植物叶片表面浮土；若表面浮土过多，用软毛刷轻轻刷去浮土，或用湿纱布轻轻擦拭，不得用水冲洗；然后将植物叶片和石英玻璃片一同放在避光盒中待测；根据植物叶片性质不同，待测时间有不同，一般要求从采样到测试完毕，时间控制在30分钟至60分钟内，植物叶片含水率越高，其待测时间越短；

(2)激光诱导植物叶片荧光测定：先取待测植物叶片的代表性部位，分别剪下面积为1.0～2.0cm²的叶片，用酯胶基沿叶片边沿2个点至4个点固定在仪器固定支架上，不要触碰待测区域；调节测定环境温度为20℃，在避光或红光条件下，选择氙灯作为植物荧光直接激发源，采用平行光源，根据不同的植物叶片种类，激发波长在325nm范围内微调，光斑面积为0.5mm×0.5mm，激发出F450、F690、F735三个较窄的荧光波段，用350到800nm波长记录光致发光强度；

(3)检测结果表征：确定植物叶片受重金属胁迫或危害的表现量为A，其中A＝F450/(F690+F735)，式中的F450、F690和F735分别是荧光强度谱图在450nm，690nm和735nm处的峰高，计算出的A值越大，说明待测植物叶片受重金属的胁迫或危害越严重，实现对各类植物叶片受重金属危害的测定。

本发明在实施测定时，采集的植物叶片应严禁与易污染物质或环境接触，以防干扰测定准确度；若测定周期要求在30分钟内完成，而植物叶片量过大，分批在测定前采样，切忌大量采样放入冰箱保存，以避免叶片失水、冻伤和污染；测定不同的植物叶片时，光斑尽量避开植物的叶脉；激发波长的选定需参考F450、F690和F735荧光波带的峰型，尽量使峰型呈锐峰，以减少计算误差。

本发明与现有技术相比具有如下优点：一是植物荧光的激发源由现有技术的He-Cd激发源改为氙灯激发源，其光电参数一致性好，工作状态受外界影响小；具有高效的电光转换效率，可输出高能量的平行光，光功率50W，光功率密度^大；二是扩大了应用范围，由于现有技术的He-Cd激发源仅可测定禾本科植物叶片如黑麦草，而对于茄果类植物叶片往往获得的F450、F690和F735三个荧光波带峰型较钝，使计算误差较大；氙灯激发源的激发波可调，不同的植物均可得最优的450nm，690nm和735nm三个锐峰，计算结果误差最小；三是改进了测定方法和植物叶片表面浮土预处理方法，对所有植物叶片测定结果均无明显影响；其测定工艺简单，设计原理可靠，使用操作方便，测定准确率高，应用范围广，测定环境友好。

附图说明：

图1为本发明实现对植物叶片测定时的工艺流程框图。

具体实施方式：

下面通过实施例并结合附图对本发明做进一步描述。

实施例1：本实施例通过培养实验、盆栽实验、比较实验，在不破坏植物生长的条件下，以氙灯为激光源，系统地实施对不同的植物、不同重金属、不同土壤中激光诱导的植物荧光的光谱特征、定量方法和影响因素，具体的实施过程见图1；本实施例涉及氙灯激发光源的光谱特性、仪器操作条件确定，其氙灯激光源在波长325nm.，狭缝宽度0.05mm，激发光通过1/5m长的双单色仪(Oriel 77225)，用350到800nm波长记录光致发光强度。

实施例2：本实施例涉及不同重金属胁迫下不同植物叶片的光谱特征参数，以霍格兰营养液为水培营养液，分别加入0-10.0mg.L^-1的Cu²⁺(CuSO₄)、0-1.0mg.L^-1的Cd²⁺(CdCl₂)、0-10.0mg.L^-1的Zn²⁺(ZnSO₄)、0-10.0mg.L^-1的Pb²⁺(PbCl₂)，模拟重金属胁迫，种植不同植物，温室通气培养(25℃)，监控营养液的pH，测定不同植物、不同重金属胁迫下植物叶片的荧光光谱特征参数，确定仪器条件、方法的操作步骤、定量方法；不同浓度的Zn、Cu、Pb或Cd等胁迫下植物的荧光强度在450nm，690nm和735nm处均出现峰。690nm和750nm处的峰高随着重金属胁迫浓度的呈降低趋势，450nm处的峰高随着重金属浓度增加而增高。

实施例3：本实施例涉及利用三个荧光波带计算土壤中重金属的胁迫，为了寻找荧光强度与植物叶片对重金属的吸收之间的关系，利用三个峰的峰高分别计算出F450/F690,F450/F735，F690/F735和F450/(F690+F735)的比值；F450/F690,F450/F735和F450/(F690+F735)三个比值均随重金属胁迫浓度的增加而增加；如，F450/F690随Cd的浓度增加而增加；F450/F735随Cu的浓度增加而增加；只有F450/(F690+F735)比值在对实验所用叶片和重金属范围内，均为随重金属胁迫浓度的增加而增加；因此，通过A＝F450/(F690+F735)反映植物受重金属胁迫的程度，A值越大，受重金属胁迫越严重。

实施例4：本实施例涉及样品预处理方法对测定结果的影响；称取1.00kg过20目筛的土壤(风干土)于塑料钵中，分别加入0-400mg.kg^-1的Cu²⁺(CuSO₄)、0-20mg.kg^-1的Cd²⁺(CdCl₂)、0-400mg.kg^-1的Zn²⁺(ZnSO₄)或0-1000mg.kg^-1的Pb²⁺(PbCl₂)；在室内培养两个月，重金属在土壤中的各形态分配达平衡后，每钵施磷酸二氢钾0.3333g、尿素0.3477g。然后播种黑麦草(15株/钵)，温室内生长，培养过程中保持土壤水分在田间持水量的70％；激发源光斑避开叶脉后，样叶各部位的测试点的测定结果相对相差为1.58-3.36％；相同处理不同盆钵采样部位一致的样叶测定结果相对相差2.25-4.46％；除去叶片浮土的方法：用洗耳球吹测定结果相对相差1.25-4.66％；用软毛刷扫1.20-10.03％；用湿纱布擦1.45-15.58％；用水冲洗8.25-40.55％；相对相差控制在5％以内，故要求用洗耳球吹去植物叶片上的浮土。

实施例5：本实施例涉及对黄瓜叶片的具体测定工艺：

(1)待测植物样品的采集与预处理：先选择正常生长的黄瓜叶片，用洗耳球吹去叶面上浮土，用不锈钢剪刀剪下所需的黄瓜叶片，将黄瓜叶片放在石英玻璃板上，然后将黄瓜叶片和石英玻璃片一同放在避光盒中待测，其待测试时间少于30分钟；

(2)激光诱导植物叶片荧光的测定：先取待测黄瓜叶片的代表性部位，分别剪下面积为1×2cm²的叶片，用少量酯胶基沿叶片边沿4个点固定在仪器固定支架上，不要触碰待测区域；调节测定环境温度为20℃，避光或红光条件下，选择激发光源为氙灯激光，在波长325nm，狭缝宽度为0.05mm，激发光通过1/5m长的双单色仪(Oriel77225)，用350到800nm波长记录光致发光强度；

(3)检测结果计算确定：设定黄瓜叶片受重金属胁迫或危害的表现量为A，其中A＝F450/(F690+F735)，式中的F450、F690和F735分别是荧光强度谱图在440nm，680nm和730nm处的峰高，计算出的A值的大小，随着土壤中重金属Cd浓度从0-10mg.kg^-1，A_Cd值从0.1568-0.4997；A用以表征被检测黄瓜叶片受Cd的胁迫或危害的程度，实现对鲜黄瓜叶片受重金属危害的检测。

实施例6：本实施例以种植的小麦叶片为检测植物，先称取1.00kg过20目筛的土壤(风干土)于塑料钵中，分别加入0-150mg.kg^-1的Cu²⁺(CuSO₄)在室内培养两个月，重金属在土壤中的各形态分配达平衡后，每钵施磷酸二氢钾0.3333g、尿素0.3477g；然后播种小麦，温室内生长；培养过程中保持土壤水分在田间持水量70％；不同浓度的Cu胁迫下小麦叶片的荧光强度在450nm，690nm和735nm处均出现峰，这三个峰高和峰形均随着Cu胁迫浓度0-150mg.kg^-1的升高，690nm和735nm处的峰高呈降低趋势，而450nm处的峰高增高；其具体测定工艺参照实施例5进行。随着土壤中重金属Cu浓度从0-150mg.kg^-1，Cu的A值从0.1578-0.3605。

实施例7：本实施例选定冬青树叶为待测定植物，具体测定工艺可参照实施例5或6的步骤；因在校园直接采样，土壤未受污染，测得的A为0.1567；本实施例的具体测定植物还包括高粱或谷子类植物以及梧桐树等。

Claims

1.一种植物微域叶绿素荧光法测定重金属对植物胁迫的方法，其特征在于测定工艺步骤包括：

2.根据权利要求1所述植物微域叶绿素荧光法测定重金属对植物胁迫的方法，其特征在于采集的植物叶片严禁与易污染物质或环境接触，以防干扰测定准确度；若测定周期要求在30分钟内完成，而植物叶片量过大，分批在测定前采样，避免采样放入冰箱保存，以防止叶片失水、冻伤和污染；测定不同的植物叶片时，光斑要避开植物的叶脉；激发波长根据F450、F690和F735荧光波带的峰型确定，以减少计算误差。