CN109329656A - 一种提高高脂胁迫下海鲈肝脏线粒体功能的饲料添加剂及其制备方法与应用、海鲈饲料 - Google Patents

一种提高高脂胁迫下海鲈肝脏线粒体功能的饲料添加剂及其制备方法与应用、海鲈饲料 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种提高高脂胁迫下海鲈肝脏线粒体功能的饲料添加剂及其制备方法与应用、海鲈饲料，属饲料领域。每100重量份的饲料添加剂包括10‑20重量份的乌桕树皮提取物、10‑20重量份的藤茶提取物、5‑15重量份的水飞蓟素、8‑16重量份的竹荪多糖螯合锌、6‑12重量份的蛋氨酸螯合铁及4‑8重量份的生物素，余量为载体。该饲料添加剂不仅能提高海鲈线粒体生成，促进线粒体的再生，增强线粒体呼吸链活性，同时还能提高肝脏线粒体的抗氧化能力，减少线粒体氧化损伤，并具有降脂的作用。其制备方法简单，饲料稳定性好，具有良好的应用前景。将上述饲料添加剂应用于制备海鲈饲料，可提高高脂胁迫下海鲈肝脏线粒体功能。

Description

一种提高高脂胁迫下海鲈肝脏线粒体功能的饲料添加剂及其 制备方法与应用、海鲈饲料
技术领域
本发明涉及饲料领域，且特别涉及一种提高高脂胁迫下海鲈肝脏线粒体功能的饲料添加剂及其制备方法与应用、海鲈饲料。
背景技术
海鲈是一种肉食性鱼类，因其具有生长速度快以及肉质鲜美等优点，已在我国广泛养殖。近年来，高脂饲料因其可节约蛋白质，降低饲料成本以及减少氨氮排放等成为海鲈饲料研究和生产的趋势。但高脂饲料会诱发鱼体发生脂肪肝，脂肪肝不仅会使鱼体生长速度减慢，饵料系数升高，还会严重影响鱼体健康，使鱼体的抗应激能力下降，死亡率大大增加，给养殖户造成巨大的经济损失。
因此，如何解决高脂饲料引起的脂肪肝是当前海鲈养殖需要解决的一大难题。开发在高脂胁迫下能够提高海鲈肝脏线粒体功能的相关饲料添加剂产品对于减少海鲈脂肪肝的发生具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高高脂胁迫下海鲈肝脏线粒体功能的饲料添加剂，该饲料添加剂不仅能提高海鲈线粒体生成，促进线粒体的再生，增强线粒体呼吸链活性，同时还能提高肝脏线粒体的抗氧化能力，减少线粒体氧化损伤，并具有降脂的作用。
本发明的第二目的在于提供一种上述饲料添加剂的制备方法，该制备方法简单，饲料稳定性好，具有良好的应用前景。
本发明的第三目的在于提供上述饲料添加剂在制备海鲈饲料中的应用，将其应用于制备海鲈饲料，可有效提高高脂胁迫下海鲈肝脏线粒体功能。
本发明的第四目的在于提供一种包括上述饲料添加剂的海鲈饲料，其能够促进海鲈肝脏线粒体生成，避免线粒体遭受氧化损伤，降低肝脏中脂肪沉积，从而有效改善海鲈肝脏线粒体的功能，提高线粒体的脂肪酸分解能力，缓解脂肪肝的发生。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：
本发明提出一种提高高脂胁迫下海鲈肝脏线粒体功能的饲料添加剂，每100重量份的饲料添加剂包括10-20重量份的乌桕树皮提取物、10-20重量份的藤茶提取物、5-15重量份的水飞蓟素、8-16重量份的竹荪多糖螯合锌、6-12重量份的蛋氨酸螯合铁以及4-8重量份的生物素，余量为载体。
优选地，载体包括脱脂米糠和/或沸石粉。
优选地，乌桕树皮提取物中至少含有98wt％的鞣花酸；鞣花酸的纯度至少为95％。
本发明还提出上述饲料添加剂的制备方法，包括以下步骤：按配比混合乌桕树皮提取物、藤茶提取物、水飞蓟素、竹荪多糖螯合锌、蛋氨酸螯合铁、生物素以及载体。
优选地，混合前，将所有原料均粉碎至150-180μm。
另外，本发明还提出了上述饲料添加剂在制备海鲈饲料中的应用，例如可按质量百分数为0.05-0.2％的比例添加于海鲈饲料中。
此外，本发明还提出了一种包括上述饲料添加剂的海鲈饲料。
本发明较佳实施例提供的提高高脂胁迫下海鲈肝脏线粒体功能的饲料添加剂及其制备方法与应用、海鲈饲料的有益效果包括：
(1)饲料添加剂调控靶点明确、安全高效、配方合理，不仅能提高海鲈线粒体生成，促进线粒体的再生，增强线粒体呼吸链活性，同时还能提高肝脏线粒体的抗氧化能力，减少线粒体氧化损伤，并具有降脂的作用。
(2)制备方法简单，饲料稳定性好，具有良好的应用前景。
(3)将上述饲料添加剂应用于制备海鲈饲料，可有效提高高脂胁迫下海鲈肝脏线粒体功能。
(4)包括上述饲料添加剂的海鲈饲料能够促进海鲈肝脏线粒体生成，避免线粒体遭受氧化损伤，降低肝脏中脂肪沉积，从而有效改善海鲈肝脏线粒体的功能，提高线粒体的脂肪酸分解能力，缓解脂肪肝的发生。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的提高高脂胁迫下海鲈肝脏线粒体功能的饲料添加剂及其制备方法与应用、海鲈饲料进行具体说明。
发明人经长期研究发现线粒体的功能障碍是海鲈脂肪肝发生的根本原因，具体地，摄入高脂类物质会导致海鲈肝细胞线粒体结构和功能受到损伤，进而降低肝脏脂肪酸氧化分解能力，致使脂肪易在肝脏过度沉积，久而久之便形成脂肪肝。
基于上述发现，本申请提供的每100重量份的饲料添加剂中包括10-20重量份的乌桕树皮提取物、10-20重量份的藤茶提取物、5-15重量份的水飞蓟素、8-16重量份的竹荪多糖螯合锌、6-12重量份的蛋氨酸螯合铁以及4-8重量份的生物素，余量为载体。
作为可选地，乌桕树皮提取物和藤茶提取物的重量份均可以单独地为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20重量份，也可以为10.5、11.5、12.5、13.5、14.5、15.5、16.5、17.5、18.5或19.5重量份等，此外还可以为10-20范围内的任一重量份数值。
水飞蓟素的重量份可以为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15重量份，也可以为5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5、11.5、12.5、13.5或14.5重量份等，此外还可以为5-15范围内的任一重量份数值。
竹荪多糖螯合锌的重量份可以为8、9、10、11、12、13、14、15或16重量份，也可以为8.5、9.5、10.5、11.5、12.5、13.5、14.5或15.5重量份等，此外还可以为8-16范围内的任一重量份数值。
蛋氨酸螯合铁的重量份可以为6、7、8、9、10、11或12重量份，也可以为6.5、7.5、8.5、9.5、10.5或11.5重量份等，此外还可以为6-12范围内的任一重量份数值。
生物素的重量份可以为4、5、6、7或8重量份，也可以为4.5、5.5、6.5或7.5重量份等，此外还可以为4-8范围内的任一重量份数值。
值得说明的是，本申请中，乌桕树皮提取物、藤茶提取物、水飞蓟素、竹荪多糖螯合锌、蛋氨酸螯合铁以及生物素可按上述各自范围内的任一重量份数值进行自由组合，余量用载体补充即可。载体例如可以选自包括脱脂米糠和/或沸石粉。
在一些实施方式中，每100重量份的饲料添加剂可以包括12-18重量份的乌桕树皮提取物、12-18重量份的藤茶提取物、8-12重量份的水飞蓟素、10-14重量份的竹荪多糖螯合锌、8-10重量份的蛋氨酸螯合铁以及5-7重量份的生物素，余量为载体。也即乌桕树皮提取物、藤茶提取物、水飞蓟素、竹荪多糖螯合锌、蛋氨酸螯合铁以及生物素可按上述各自范围内的任一重量份数值进行自由组合。
在一具体的实施方式中，每100重量份的饲料添加剂包括15重量份的乌桕树皮提取物、15重量份的藤茶提取物、10重量份的水飞蓟素、12重量份的竹荪多糖螯合锌、9重量份的蛋氨酸螯合铁以及6重量份的生物素，余量为载体。
本申请中，乌桕树皮提取物主要为鞣花酸，鞣花酸在乌桕树皮提取物中的质量百分比至少为98wt％，鞣花酸的纯度达95％及其以上。乌桕树皮提取物主要用于清除海鲈体内的氧自由基和羟自由基，抑制线粒体和微粒体中的脂质体过氧化，同时减少线粒体介导的细胞凋亡。
藤茶提取物主要为黄酮类化合物，尤其是二氢杨梅素，该产品可直接市售购买得到。在本申请中，藤茶提取物主要用于提高抗氧化酶活性，其与乌桕树皮提取物配合以有效清除超氧阴离子自由基、羟自由基和DPPH自由基。此外，藤茶提取物还具有促进肝脏线粒体生成、保护肝细胞、减少肝损伤以及降血脂等功效。
水飞蓟素在本申请中不仅用于清除自由基及抑制脂肪氧化酶，同时还用于调节肝线粒体内、外膜流动性，增加膜柔顺性，从而保护肝线粒体。水飞蓟素具有上述作用的原因可能是由于水飞蓟素一方面能通过恢复膜脂质浅层流动性，缓解脂质过氧化造成的膜脆性增大；另一方面能够通过恢复膜深层流动性增强膜屏障作用，减少脂质过氧化产物等毒性物质进入膜内。
经发明人发现，竹荪多糖螯合锌应用于本申请中，能够克服鱼类饲料中常用的硫酸锌吸收率低，以及其易与植酸、草酸、脂肪酸等物质结合生成不溶物而流失的缺点，同时竹荪多糖螯合锌还能够充分发挥竹荪多糖的生理活性，增强海鲈体内抗氧化酶的活性，有效清除自由基，提高细胞免疫活性。此外，竹荪多糖螯合锌还能够起到一定的降脂和保肝作用。
蛋氨酸螯合铁含有蛋氨酸，能够避免脂质过氧化物损害初级和次级溶酶体膜，导致溶酶体内含有的作为水解的酸性磷酸酶释放出来而对细胞和线粒体膜等重要的细胞器造成损害。此外，蛋氨酸还能够促进肝细胞膜磷脂甲基化，使膜流动性增强，减少肝细胞内胆汁的淤积，加强转硫基作用，减少胆汁酸在肝内聚积，具有较佳的解毒作用。
通过采用同时含有蛋氨酸与铁的蛋氨酸螯合铁，不仅能够兼具蛋氨酸以及铁的作用，而且还能较单独的蛋氨酸或者铁具有更高的生物效价。
较佳地，上述蛋氨酸螯合铁中的配体比(蛋氨酸与铁元素的摩尔比)优选控制在2-3：1，此配体比范围内蛋氨酸螯合铁的稳定性较适合海鲈吸收利用。配体比过小会造成形成的螯合物不稳定；配体比过大，虽螯合物稳定性增强，但其稳定性过强后，不仅不利于海鲈吸收利用，同时还会造成蛋氨酸的浪费，从而增加生产成本。
生物素主要用于与竹荪多糖螯合锌以及蛋氨酸螯合铁配合以补充鱼体所需的锌、铁和生物素，避免机体缺乏锌、铁和生物素造成线粒体血红素生物合成途径受到抑制，导致血红素a缺陷，加速线粒体氧化功能障碍。
上述原料成分除了各自具有单独的作用外，各原料之间还具有协同增效作用，例如：藤茶提取物、乌桕树皮提取物、水飞蓟素和竹荪多糖螯合锌一方面能在发挥抗氧化作用上协同互补，以清除各种自由基，消除线粒体的脂质过氧化物，最大程度地发挥抗氧化作用，避免线粒体遭受氧化损伤；另一方面可协同降低血脂，减少脂肪在肝脏沉积。水飞蓟素与蛋氨酸螯合铁协同增加线粒体膜的流动性，保护线粒体膜的完整性，增强膜屏障作用，减少脂质过氧化产物等毒性物质进入膜内，从而保护肝线粒体。生物素、竹荪多糖螯合锌以及蛋氨酸螯合铁可协同预防高脂胁迫下因锌、铁和生物素不足引起的线粒体氧化功能障碍。
承上，本发明实施例的饲料添加剂中的原料配合使用后，不仅能提高海鲈线粒体生成，促进线粒体的再生，增强线粒体呼吸链活性，同时还能提高肝脏线粒体的抗氧化能力，减少线粒体氧化损伤，并具有降脂的作用。
此外，本申请还提供了一种上述饲料添加剂的制备方法，包括以下步骤：按配比混合乌桕树皮提取物、藤茶提取物、水飞蓟素、竹荪多糖螯合锌、蛋氨酸螯合铁、生物素以及载体。优选地，混合前，可将所有原料均粉碎至150-180μm，以提高固体原料的颗粒均一性，改善饲料添加剂的可食性和消化率。
作为可参考地，乌桕树皮提取物的制备方法可以包括：用乙醇回流提取乌桕树皮(回流次数可根据需要设置为1次或多次)，浓缩提取液(当回流次数为多次时，待浓缩的提取液为每次回流后所收集的提取液的和)，将浓缩所得的提取物溶于水，然后依次用石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取，将经正丁醇萃取后所得的乙酸乙酯部分进行硅胶柱层析，收集含有活性组分的洗脱组分；层析过程中以氯仿-甲醇溶液作为洗脱溶液进行梯度洗脱。
洗脱条件包括：洗脱过程中，甲醇按体积百分数计在氯仿-甲醇溶液中的含量依次为0％、20％、40％、60％、80％和100％，每个洗脱阶段所用的洗脱溶液的体积分别为300-400mL、400-500mL、500-600mL、500-600mL、400-500mL和300-400mL。优选地，上述洗脱过程的洗脱流速为2.5-3mL/min。
本申请中，所用的硅胶柱的内径为5cm，硅胶填料的填充高度可以为25-30cm(包括该范围内的任一高度值)。待洗脱的乙酸乙酯部分的上样量为5-6mg，上样前，可先将乙酸乙酯部分按料液比为10g：10-15mL溶解于氯仿中，然后以溶解后所得的溶液作为上样样品。
层析后，收集具有活性组分的第三组分以及第四组分，也即经甲醇按体积百分数计在氯仿-甲醇溶液中的含量为40％和60％两组洗脱溶液洗脱而得的洗脱组分。经上述方法所得的乌桕树皮提取物中含有纯度达95wt％以上的鞣花酸。
此外，竹荪多糖螯合锌的制备方法例如可以包括：将氯化锌溶液与竹荪多糖溶液以体积比为30-35：15-20混合，调节pH至7.9-8.1，于48-52℃的条件下振荡反应至少50h，然后将反应液转移至3kDa的透析袋中并于3-5℃的条件下透析，收集透析得物，干燥。
其中，氯化锌溶液的浓度可以为2mg/mL，竹荪多糖溶液的浓度可以为5mg/mL。调节pH所用的试剂可以为0.5mol/L的氢氧化钠。透析可以将透析体系置于冰箱中进行，也可直接在透析体系中加入冰袋或冰块以保持透析所需的较低温度，透析过程中每隔2-3h换一次蒸馏水。透析后干燥可以采用真空冷冻干燥，以降低活性物质的损失率并同时保持活性物质的较高活性。
此外，本发明实施例还提供了一种上述饲料添加剂的应用，例如可将其用于制备海鲈饲料并饲喂海鲈，以有效提高高脂胁迫下海鲈肝脏线粒体功能。
作为可选地，该饲料添加剂例如可以按质量百分数为0.05-0.2％添加于海鲈饲料中，例如可以按0.05wt％、0.1wt％和0.2wt％加入海鲈饲料中，优选按0.1wt％加入至海鲈饲料中。该添加比例下，饲料添加剂的性价比最佳。
此外，本申请还提供了一种海鲈饲料，该饲料中含有上述所涉及的饲料添加剂，其能够促进海鲈肝脏线粒体生成，避免线粒体遭受氧化损伤，降低肝脏中脂肪沉积，从而有效改善海鲈肝脏线粒体的功能，提高线粒体的脂肪酸分解能力，缓解脂肪肝的发生。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
混合前，将所有原料粉碎至150μm，按每100重量份的饲料添加剂含有20重量份的乌桕树皮提取物、10重量份的藤茶提取物、15重量份的水飞蓟素、8重量份的竹荪多糖螯合锌、12重量份的蛋氨酸螯合铁以及4重量份的生物素，余量为脱脂米糠的比例将各原料进行混合，得提高高脂胁迫下海鲈肝脏线粒体功能的饲料添加剂。
其中，乌桕树皮提取物中含有99wt％的鞣花酸，鞣花酸的纯度为99.8％。蛋氨酸螯合铁的配体比为2：1。
乌桕树皮提取物的制备方法包括：用90wt％的乙醇回流提取乌桕树皮3次，收集并合并每次回流提取后的提取液，浓缩。将浓缩所得的提取物溶于水，然后依次用石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取，将经正丁醇萃取后所得的乙酸乙酯部分干燥后取5mg按料液比为10g：10mL溶解于氯仿中，以获得上样样品。将上样样品上样于内径为5cm以及填料高度为25cm的硅胶柱中。
按以下洗脱条件进行梯度洗脱：洗脱过程中，洗脱流速为2.5mL/min；甲醇按体积百分数计在氯仿-甲醇溶液中的含量依次为0％、20％、40％、60％、80％和100％，每个洗脱阶段所用的洗脱溶液的体积分别为300mL、400mL、500mL、500mL、400mL和300mL，分别得到第一至第六洗脱组分。合并第三组分以及第四组分，干燥，以获得乌桕树皮提取物。
竹荪多糖螯合锌的制备方法包括：将2mg/mL的氯化锌溶液与5mg/mL的竹荪多糖溶液以体积比为30：15混合，用0.5mol/L的氢氧化钠调节pH至8，于48℃的条件下振荡反应50h，然后将反应液转移至3kDa的透析袋中并置于4℃的冰箱中透析24h，透析过程中每隔2h换一次蒸馏水，收集透析得物，真空冷冻干燥，以获得竹荪多糖螯合锌。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：每100重量份的饲料添加剂含有15重量份的乌桕树皮提取物、15重量份的藤茶提取物、10重量份的水飞蓟素、12重量份的竹荪多糖螯合锌、9重量份的蛋氨酸螯合铁以及6重量份的生物素，余量为脱脂米糠。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：每100重量份的饲料添加剂含有10重量份的乌桕树皮提取物、20重量份的藤茶提取物、5重量份的水飞蓟素、16重量份的竹荪多糖螯合锌、6重量份的蛋氨酸螯合铁以及8重量份的生物素，余量为脱脂米糠。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于：每100重量份的饲料添加剂含有12重量份的乌桕树皮提取物、12重量份的藤茶提取物、8重量份的水飞蓟素、10重量份的竹荪多糖螯合锌、8重量份的蛋氨酸螯合铁以及5重量份的生物素，余量为脱脂米糠。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于：每100重量份的饲料添加剂含有18重量份的乌桕树皮提取物、18重量份的藤茶提取物、12重量份的水飞蓟素、14重量份的竹荪多糖螯合锌、10重量份的蛋氨酸螯合铁以及7重量份的生物素，余量为脱脂米糠。
实施例6
本实施例与实施例2的区别在于：蛋氨酸螯合铁中的配体比为2.5：1。
实施例7
本实施例与实施例2的区别在于：蛋氨酸螯合铁中的配体比为3：1。
实施例8
本实施例与实施例2的区别在于：乌桕树皮提取物中含有98wt％的鞣花酸，鞣花酸的纯度为95％。
实施例9
本实施例与实施例2的区别在于：乌桕树皮提取物中含有98.5wt％的鞣花酸，鞣花酸的纯度为98％。
实施例10
本实施例与实施例2的区别在于：混合前，所有原料均粉碎至160μm。
实施例11
本实施例与实施例2的区别在于：混合前，所有原料均粉碎至180μm。
实施例12
本实施例与实施例2的区别在于：乌桕树皮提取物的制备方法包括：用95wt％的乙醇回流提取乌桕树皮2次，收集并合并每次回流提取后的提取液，浓缩。将浓缩所得的提取物溶于水，然后依次用石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取，将经正丁醇萃取后所得的乙酸乙酯部分干燥后取5.5mg按料液比为10g：12.5mL溶解于氯仿中，以获得上样样品。将上样样品上样于内径为5cm以及填料高度为28cm的硅胶柱中。
按以下洗脱条件进行梯度洗脱：洗脱过程中，洗脱流速为2.5mL/min；甲醇按体积百分数计在氯仿-甲醇溶液中的含量依次为0％、20％、40％、60％、80％和100％，每个洗脱阶段所用的洗脱溶液的体积分别为350mL、450mL、550mL、550mL、450mL和350mL，分别得到第一至第六洗脱组分。合并第三组分以及第四组分，干燥，以获得乌桕树皮提取物。
实施例13
本实施例与实施例2的区别在于：乌桕树皮提取物的制备方法包括：用90wt％的乙醇回流提取乌桕树皮1次，收集提取后的提取液，浓缩。将浓缩所得的提取物溶于水，然后依次用石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取，将经正丁醇萃取后所得的乙酸乙酯部分干燥后取6mg按料液比为10g：15mL溶解于氯仿中，以获得上样样品。将上样样品上样于内径为5cm以及填料高度为30cm的硅胶柱中。
按以下洗脱条件进行梯度洗脱：洗脱过程中，洗脱流速为3mL/min；甲醇按体积百分数计在氯仿-甲醇溶液中的含量依次为0％、20％、40％、60％、80％和100％，每个洗脱阶段所用的洗脱溶液的体积分别为400mL、500mL、600mL、600mL、500mL和400mL，分别得到第一至第六洗脱组分。合并第三组分以及第四组分，干燥，以获得乌桕树皮提取物。
实施例14
本实施例与实施例2的区别在于：竹荪多糖螯合锌的制备方法包括：将2mg/mL的氯化锌溶液与5mg/mL的竹荪多糖溶液以体积比为32.5：17.5混合，用0.5mol/L的氢氧化钠调节pH至7.9，于50℃的条件下振荡反应54h，然后将反应液转移至3kDa的透析袋中并置于4℃的条件下(用冰块维持温度)透析36h，透析过程中每隔3h换一次蒸馏水，收集透析得物，真空冷冻干燥，以获得竹荪多糖螯合锌。
实施例15
本实施例与实施例2的区别在于：竹荪多糖螯合锌的制备方法包括：将2mg/mL的氯化锌溶液与5mg/mL的竹荪多糖溶液以体积比为35：20混合，用0.5mol/L的氢氧化钠调节pH至8.1，于52℃的条件下振荡反应52h，然后将反应液转移至3kDa的透析袋中并置于4℃的冰箱中透析24h，透析过程中每隔2.5h换一次蒸馏水，收集透析得物，真空冷冻干燥，以获得竹荪多糖螯合锌。
实施例16
本实施例提供一种海鲈饲料，该海鲈饲料中含有质量百分数为0.1％的提高高脂胁迫下海鲈肝脏线粒体功能的饲料添加剂。提高高脂胁迫下海鲈肝脏线粒体功能的饲料添加剂可参照上述实施例1-15任一实施例提供的饲料添加剂。
实施例17
本实施例与实施例16的区别在于，该海鲈饲料中含有质量百分数为0.05％的提高高脂胁迫下海鲈肝脏线粒体功能的饲料添加剂。
实施例18
本实施例与实施例16的区别在于，该海鲈饲料中含有质量百分数为0.2％的提高高脂胁迫下海鲈肝脏线粒体功能的饲料添加剂。
试验例1
重复实施上述实施例1-15，得到足够多的提高高脂胁迫下海鲈肝脏线粒体功能的饲料添加剂。
采用单因子设计，将试验鱼驯化一周后，挑选体格健壮、规格均一(均重为280±2g)的海鲈1170尾，随机分成13组(正常对照组、高脂对照组、试验组1-3以及对比组1-8)，每组3个重复，每个重复30尾。海鲈养殖于39个海水网箱中(规格为2.0m×2.0m×2.0m)中养殖。养殖试验期间，每日投喂3次(8:30、12:30和16:30)，饱食投喂，养殖周期为10周。
每组饲料配方如表1和表2所示，正常对照组：饲料脂肪含量为11％，高脂对照组：饲料脂肪水平为20％(本实验室前期研究表明：20％脂肪会损伤肝脏线粒体)，试验组、对比组：饲料脂肪水平为20％，并添加表2所示的添加剂。所有饲料用小型颗粒机加工成粒径为3mm左右的颗粒，常温风干后置于4℃冰箱保存备用。
养殖试验结束，禁食24h。将鱼用浓度为100mg/L的MS-222(Sigma，美国)麻醉，置于冰盘上采集肝脏，并提取线粒体，用于测试以下指标。试验结果如表3至表6所示。
表1各组饲料配方％
注：表1中维生素预混物(mg或g/kg饲料)分别含有硫胺素25mg，核黄素45mg，盐酸吡哆醇20mg，维生素B12 0.1mg，维生素K3 10mg，肌醇800mg，泛酸60mg，烟酸200mg，叶酸20mg，生物素1.2mg，维生素A乙酸酯32mg，维生素D3 5mg，α-生育酚120mg，乙氧基喹啉150mg，胆碱(50％)5000mg。
矿物质预混料(mg/kg饲料)分别含有一水硫酸镁4000mg，一水硫酸锌50mg，碘化钾(1％)100mg，氯化钴(1％)100mg，五水硫酸铜20mg，一水硫酸亚铁260mg，一水硫酸锌150mg，亚硒酸钠(1％)50mg。
表2不同处理组添加剂(0.1％)组成
表2(续)不同处理组添加剂(0.1％)组成
对比组3 对比组4 对比组5 对比组6 对比组7 对比组8
乌桕树皮提取物 20 20 20 15 0 25
藤茶提取物 20 20 20 15 0 24
水飞蓟素 0 10 10 15 0 20
竹荪多糖螯合锌 12 0 12 12 22 0
蛋氨酸螯合铁 9 9 0 12 22 0
生物素 6 6 5 0 25 0
载体 33 35 33 31 31 31
合计 100 100 100 100 100 100
表3不同处理组海鲈肝脏线粒体含量的影响
表3(续)不同处理组海鲈肝脏线粒体含量的影响
注：同行上标没有相同字母表示差异显著(P<0.05)，下同。
由表3可以看出，高脂对照组的线粒体蛋白含量、线粒体DNA拷贝数以及线粒体密度均较正常对照组显著下降(P<0.05)，表明高脂饲料会导致海鲈肝脏线粒体生成减少。
试验组1-3的线粒体蛋白含量、线粒体DNA拷贝数以及线粒体密度显著高于高脂对照组(P<0.05)，与正常对照组相比无显著差异(P>0.05)，表明添加本发明实施例提供的饲料添加剂可增加海鲈肝脏线粒体生成；同时，试验组1-3的线粒体蛋白含量、线粒体DNA拷贝数以及线粒体密度显著高于对比组1-8，表明各成分需配伍使用才能够达到良好的使用效果，在添加剂总量相同的情况下，缺少其中一种或几种均会使效果显著下降。
由试验组1-3可以看出，试验组3的效果较试验组1和试验组2均更佳，说明试验组3的原料配比更利于提高海鲈线粒体蛋白含量、线粒体DNA拷贝数以及线粒体密度。
表4不同处理组线粒体能量代谢功能指标
表4(续)不同处理组线粒体能量代谢功能指标
由表4可以看出，高脂对照组的柠檬酸合成酶、琥珀酸脱氢酶以及Na+,K+-ATPase活性均较正常对照组显著下降(P<0.05)，表明高脂会降低海鲈肝脏线粒体功能。此外，高脂对照组海鲈的脂肪酸分解速率较正常对照组显著下降(P<0.05)，表明高脂饲料会降低线粒体的脂肪酸分解能力。
试验组1-3的柠檬酸合成酶、琥珀酸脱氢酶以及Na+,K+-ATPase活性显著高于高脂对照组和对比组1-8(P<0.05)，与正常对照组相比无显著差异(P>0.05)，表明添加本发明实施例提供的饲料添加剂可提高海鲈肝脏线粒体功能和脂肪酸分解能力，且各成分需配伍使用才能够达到良好的使用效果，在添加剂总量相同的情况下，缺少其中一种或几种均会使效果显著下降。
由试验组1-3可以看出，试验组3的效果较试验组1和试验组2均更佳，说明试验组3的原料配比更利于提高海鲈肝脏线粒体功能和脂肪酸分解能力。
表5不同处理组肝脏线粒体呼吸链复合物活性比较
表5(续)不同处理组肝脏线粒体呼吸链复合物活性比较
指标 对比组3 对比组4 对比组5 对比组6 对比组7 对比组8
呼吸链复合物I(nmolNADH/min/mgprot) 2.17<sup>b</sup> 2.23<sup>b</sup> 2.31<sup>b</sup> 2.42<sup>b</sup> 1.79<sup>bc</sup> 1.98<sup>b</sup>
呼吸链复合物II(nmolDCPIP/min/mgprot) 1.16<sup>b</sup> 1.20<sup>b</sup> 1.23<sup>b</sup> 1.21<sup>b</sup> 0.99<sup>c</sup> 1.16<sup>b</sup>
呼吸链复合物III(nmolCytC/min/mgprot) 0.38<sup>b</sup> 0.35<sup>b</sup> 0.31<sup>b</sup> 0.36<sup>b</sup> 0.34<sup>b</sup> 0.34<sup>b</sup>
由表5可以看出，高脂对照组的呼吸链复合物I、II和III活性均较正常对照组显著下降(P&lt;0.05)，表明高脂会降低海鲈肝脏线粒体呼吸链活性。
试验组1-3的呼吸链复合物I、II和III活性显著高于高脂对照组和对比组1-8(P&lt;0.05)，与正常对照组相比无显著差异(P&gt;0.05)，表明添加本发明实施例提供的饲料添加剂可提高海鲈肝脏线粒体呼吸链活性，且需要将添加剂中的各个组分复合使用才能够达到较好的作用效果。
由试验组1-3可以看出，试验组3的效果较试验组1和试验组2均更佳，说明试验组3的原料配比更利于提高海鲈肝脏线粒体呼吸链活性。
表6不同处理组肝脏线粒体呼吸链复合物活性比较
表6(续)不同处理组肝脏线粒体呼吸链复合物活性比较
指标 对比组3 对比组4 对比组5 对比组6 对比组7 对比组8
总超氧化物歧化酶SOD(U/mg protein) 155<sup>b</sup> 152<sup>b</sup> 158<sup>b</sup> 163<sup>b</sup> 125<sup>c</sup> 144<sup>bc</sup>
脂质过氧化物MDA(nmol/mg protein) 3.63<sup>b</sup> 3.58<sup>b</sup> 3.46<sup>b</sup> 3.22<sup>b</sup> 3.66<sup>b</sup> 3.71<sup>b</sup>
细胞内ROS含量(mmol/mg prot) 8.45<sup>b</sup> 8.65<sup>b</sup> 7.95<sup>b</sup> 7.48<sup>b</sup> 9.16<sup>ab</sup> 9.83<sup>ab</sup>
由表6可以看出，高脂对照组的总超氧化物歧化酶SOD活性均较正常对照组显著下降(P&lt;0.05)，脂质过氧化物MDA和细胞内ROS含量较正常对照组显著升高(P&lt;0.05)，表明高脂会导致海鲈肝脏线粒体遭受氧化损伤。
试验组1-3线粒体的总超氧化物歧化酶SOD活性相对于高脂对照组和对比组1-8显著提高(P&lt;0.05)，表明添加本发明实施例提供的饲料添加剂可增强海鲈肝脏线粒体抗氧化功能；与之对应的是，试验组1-3脂质过氧化物MDA和细胞内ROS含量相对于高脂对照组和对比组1-8显著下降(P&lt;0.05)，表明添加本发明实施例提供的饲料添加剂可使海鲈肝脏线粒体遭受的氧化损伤程度降低。
由试验组1-3可以看出，试验组3的效果较试验组1和试验组2均更佳，说明试验组3的原料配比更利于降低海鲈肝脏线粒体遭受的氧化损伤程度。
按照上述试验例的方法对实施例4-15所得的提高高脂胁迫下海鲈肝脏线粒体功能的饲料添加剂进行试验，其结果同样显示通过饲喂含有本发明实施例提供的提高高脂胁迫下海鲈肝脏线粒体功能的饲料添加剂的海鲈饲料，可较高脂对照组以及对比组1-8增加海鲈肝脏线粒体生成、提高海鲈肝脏线粒体功能和脂肪酸分解能力、提高海鲈肝脏线粒体呼吸链活性以及降低海鲈肝脏线粒体遭受的氧化损伤程度。
试验例2
按试验例1的试验方法，设置比对组1-2，比对组1-2与试验组2的区别分别在于：比对组1中蛋氨酸螯合铁中的配体比为1:1，比对组2中蛋氨酸螯合铁中的配体比为4:1。对比试验组2以及比对组1-2，其结果显示：
试验组2较对比组1和2具有更优的增加海鲈肝脏线粒体生成、提高海鲈肝脏线粒体功能和脂肪酸分解能力、提高海鲈肝脏线粒体呼吸链活性以及降低海鲈肝脏线粒体遭受的氧化损伤程度的作用；此外，对比组1和2在上述方面的效果还均低于试验组1和试验组3。
试验例3
按试验例1的试验方法，设置比对组3-5，比对组3-5与试验组2的区别分别在于：比对组3中乌桕树皮提取物的主要成分为槲皮素(乌桕树皮提取物中槲皮素的含量为99wt％，鞣花酸的含量不高于1wt％)，比对组4中乌桕树皮提取物的主要成分为乌桕单宁(乌桕树皮提取物中乌桕单宁的含量为99wt％，鞣花酸的含量不高于1wt％)，比对组3中乌桕树皮提取物所含的鞣花酸的纯度为70wt％。对比试验组2以及比对组3-5，其结果显示：
(1)试验组2较对比组3和5具有更优的增加海鲈肝脏线粒体生成、提高海鲈肝脏线粒体功能和脂肪酸分解能力、提高海鲈肝脏线粒体呼吸链活性以及降低海鲈肝脏线粒体遭受的氧化损伤程度的作用；
(2)对比组1-8的效果均优于比对组3和4；
(3)比对组5的效果优于比对组3和4且比对组3的效果优于比对组4。
由此说明，并非所有的乌桕树皮成分均能达到本申请所需的技术效果，且乌桕树皮提取物中鞣花酸的纯度对最终饲料添加剂的作用效果也有直接影响，纯度越高，作用效果越明显。
综上所述，本申请提供的饲料添加剂不仅能提高海鲈线粒体生成，促进线粒体的再生，增强线粒体呼吸链活性，同时还能提高肝脏线粒体的抗氧化能力，减少线粒体氧化损伤，并具有降脂的作用。其制备方法简单，饲料稳定性好，具有良好的应用前景。将其用于制备海鲈饲料，可有效提高高脂胁迫下海鲈肝脏线粒体功能。含有上述饲料添加剂的海鲈饲料能够促进海鲈肝脏线粒体生成，避免线粒体遭受氧化损伤，降低肝脏中脂肪沉积，从而有效改善海鲈肝脏线粒体的功能，提高线粒体的脂肪酸分解能力，缓解脂肪肝的发生。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种提高高脂胁迫下海鲈肝脏线粒体功能的饲料添加剂，其特征在于，每100重量份的所述饲料添加剂包括10-20重量份的乌桕树皮提取物、10-20重量份的藤茶提取物、5-15重量份的水飞蓟素、8-16重量份的竹荪多糖螯合锌、6-12重量份的蛋氨酸螯合铁以及4-8重量份的生物素，余量为载体；
优选地，所述载体包括脱脂米糠和/或沸石粉；
优选地，所述乌桕树皮提取物中至少含有98wt％的鞣花酸；所述鞣花酸的纯度至少为95％。
2.根据权利要求1所述的饲料添加剂，其特征在于，每100重量份的所述饲料添加剂包括12-18重量份的所述乌桕树皮提取物、12-18重量份的所述藤茶提取物、8-12重量份的所述水飞蓟素、10-14重量份的所述竹荪多糖螯合锌、8-10重量份的所述蛋氨酸螯合铁以及5-7重量份的所述生物素，余量为所述载体。
3.根据权利要求2所述的饲料添加剂，其特征在于，每100重量份的所述饲料添加剂包括15重量份的所述乌桕树皮提取物、15重量份的所述藤茶提取物、10重量份的所述水飞蓟素、12重量份的所述竹荪多糖螯合锌、9重量份的所述蛋氨酸螯合铁以及6重量份的所述生物素，余量为所述载体。
4.如权利要求1-3任一项所述的饲料添加剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：按配比混合所述乌桕树皮提取物、所述藤茶提取物、所述水飞蓟素、所述竹荪多糖螯合锌、所述蛋氨酸螯合铁、所述生物素以及所述载体；
优选地，混合前，将所有原料均粉碎至150-180μm。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述乌桕树皮提取物的制备方法包括：用乙醇回流提取乌桕树皮，浓缩提取液，将浓缩所得的提取物溶于水，然后依次用石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取，将经所述正丁醇萃取后所得的乙酸乙酯部分进行硅胶柱层析，收集含有活性组分的洗脱组分；层析过程中以氯仿-甲醇溶液作为洗脱溶液进行梯度洗脱。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，洗脱条件包括：洗脱过程中，甲醇按体积百分数计在所述氯仿-甲醇溶液中的含量依次为0％、20％、40％、60％、80％和100％，每个洗脱阶段所用的洗脱溶液的体积分别为300-400mL、400-500mL、500-600mL、500-600mL、400-500mL和300-400mL；
优选地，洗脱流速为2.5-3mL/min。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述硅胶柱的内径为5cm，硅胶填料的填充高度为25-30cm；和/或所述乙酸乙酯部分的上样量为5-6mg。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述竹荪多糖螯合锌的制备方法包括：将氯化锌溶液与竹荪多糖溶液以体积比为30-35：15-20混合，调节pH至7.9-8.1，于48-52℃的条件下振荡反应至少50h，然后将反应液转移至3kDa的透析袋中并于3-5℃的条件下透析，收集透析得物，干燥。
9.如权利要求1-3任一项所述的饲料添加剂在制备海鲈饲料中的应用，其特征在于，所述饲料添加剂按质量百分数为0.05-0.2％的比例添加于海鲈饲料中；
优选地，所述饲料添加剂按质量百分数为0.1％的比例添加于海鲈饲料中。
10.一种海鲈饲料，其特征在于，所述海鲈饲料包括如权利要求1-3任一项所述的饲料添加剂。
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