CN109331218B

CN109331218B - 一种含抗菌成分小檗碱的止血微球及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109331218B
Application number: CN201811483221.3A
Authority: CN
Inventors: 叶飞; 金甲; 代凯丽; 王林; 张伦
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Gaolai Shanghai Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2018-12-05
Filing date: 2018-12-05
Publication date: 2021-08-10
Anticipated expiration: 2038-12-05
Also published as: CN109331218A

Abstract

本申请涉及一种含抗菌成分小檗碱的止血微球及其制备和应用，且止血剂可用于体内并能快速降解吸收。本发明采用一种海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、明胶和小檗碱为原料的复合抗菌止血微球材料，利用小檗碱的抗菌和粘附性特点，在使得材料获得抗菌性能的同时，其止血效果进一步加强。同时在止血后的模拟体液环境下，降解海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、明胶和小檗碱止血抗菌有效成分，从而起到止血材料在体内可快速降解吸收的效果。

Description

一种含抗菌成分小檗碱的止血微球及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种含抗菌成分小檗碱的止血微球及其制备方法和相关应用。

发明背景

伤口大量出血一直是病人手术和战争中的主要致死原因，快速有效的止血可以在关键时刻挽救病人生命，这在临床上具有重大意义。近年来，针对快速止血这一需求，市场上出现了各种各样的止血材料，主要包括沸石敷料、壳聚糖敷料、明胶海绵、氧化再生纤维素等，这些材料吸水倍率较高，可快速粘附伤口形成止血微环境。明胶海绵尽管可以迅速吸血溶胀，止血效果好，但在神经系统等神经元密集的地方要小心使用，否则会压迫神经，造成不可估量的危害。氧化再生纤维素在骨科手术中应谨慎使用，它可延迟骨痂的形成，还有形成囊肿的可能。因此以海藻酸钠、壳聚糖等为主要成分的新型止血材料正在蓬勃发展，众多实验结果表明，该类止血材料效果明显、副作用小、安全性高，是现代止血剂发展的一个热门方向。

随着抗生素滥用导致“超级细菌”的出现，出血伤口化脓性感染或者特异性细菌感染可能会导致破伤风、败血症、脓血症和毒血症，甚至出现感染性休克，这些都是造成死亡不可忽略的因素。因此，新型止血材料所具有的功效不仅要包括很强的凝血能力，还应具备抗菌抗感染的能力，从而减少病人由于术后感染、伤口化脓等因素造成的死亡。国内外研制的止血材料很多，其中也不乏有抗菌性能的产品，但是大部分产品是利用材料进行抗生素类药物的载药复合或是复合抗菌作用的锌、银、碘等抗菌粒子，这不但加重了细菌耐药性问题而且这些抗菌粒子不易被人体吸收降解且价格较贵，所以在应用上有一定的局限性。

中国专利201410384076.9公开了一种抗菌促愈合活性的复合止血粉及其制备方法，涉及一种以埃洛石纳米管负载溶菌酶并且复合了壳聚糖的止血粉剂材料。该种材料希望利用埃洛石和壳聚糖发挥无机、有机材料各自优点起到止血杀菌作用，但正如其所述埃洛石纳米管作为无机材料，主要成分为氧化硅、氧化铝以及少量其他金属氧化物，该类成分在体内很难被降解吸收，也不能被溶菌酶水解从而发挥协同作用，因此不宜作为止血粉剂用于体内止血。

中国专利CN201610526892.8公开了一种可吸收抗菌止血微球、制备方法及其应用，所述的可吸收抗菌止血微球包括羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、明胶和溶菌酶，对大出血创面快速止血，防止创面细菌感染；生物相容性好，可降解吸收，促进伤口愈合。该发明主要应用了溶菌酶的易降解特定结合其他成分形成可吸收抗菌止血微球，其提供的可选择和可替代方案较少，规模化应用对于产品原料的来源具有一定的局限性。

因此，受血小板在凝血中作用机制的启发，本发明将海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、明胶和小檗碱这四种天然生物质材料和天然产物通过复合交联反应来制备新型复合抗菌生物质止血微球。与传统的止血材料相比，微球是一种最近几年发展起来的新剂型，具有高紧致度以及优秀的堆积作用，可以较好的增加药物的稳定性，并使药物具有靶向作用及缓释功效。并且粉末状止血材料能够应用于任何深度或形状的伤口，当被喷射入伤口造成的开腔时，它会扩散并形成一个抑制血液流出的屏障，其高效的止血效率能够显著的提高患者存活率。羧甲基纤维素钠是壳聚糖的一种新的衍生物，壳聚糖是甲壳素经化学处理脱乙酰基后的产物，是一种天然的阳离子型的生物聚合物。壳聚糖具有众多生理活性，如止血、抗肿瘤、抗氧化、降脂、抗凝血，促进伤口愈合，提高免疫力等。同时，壳聚糖无刺激性、无抗原免疫性，并且具有良好的组织相容性，可以被动物体组织中的溶菌酶降解，生成能被机体完全吸收的无毒的天然代谢产物。羧甲基纤维素钠除了具有壳聚糖的一般优点性质外，还具有优良的水溶性和更快的生物降解性，因此比壳聚糖能应用到更多的领域。海藻酸钠是一种从天然褐藻中提取的聚阴离子多糖的钠盐，具有无毒性、生物相容性、生物降解性、生物黏附性以及胶凝特性。进入人体后不会参与机体代谢，在人体中最终降解为甘露糖和古罗糖，不被人体吸收，无毒副作用，可以通过尿液从人体中安全排除，可作为安全良好的制剂。明胶是由动物皮肤、骨、肌膜等结缔组织中的胶原部分降解而成，由于其结构与生物体组织结构相似，因此具有良好的生物相容性。明胶具有很强的亲水性，在与创面接触时，可以迅速吸收创面处的渗出液与血液。同时明胶也会自身膨胀，增大对创面的压力，能减缓患处的血液流速。此外明胶作为一种天然的高分子材料，降解产物易被吸收且不产生炎症反应。小檗碱是我国传统的中药材，有数百年的使用历史，抗菌谱广，体外对多种革兰阳性及阴性菌均具抑菌作用。其中对溶血性链球菌、金葡菌、霍乱弧菌、脑膜炎球菌、志贺痢疾杆菌、伤寒杆菌、白喉杆菌等有较强的抑制作用，低浓度时抑菌，高浓度时杀菌。对流感病毒、阿米巴原虫、钩端螺旋体、某些皮肤真菌也有一定抑制作用，同时其与青霉素、链霉素等并无交叉耐药性。

因此，本发明希望通过研制一种复合抗菌止血剂，且止血剂可用于体内并能快速降解吸收，在降解过程中释放抗菌成分小檗碱，起到防止伤口感染的目的。同时本发明利用小檗碱的抗菌和亲脂性特点，既起到抗菌作用同时在止血初期的体液环境下，利用小檗碱的亲脂性，使得材料快速粘附于创面加快止血，缩短出血时间。利用羧甲基纤维素钠和海藻酸钠均为聚多糖可被水解的性质，以及明胶为氨基酸多肽也可被水解的性质，从而起到止血材料在体内可快速降解吸收的效果。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种含抗菌成分小檗碱的止血微球：包括海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、明胶和小檗碱，对大出血创面快速止血，防止创面细菌感染；生物相容性好，可降解吸收，促进伤口愈合。

优选的，所述的海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、明胶和小檗碱的质量比为：1~5:0.1~1:0.01~0.05:0.01~0.5。

优选的，所述的海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、明胶和小檗碱的质量比为：1~3:0.1~1:0.01~0.05:0.01~0.5。

进一步优选的，所述的海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、明胶和小檗碱的质量比为：1~3:1:0.02~0.04:0.02~0.4，特别优选1.5:1:0.025:0.075-0.15。

优选的，所述微球的平均粒径1-100 μm，特别优选1-60 μm。

本发明的另一个目的在于，提供一种含抗菌成分小檗碱的止血微球的制备方法，具体包括如下步骤：

（1）基质溶液制备：将海藻酸钠、羧甲基纤维素钠和明胶分别加入按照质量体积比为10-100倍的蒸馏水中搅拌溶解，然后将三种溶液混合制成基质溶液。

（2）物料混合及乳化交联共聚：将制备的基质溶液加入到含分散剂的乳化剂中，强力搅拌，分散剂与基质溶液的体积比或质量比，ml/ml或g/g为1~30:10，乳化剂与基质溶液的体积比或质量比ml/ml或g/g，为0.1~3: 10；

（3）精制：待溶液分层后，弃去下层溶液，抽滤，将粗样用按照质量体积比为100-1000倍无水乙醇清洗3次，再用按照质量体积比为100-1000倍石油醚洗3次即可；将洗脱后的样品溶解于10 L 20%乙醇溶液，再加入小檗碱混匀，反应时间为1~12小时，反应完毕后，停止搅拌，出料，喷雾干燥和真空干燥；最后，密封包装，无菌处理得到制备止血微球；其中，海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、明胶和小檗碱的质量比为：1~5:0.1~1:0.01~0.05: 0.01~0.5。

所述的含抗菌成分小檗碱的止血微球的制备方法，优选的，海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、明胶和小檗碱的质量比为：1~3:0.1~1:0.01~0.05:0.01~0.5，进一步优选1~3:1:0.02~0.04:0.02~0.4，特别优选1.5:1:0.025:0.075-0.15。

所述的含抗菌成分小檗碱的止血微球的制备方法，优选的，步骤（5）中所述稀释液为蒸馏水或5%~20%的乙醇溶液。

所述的含抗菌成分小檗碱的止血微球的制备方法，优选的，步骤（5）中干燥后获得的所述微球的平均粒径为1-100 μm。

进一步优选的微球的平均粒径为1-60 μm。

本发明的另一个目的在于，提供一种含抗菌成分小檗碱的止血微球在制备止血材料中应用。

上述本发明提供的含抗菌成分小檗碱的止血微球所用的分散剂优选如下：不仅限于液体石蜡、大豆油、乙酸乙酯、乙醇、蓖麻油、甘油酯脂肪酸等，可以单独或混合适用于本发明。

上述本发明提供的含抗菌成分小檗碱的止血微球所用的乳化剂优选如下：不仅限于司班系列和吐温系列等，可以单独或混合适用于本发明。

上述本发明提供的含抗菌成分小檗碱的止血微球所用的交联剂优选如下：不仅限于甲醛、环氧氯丙烷、氯化钙、戊二醛、三氯氧磷、三偏磷酸钠等，可以单独或混合适用于本发明。

上述本发明的含抗菌成分小檗碱的止血微球，所述的洗涤剂优选为蒸馏水、乙酸乙酯、乙醇、丙酮、甲醇和石油醚中的一种以上。

上述本发明的含抗菌成分小檗碱的止血微球，所述的稀释剂优选为蒸馏水、乙酸乙酯、乙醇、丙酮、甲醇和石油醚等，可以单独或混合适用于本发明。

上述步骤（5）中微球干燥完成后，体积平均粒径1-100 μm，优选平均粒径1-60 μm.

本发明还公开了上述含抗菌成分小檗碱的止血微球在用于SD大鼠半截尾止血应用的效果。

本发明的作用机理为：含抗菌成分小檗碱的止血微球是一种干燥、无菌、具有微米和纳米孔径、球状的微粒，添加小檗碱作为抗菌成分，具有极强的吸水性能，通过浓缩血液的固形成分，提高血小板聚集、粘附，从而激活血小板发挥凝血作用，并激发纤维蛋白原形成蛋白纤维，加快了蛋白网形成止血塞的过程和稳定性，同时利用小檗碱提高材料粘性，加速材料堆积和缩短止血时间。体外降解实验表明，材料的降解迅速，在12小时内即完成降解。材料的抑菌实验表明，材料的抑菌效果明显；进行的动物实验表明，其止血迅速。

本发明含抗菌成分小檗碱的止血微球具有以下有益效果：1.本发明的止血材料止血时间短：一般1-2分钟完成止血；2.本发明的止血材料通过创造性的引用来源更广泛、成本更低的小檗碱，同时利用小檗碱亲脂性的特点，提高材料粘附性，加速伤口堆积和缩短止血时间；3.强效抑菌，防止伤口感染；4.使用方便：将止血粉喷洒于创面出血处即可；5.易储存，保存时间长；6.羧甲基纤维素钠、海藻酸钠和明胶可被水解的性质，以及小檗碱的小分子化合物易代谢特点，止血材料降解速度快。因此，复合抗菌可吸收止血微球将是一种理想的外科止血抗菌剂。

附图说明

附图1：实施例1止血微球产品扫描电镜图示意图；

附图2：实施例2止血微球产品扫描电镜图示意图；

附图3：实施例3止血微球产品扫描电镜图示意图；

附图4：实施例4止血微球产品扫描电镜图示意图；

附图5：实施例1-5产品对应溶胀结果图；

附图6：实施例1-5产品对应降解结果图。

实施例1

1、基质溶液制备：将15 g海藻酸钠、10 g羧甲基纤维素钠和0.25 g明胶分别加入到1000 m1、500 ml、500 ml水中搅拌溶解，然后将三种溶液混合制成基质溶液。

2、物料混合及乳化交联共聚：将2000 ml ddH₂O加入烧杯中，然后加入187.5 ml吐温80，快速搅拌5 min左右，加入基质溶液，继续乳化搅拌30 min。乳化后，缓慢滴加2%CaCl₂溶液10 ml，进行交联反应，滴加后，快速搅拌1 h。交联完成后，加入5000ml无水乙醇浸泡2 h。

3、精制：待溶液分层后，弃去下层溶液，抽滤，将粗样用1000 ml无水乙醇清洗3次，再用1000 ml石油醚洗3次即可。将洗脱后的样品溶解于10 L 20%乙醇溶液，再加入0.25 g小檗碱混匀，喷雾干燥制备止血微球，最后收集产品于烘箱60℃真空干燥，密封包装，无菌处理得到小檗碱止血微球材料（SSGCM-1B）。

实施例2

3、精制：待溶液分层后，弃去下层溶液，抽滤，将粗样用1000 ml无水乙醇清洗3次，再用1000 ml石油醚洗3次即可。将洗脱后的样品溶解于10 L 20%乙醇溶液，再加入0.75g小檗碱混匀，喷雾干燥制备止血微球，最后收集产品于烘箱60℃真空干燥，密封包装，无菌处理得到小檗碱止血微球材料（SSGCM-3B）。

实施例3

3、精制：待溶液分层后，弃去下层溶液，抽滤，将粗样用1000 ml无水乙醇清洗3次，再用1000 ml石油醚洗3次即可。将洗脱后的样品溶解于10 L 20%乙醇溶液，再加入1.5 g小檗碱混匀，喷雾干燥制备止血微球，最后收集产品于烘箱60℃真空干燥，密封包装，无菌处理得到小檗碱止血微球材料（SSGCM-6B）。

实施例4

3、精制：待溶液分层后，弃去下层溶液，抽滤，将粗样用1000 ml无水乙醇清洗3次，再用1000 ml石油醚洗3次即可。将洗脱后的样品溶解于10 L 20%乙醇溶液，再加入2 g小檗碱混匀，喷雾干燥制备止血微球，最后收集产品于烘箱60℃真空干燥，密封包装，无菌处理得到小檗碱止血微球材料（SSGCM-8B）。

实施例5

配比对照组制备：将15 g海藻酸钠、10 g羧甲基纤维素钠和0.25 g明胶和1.5 g小檗碱粉末混合均匀后，不作交联反应处理，进一步真空干燥、无菌处理后密封包装。

测试例

1）材料扫描电镜分析

对实施例1-4的产品进行扫描电镜观察，其电镜图扫描结果如说明书附图1-4所示。扫描电子显微镜 SEM 观察材料的表面形态，按使用说明，首先将材料喷金后固定在导电胶带上，然后选择在合适模式下进行扫描，观察分析材料的三维形貌。从图1中可见SSGCM-1B的形状为扁球状颗粒，直径大小不等，微球表面结构较粗糙，有的相互粘连，有利于材料粘附在出血伤口表面；同时材料内部展现出一定的空间弹性，便于吸血溶胀；从材料的形貌和结构来看，材料具有快速粘附伤口和吸血溶胀的特点。实施例2-4方案制备产品中小檗碱含量较高，使得微球较粘结，其空间弹性略有下降。

）溶胀率分析

目的对实施例1-4产品和阳性对照止血粉（CMPHP）进行吸水倍率检测实验

方法称量空EP管的质量（W，单位g），再取10 mg复合材料于EP管中，再称重（Wi，单位g）。加入2 ml PBS缓冲溶液，振荡摇匀。将其放在37℃水浴锅中，每隔不同时间段取出12000 rpm离心2 min，去上清留沉淀，沥干后称总重（Ws，单位g），直至材料完全溶胀，重量不再发生明显变化，溶胀率计算按照公式（一）：

。

实验结果如图5所示：从图5中的溶胀率结果可以看出四种材料在30 min后的溶胀率与CMPHP相差不大，其中SSGCM-6B在前30分钟内的最高吸水倍率可达3000%左右，其吸水溶胀效果明显强于其余材料。

）降解率分析

目的对实施例1-4的产品进行体外降解测试，实验结果如图6所示。

方法配制0.2% 溶菌酶溶液模拟体液环境；按照溶胀率测定时的步骤重新溶胀复合材料至最大后（15 min），离心去上清、称重（Ws，单位g）；加入1 ml新鲜的溶菌酶溶液后37℃水浴，每隔5 min，离心、称重（Wt，单位g）、去上清，重复以上步骤，直至材料完全降解，重量不再发生明显变化，体外降解率计算按照公式（二）：

。每组实验平行重复3次。

实验结果如图2所示，在降解率测定过程中，四种复合材料的最大降解时间为15min左右，并且在20 min时降解率已超过80%，可见四种材料降解非常迅速。经测定，在25min时，四种复合材料的降解率已达90%左右，其中SSGCM-6B在10 min后其降解速率明显高于其他产品，并且降解率达到最高水平，接近100%。而CMPHP的降解率仅为36%，其在1h处的降解率仅有60%左右，可见CMPHP降解较缓慢。每组实验平行重复3次。

）大鼠断尾止血模型分析

目的对实施例1-5进行大鼠断尾止血实验，评价含抗菌成分小檗碱的止血微球对大鼠半截尾的创面止血效果。

方法将SD大鼠随机分为空白对照组(无止血材料)、阳性对照组（CMPHP）、实施例1给药组、实施例2给药组、实施例3给药组和实施例4给药组，实施例5为配比对照组，每组6只（♂），水合氯醛腹腔注射麻醉，将大鼠尾巴剪去 1/2建立出血模型，使创面大小基本保持一致，立即将断尾创面伸入含有100 mg止血材料的EP管，用于大鼠尾部止血并收集血液，记录止血时间。每组实验平行重复6次。

结果实验结果如下表1：

表1 新型复合抗菌止血生物材料的SD大鼠断尾止血模型实验结果

组别	平均止血时间（s）
		空白对照组（无止血材料）	>720
阳性对照组（CMPHP）	154.33
		配比对照组	>700
实施例1给药组	383.25
		实施例2给药组	147.00
实施例3给药组	128.60
		实施例4给药组	132.50

实验结果表明平均止血时间：SSGCM-6B（128.60 s）< SSGCM-8B（132.50 s）<SSGCM-3B（147.00 s）< CMPHP（154.33 s）< SSGCM-1B（383.25 s）< 配比对照组（>700s） <空白对照（>720 s,不加止血材料），所以SSGCM-6B具有可缩短止血时间的效果，止血效果良好；从配比对照组与用药组实施例3（SSGCM-6B）的对比结果来看，本发明制备成的止血微球的结构，其产品最终形成微球结构对于提升产品性能具有明显协同作用。

）抑菌实验分析

目的对实施例3进行抑菌圈实验分析，评价含抗菌成分小檗碱的止血微球的抗菌活性。

方法在LB固体培养基中按菌液：培养基1：100加入金黄色葡萄球菌，倒平板。将灭过菌的滤纸片用打孔器制成每个为6 mm的直径相同的圆片，分别浸润在1 ml的 1 mg/mlAmp(胺苄青霉素溶液)、1 mg/ml小檗碱溶液、1 mg/ml的实施例3、10 mg/ml的实施例3和ddH₂O中；在超净台里，将制备好的培养基用记号笔在培养皿底部划线为4等分，并标记好每部分所对应的纸片型号；用镊子将纸片分别放入对应的区域，空白对照放于平板中央。将平板放置在37℃培养箱中培养12小时，观察并测量抑菌圈直径。

结果实验结果如下表2：

表2 抑菌圈直径测量记录表

<i></i>	Amp	1mg/ml小檗碱	1mg/ml 实施例3	10mg/ml 实施例3	空白对照
						D<sub>1</sub>/mm	23	26	16	24	6
D<sub>2</sub>/mm	28	29	17	22	6

按照下式计算抑菌带宽度：H=（D-d）/2

D₁为第一次测试金黄色葡萄球菌抑菌圈直径，D₂第二次测试金黄色葡萄球菌抑菌圈直径，d为滤纸片直径= 6 mm，根据表1计算出1、2、3、4四种小纸片对金黄色葡萄球菌形成的平均抑菌带宽度分别为19.5 mm、21.5 mm、10.5 mm和17.0 mm > 1 mm，这表明四种小纸片均有良好的抑菌效果。3、4号纸片浸润不同浓度止血材料，因而本产品止血微球也具有良好的抗菌效果。

Claims

1.一种含抗菌成分小檗碱的止血微球，包括海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、明胶和小檗碱，所述的海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、明胶和小檗碱的质量比为：1~5:0.1~1:0.01~0.05:0.01~0.5。

2.如权利要求1所述的含抗菌成分小檗碱的止血微球，所述的海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、明胶和小檗碱的质量比为：1~3:0.1~1:0.01~0.05:0.01~0.5。

3.如权利要求2所述的含抗菌成分小檗碱的止血微球，其特征在于，所述微球的平均粒径1-100 μm。

4.如权利要求3所述的含抗菌成分小檗碱的止血微球，其特征在于，所述微球的平均粒径1-60 μm。

5.一种含抗菌成分小檗碱的止血微球的制备方法，其特征在于具体包括如下步骤：

（1）基质溶液制备：将海藻酸钠、羧甲基纤维素钠和明胶分别加入按照质量体积比为10-100倍的蒸馏水中搅拌溶解，然后将三种溶液混合制成基质溶液；

（3）精制：待溶液分层后，弃去下层溶液，抽滤，将粗样用按照质量体积比为10-100倍无水乙醇清洗3次，再用按照质量体积比为10-100倍石油醚洗3次即可；将洗脱后的样品溶解于10 L 20%乙醇溶液，再加入小檗碱混匀，反应时间为1~12小时，反应完毕后，停止搅拌，出料，喷雾干燥和真空干燥；最后，密封包装，无菌处理得到制备止血微球；其中，海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、明胶和小檗碱的质量比为：1~5:0.1~1:0.01~0.05: 0.01~0.5。

6.如权利要求5所述的含抗菌成分小檗碱的止血微球的制备方法，其特征在于，海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、明胶和小檗碱的质量比为：1~3:0.1~1:0.01~0.05:0.01~0.05。

7.如权利要求1-4中任一项所述的含抗菌成分小檗碱的止血微球在制备止血材料中应用。