CN104186966A

CN104186966A - 一种缓解肉鸡氧化应激的绿色添加剂制备及使用方法

Info

Publication number: CN104186966A
Application number: CN201410356800.7A
Authority: CN
Inventors: 史东辉; 金立志; 许云贺; 王佳丽
Original assignee: GUANGZHOU MERITECH BIO-ENGINEERING TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: GUANGZHOU MERITECH BIO-ENGINEERING TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-07-25
Filing date: 2014-07-25
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2034-07-25
Also published as: CN104186966B

Abstract

一种缓解肉鸡氧化应激的绿色添加剂制备及使用方法，本发明制备过程如下：按重量份数取料，止痢草提取物300份，α-生育酚醋酸酯50份，VC磷酸酯100份，剩余份数为载体共1000份，均匀混合，得到绿色添加剂。上述所述的载体为多孔吸附性沸石粉与玉米芯粉按重量份数比2：1；两者分别预先做粉碎处理，使其细度为10～100目。饲养生产中应用效果显著，可替代或部分替代抗生素的使用，对提高肉鸡生产水平、保证鸡肉产品安全、维护生态环境、促进畜牧养殖产业健康可持续发展具重要意义。

Description

一种缓解肉鸡氧化应激的绿色添加剂制备及使用方法

技术领域

本发明为一种缓解肉鸡氧化应激的绿色添加剂制备及使用方法。

背景技术

止痢草（Origanum heracleoticum L., 过去也称 Origanum vulgare spp hirtum）为唇形科牛至属多年生草本植物。主要分布于地中海地区至中亚、北非、北美及我国大部分地区。味辛、性凉、无毒，是一种安全的饲料添加剂。目前，肉鸡养殖生产受动物疾病高发的困扰，导致抗生素不仅仅作为治疗疾病被使用，还在饲料中滥用，造成畜产品中药物残留超标、动物产生耐药性，危害动物和人类健康。由此，食品安全问题已经被全民重视，绿色生态养殖迫在眉睫，天然植物止痢草提取物作为一种安全有效的中草药类饲料添加剂已逐渐被行业认可。

氧化应激不同程度地影响着现代养殖生产中动物的生产力和经济效益。伴随着肉鸡集约化养殖规模的迅速扩大同时技术、管理滞后，疾病问题也日趋严重。特别是因疾病、运输、环境温度过高过低等应激引起的氧化损伤严重影响了肉鸡生产性能。肉仔鸡生长速度快，饲养周期短，7～8周既可出栏,50d体重可达2.5kg，每平方米可饲养2周龄以内的鸡30只左右；各组织器官和肌肉的生长发育不均衡，肌肉的生长速度远快于内脏的生长发育，尤其是心肺的发育慢于肌肉，心肺不能满足供应肌肉快速生长对血氧的需要，而常常导致代偿性疾病的发生；同时，肉鸡对周围环境的适应能力和对疾病的抵抗能力较差，极易出现氧化应激反应。氧化应激表现为肉鸡体内产生过量的自由基，这些自由基与体内的脂质、DNA发生链式反应，产生的氧化应激导致疾病的发生、免疫力减弱、生产力下降、鸡肉产品质量下降，严重时肉鸡猝死。这种氧化应激影响面大，特别是养殖环境恶劣、疾病多发的规模化肉鸡养殖场尤为突出。

针对肉鸡氧化应激的防治有采用有机铬、抗生素、镇静药方法，但随之而出现食品安全问题。目前提倡添加维生素E、C、A和电解质以缓解氧化应激。维生素E和维生素C通常联合使用，因VE脂溶性，可以中断脂肪过氧化自由基的连锁反应；VC为水溶性，其抗氧化性可对许多水溶性的自由基反应。但目前的研究表明由体外大剂量的添加VC等抗氧化药物，对于预防和缓解肉鸡氧化应激反应缺乏有利证据，这是因为造成氧化应激反应的原因非常复杂，可能与神经、内分泌、营养代谢和免疫系统都有关，自由基可能不是唯一致氧化损伤因素，因此，除抗自由基外应与其他添加物及防治措施同时使用，才能获得更理想的效果。天然植物和中草药高效、安全、没有残留，除抗菌、提高免疫力外兼具促生长、改善肠道健康和产品品质等多种生理功能。

至于以往使用的丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)和没食子酸丙酯(PG)，日本报道从1981年起经过两个试验，发现BHA对大鼠前胃有致癌作用。据报道BHT有可能抑制人体呼吸酶活性，故希腊、土耳其、印度尼西亚等国家禁用。有报道没食子酸丙酯及其他所有的酯类(辛酯、异戊酯、月桂酯等)可能是导致某些人患胃炎和皮肤炎的原因，还包括引发哮喘或对阿斯匹林过敏。大剂量(1.17%--2.34%)长期饲养大鼠后有发生肾脏损害、发育受阻、红血球和白血球数异常等现象。

止痢草蒸汽蒸馏加工得到的精油具有抗氧化活性。止痢草精油中两种主要的酚类物质是香芹酚和百里香酚，次要成分为糖苷配基，还有种类丰富的低分子量的次生代谢产物如苯丙素类、醌类、黄酮类、单宁类、萜类等，这些化合物作为防御系统在抗氧化应激、抵御生理、环境、食物链上游和病原体的侵袭进程中起着重要的协同作用。大量的上述这些活性成分因具有抗生素样功能和抗氧化作用因些可以作为饲料添加剂广泛应用于动物生产以及食品中。天然植物及中草药种类繁多，生理功能不尽相同。为使丰富的植物资源得到充分利用，增加对安全、绿色抗氧化应激添加物的选择，有效预防和缓解肉仔鸡氧化应激反应，提高生产水平，开发研制了抗氧化应激的绿色添加剂的制备及使用方法。这也是养殖生产上亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服以上所存在的问题，提供一种预防和缓解肉仔鸡氧化应激反应的绿色添加剂制备方法。

本发明制备过程如下：

按重量份数取料，止痢草提取物300份，α-生育酚醋酸酯50份，VC 磷酸酯100份，剩余份数为载体共1000份，均匀混合，得到绿色添加剂。

上述所述的载体为多孔吸附性沸石粉与玉米芯粉按重量份数比2：1；两者分别预先做粉碎处理，使其细度为10～100目。

其中止痢草提取物是通过如下方法得到的：

1．采用止痢草植株(开花期)的地上部分，用流水和70%酒精反复清洗，除去灰尘和污染物；然后阴干10～15d，使含水量低于12%；粉碎，10～100目。

2．准确称取粉碎后的止痢草500g用甲醇、石油醚、氯仿、丙酮和苯各1L，放入容器内，索式抽提法抽提20h，温度不要超过溶液沸点；得到粗提物。

3．粗提物用Whatman滤纸（No.1）过滤，37℃蒸发、干燥去除多余溶剂。

4. 真空薄膜浓缩后与多孔吸附性沸石粉按1：1混合，70℃搅拌吸附3 h，再静置吸附24 h，过筛即得颗粒止痢草提取物。

本发明使用方法如下：

使用方法：将上述绿色添加剂加入肉仔鸡全价饲料中混匀，饲喂。

使用剂量：以150g/t的重量将绿色添加剂混匀在饲料中。

使用时间：连续使用15～21d；全程使用，还可以改善肉质。

本发明的优点：

（1）止痢草提取的精油有效成分高，得率高。提取止痢草抗氧化有效成分采用有机溶剂提取，克服了以往水蒸气蒸馏提取方法中有些水溶解度大的挥发性成分，不易得到，得率低的缺点。克服了超临界二氧化碳萃取方法中亲水性成分获得率过低、不能提取极性较大物质、设备造价高、清洗设备困难的缺点。不同于其他有机溶剂提取方法的溶剂剂型单一，针对该植物中不同的活性成分，分别采了用甲醇、石油醚、氯仿、丙酮和苯等不同溶剂来提取，虽然操作时间长，但得油率高，精油的有效成分得以充分提取。

（2）效率高。目前提取止痢草活性成分常用的浓缩法为旋转薄膜浓缩法，虽然浓缩效率较高，但其容量小，且浓缩液体始终处于被加热状态可能导致一些热敏性成分分解，影响提取物成分含量和质量。真空薄膜浓缩法克服了旋转薄膜浓缩法的缺点，使浓缩可以反复进行，不受被浓缩液体积的局限，可浓缩至所设定体积，容量大，馏出量高于旋转薄膜浓缩法。浓缩速度快，受热时间短，保护了热敏性成分不受破坏。

（3）多孔吸附性沸石粉含有动物生长发育所需要的常量矿物质元素钙和部分微量元素，这些元素以离子状态存在，能被动物吸收利用。多孔吸附性沸石粉还具有独特的吸附性、离子交换性、热稳定性、催化特性、耐酸性、生物学活性及抗毒性。多孔吸附性沸石粉内部孔穴和孔道中大量的流动性强的阳离子有很强的选择性离子交换性，可将有害的重金属离子除掉。

（4）防止饲料氧化变质。α-生育酚醋酸酯和VC 磷酸酯可以防止饲料在运输、储存过程中脂类等营养物质的氧化反应,从而保存饲料营养价值，延长储存期，避免饲料饲料氧化酸败造成的适口性下降,有利于肉鸡生产。

（5）对所得的抗氧化应激产品进行动物体外抗氧化试验和肉鸡体内的抗氧化应激试验，论证了该绿色添加剂的抗氧化作用。同时还进行了体外抑菌试验，以充分论证其活性物质除抗氧化作用外，在其他方面的一个综合、协调作用。

（6）充分调研肉鸡氧化应激产生的原因及引发的氧化伤害，以肉鸡血清氧化功能指标和鸡肉脂类氧化指标为模式测试，使该绿色添加剂更具用实用性和适用性。依据肉鸡氧化应激的症状及临床表现特征，查找医药典籍，以抗氧化性能为主要药理学指标，结合抑菌作用、提高生产性能作用、抗球虫作用、调节免疫，将提取物进行了药效学试验。

（7）本发明止痢草提取物，主要活性物质为香芹酚和百里香酚，次要成分糖苷配基，种类丰富的低分子量的次生代谢产物均具有很强的抗氧化作用，同时提高日增重，改善饲料报酬；具有抑菌作用，降低疾病发生的可能性；可以提高肉鸡的免疫力；控制肉仔鸡艾美耳球虫病的发生。除抗自由基作用外，在肉仔鸡的营养代谢和免疫系统方面起到了综合作用。

（8）止痢草的最小抑菌浓度显著小于其他几种植物提取物的最小抑菌浓度，将植物的活性成分提取，浓缩，纯化，保证疗效的前提下，减少了使用量，不降低饲料的营养浓度，确保其添加效果。

（9）选用的止痢草是欧美人们餐桌上的调味品，α-生育酚醋酸酯，VC 磷酸酯，及其载体为可食用、绿色、无毒副作用、不产生抗药性、易获得。而且，α-生育酚醋酸酯和VC 磷酸酯与止痢草提取物具有协同作用，其效果见后面的试验数据。饲养生产中应用效果显著，可替代或部分替代抗生素的使用，对提高肉鸡生产水平、保证鸡肉产品安全、维护生态环境、促进畜牧养殖产业健康可持续发展具重要意义。

具体实施方式

止痢草提取物的体外抗氧化实验，与a-生育酚对比，检测储藏猪油过氧化物的生成速度；用常见的AA+肉仔鸡为对象，检测该绿色添加剂对肉鸡血清的抗氧化作用和鸡肉脂类氧化影响；以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌为模式测试菌，实验室测定几种常见植物的最小抑菌浓度；测试肉仔鸡对该止痢草提取物的毒性反应；最后进行临床防治验证。

一、止痢草提取物体抗氧化实验

（一）止痢草提取物体外抗氧化实验

1、准备猪油。100℃加热猪肉获得猪油，过滤后-20℃储藏。

2、所有化学试剂均为生物分析纯，D-a-生育酚购自北京三区生物技术有限公司。

3、将猪油转入6个透明的玻璃瓶，每瓶10g。将止痢草提取物和D-a-生育酚用戊烷溶解加入猪油样本中，60℃熔化。添加量为2000mg/kg，另有一空白对照组，不添加任何添加剂，每组两个重复。所有样本在培养箱60℃培养。检测过氧化值（PV，Peroxide values），检测方法参照GB-T 5538-2005/ISO 3960：2001，IDT。

5、检测了3个月内猪油过氧化值，如图1，止痢草提取物对储藏猪油氧化性能的影响；对照组（不添加任何添加剂组）在第10天PV值迅速上升，D-a-生育酚在1个月后PV值也快速上升，而止痢草提取物在实验80天前都体现了非常好的抗氧化能力。

图1表明止痢草提取物在动物油脂起到了延缓其氧化的作用。其抗氧化能力远远大于VE，特别是随着试验时间的延长更体现了其卓越的抗氧化性能，表现了很好的抗氧化稳定性。

（二）该绿色添加剂体内抗氧化实验

2012年6月在锦州北镇前进养殖场进行了生产实验。

1、动物、饲粮与饲养管理

试验选取1日龄同批孵化AA+720只，采用单因子随机分组试验设计，随机分为4个处理，每个处理6个重复，每个重复30只肉仔鸡，公母各半。试验期42d，阶段日粮采取逐渐过渡的方式，试验无预饲期。基础饲粮参照2004我国肉仔鸡饲养标准和美国NRC（1994）家禽营养需要配制。见表1。分组如下：Ⅰ组为对照组：无添加的基础日粮组,所用大豆油过氧化物值＜6 mmol/kg；Ⅱ组：基础日粮中大豆油为过氧化物值为40mmol/kg，无添加；Ⅲ组：基础日粮（大豆油为过氧化物值为40mmol/kg）+150g/t绿色添加剂；Ⅳ组：基础日粮（大豆油为过氧化物值为40mmol/kg）+50g/t止痢草提取物。试验Ⅲ组与Ⅳ组止痢草精油浓度相同。试验组间饲养管理、免疫程序一致。

每千克配合饲料中含(Supplied per kg diet)：V_Al2000IU，V_D3 2500IU，V_E 30mg，V_K3 3mg，V_B1 3mg，V_B2 8mg，V_B6 7mg，V_Bl2 0.03mg，泛酸20mg，烟酸50mg，生物素0.18mg，叶酸1.5mg，Vc 10mg，氯化胆碱1000mg。，Zn 110mg，Mn l20mg，Fe100mg，Cu 15mg ，Co 0.2mg ，Se 0.3mg,，I 1mg。

2、样品采集

于试验第42d从每个处理组随机抽取12只体重接近该组平均体重的试验肉鸡（每重复2只，公母各1只），共48只鸡, 无菌翅静脉采血，凝固后离心（3 500 r/min离心10min）吸取上清液，分装，4℃保存，2d 内完成抗氧化酶的指标测定；禁食12h后，将鸡只致昏后放血、屠宰，胴体称重，去除骨和结缔组织，剥皮，4℃冷却。取右侧胸肌和腿肌4℃冷却后检测MDA含量，同时留样真空包装，于-20℃冰箱中冷冻保存。贮藏1个月、3个月和6个月后检测胸肌和腿肌的MDA含量。

3、检测方法与数据分析

3.1 血清总抗氧化能力（T-AOC）采用比色法，超氧化物歧化酶（SOD）活性测定采用黄嘌呤氧化物酶法、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）采用二硫代二硝基苯甲酸法；丙二醛（MDA）含量测定采用硫代巴比妥酸法（TBA）。

3.2 分别检测新鲜的及在-20℃贮藏1、3、6个月后的胸肌和腿肌的丙二醛（MDA）含量。将样本在4℃条件下解冻12h，准确称取胸肌和腿肌重量，按重量体积比加9倍生理盐水制成10%的匀浆，2 000 r/min离心10min，取上清待测。

以上测定试剂采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒，具体操作方法对照试剂盒说明书。组织匀浆中蛋白含量采用双缩脲法测定。试验数据采用Excel处理，应用SPSS13.0软件One-way ANOVA方法进行统计分析，并采用LSD法多重比较，结果以平均值±标准差表示，P<0.05 作为差异显著的标准。

4、结果

表2 绿色添加剂对42日龄肉鸡血清抗氧化功能的影响

从表2可以看出，42日龄肉鸡血清T-AOC活性Ⅲ组最高，显著高于Ⅱ组(P<0.05），比Ⅱ组提高了25.92%(P<0.05）；不同添加剂添加量组间差异并不显著（P>0.05）。

血清SOD活性以Ⅱ组最低，Ⅲ组肉鸡血清SOD活性明显高于Ⅱ组和Ⅰ组(P<0.05）。

在血清GSH-Px活性方面，Ⅲ组和Ⅳ组的血清GSH-Px活性均高于Ⅱ组（P>0.05）。Ⅲ组和Ⅳ组间差异并不显著（P>0.05）。血清GSH-Px活性Ⅲ组最高，比对照组提高了2.6%（P>0.05）。

Ⅲ组肉鸡的血清MDA含量均低于Ⅱ组，但差异不显著（P>0.05）。

表3 胸肌样本在- 20℃贮藏条件下丙二醛的变化（nmol·mg prot）

表3和表4描述了胸肌和腿肌样本-20℃贮藏后MDA的变化。由表2可知，屠宰后即检测MDA的含量，Ⅰ组、Ⅲ组和Ⅳ组比Ⅱ组对照组降低了18.4%(P<0.05）、24.1%(P<0.05）和24.8%(P<0.05），Ⅲ组和Ⅳ组的MDA值在-20℃贮藏1个月、3个月后有小幅度的增加（P>0.05），均明显低于对照组 (P<0.05)。

由表3可以看出，各试验组的胸肌样本-20℃冷冻在6个月后，MDA浓度均显著增加(P<0.05），但Ⅱ组尤其明显。

表4数据显示，Ⅱ组腿肌MDA浓度显著高于其他各组 (P<0.05）。样本在-20℃贮藏1、3、6个月后的情况亦相同(P<0.05）。

从表3和表4可知，屠宰后试验各组测定MDA的浓度，腿肌均高于胸肌(P<0.05）。Ⅲ组和Ⅳ组胸肌和腿肌MDA含量均显著低于对照组和Ⅱ组(P<0.05）。

5、结论

试验表明，肉鸡日粮中添加绿色添加剂可以提高血清T-AOC含量，SOD和GSH-Px活性，降低血清和肌肉中MDA含量，表现了显著的抗氧化能力。其作用效果好于止痢草提取物组，这可能是VE、VC与止痢草提取物产生了协同作用，增强了肉鸡的抗氧化应激能力。通过以上生产实践表明：本发明能有效防控肉鸡氧化应激的发生，同时，在保证防治效果的前提下，对推行无公害化生产，保证食品安全，保护环境有着积极的意义。

二、止痢草提取物的抑菌实验

1.试验用菌株的准备。鸡致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌均由辽宁医学院畜牧兽医学院微生物教研室分离，血琼脂保存。隔夜从血琼脂取每种2-3个菌落接种于MH肉汤培养。肉汤35℃，振荡，孵育12 h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水校正浓度至10⁸cfu ml^-1。

2. 中草药选择及制备

查阅大量文献，充分调研肉鸡氧化应激的发病原因及病理学特点的基础上，选择几种兼具抗氧化和抑菌性能的植物提取物进行试验，分别是止痢草植物提取物、迷迭香提取物、百里香提取物，后两者分别购于禹州市森普诺生物科技有限公司和西安昌岳植物化工有限公司。以上提取物按照琼脂稀释方法来稀释v/v。

3．琼脂稀释方法

琼脂稀释方法按照美国临床实验室国家标准化委员会NCCLS制定标准执行。稍作变动：0.5%(v/v)吐温--20加入琼脂以促进油脂溶解。采用两倍稀释法，每种提取物浓度从2%(v/v)到0.03%(v/v)，加入Mueller-Hinton琼脂0.5%(v/v)吐温—20。培养皿35℃干燥30min后，接种1-2μL斑点，菌数约10⁴cfu ml^-1。另有一没有添加提取物的Mueller-Hinton琼脂0.5%(v/v)吐温—20作为对照。培养皿35℃孵育48 h。24 h后检测最小抑菌浓度（MICs）。以琼脂皿无可见细菌生长的最小提取物浓度计为试验菌的最小抑菌浓度（以两组样本平均值）。一或两个菌落忽略不计。

从上表5中可以看出，止痢草植物提取物对鸡致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌的MIC是最小的，除了与百里香提取物对大肠杆菌的MIC相同外；综合来讲好于迷迭香提取物和百里香提取物。

从上述抗氧化能力和MIC来看，止痢草植物提取物可以有力地预防和缓解肉鸡氧化应激反应，这可能与其提取物中含有的酚类香芹酚和百里香酚有关，还可能与次要成分糖苷配基有关，与低分子量的次生代谢产物如苯丙素类、醌类、黄酮类、单宁类、萜类等有关；可能是上述各成分的综合协同作用，才获得了理想的效果。

二、产品制备及使用方法

多孔吸附性沸石粉具有多孔性、孔径均一，适宜的孔结构及表面结构，比表面积巨大，吸附力强，耐磨的机械强度等特点，电子显微镜下呈海绵状多孔性，故能保持很强的吸附作用、交换作用。化学性质稳定，制造方便，容易再生。基本成分是碳酸钙，含钙约为35%。按干物质计，石灰沸石粉的成分与含量如下（%）：灰分96.9%，钙 35.89%, 氯 0.03%, 铁 0.35%, 锰 0.027%, 镁 0.06% ，丰富的矿物元素可供动物直接利用，是理想的止痢草提取物缓释剂材料。玉米芯粉含粗蛋白5.7%、粗纤维3.7%，亦具有良好的吸附性，稳定、生物可降解、流动性好、吸水性强、适口性好的特点。

绿色抗氧化应激添加剂制备过程如下：

其中止痢草提取物是通过如下方法得到的：

本发明使用方法如下：

使用剂量：以150g/t的重量将绿色添加剂混匀在饲料中。

使用时间：连续使用15～21d；全程使用，改善肉质。

Claims

1.一种缓解肉鸡氧化应激的绿色添加剂制备方法，特征在于，其制备过程如下：

按重量份数取料，止痢草提取物300份，α-生育酚醋酸酯50份，VC 磷酸酯100份，剩余份数为载体共1000份，均匀混合，得到绿色添加剂；

上述所述的载体为多孔吸附性沸石粉与玉米芯粉按重量份数比2：1；两者分别预先做粉碎处理，使其细度为10～100目；

上述所述的止痢草提取物是通过如下方法得到的：

（1）．采用止痢草植株(开花期)的地上部分，用流水和70%酒精反复清洗，除去灰尘和污染物；然后阴干10～15d，使含水量低于12%；粉碎，10～100目；

（2）．准确称取粉碎后的止痢草500g用甲醇、石油醚、氯仿、丙酮和苯各1L，放入容器内，索式抽提法抽提20h，温度不要超过溶液沸点；得到粗提物；

（3）．粗提物用Whatman滤纸（No.1）过滤，37℃蒸发、干燥去除多余溶剂；

（4）. 真空薄膜浓缩后与多孔吸附性沸石粉按1：1混合，70℃搅拌吸附3 h，再静置吸附24 h，过筛即得颗粒止痢草提取物。

2.一种利用权利要求1的绿色添加剂的使用方法，特征在于，将上述绿色添加剂加入肉仔鸡全价饲料中混匀，饲喂；其使用剂量，以150g/t的重量将绿色添加剂混匀在饲料中。