CN109320557B - 99mTc(CO)3核标记的含异腈的帕博西尼衍生物及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种99mTc(CO)3核标记的含异腈的帕博西尼衍生物，分子通式写为[99mTc(CO)3(CNPBB)3]+，结构式中：以99mTc(CO)3核为中心核，CNPBB配体分子中的异腈基团的碳原子取代[99mTc(CO)3(H2O)3]+中间体上的水分子后形成[99mTc(CO)3(CNPBB)3]+配合物，其中n等于2和3。通过配体CN2PBB和CN3PBB的合成，配合物[99mTc(CO)3(CN2PBB)3]+和[99mTc(CO)3(CN3PBB)3]+的合成等具体制备步骤，得到[99mTc(CO)3(CN3PBB)3]+配合物。该配合物放射化学纯度高、稳定性好，作为肿瘤显像剂应用在在核医学领域中。
Description
技术领域
本发明涉及99mTc标记的放射性药物化学和临床核医学技术领域，具体说是涉及到一种99mTc(CO)3核标记的含异腈的帕博西尼衍生物的制备方法和应用。
背景技术
肿瘤是机体在致癌因子作用下，其细胞周期失去正常调控，导致细胞克隆性异常增值而形成的。正常的细胞周期包括G1期、S期、G2期和M期。在这个过程中，有很多酶和蛋白起到调节和控制的作用，例如细胞周期蛋白依赖性激酶、细胞周期蛋白以及成视网膜细胞瘤蛋白等。其中，CDK4/6在细胞周期G1期到S 期的转变中起到重要作用。当CDK4/6与cyclinD结合形成复合物时，可以使Rb 磷酸化，从而实现细胞周期从G1期到S期的转变。在很多恶性肿瘤中都存在 CDK4/6的异常表达，因此CDK4/6成为肿瘤诊断与治疗的一个重要靶点。
近年来，很多CDK4/6的抑制剂被研发作为抗肿瘤药物并取得了不错的效果，其中，帕博西尼(palbociclib)是2015年被美国食品药品监督管理局批准的抗乳腺癌新药，联合来曲唑用于治疗绝经期女性雌激素受体阳性、人表皮生长因子受体2 阴性的绝经期女性晚期乳腺癌。在CDK4/6的抑制剂作为肿瘤显像剂研究方面，124I标记的帕博西尼类似物([124I]CKIA和[124I]CKIB)有相关报道(Lena Koehler et al， Radiosynthesis andradiopharmacological evaluation of cyclin-dependent kinase 4 (Cdk4)inhibitors，Eur.J.Med.Chem.45(2010)727-737)，然而这两种标记物在体内的稳定性较差，因此并不适宜作为肿瘤显像剂。
99mTc是临床上最常用的SPECT显像核素，因为其具有优良的核素性质(T1/2＝6 h，Eγ＝140keV)并可以通过99Mo/99mTc发生器淋洗，方便易得。目前尚未见99mTc 标记的CDK4/6抑制剂作为肿瘤显像剂的相关报道，因此研制新型99mTc标记 CDK4/6抑制剂作为肿瘤显像剂具有重要的现实意义。基于以上背景，本发明以商品化的帕博西尼为原料，对其进行结构修饰，使其与含有异腈基团的活化酯进行反应，得到以帕博西尼基本骨架为靶向基团、异腈基团为99mTc螯合基团的配体分子，再用99mTc(CO)3中心核进行标记来探求新型的性质优良的SPECT肿瘤显像剂，具有重要的科学研究和应用开发价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种放射化学纯度高、稳定性好，应用在肿瘤显像领域的99mTc(CO)3核标记的含异腈的帕博西尼衍生物及其制备方法和应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：一种99mTc(CO)3核标记的含异腈的帕博西尼衍生物，分子通式写为[99mTc(CO)3(CNPBB)3]+，其结构式如下：
该结构式中：以99mTc(CO)3核为中心核，CNPBB配体分子中的异腈基团的碳原子取代[99mTc(CO)3(H2O)3]+中间体上的水分子后形成[99mTc(CO)3(CNPBB)3]+配合物，其中n等于2和3。
[99mTc(CO)3(CNPBB)3]+配合物的制备方法如下：
a.配体CNPBB的合成：
称取适量帕博西尼和三乙胺于反应容器中，向反应容器中加入适量二氯甲烷，冰浴下搅拌10min。再加入适量含化合物B的二氯甲烷溶液，室温下反应3h，反应结束后减压蒸馏除去溶剂，柱层析纯化得到配体；
具体合成路线为：
b.[99mTc(CO)3(CNPBB)3]+配合物的制备：
在反应瓶中加入5mg Na2CO3、10mg NaBH4和15mg酒石酸钾钠，加入0.5mL生理盐水使其溶解，通入CO气体15min，加入适量新鲜99mTcO4 -淋洗液，在保持通入CO气体条件下80℃反应30min，即得到[99mTc(CO)3(H2O)3]+中间体；调节中间体的pH为5～6，然后加入含有0.5mg配体的DMF溶液，100 ℃下加热30min即得到本发明所述的[99mTc(CO)3(CNPBB)3]+配合物；
反应路线如下：
具体制备步骤如下：
1.CN2PBB的合成
称取帕博西尼447mg于50mL圆底烧瓶中，加入160μL三乙胺和20mL二氯甲烷，冰浴下搅拌10min，再向其中加入含有265mg化合物B(n＝2)的二氯甲烷溶液，室温下反应3h，反应结束后减压蒸馏除去溶剂，剩余固体使用硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)分离纯化，干燥后得CN2PBB；
2.CN3PBB的合成
称取帕博西尼447mg于50mL圆底烧瓶中，加入160μL三乙胺和20mL二氯甲烷，冰浴下搅拌10min，再向其中加入含有279mg化合物B(n＝3)的二氯甲烷溶液，室温下反应3h，反应结束后减压蒸馏除去溶剂，剩余固体使用硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)分离纯化，干燥后得CN3PBB；
3.[99mTc(CO)3(CN2PBB)3]+、[99mTc(CO)3(CN3PBB)3]+的合成
在青霉素小瓶中加入5mg Na2CO3、10mg NaBH4和15mg酒石酸钾钠，加入0.5mL生理盐水使其溶解，通入CO气体15min，加入适量新鲜99mTcO4 -淋洗液，在保持通入CO气体条件下80℃反应30min，得到[99mTc(CO)3(H2O)3]+中间体，调节中间体的pH为5～6，然后加入含有0.5mg CN2PBB的DMF溶液， 100℃下加热30min即得到本发明所述的[99mTc(CO)3(CN2PBB)3]+配合物；
在青霉素小瓶中加入5mg Na2CO3、10mg NaBH4和15mg酒石酸钾钠，加入0.5mL生理盐水使其溶解，通入CO气体15min，加入适量新鲜99mTcO4 -淋洗液，在保持通入CO气体条件下80℃反应30min，得到[99mTc(CO)3(H2O)3]+中间体，调节中间体的pH为5～6，然后加入含有0.5mg CN3PBB的DMF溶液， 100℃下加热30min即得到本发明所述的[99mTc(CO)3(CN3PBB)3]+配合物。
本发明所述的化学合成试剂原料均为市售商品，来源广泛。通过上述方法制备的[99mTc(CO)3(CNPBB)3]+配合物的放射化学纯度大于90％，经HPLC纯化后放射化学纯度大于98％。[99mTc(CO)3(CNPBB)3]+配合物为亲脂性物质，体外稳定性良好。其在MCF-7细胞中有一定摄取，且摄取可以被帕博西尼以及相应的配体抑制，说明其与CDK4/6是特异性结合。其在荷MCF-7肿瘤小鼠肿瘤部位有较高的摄取，肿瘤/肌肉和肿瘤/血比值好，可成为新型靶向CDK4/6的肿瘤显像剂。
本发明[99mTc(CO)3(CNPBB)3]+的性能测定
1.[99mTc(CO)3(CNPBB)3]+配合物的高效液相色谱(HPLC)鉴定
高效液相色谱(HPLC)鉴定：Waters 600型高效液相色谱仪，Kromasil C18 反相柱(250×4.6mm)，Gabi raytest放射性检测器。淋洗梯度见表1(A相为含 0.1％TFA的水，B相为含0.1％TFA的乙腈)，流速为1mL/min。[99mTc(CO)3(H2O)3]+中间体的保留时间为15.359min，配合物的保留时间分别为： [99mTc(CO)3(CN2PBB)3]+：18.817min；[99mTc(CO)3(CN3PBB)3]+：19.117min。
表1配合物的梯度洗脱条件
2.[99mTc(CO)3(CNPBB)3]+配合物的脂水分配系数的测定
取1.0mL正辛醇和1.0mL pH＝7.4的(0.025mol/L)磷酸盐缓冲液于10mL 离心试管中，在离心试管中加入0.01mL[99mTc(CO)3(CNPBB)3]+配合物溶液，盖上塞子，充分摇匀，离心5min(5000r/min)。然后分别从有机相和水相中取出0.10 mL，测定二相的放射性计数，并计算log P值(P＝有机相的放射性活度/水相的放射性活度)。配合物的脂水分配系数(log P)分别为：[99mTc(CO)3(CN2PBB)3]+： 1.476±0.022；[99mTc(CO)3(CN3PBB)3]+：1.225±0.061。说明 [99mTc(CO)3(CNPBB)3]+配合物为脂溶性物质。
3.[99mTc(CO)3(CNPBB)3]+配合物的体外稳定性测定
将分离纯化后的[99mTc(CO)3(CNPBB)3]+配合物分别在室温下和在37℃小鼠血清中放置4h后测定其放射化学纯度，实验结果表明[99mTc(CO)3(CNPBB)3]+配合物在室温下和在37℃小鼠血清中放置6小时后放射化学纯度均大于95％，说明 [99mTc(CO)3(CNPBB)3]+配合物的体外稳定性好，适于临床应用的需要。
4.[99mTc(CO)3(CNPBB)3]+配合物的细胞结合和抑制实验
将MCF-7细胞种于24孔板(2*105/孔)，放置过夜，使其贴壁。吸去培养基并用0.5mLDMEM培养基洗涤，然后向每孔加入分离纯化后的 [99mTc(CO)3(CNPBB)3]+配合物(7.4kBq，0.1mL)，在37℃培养箱中孵育15min、30 min、60min、90min和120min。抑制实验组提前30min加入帕博西尼(60μM) 或相应的CNPBB配体(60μM)。在相应的时间点，用冷的PBS(含0.2％BSA)洗涤两次，然后用0.5mL 1M NaOH溶液处理，再用γ-counter测定其计数。每孔细胞的蛋白含量使用BCA蛋白定量试剂盒进行测定。结果表明， [99mTc(CO)3(CNPBB)3]+配合物在MCF-7细胞中有一定摄取，且摄取值随时间增加(15 min时配合物[99mTc(CO)3(CN2PBB)3]+和[99mTc(CO)3(CN3PBB)3]+的细胞摄取值分别为 72.44±2.11％ID/mg protein和98.97±1.13％ID/mg protein，120min时配合物 [99mTc(CO)3(CN2PBB)3]+和[99mTc(CO)3(CN3PBB)3]+的细胞摄取值分别为126.90± 0.97％ID/mg protein和200.29±15.90％ID/mgprotein)。抑制实验结果表明 [99mTc(CO)3(CNPBB)3]+配合物在MCF-7细胞中的摄取可以被帕博西尼以及相应的配体明显抑制([99mTc(CO)3(CN2PBB)3]+的摄取值可以被帕博西尼和配体分别抑制 25.67％和76.67％，[99mTc(CO)3(CN3PBB)3]+的摄取值可以被帕博西尼和配体分别抑制58.82％和63.99％)，说明配合物[99mTc(CO)3(CNPBB)3]+与CDK4/6的结合是特异性的。
5.[99mTc(CO)3(CNPBB)3]+配合物在荷MCF-7肿瘤裸鼠体内的生物分布实验
将0.10mL分离纯化后的[99mTc(CO)3(CNPBB)3]+配合物溶液尾静脉注射到荷 MCF-7肿瘤裸鼠体内，注射后2h断头处死小白鼠。取其血、心、肝、肺、肾、肌肉、骨、肿瘤等有关组织和器官，擦净后称重，并用γ-counter测其放射性计数，每个时相的小白鼠数为3只。计算各组织的每克百分注射剂量(％ID/g)。生物分布实验的结果如表2所示。
表2[99mTc(CO)3(CNPBB)3]+配合物在注射2h后在荷瘤小鼠体内生物分布结果(％ID/g±SD， n＝3)
从表2可以看出，[99mTc(CO)3(CNPBB)3]+配合物在注射2h后在肿瘤中具有较高的摄取以及较好的瘤/肉比值，可作为新型肿瘤显像剂。
具体实施方式：
下面通过实施例详述本发明：一种99mTc(CO)3核标记的含异腈的帕博西尼衍生物，分子通式写为[99mTc(CO)3(CNPBB)3]+，其结构式如下：
该结构式中：以99mTc(CO)3核为中心核，CNPBB配体分子中的异腈基团的碳原子取代[99mTc(CO)3(H2O)3]+中间体上的水分子后形成[99mTc(CO)3(CNPBB)3]+配合物，其中n等于2和3。
一种99mTc(CO)3核标记的含异腈的帕博西尼衍生物的制备步骤如下：
a.配体CNPBB的合成：
称取适量帕博西尼和三乙胺于反应容器中，向反应容器中加入适量二氯甲烷，冰浴下搅拌10min。再加入适量含化合物B的二氯甲烷溶液，室温下反应3h。
反应结束后减压蒸馏除去溶剂，柱层析纯化得到配体。
具体合成路线为：
b.[99mTc(CO)3(CNPBB)3]+配合物的制备：
在反应瓶中加入5mg Na2CO3、10mg NaBH4和15mg酒石酸钾钠，加入0.5mL生理盐水使其溶解，通入CO气体15min，加入适量新鲜99mTcO4 -淋洗液，在保持通入CO气体条件下80℃反应30min，即得到[99mTc(CO)3(H2O)3]+中间体。调节中间体的pH为5～6，然后加入含有0.5mg配体的DMF溶液，10℃下加热30min即得到本发明所述的[99mTc(CO)3(CNPBB)3]+配合物。
反应路线如下：
具体制备步骤如下：
1.CN2PBB的合成
称取帕博西尼447mg于50mL圆底烧瓶中，加入160μL三乙胺和20mL二氯甲烷，冰浴下搅拌10min。再向其中加入含有265mg化合物B(n＝2)的二氯甲烷溶液，室温下反应3h。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，剩余固体使用硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)分离纯化，干燥后得黄色固体475mg，产率 90％。1H NMR(400M，CDCl3)δ8.89(s，1H)，8.19(d，J＝9.1Hz，1H)，8.06(d，J＝2.7Hz， 1H)，7.33(d，J＝9.1Hz，1H)，5.85(p，J＝8.9Hz，1H)，3.84-3.73(m，3H)，3.63(dt，J＝ 11.8，5.0Hz，3H)，3.16(dt，J＝17.1，4.9Hz，4H)，2.80(t，J＝7.0Hz，1H)，2.61(t，J＝5.1 Hz，1H)，2.52(s，3H)，2.35-2.29(m，5H)，2.04(p，J＝7.5Hz，2H)，1.92-1.81(m，2H)， 1.72-1.58(m，2H).13C NMR(100MHz，CDCl3)δ202.76，170.05，167.06，161.48，158.12，157.37，155.61，145.95，143.01，141.88，137.14，130.86，126.98，113.76，107.78，54.26，50.06，49.75，45.29，41.68，33.02，31.61，28.15，14.04.HRMS(ESI)： m/zcalculated for C28H33N8O3[M+H]+529.2670，found 529.2676.
2.CN3PBB的合成
称取帕博西尼447mg于50mL圆底烧瓶中，加入160μL三乙胺和20mL二氯甲烷，冰浴下搅拌10min。再向其中加入含有279mg化合物B(n＝3)的二氯甲烷溶液，室温下反应3h。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，剩余固体使用硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)分离纯化，干燥后得黄色固体266mg，产率 49％。1H NMR(400M，CDCl3)δ8.94(s，1H)，8.16(d，J＝9.1Hz，1H)，8.06(d，J＝2.8Hz， 1H)，7.29(dd，J＝9.1，2.9Hz，1H)，5.85(p，J＝8.6Hz，1H)，3.78(t，J＝4.9Hz，2H)，3.66 (t，J＝4.5Hz，2H)，3.53(t，J＝6.2Hz，2H)，3.14(dt，J＝14.5，4.9Hz，4H)，2.54(t，J＝6.8 Hz，2H)，2.50(s，3H)，2.38-2.29(m，5H)，2.03(m，4H)，1.92-1.79(m，2H)，1.74-1.60(m， 2H).13C NMR(100MHz，CDCl3)δ202.71，169.62，161.44，158.17，157.47，155.61， 145.90，143.03，141.97，137.17，130.65，126.59，113.55，107.50，54.33，49.92，49.75， 45.23，41.55，31.61，28.89，28.11，25.77，24.37，14.00.HRMS(ESI)：m/zcalculated for C29H35N8O3[M+H]+543.2826，found 543.2823.
3.[99mTc(CO)3(CN2PBB)3]+、[99mTc(CO)3(CN3PBB)3]+的合成
在青霉素小瓶中加入5mg Na2CO3、10mg NaBH4和15mg酒石酸钾钠，加入0.5mL生理盐水使其溶解，通入CO气体15min，加入适量新鲜99mTcO4 -淋洗液，在保持通入CO气体条件下80℃反应30min，得到[99mTc(CO)3(H2O)3]+中间体。调节中间体的pH为5～6，然后加入含有0.5mg CN2PBB的DMF溶液， 100℃下加热30min即得到本发明所述的[99mTc(CO)3(CN2PBB)3]+配合物。
在青霉素小瓶中加入5mg Na2CO3、10mg NaBH4和15mg酒石酸钾钠，加入0.5mL生理盐水使其溶解，通入CO气体15min，加入适量新鲜99mTcO4 -淋洗液，在保持通入CO气体条件下80℃反应30min，得到[99mTc(CO)3(H2O)3]+中间体。调节中间体的pH为5～6，然后加入含有0.5mg CN3PBB的DMF溶液， 100℃下加热30min即得到本发明所述的[99mTc(CO)3(CN3PBB)3]+配合物。
Claims (3)
1.一种99mTc(CO)3核标记的含异腈的帕博西尼衍生物，分子通式写为[99mTc(CO)3(CNPBB)3]+，其结构式如下：
该结构式中：以99mTc(CO)3核为中心核，CNPBB配体分子中的异腈基团的碳原子取代[99mTc(CO)3(H2O)3]+中间体上的水分子后形成[99mTc(CO)3(CNPBB)3]+配合物，其中n等于2和3。
2.如权利要求1所述99mTc(CO)3核标记的含异腈的帕博西尼衍生物的制备方法，其工艺步骤如下：
A.配体CNPBB的合成：
称取适量帕博西尼和三乙胺于反应容器中，向反应容器中加入适量二氯甲烷，冰浴下搅拌10min，再加入适量含化合物B的二氯甲烷溶液，室温下反应3h，反应结束后减压蒸馏除去溶剂，柱层析纯化得到配体；
具体合成路线为：
B.[99mTc(CO)3(CNPBB)3]+配合物的制备：
在反应瓶中加入5mg Na2CO3、10mg NaBH4和15mg酒石酸钾钠，加入0.5mL生理盐水使其溶解，通入CO气体15min，加入适量新鲜99mTcO4 -淋洗液，在保持通入CO气体条件下80℃反应30min，即得到[99mTc(CO)3(H2O)3]+中间体；调节中间体的pH为5～6，然后加入含有0.5mg配体的DMF溶液，100℃下加热30min即得到所述的[99mTc(CO)3(CNPBB)3]+配合物；
反应路线如下：
具体制备步骤如下：
a.CN2PBB的合成
称取帕博西尼447mg于50mL圆底烧瓶中，加入160μL三乙胺和20mL二氯甲烷，冰浴下搅拌10min，再向其中加入含有265mg n＝2的化合物B的二氯甲烷溶液，室温下反应3h，反应结束后减压蒸馏除去溶剂，剩余固体使用硅胶柱层析分离纯化，其中二氯甲烷：甲醇＝20：1，干燥后得CN2PBB；
b.CN3PBB的合成
称取帕博西尼447mg于50mL圆底烧瓶中，加入160μL三乙胺和20mL二氯甲烷，冰浴下搅拌10min，再向其中加入含有279mg n＝3的化合物B的二氯甲烷溶液，室温下反应3h，反应结束后减压蒸馏除去溶剂，剩余固体使用硅胶柱层析分离纯化，其中二氯甲烷：甲醇＝20：1，干燥后得CN3PBB；
c.[99mTc(CO)3(CN2PBB)3]+、[99mTc(CO)3(CN3PBB)3]+的合成
在青霉素小瓶中加入5mg Na2CO3、10mg NaBH4和15mg酒石酸钾钠，加入0.5mL生理盐水使其溶解，通入CO气体15min，加入适量新鲜99mTcO4 -淋洗液，在保持通入CO气体条件下80℃反应30min，得到[99mTc(CO)3(H2O)3]+中间体，调节中间体的pH为5～6，然后加入含有0.5mgCN2PBB的DMF溶液，100℃下加热30min即得到所述的[99mTc(CO)3(CN2PBB)3]+配合物；
在青霉素小瓶中加入5mg Na2CO3、10mg NaBH4和15mg酒石酸钾钠，加入0.5mL生理盐水使其溶解，通入CO气体15min，加入适量新鲜99mTcO4 -淋洗液，在保持通入CO气体条件下80℃反应30min，得到[99mTc(CO)3(H2O)3]+中间体，调节中间体的pH为5～6，然后加入含有0.5mgCN3PBB的DMF溶液，100℃下加热30min即得到所述的[99mTc(CO)3(CN3PBB)3]+配合物。
3.如权利要求1所述的99mTc(CO)3核标记的含异腈的帕博西尼衍生物在核医学显像领域制备肿瘤显像剂中的应用。
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