CN109313352B - 样品的基于图像的分析 - Google Patents

Abstract

一种对多个样品的基于图像的分析方法，包括：使用样品保持器(100)，其具有多个感兴趣位置(16、18)和多个焦点结构(12)，所述多个焦点结构(12)中的每一者与所述多个感兴趣位置(16、18)中的一者或多者相关联，其中所述多个样品分散在所述多个感兴趣位置(16、18)上；获得所述多个感兴趣位置(16、18)的图像区域，从而获得用于对所述多个样品的分析的多个数字图像区域，其中每个所述图像区域包括感兴趣位置(16、18)中的至少一者和焦点结构(12)中的至少一者；使用图像处理算法来分析每个所述数字图像区域并检查焦点结构(12)是否指示该图像区域处于清晰焦点；以及如果图像处理算法指示有任何数字图像区域失焦，则提供指示和/或采取补救措施。

Description

样品的基于图像的分析

技术领域

本发明涉及用于多个样品的基于图像的分析的方法和设备，以及涉及用于样品的此种基于图像的分析的样品保持器。在一些示例中，样品的基于图像的分析涉及检测样品中微观物体(诸如微观生物物体)的存在、量和/或不存在。

背景技术

在各个领域中重要的是能够快速有效地分析样品，并且特别的是能够检测和/或计数小物体，诸如生物颗粒、分子和细胞等。在生物技术中，例如与DNA复制/扩增有关，可能重要的是能够检测分子元素，诸如滚环产物(RCP)。在医学中，由微生物制剂引起的医学病症通常通过测试取自患者的样品来诊断。主要目的(特别是具有快速进展率的危及生命的病症，诸如败血症)是尽可能快地分析样品，以便可以鉴定微生物并施用适当的靶向治疗。因此，显然需要一种快速可靠的方法来分析可能含有微观物体的样品。

一种已知的用于检测微观物体的系统是流式细胞术。这是一种基于激光的生物物理技术，其用于细胞计数、细胞分选、生物标记物检测和蛋白质工程。将细胞悬浮在流体流中并通过电子检测装置传递。流式细胞术允许同时多参数分析每秒多达数千个颗粒的物理和化学特征。然而，流式细胞术是一种复杂的分析方法。

在US 2015/293270中，Q-Linea AB提出了一种用于检测微观物体的装置，该装置使用检测盘，检测盘具有用于流体样品的通道和与通道相邻的焦点结构。有利地，焦点结构是在光学平坦的样品保持器的模制期间形成的凹槽，其中凹槽通过利用硅模板的晶体结构而形成为精确的尺寸。硅模板具有光学平坦表面并且其被蚀刻以形成凹槽，该凹槽与硅的晶面对准。然后将模板用于制造母模，例如经由电镀镍，并且母模用作样品保持器的模具，使得样品保持器具有光学平坦表面以及精确成形的焦点结构。在US 2015/293270的优选实施例中提出的成像方法涉及使用专用聚焦相机和第二相机，专用聚焦相机基于凹槽的精确深度建立焦面，以及第二相机拍摄具有相同焦面的通道图像，以便通道中的微观物体具有正确的焦点。与现有技术系统相比，该装置和样品保持器具有显著的优点，并且特别的是能够可靠地聚焦并因此检测通道中的各个微观物体。然而，仍然需要进一步改进该领域中的方法、设备和样品保持器的能力。

发明内容

从第一方面看，本发明提供了一种对多个样品的基于图像的分析方法，该方法包括：使用样品保持器，所述样品保持器具有多个感兴趣位置和多个焦点结构，所述多个焦点结构中的每一者与所述多个感兴趣位置中的一者或多者相关联，其中所述多个样品分散在所述多个感兴趣位置上；获得所述多个感兴趣位置的图像区域，从而获得多个数字图像区域以用于对所述多个样品的分析，其中每个所述图像区域包括所述感兴趣位置中的至少一者和所述焦点结构中的至少一者；使用图像处理算法来分析每个所述图像区域并检查所述焦点结构是否指示所述图像区域处于清晰焦点；以及如果所述图像处理算法指示有任何数字图像区域失焦，则提供指示和/或采取补救措施。

图像区域可以是多个帧的复合帧。例如，可以使用线条相机，其每个帧是单行像素，并且其扫描并输出由多个帧组成的复合帧。在线条相机沿着多个感兴趣位置和对应的焦点结构扫描的情况下，图像区域可以是复合图像区域，其包括所有扫描的多个感兴趣位置和相应的焦点结构。替选地，可以对复合图像区域进行分割，以将其划分为多个图像区域，每个图像区域包括感兴趣位置和相应的焦点结构的子集(例如，仅一个感兴趣位置和相应的焦点结构)。

图像区域可以是单个帧。例如，可以使用区域相机，其将每个感兴趣位置与相应的焦点结构分开成像，使得每个帧显示单个感兴趣位置和相应的焦点结构。然后，每个单独的帧对应于图像区域。替选地，可以在单个帧中捕获多个感兴趣位置和相应的焦点结构，并且该单个帧可以构成单个图像区域。

图像区域可以是单个帧的子集。可以使用区域相机，其在单个帧中成像多个感兴趣位置和相应的焦点结构，然后可以对单个帧进行分割以将帧划分为多个图像区域，每个图像区域包括感兴趣位置的子集和相应的焦点结构的子集(例如，仅一个感兴趣位置和相应的焦点结构)。

图像区域也可以是由区域相机捕获的多个帧的复合帧。

从前面的讨论中应该清楚的是，图像区域是帧、帧的子集或多个帧的复合帧，其包括至少一个感兴趣位置和至少一个焦点结构。随后，“图像区域”被称为“数字图像”或简称为“图像”。

利用这种方法，可以尽可能快地在大量的感兴趣位置上收集图像，同时还确保可以通过检查焦点结构的图像来自动检查图像的准确性，焦点结构也可以描述为聚焦参考结构。与US 2015/293270的方法相反，对于每个图像没有单独的聚焦步骤，这可能导致成像过程需要更长的时间。当涉及样品保持器上的大量样品和位置时，增加的时间可能相当大。在收集数字图像之后，可以经由图像处理算法检查每个图像的焦点(尽管可选地与拍摄相同样品保持器的后续数字图像并行)，因为每个图像包括与感兴趣位置相关联的一个或多个焦点结构，而不仅仅是样品的位置。这可以通过检查焦点结构清晰地成像来完成，其中焦点结构位于焦面中以便清晰地成像样品。替选地，在一些情况下，焦点结构可以在焦面的外部，在这种情况下，每个图像的焦点可以包括检查焦点结构以与所需焦面一致的方式成像。所提出的方法可以大大减少获得和检查多个样品的多个图像的焦点所花费的时间，并且即使在其中一个或多个图像失焦并且可能需要补救措施的情况下也可以节省时间。

方法可以包括使用具有预设焦面的成像设备以获得多个图像。这可以允许尽可能快地获得图像，这依赖于样品保持器和装置完全对准并且向成像设备呈现平坦焦面的假设。可以基于预设焦面的预设焦点来收集所有所需的图像，其中该过程的速度仅受成像设备本身的速度限制。替选地，成像设备可以通过连续聚焦获得图像，优选地独立于任何焦点结构。快速连续聚焦设备是可用的，并且尽管这可能对获得图像的速度产生影响，但是第一方面的方法仍然提供比现有技术方法更快的过程，其包括针对每个成像步骤经由焦点结构检查焦点。在获得图像期间连续聚焦的情况下，然后，之后仍然检查焦点以确保聚焦过程已正确完成。

在其中样品的分析涉及确认特征是否存在的情况下，特别是在其中正确的焦点对于获得清晰可靠的图像非常重要的微观物体成像的情况下，所提出的方法提供了显著的优点。样品可以是其中需要确定样品中微观物体的存在、量和/或不存在的样品。因此，成像可以放大成像和/或以适合于微观物体成像的高分辨率成像。方法可以包括确定微观物体是否存在于图像中，例如使用上述图像处理算法或其它的图像处理算法。缺少特征可能难以或不可能区别于失焦图像，尤其是在其中涉及微观物体的情况下。通过使用与每个感兴趣位置相关联的至少一个焦点结构，可以经由图像分析算法确认图像处于聚焦，并且从而图像中的缺少特征是可靠的指示，即样品中不存在该特征。以这种方式，可以最小化假阴性的风险，并且样品分析的阴性结果中存在高度置信度。相同的焦点检查过程意味着在确定是否存在微观物体时和/或在确定微观物体的量时存在类似的高置信度。

微观物体可以是包含在样品流体中的物体，并且因此样品保持器上感兴趣位置可以是用于容纳多个样品的样品流体的体积。样品流体通常是液体，其中物体悬浮在液体中。替选地，物体可以主要位于包含样品流体的体积的表面上，例如底表面上。因此，体积可以在焦深方向上具有深度，并且在与数字图像的平面对应的二维平面中具有横截面。感兴趣位置可以包括样品保持器中或其上的孔和/或通道，孔和/或通道提供用于容纳样品流体的体积。如上所述，每个数字图像包括感兴趣位置以及一个或多个相关的焦点结构。

优选地，相关联的焦点结构紧邻相应的感兴趣位置。焦点结构可以放置在感兴趣位置的体积内，诸如在体积的底部处。替选地，焦点结构可以与体积相邻并且足够靠近体积的边缘，使得它可以包括在相同的图像中。因此，作为组合的成像设备和样品保持器布置成使得成像设备能够在相同的图像区域中成像感兴趣位置的体积和焦点结构。

图像区域可以是由成像设备捕获的帧，或者可以是帧的子集，或者可以是多个帧的复合帧。

成像设备可以是线条相机，其通过沿着感兴趣位置和相应的焦点结构扫描来捕获多个帧并输出由多个帧组成的复合帧。在这种情况下，给定焦点结构处于焦点内或失焦的信息可能仅适用于同一线列的其它部分。在焦点结构之前或之后成像的线将不包含焦点信息。

如果图像区域是由区域相机捕获的单个帧，则如果选择较大视场的成像设备，则焦点结构不需要如此接近感兴趣位置，而如果样品保持器可以制造成焦点结构非常靠近感兴趣位置，则对成像设备性能的限制较少。如下面更详细说明的，一个示例性样品保持器具有沿通道间隔开的多个孔，通道提供孔之间的流体连通。孔的宽度可以是例如1-5mm，优选1至3.5mm，优选1.5至3mm，其中深度最多5mm。焦点结构可以在成像设备可以拍摄包括通道和相关联的焦点结构的图像的足够距离内邻近通道的端部。焦点结构可能是距离通道端部的孔的宽度的三到四倍。

代替在每个通道的端部附近提供焦点结构，可以在相邻的孔之间提供焦点结构。焦点结构可以在孔的外部宽度的向内间隔开，其中宽度是在垂直于其中多个孔所位于的线的方向上的孔的范围。在使用线条相机的情况下，此种布置是特别有利的。

在使用线条相机成像的情况下，可以放置多个焦点结构，使得它们在由线条相机成像的例如每第10行、每第50行或每第100行中可见。替选地，每个通道可以在视场内与单个焦点结构相关联并且平行于线条相机的运动方向，单个焦点结构包括沿着通道的长度延伸的凹槽或线。在那种情况下，焦点结构的一部分可以存在于由线条相机成像的每个线中。

方法可以与样品一起使用，样品可以包含微观物体，微观物体包括颗粒(特别是生物颗粒)、细胞、微生物(诸如细菌)、其它病原体(诸如病毒和真菌病原体)和/或包括大分子的分子。微观物体可以包括任何物体，其尺寸适当的小并且可以基于成像方法检测，方法包括可能地使用物体的荧光或施加到物体上的荧光组合物的荧光。在一些示例中，如果物体是没有散射特性的半透明物体，例如RCP，则物体的尺寸可以是10μm或更小，可能是尺寸为5μm或更小。物体可具有2μm或更小的最大尺寸，可能是1.5μm或更小，1μm或更小，并且在一些情况下为0.5μm或更小。

在一些示例性实施例中，样品保持器是可消耗的一次性产品，其可在使用后丢弃。这允许在不需要清洁样品保持器并最小化样品污染的风险的情况下重复使用相同的成像设备。方法可以包括使用第一样品保持器对第一组样品进行基于图像的分析，以及使用其它的样品保持器对第二组样品和任选的其它组样品进行后续的基于图像的分析。

样品保持器可以具有光学平坦表面，并且可以包括透明材料。样品保持器可以包括用于保持所有样品和所有感兴趣位置的单个部件，其中在这种情况下，样品保持器的形式和制造可以类似于US 2015/293270的形式和制造。替选地，样品保持器可以层叠有第一层，第一层具有包括焦点结构的光学平坦表面并且为包含样品的体积提供底部，其中体积被包围在平坦层顶部上的第二层内。光学平坦层可以使用母模制造，母模本身来自具有与光学平坦层类似形状的模板。因此，光学平坦层可以以与CD类似的方式制造。这允许光学平坦表面和焦点结构的精确模制以及光学平坦层的任选其它表面特征。CD型制造工艺在可消耗的一次性产品的情况下是特别有用的，因为它可以用于样品保持器的成本有效的大规模生产，或者在用于样品保持器的层的情况下是特别有用的，其具有光学平坦表面以及精确成形并定位的焦点结构。

在使用分层结构的情况下，可以存在包围体积顶部的第三层，优选地是与成像系统兼容的层，例如对可见光透明的层。第三层可以包括透气材料和/或可以包括用于从样品中释放气体的开口。第三层可以具有通气孔或孔，其任选地覆盖有透气膜。这可以允许气体在样品保持器充满样品时逸出。

焦点结构可以是在正确焦面的所需深度处具有至少一个尖锐边缘或顶点的形状。这产生了在数字图像中具有鲜明对比度的特征，并且因此提供了当图像处于正确焦点时可以由图像处理算法容易且可靠地识别的图像特征。优选地，焦点结构包括三维形状，其可以形成为样品保持器中的凹坑或突起。焦点结构可以成形为为透射和反射的光成像提供足够的对比分辨率。在有利的示例中，三维形状配置成使得穿过光学平坦层下方的材料的光被折射和/或反射，以便将具有鲜明对比度的光图案发送到成像设备。例如，焦点结构可以包括成角度的侧，其中角度基于围绕焦点结构的材料的折射率设置，使得所有或大部分来自焦点结构下方的入射光在内部被反射，以大大减少从焦点结构进入光学检测系统的光的量。

在一些示例性实施例中，焦点结构包括样品保持器中的凹槽或金字塔形腔。金字塔形腔的顶点或凹槽的底部可以在数字图像中提供所需的鲜明对比度。当与US 2015/293270中的凹槽一起使用时，第一方面的方法可以提供如上所述的优点，并且因此方法可以包括使用具有如US 2015/293270中的通道和凹槽布置的样品保持器。

方法可以包括使用样品保持器，其具有基于使用模板或母模的晶面形成的特征模制的焦点结构，例如通过蚀刻用于形成具有相反几何形状的母模的硅模板，其中样品保持器或其层(诸如上面讨论的光学平坦层)通过基于母模的模制形成。硅晶面可以在焦点结构的侧壁和光学平坦表面之间提供54.7°的角度，并且在透明材料围绕焦点结构的情况下，存在能够产生从焦点结构下方照射的光的全内反射的各种材料，例如如下所述的诸如

聚合物的材料。与US 2015/293270中提出的工艺类似的CD型制造工艺可以用于生产该层。应当注意，尽管优选实施例使用类似于CD的圆形几何形状，但这不是必要特征，并且可以使用替代的几何形状，同时仍然利用CD型模制工艺来确保光学平坦表面和精确形成的焦点结构。

在与每个感兴趣位置相关联的每个焦点结构中可以存在多个凹槽和/或金字塔，其中多个凹槽和/或金字塔中的每一者具有相同的深度，并且因此在相同的焦深处提供具有鲜明对比度的特征。下面更详细地描述使用一个或多个金字塔焦点结构的示例性样品保持器，以及制造此种样品保持器的方法。如下所述，焦点结构可以各自包括多个金字塔，这产生了优点，因为存在多个顶点作为在所需焦面上间隔开的聚焦参考点。

焦点结构也可以用作局部x-y参考的基准标记。

样品可以是测试样品，其中微观物体的存在、数量和/或不存在取决于测试结果。方法的一个用途是药物敏感性测试，诸如抗生素敏感性测试(AST)，其中快速获得多个图像以分析多个样品的能力可能极为重要。因此，优选实施例的方法可以是基于显微镜的AST的、对多个样品的基于图像的分析方法。在AST的情况下，样品保持器可以和与多种不同抗生素和/或不同的抗生素浓度相关的多个感兴趣样品一起使用，其中数字图像用于确定微生物(诸如细菌)的存在或不存在和/或微生物的量，从而确定哪种抗生素和/或哪种浓度有效抑制微生物生长。样品的分析可以包括使用上述图像处理算法或其它图像处理算法来识别哪些样品包括微生物，并且优选地识别样品中的微生物的量。方法可以包括在不同时间拍摄多组图像以建立微生物的生长速率，并且因此能够建立参数，诸如抗生素的最小抑制浓度(MIC)。方法可以包括使用具有用于药物测试(诸如显微镜AST)的特征的样品保持器，如下面更详细地解释的。

在使用预设焦面的情况下，预设焦面可以是成像设备的参数，其基于样品保持器的标准化格式和位置来设置。替选地，可以在获得图像之前设置预设焦面，例如通过使用一个或多个焦点结构拍摄一个或多个参考图像以及通过基于参考图像确定成像设备的最佳焦点。

在方法包括提供失焦图像的指示的情况下，指示可以包括将图像识别为需要进一步分析和/或检查(即验证)的图像。替选地或附加地，指示可以包括将图像识别为可能不可信赖的。在某些情况下，可能存在来自处于聚焦的剩余图像的足够信息，以允许忽略任何失焦图像。在这种情况下，不需要采取进一步的补救措施。例如，如果样品的基于图像的分析用于AST，并且失焦图像涉及较低浓度的抗生素，当有清晰图像示出较高浓度的相同抗生素无效时，则可能不需要解决失焦图像，因为它可能与确定使用的抗生素所需的浓度无关。

在方法包括采取补救措施的情况下，补救措施可以是重新成像其中原始图像失焦的感兴趣位置，使用图像处理来移除失焦区域，或调整原始数字图像数据以改善数字图像。

成像设备可以包括光学和电子元件，其根据需要以所需的放大率捕获数字图像。成像设备可以是传统数字相机，其使用二维数字图像传感器，诸如CCD或CMOS传感器。样品保持器和数字图像传感器可以相对于彼此移动，使得传感器可以在样品保持器上的所有感兴趣位置处捕获数字图像。例如，可以旋转样品保持器并且可以平移成像设备，以便可以在样品保持器的圆形区域上的任何点获得图像。或者，成像设备可以是线条相机，其具有线性数字图像传感器，诸如线性CCD传感器。在这种情况下，样品保持器和数字图像传感器可以在捕获每个图像期间相对于彼此移动以及在不同的感兴趣位置之间移动。方法可以包括使用多个成像设备以进一步加速样品成像的过程。

当使用区域相机时，在图像区域是显示单个感兴趣位置和相应的焦点结构的单个帧的情况下，成像过程可以如下：

1.移动到感兴趣位置；

2.暂停以使系统稳定，使得图像传感器和样品保持器都不会运动；

3.自动对焦图像传感器；

4.对感兴趣区域进行成像；以及

5.对每个感兴趣位置重复步骤1到4。

当对多个感兴趣位置进行成像时，替代地使用线扫描成像方法以及跟踪自动聚焦是有利的(更简单和更快速)。该过程可以如下：

1.移至感兴趣位置的第一行；以及

2.一次性对感兴趣位置的整个行进行成像，在不断调整焦点的同时在相机线上移动感兴趣位置的线。

相机可以将一系列帧(即，单行像素)输出到帧抓取器卡，帧抓取器卡从多个帧创建复合图像。此复合图像可以包含聚焦的部分和失焦的部分。复合图像可以被传递到图像分析软件，该软件将复合图像切割并截断为相关部分，即，切割并截断成多个图像区域，每个图像区域包括感兴趣位置和相应焦点结构。然后，可以通过软件分析图像区域。

在上述两种方法中，焦点可以在两个点之间外推。对于线条相机，这仅需要沿着线条相机的线进行外推，而对于区域相机，这要求外推与测量的多个点之间的区域相关。后者对可消耗品的平坦度和质量提出了更高的要求。因此，从可消耗品的角度来看，线条相机外推是有益的。

其它替代方法是动态区域成像。这里，对于线成像，感兴趣位置可以沿着成像线连续移动。然而，使用区域扫描相机，其在往复期间的相关时间处曝光。曝光时间足够短以保持图像质量，并且成像频率与区域扫描相机的帧速率兼容。曝光时间可以由相机本身设定，或者通过与视场中感兴趣位置同步地频闪照射来设定。

从第二方面看，本发明提供了一种计算机程序产品，其包含用于在对多个样品进行基于图像的分析的设备上执行的指令，设备包括：样品保持器，其具有多个感兴趣位置和多个焦点结构，所述多个焦点结构中的每一者与多个感兴趣位置中的一者或多者相关联，其中多个样品在使用中分散在多个感兴趣位置上；成像设备；以及图像处理系统；其中，指令在执行时将设备配置成：使用成像设备获得多个感兴趣位置的数字图像区域，其中每个图像区域包括至少一个感兴趣位置和至少一个焦点结构；分析每个数字图像区域并检查至少一个焦点结构是否指示图像区域处于清晰焦点；以及如果图像处理算法指示有任何数字图像区域失焦，则提供指示和/或采取补救措施。

如参考第一方面详细解释的，图像区域可以是帧、帧的子集或多个帧的复合帧，其包括至少一个感兴趣位置和至少一个焦点结构。随后，“图像区域”被称为“数字图像”或简称为“图像”。

指令还可以布置成将设备配置为执行上述任何方法步骤，例如通过控制成像设备以拍摄附加图像来采取补救措施。对多个样品进行基于图像的分析的设备可以具有如下所述的特征，并且还应当注意，如下所述，对多个样品进行基于图像的分析的设备可以由可以被彼此分离或者远离的多个单独元件组成。例如，图像处理系统可以是与成像设备不同的物理系统的一部分，诸如从远程位置与成像设备通信的单独的计算机系统。

从第三方面看，本发明提供了一种用于多个样品的基于图像的分析的设备，设备包括：样品保持器，其具有多个感兴趣位置和多个焦点结构，所述多个焦点结构中的每一者与所述多个感兴趣位置中的一者或多者相关联，其中所述多个样品在使用中分散在所述多个感兴趣位置上；成像设备，其布置成获得所述多个感兴趣位置的图像区域，其中每个所述图像区域包括所述感兴趣位置中的至少一者和所述焦点结构中的至少一者；以及图像处理系统，其布置成分析每个所述数字图像区域并检查所述焦点结构是否指示所述图像区域处于清晰焦点；并且如果所述图像处理算法指示有任何数字图像区域失焦，则提供指示和/或采取补救措施。

如参考第一方面详细解释的，图像区域可以是帧、帧的子集或多个帧的复合帧，其包括至少一个感兴趣位置和至少一个焦点结构。随后，“图像区域”被称为“数字图像”或简称为“图像”。

成像设备可以是线条相机，其配置成通过沿着感兴趣位置和相应的焦点结构扫描来捕获多个帧并输出由多个帧组成的复合帧。

该设备可以根据第一方面的方法操作，并提供类似的优点。因此，设备可以在没有单独的聚焦相机的情况下与成像设备并行使用。设备可以与样品一起使用，其中需要确定样品中微观物体的存在、量和/或不存在。因此，成像设备可以布置成放大成像和/或以适合于微观物体成像的高分辨率成像。成像处理系统可以布置成确定图像中是否存在微观物体。

用于对多个样品进行基于图像的分析的设备可以包括样品，并且样品可以包括包含在样品流体中的微观物体，诸如上面讨论的微观物体。流体可以是液体，其中微观物体保持悬浮。替选地，微观物体可以位于样品保持器或保持样品液体的载玻片的表面上，例如底表面上。样品液体可以包括临床样品或源自临床样品的材料，其中临床样品包括但不限于血液、血清、血浆、血液成分、关节液、尿液、精液、唾液、粪便、脑脊液、胃内容物、阴道分泌物、粘液、组织活检样品、组织匀浆、骨髓抽吸物、骨匀浆、痰液、抽吸物、伤口渗出液、拭子和拭子冲洗液(例如鼻咽拭子)和其它体液等。样品液体可以包括培养基，并且可以是临床样品的混合物或源自具有培养基的临床样品的材料。样品可以是如上所述的测试样品。可将样品分成级分/等分试样/部分，其各自暴露于不同的培养基。

样品保持器上的感兴趣位置可以是用于容纳多个样品的样品流体的体积。体积可以如上所述，并且因此可以包括孔和/或通道。如上所述，样品保持器可以具有焦点结构，其如上所述靠近感兴趣位置。

在一些示例性实施例中，样品保持器是可消耗的一次性产品，其可在使用后丢弃。用于对多个样品进行基于图像的分析的设备可以布置成例如在盒式系统中和/或在转盘上相对于成像设备支撑样品保持器。在样品保持器和成像设备之间可以存在可释放的连接，例如允许通过手将样品保持器从成像设备脱离的连接。可以使用此联接，其类似于用于在光盘读取器中保持光盘的联接。

样品保持器可以如上所述，并且还可以具有如下关于第四方面所讨论的特征。

用于对多个样品进行基于图像的分析的设备可以布置成在获得图像之前确定预设焦面。例如，成像设备可以配置成捕获一个或多个焦点结构的一个或多个参考图像，并且图像处理系统可以布置成基于参考图像确定成像设备的最佳焦点。

图像处理系统可以布置成提示成像设备通过拍摄原始图像中失焦的感兴趣位置的附加图像来采取补救措施。对多个样品进行基于图像的分析的设备可以由多个单独的元件组成，元件可以彼此分离或远离。例如，图像处理系统可以是与成像设备不同的物理系统的一部分，例如从远程位置与成像设备通信的单独的计算机系统。图像处理系统本身可以分布在不同的硬件元件上，例如，其中一个子系统执行焦点检查步骤，并且一个子系统确定在验证焦点之后图像中是否存在微观物体。

成像设备可以包括光学和电子元件，其根据需要以所需的放大率捕获数字图像。成像设备可以是传统数字相机，其使用二维数字图像传感器，诸如CCD或CMOS传感器。样品保持器和数字图像传感器可以相对于彼此移动，使得传感器可以在样品保持器上的所有感兴趣位置处捕获数字图像。替选地，成像设备可以是线条相机，其具有线性数字图像传感器，诸如线性CCD传感器。在这种情况下，样品保持器和图像传感器可以在捕获每个图像期间相对于彼此移动以及在不同的感兴趣位置之间移动。方法可以包括使用多个成像设备以进一步加速样品成像的过程。

从第四方面看，本发明提供了一种用于对多个样品进行基于图像的分析的设备的样品保持器，其可以是如上所述的设备，样品保持器包括：光学平坦表面；分散在光学平坦表面上的多个感兴趣位置，其每个在使用中对应于多个样品中的一个样品的位置；以及多个焦点结构，其与多个感兴趣位置相关联；其中每个焦点结构包括在光学平坦表面中的至少一个金字塔形凹口。

在US 2015/293270中未公开金字塔的使用，尽管金字塔可以落入其权利要求的范围内。发明人已经认识到，金字塔在便于制造方面提供了优势，而不会对结合上述第一至第三方面所要求的检查焦点的能力产生负面影响。金字塔可以是比起凹槽不太复杂的形状，其以所需的精度制造以用作焦点结构。例如，金字塔可以更容易地蚀刻成结晶材料，诸如硅，然后可以将其用于制造母模，母模用于模制样品保持器的光学平坦表面。金字塔可以经由形成在掩模中的圆形孔蚀刻，而凹槽需要掩模中的长形孔，这可能更难以精确地形成。因此，光学平坦表面和焦点结构可以基于蚀刻的模板生产，其中表面和焦点结构的平面与模板材料的晶面(诸如硅的晶面)对准。如果需要大量或高密度的焦点结构，则使用金字塔结构也是有益的。需要在每个图像场内至少一个焦点结构是可见的，并且如果需要高放大率来分析样品保持器上的多个不同感兴趣位置的生物结构，则可能需要多个焦点结构。由于金字塔焦点结构更容易制造，因此对于更多数量的焦点结构，使用这种形状的焦点结构的优点增加。

样品保持器优选是可消耗的一次性产品，并且可以与上述方法和/或设备一起使用。样品保持器可以布置成与多个其它类似的样品保持器堆叠。

在一些示例实施例中，每个焦点结构包括在光学平坦表面中的多个金字塔形腔，其中每个金字塔具有相同的深度，使得焦点结构借助多个金字塔的顶点具有多个焦点参考点。焦点结构也可以具有附加特征，诸如凹槽等，但是在一个示例中，焦点结构仅包括金字塔而没有凹槽。每个金字塔的深度可以相同，并且该深度可以具有固定的(即，预定的、预先已知的或非任意的)值。当金字塔基于模板形成，其中蚀刻的金字塔与晶面对齐时，金字塔的深度直接与金字塔底部的大小相关，并且在制造工艺的公差范围内，金字塔的尺寸和形状可以都相同。金字塔可以例如是5μm至100μm深，诸如5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、60μm、80μm或100μm深，其中正方形底部的边长具有相似的尺寸范围。当使用硅晶面时，底部长度将等同于深度的两倍除以tan(54.7°)。

应当理解，可以使用如上所述的CD型制造工艺，并且样品保持器的优选实施例是具有类似于CD的圆形几何形状的盘形状。这是有利的特征，但不是必要的特征，并且可以使用替代的几何形状，同时仍然使用类似的模板和母模模制工艺来确保光学平坦表面和精确形成的焦点结构。

样品保持器上的感兴趣位置可以是用于容纳多个样品的样品流体的体积。体积可以如上所述，并且因此可以包括孔和/或通道。样品保持器可以具有如上所述靠近感兴趣位置的焦点结构，并且在每个焦点结构中存在多个金字塔的情况下，每个金字塔之间的间距不超过焦点结构与感兴趣位置的间距。

在一个示例性实施例中，每个焦点结构包括多个金字塔凹口，优选地至少四个对称间隔的金字塔凹口，其中凹口以此间距彼此间隔开，该间距不超过与焦点结构相关联的感兴趣位置处的体积的宽度的三倍，可选地不超过宽度的两倍或一倍。当焦点结构小于体积的宽度时，它可以放置在体积内，例如在体积的底部(即底表面)处。替换地，焦点结构可以与体积相邻，例如，它可以足够靠近体积的边缘，使得它可以包括在相同的图像中。焦点结构与体积的间距可以不大于体积宽度的四倍，可选地不超过体积宽度的三倍。也就是说，如果体积具有宽度W，则体积边缘与焦点结构之间的间距不大于4W，可选地不大于3W。例如，可以在正方形或矩形的四个角处间隔开四个金字塔凹口。在每个体积的每个端部处可以有两个金字塔凹口，并且针对该体积的焦点结构可以包括该四个凹口。以这种方式使用至少四个金字塔凹口给出在光学平坦表面上以二维间隔开的聚焦参考特征，这意味着可以参考光学平坦表面的平面的两个轴线来检查图像的焦点。因此可以检测成像设备的焦面相对于光学平坦表面的任何不期望的倾斜。这可能是在如上所述的样品的基于图像的分析方法期间，和/或在为成像设备预设所需焦面的同时。焦点结构还可以包括围绕金字塔凹口的圆形特征。这可以使得通过肉眼或在具有较小放大率的图像中更容易找到凹口的位置。

如上所述，一个示例性样品保持器具有沿通道间隔开的多个孔，通道提供孔之间的流体连通，其中焦点结构足够靠近通道的边缘，使得它可以包括在相同的图像中。沿着通道的孔是感兴趣位置，并且可以在孔中放置多个样品。有利的是通过通道连接多个孔，因为此时仅需要将样品流体分配到一个位置以便填充多个孔，并且还因为此种结构具有更少的可能需要关闭的孔。优选的是，分配位置与孔的数量的比显著小于1：1，例如对于每个分配位置5个或更多个孔。分配位置可以是覆盖层中的开口，覆盖层包围孔和通道的顶部，例如如下所述的分层样品保持器的第三层中的开口。

这种类型的几何形状可以用于样品测试方法，包括药物敏感性测试，诸如AST，其中单一类型的样品流体需要与化学或生物制剂的多种不同组合物组合进行测试。例如，通过AST，沿着通道的孔可以提供有多种不同类型的抗生素或多种不同浓度的抗生素，孔可以填充有样品流体，例如包含临床样品或来自临床样品(诸如如上文所述的临床样品)的材料的样品流体。临床样品可以来自患有感染的患者。通道用于在孔之间分配样品。然后，在一段时间之后，任选地包括将样品保持器暴露于所需的温育条件，诸如所需的温度和/或搅拌，可以如上所述对样品保持器中的样品进行成像和分析。可以使用具有多个孔的样品保持器将这些步骤与上述方法进行组合，以提供用于AST的对多个样品的基于图像的分析方法。

一种特别优选的样品保持器具有多个通道，其可以用于药物敏感性测试，诸如AST，每个通道具有多个孔，孔沿通道间隔开并通过通道连接，并且每个通道具有相关联的焦点结构。通道可以布置成沿圆形样品保持器的半径延伸的圆形阵列，其中焦点结构位于通道的外端部处，并且因此围绕样品保持器的圆周(或围绕与样品保持器的中心同心的圆形)。

在类似的样品保持器中，比起仅具有一个相关联的焦点结构，每个通道可以具有多个相关联的焦点结构，这些焦点结构与样品保持器的中心以设定间距分隔开，使得焦点结构沿着以样品保持器的中心为中心的同心圆放置。在使用线条相机的情况下，可以放置多个焦点结构，使得它们在由线条相机成像的例如每第10行、每第50行或每都100行中可见。

替选地，每个通道可以在视场内与焦点结构相关联并且平行于线条相机的运动方向，焦点结构包括沿着通道的长度延伸的凹槽或线。在那种情况下，焦点结构的一部分可以存在于由线条相机成像的每个线中。

用于药物敏感性测试(诸如AST)的样品保持器可以包括多个孔，其中孔中的抗生素准备好与样品流体一起使用。例如，孔可以包括粉末形式的抗生素，其中不同的孔包括不同的抗生素和/或不同浓度的抗生素。

样品保持器可以包括透明材料，其可以是光学平坦表面和焦点结构的材料。这可以是透明的注塑成型聚合物，例如UV级PMMA、PMMA、PC或其它基于COC聚合物的材料。当使用硅或类似材料的晶面形成焦点结构时以及当光线从空气入射到样品保持器上时，材料的折射率应优选大于约1.22(即1/sin(54.7°))，因为在这种情况下光学平坦表面与交点结构的侧壁之间的角度为54.7°。可能的材料包括折射率为1.5的

1060R，或硬化的PDMS(折射率为1.4)。例如，如果光入射通过水，则折射率需要变得更大(大于约1.63)。

样品保持器可以包括用于保持所有样品和所有感兴趣位置的单个部件，其中在这种情况下，样品保持器的形式和制造可以类似于US 2015/293270的形式和制造。替换地，样品保持器可以层叠有第一层，第一层具有包括焦点结构的光学平坦表面并且为包含样品的体积提供底部，其中体积被包围在第一光学平坦层的顶部上的第二层内。光学平坦层可以使用母模制造，母模本身来自具有与光学平坦层类似形状的模板。因此，光学平坦层可以以与CD类似的方式制造。这允许光学平坦表面和焦点结构的精确模制以及光学平坦层的任选其它表面特征。CD型制造工艺在可消耗的一次性产品的情况下是特别有用的，因为它可以用于样品保持器的成本有效的大规模生产，或者在用于样品保持器的层的情况下是特别有用的，其具有光学平坦表面以及精确成形并定位的焦点结构。

在使用分层结构的情况下，可以存在包围体积顶部的第三层，优选地是对成像系统透明的层，例如对可见光透明的层。第三层可以包括透气材料和/或可以包括用于从样品中释放气体的开口。第三层可以具有通气孔或孔，其任选地覆盖有透气膜。这可以允许气体在样品保持器充满样品时逸出。第三层可以具有用于将样品流体分配到感兴趣位置的体积中的开口。优选地，如上所述，存在比感兴趣位置少得多的开口，其中流体路径将每个开口接合到多个感兴趣位置，诸如如上所述的通道和孔布置。

本发明进一步扩展到模板，模板用于产生用于样品保持器的光学平坦表面和焦点结构或用于产生母模，该母模用于产生用于样品保持器的光学平坦表面和焦点结构，该模板包括光学平坦表面和多个焦点结构，或焦点结构的镜像，其中焦点结构分散在光学平坦表面上并且定位成使得与多个感兴趣位置相关联，并且焦点结构包括在样品保持器的表面中的多个金字塔凹口。

该模板可以用于产生第四方面的样品保持器的光学平坦表面和焦点结构。优选地，它是用于形成母模的模板，母模用于模制样品保持器，例如使用注塑成型，并且在这种情况下，模板可以有利地由结晶材料形成，其中结晶材料的晶面用于设定金字塔焦点结构的几何形状。应当理解，一个特定的示例是使用硅，其中硅的晶面对齐以提供光学平坦表面和金字塔的倾斜侧壁。硅的(100)表面可以是光学平坦表面，其中四个金字塔侧壁与硅的{111}平面对齐。金字塔的大小和布局可以如上所述。

本发明的另一方面提供了一种用于制造样品保持器的方法，样品保持器用于对多个样品进行基于图像的分析的设备，其可以是如上所述的设备，样品保持器包括：光学平坦表面；分散在光学平坦表面上的多个感兴趣位置，其每个在使用中对应于多个样品中的一个样品的位置；以及多个焦点结构，其与多个感兴趣位置相关联；方法包括将每个焦点结构形成为光学平坦表面中的至少一个金字塔形凹口。

方法可以包括形成具有如上所述特征的焦点结构和/或感兴趣位置。样品保持器上的感兴趣位置可以是用于容纳多个样品的样品流体的体积。体积可以如上所述，并且因此方法可以包括形成诸如上面讨论的那些体积，包括孔和/或通道。样品保持器可以形成有如上所述靠近感兴趣位置的焦点结构，并且在每个焦点结构中存在多个金字塔的情况下，每个金字塔之间的间距不超过焦点结构与感兴趣位置的间距。

例如，样品保持器可以设置有沿着通道间隔开的多个孔，通道提供孔之间的流体连通，其中焦点结构在距离通道的端部的三个或四个孔宽度内。方法可以包括提供多个孔，其中在孔中的抗生素准备好与样品流体一起使用。例如，孔可以包括粉末形式的抗生素，其中不同的孔包括不同的抗生素和/或不同浓度的抗生素。

方法可以包括基于使用模板或母模的材料的晶面形成的特征来模制焦点结构的金字塔凹口，例如通过蚀刻用于形成具有相反几何形状的母模的硅模板，其中样品保持器或其层(诸如上面讨论的光学平坦层)通过基于母模的模制形成。

方法可以包括：形成具有光学平坦表面的模板，优选地通过将表面与结晶材料的晶面对齐；将掩模应用于表面，该掩模在金字塔的所需位置处设置有圆孔；蚀刻模板以形成金字塔；以及然后移除掩模。然后，方法可以包括产生与模板相反的母模，然后使用母模来形成样品保持器的光学平坦表面和焦点结构。模板材料可以是硅。母模可以通过硅的电镀来制造。用于样品保持器的光学平坦表面和焦点结构可以通过使用母模进行模制来形成，例如经由注塑成型。

由于可以使用CD型制造工艺，因此样品保持器可以形成为具有类似于CD的圆形几何形状的盘形状。如上所述，这是有利的特征，但不是必要的特征，并且可以使用替代的几何形状，同时仍然使用类似的模板和母模模制工艺来确保光学平坦表面和精确形成的焦点结构。

方法可以包括将透明材料用于样品保持器的至少一部分，其可以是光学平坦表面和焦点结构。方法可以包括光学平坦表面和焦点结构的注射成型，例如如上结合样品保持器所讨论的材料。

方法可以包括在样品保持器的第一层上形成光学平坦表面和焦点结构，第一层还为在使用中将包含样品的体积提供底部。然后，方法可以包括在第一光学平坦层的顶部上提供第二层，其中第二层形成体积的侧壁。光学平坦层可以使用母模制造，母模本身来自具有与光学平坦层类似形状的模板，如上所述。在第二层上方可以存在第三层，其中第三层包围体积的顶部。第三层优选是此层，其在例如如上所述的用于图像分析的方法和设备中对所使用的成像系统透明。第三层可以包括透气材料和/或可以包括用于从样品中释放气体的开口。第三层可以具有通气孔或孔，其任选地覆盖有透气膜。

本发明扩展到用于抗生素敏感性测试的系统，其包括如上所述的样品保持器或设备。

本发明还扩展到用于抗生素敏感性测试和病原体识别的系统，其包括如上所述的样品保持器或设备。

为避免疑义，应该注意，第四方面和随后方面的样品保持器可以用于第一方面的方法并类似的由第二方面的计算机程序产品使用。可以将样品保持器提供作为第三方面的设备的一部分。

附图说明

现在将参考附图描述本发明的优选实施例，其中：

图1示出了具有分层结构的样品保持器；

图2是图1的一部分的近视图，其包括用于保持样品的孔；

图3是图1的一部分的近视图，该图示出了焦点结构，其太小而不能在图1中看到；

图4是使用金字塔凹口的焦点结构的放大视图；

图5a和图5b示出了指向金字塔凹口的光束以及由此产生的光线的反射和折射；

图6示出了使用高速荧光检测来检测样品保持器中的物体的示例性设备；以及

图7示出了孔和焦点结构的示意图。

具体实施方式

示例性实施例在样品的基于图像的分析中使用如图1至图4所示的样品保持器。方法使用合适的设备进行，该设备包括数码相机形式的成像设备。以下结合图6描述用于样品的基于图像的分析的设备的示例。样品包括微观物体，并且必须确保相机在样品上的正确聚焦，以使得可以可靠地确定微观物体的存在、不存在或数量/量。因此，样品保持器设置有焦点结构，其允许稍后的图像分析系统检查焦点是否正确。

样品保持器

如图1所示，样品保持器100具有三个层。第一光学平坦层10形成基层，并且如图3和图4的放大图所示，该层包括焦点结构12。第二层14放置在第一层10的顶部上并且形成有用于将样品流体保持在孔16中的体积，孔经由沿着通道18进行连接。有多个通道18，其每个具有它们自己的孔16。第一层10封闭孔16的底部。第三层20覆盖孔16和通道18的顶部。第三层20包括在每个通道18的一个端部处的开口22，以允许将样品流体分配到每个通道18中，并然后沿着通道18分配以填充所有孔16。第三层20还包括在每个通道18的另一端部处的通气孔24，以允许气体在通道18充满样品流体时离开通道18。通气孔24和可选的开口22可以由透气膜覆盖。图2示出了第二层14和第三层20的放大细节。通道18连接孔16的上部。在每个通道18的端部处是用于任何过量样品流体的储存器28。

所有层10、14、20都具有中心孔26，该中心孔在将样品保持器100装载到用于拍摄样品图像的设备期间使用。在该示例中，样品保持器100具有圆形几何形状，并且其可以以与CD类似的方式保持，因此被支撑在心轴转盘上并且被保持用于与样品保持器100上方和/或下方的成像元件一起旋转。中心保持器26形成安装件以将样品保持器100联接到心轴转盘。通道18从样品保持器100的中心向外朝向外圆周延伸，并且它们沿着径向线间隔开以及第一组通道18与每个第二通道18交错，第一组通道18的起点和终点更远离样品保持器100的中心，以及每个第二通道18的起点和终点更靠近样品保持器100的中心。替选地，通道不交错，使得每个通道在距样品保持器100的中心相同的距离处开始，并且终止于距样品保持器100的中心相同的距离处。第一层10和第三层20对于用于成像样品的波长的光应该是透光的，并且通常对可见光是透光的。第二层14可以不是透明的，尽管其可以是透明的。制造第一层的方法如下所述。第二层14可以是注塑成型的。第三层20通常相对较薄并且可以从片材切割，其中开口22和通气孔24切穿片材。在替代方案中，如果第三层20是透气的，则可以省去通气孔24。

在用于荧光分析的情况下，第一层10、第二层14和第三层20在相关波长区域(例如，450nm至700nm)中应该是非荧光的。

焦点结构

在一些或所有的通道18的端部处，在第一光学平坦层10的表面上形成焦点结构12。焦点结构12可以在每个通道18的端部处。下面描述用于形成光学平坦表面和焦点结构12的方法。焦点结构12可以靠近通道18的端部放置，以便其可以捕获在与通道18和一个或多个孔16的图像相同的图像中。在替代布置中，在每个孔16的底部处(即，在流体下方的光学平坦表面中)可能存在焦点结构12，或者可能存在邻近每个孔16或邻近每个通道18的焦点结构12，其中后者类似于US 2015/293270的布置。无论焦点结构12的布置如何，样品保持器100都成像为使得焦点结构12与样品保持器100上的感兴趣位置一起存在于每个图像中，在这个示例中，感兴趣位置将是孔16内的样品流体的体积。

在另一种布置中，每个通道18可以具有多个相关联的焦点结构12，这些焦点结构与样品保持器的中心以设定间距分隔开，使得焦点结构沿着以样品保持器的中心为中心的同心圆放置。焦点结构12可以设置在相邻的孔之间，在孔的外部宽度向内间隔开。例如，当线条相机用于成像时，焦点结构可以间隔开以出现在每第10行、每第50行或每第100行中。

焦点结构12用于如下所述的方法中，以检查图像中的焦点。使用预设焦面拍摄图像，或者可选地，在拍摄图像时可以使用用于连续快速聚焦的机构。可以基于将相机聚焦在焦点结构12上来确定预设焦面，或者其可以通过其它手段来确定。用于设置焦面的相机可以与用于拍摄图像以分析样品保持器100上的样品的相机相同。替选地，可以使用专用聚焦相机，如下面的图6中所示。

图5a和图5b示出了金字塔凹口30的操作，以在从下方用近似垂直于光学平坦表面的光束照射金字塔时提供具有鲜明对比度的图像特征。图5a示出了当以下面描述的方式与硅的晶面对准形成时，光学平坦表面和金字塔凹口30的侧面的几何形状。侧壁与平坦表面成54.7°。如图5b所示，当第一层10的材料的折射率大于约1.22(即1/sin(54.7°))时，垂直于平坦表面的准直光束在金字塔30的侧壁上产生全内反射。在不完全准直的光束的情况下，反射可能不是完全的，但是其对于如下所述的对比度检测仍然足够。

作为全内反射的结果，当从顶部观察时，金字塔凹口30的大部分区域看起来是暗的。如果成像相机精确地聚焦在金字塔凹口30的底部上，其中侧壁接触并形成金字塔凹口30的点，则出现亮点。这个亮点与金字塔的周围部分的较暗区域之间的对比度随着焦面的变化而迅速变化，从而实现精确的基于对比度的聚焦。

焦点结构的制造

焦点结构12由样品保持器100的第一层10中的凹口30,32的图案组成。第一层是使用由硅模板生产的例如镍形式的生产母模通过注塑成型进行制造。该过程类似于用于制造用于存储数据和音乐的光盘的过程。事实上，CD成型机可用于制造盘。硅模板蚀刻有凹口，其具有与所需的焦点结构12完全相同的形式。本文用于第一层10的特征的相同附图标记在下文用于表示硅模板的相应特征。

模板用作相反极性的模板以形成复制母模(制作母模板或母模)，其本身用于制造具有其光学平坦表面和焦点结构12的第一层10。复制过程可以例如是热塑性注塑成型或浇铸。生产母模板可以包含镍并且可以通过电镀生产。在一个优选实施例中，复制母模用于基于CD的热塑性注塑成型，以产生具有如上所述的焦点结构12的CD形状的第一层10。

硅晶片用于形成模板的光学平坦表面，其对应于第一层10的光学平坦表面并且与硅的(100)表面对准。沿着硅晶片的{111}平面蚀刻金字塔30。然后，母模表面和{111}平面之间的角度为54.7°。在形成金字塔凹口30之前，使用深反应离子蚀刻(DRIE)独立于硅基材中的晶轴取向蚀刻位于金字塔凹口30周围的圆32。在此种情况下，通常使用SIO硅来使用嵌入的氧化物层以限定其中随后将形成金字塔结构的孔的底部。形成第一凹槽的目的是限定孔尺寸并且还使得能够例如沉积已经在第一注塑成型结构中的药物或化合物，即，孔和焦点结构都可以在相同的模制结构中和在相同的模制循环中形成，因此不需要任何第二结构的组合来形成孔。这类似于在US 2015/293270的现有技术公开中形成通道和焦点结构的过程。替选地，金字塔30可以直接蚀刻到{100}平面中，其中边缘跟随{111}平面，并且不需要先前的DRIE蚀刻或类似物。在金字塔30直接蚀刻到硅的顶平面中的此种情况下，孔如图1至图4所示形成在第二层14中，例如通过结合包括通孔的第二结构,其在粘合或以其它方式附接到包含焦点结构12的底层10时形成具有孔的结构。在这种情况下，注射成型结构仅包含焦点结构，并且孔18稍后添加。

通过湿法蚀刻来蚀刻金字塔凹口30，例如利用氢氧化钾(KOH)。金字塔30的深度由用于湿法蚀刻的掩模中的开口的直径来限定。可以以高精度形成掩模中的圆孔，并且将以相同的高精度产生金字塔形凹口30的蚀刻。因此，焦点结构12提供与样品相邻的焦点参考点，其允许直接检查样品的图像是否在焦点上。应当注意，可以将焦点结构深度与样品图像的期望焦面之间的关系设置为彼此预定的偏移。焦点结构可以在升高的平台上，其中金字塔的尖端与所需的焦面齐平。替选地，一些焦点结构可能在距焦面的限定距离处具有尖端。这可以帮助确定图像与焦点的距离，从而实现可选图像重建的可能性。还应该注意的是，图1至图4中的比例有一些放大。金字塔30可以非常浅，并且因此即使所需的焦深位于光学平坦表面处或略高于其，金字塔也在焦点深度内。此外，由于金字塔在深度上始终相同，因此即使金字塔30的尖端不在与样品的所需焦面处于完全相同的焦面中，它们也提供关于焦点的信息。可以针对与在金字塔的尖端上的焦点具有相同的发散的相同焦点结构的图像来检查焦点结构的图像，从而检查样品上的焦点是正确的。

用于制造注塑成型的第一层10的材料可以是折射率为1.5的

1060R,或硬化的PDMS(其折射率为1.4)。材料的折射率应大于约1.22(1/sin(54.7°))，以使得从下方入射到焦点结构12上的光有内反射。其它合适的材料当然也可用于检测盘，诸如UV级PMMA、PMMA、PC或其它基于COC聚合物的材料。为了具有尽可能锐化的聚焦结构，优选使用具有优异的成形填充和流动特性的热塑性材料。

用于样品的基于图像的分析的设备

图6示出了设备的示例，其可以利用样品保持器100进行样品的基于图像的分析。样品保持器100是如图1至图4所示的圆形盘，并且其保持在心轴转盘上从而以类似于CD的方式旋转。样品保持器100的旋转将使不同的通道18与设备的光学器件成线。光学器件包括一个或多个激光器42形式的照明侧光学器件，其中波长基于待成像的样品的性质而设定。激光束通过可单独聚焦的光束扩展器44准直，从而使光束直径达到约8mm(1/e2)。对光束进行共线，并且共线光束穿过光束成形透镜46，其设计成与高数值物镜(Zeiss Fluar 40x，NA1.3，Carl Zeiss AB，斯德哥尔摩城，瑞典)一起产生沿通道18的长度的线照射轮廓，通道接收所有的孔16。最后，恰好在物镜入射光瞳之前，激光穿过激光通二向色镜52(SemrockInc，罗切斯特市，纽约)。

光学器件还包括用于处理来自样品的发射光的检测侧光学器件。通过物镜收集的发射光被反射或通过二向色镜52和全镜54，之后其由一个或多个CCD线检测器40(DALSASpyder3，1024像素，5kHz线速率，Parameter AB，斯德哥尔摩城，瑞典)收集。二向色镜和带通滤波器(未示出)可以用于经由透镜58将特定波长的光引导到检测器40。在成像期间，光学器件和样品保持器100可以相对于彼此移动，使得线条相机40可以获得包括孔16和焦点结构12的区域的图像。这可以是旋转或平移运动。

图7示出了孔16和焦点结构12、12’的示意性布局，焦点结构12、12’包括沿单个通道18(未示出)的金字塔凹口30(这里示意性地示为十字形)。线条相机40在箭头A所示的方向上沿着孔的线扫描。线条相机的有效长度(即每个单像素宽度的帧中由相机捕获的线的长度)由箭头L示出。由线条相机40获得的复合图像包括沿着通道的所有孔16和焦点结构12、12’，但是该复合图像可以由图像处理算法处理以将复合图像分成单独的图像区域，每个图像区域包括孔和相应的焦点结构12、12’。在一个示例中，与给定孔16相关联的焦点结构12包括在孔的每个端部处的两个金字塔凹口30。在另一个示例中，存在焦点结构12’，其在每个孔16的端部处包括四个金字塔凹口30。在每种情况下，几何形状(即金字塔凹口30的布局)可以是相同的(如图7中所示)，但是在成像处理中焦点结构12、12’与孔16的后续关联是不同的。

一小部分荧光可以由光束采样器56重定向到CCD区域检测器60(μEyeUI-1545LE-M，Parameter AB，斯德哥尔摩城，瑞典)上以便允许通道对准和预聚焦。样品保持器100下方的LED 62可以用作预聚焦的光源。可以存在电动机64，其用于使样品保持器100和光学器件相对于彼此移动以便改变焦点。

聚焦可以使用专用聚焦相机60，并且其作为设备的测试周期的一部分自动执行，以便为经由线条相机40获得的图像设置焦面。聚焦相机60可以是CCD区域成像芯片。它是区域相机，即捕获二维图像的相机。聚焦可以通过合适的算法进行。下面解释一种算法。

设备还包括用于分配样品流体和用于收集废液的流控技术。根据测试类型，可以实施不同的流控技术布置。通常，将存在一个或多个样品流体源48和废物储存器50。

在使用该设备时，样品保持器在样品保持器上的感兴趣位置上(例如在孔16中)提供适当的样品。使用线条相机40和预设焦面收集样品的图像，或者可选地，可以如上所述使用连续快速聚焦机制。对于当前目的而言重要的是在拍摄图像并使用焦点结构12之后检查图像的焦点。图像分析系统检查图像以通过识别焦点结构12并检查它们聚焦来确认图像处于焦点，或者如上所述确认它们没有聚焦到正确的程度。如果任何图像失焦，则可以向用户给出指示和/或可以采取补救措施。图像分析系统还可以进行其它图像分析，例如以确定微观物体的存在、不存在或量和/或确定微观物体的类型。

聚焦算法

可以使用如下所述的方法来确定用于预设线条相机40的焦点的焦面(当使用预设焦点时)。首先，焦面相对于金字塔凹口30的底部的位置放置在已知位置处。也就是说，已知金字塔不会聚焦，但是位置足够接近，使得可以识别焦点结构12的每个金字塔凹口30的暗区域。而且，已知实际焦点位置是在所需焦面的远侧还是近侧。

首先，算法找到金字塔的暗区域，并对其进行掩盖。然后，使用预定义的阈值，算法尝试找到包含在暗区域内的较亮区域。如果其尝试成功，则计算对比度值。然后，算法以限定步长将焦面移动到更接近凹槽底部，重复该过程，并且只要对比度值增加，算法就在相同方向上移动。当计算小于先前的对比度值时，移动方向反转，并且步长减半。此过程一直持续至达到使用可能的最小步长的最大焦点值。然后将金字塔凹口30的尖端聚焦到小于1μm，或甚至小于0.5μm。

下面描述了另一种更快的算法。首先，如上所述，算法找到金字塔的暗区，对其进行掩盖，并尝试使用预定义的阈值找到暗区域内包含的较亮区域。如果其尝试成功，则计算对比度值。然后，算法以恒定步长将焦面移动到更接近凹槽底部，并重复该过程。这里，恒定步长小于上述算法中使用的初始步长。一旦对比度值超过某个预定值，则算法停止。

显微镜AST

如图6所示的设备的一个用途是显微镜AST。在该实施例中，使用如图1至图4中的样品保持器100，其中孔16各自具有在AST中使用的抗生素。在一个示例中，沿着通道18的每个序列的孔16具有相同类型但具有不同浓度的抗生素，其中不同通道18含有不同类型的抗生素。可以在样品保持器100的制造期间将抗生素提供给孔16，例如通过以粉末形式添加它们和/或将它们粘附到孔16的壁上。因此，样品保持器100可以用准备在AST中使用的抗生素组大量生产，从而提供方便的可消耗产品，其可以与本文所述的方法一起用于快速的基于图像的AST。样品流体可以通过图6的设备添加到孔16中，例如从流体源48，或者样品流体可以在样品保持器100装配到设备之前添加。当样品准备好用于AST时，图6的设备用于获得每组孔16的图像，其中这些图像还包括相关的焦点结构12。然后将图像传递到图像分析系统，其自动识别并检查焦点结构12。如果焦点结构12确认图像聚焦良好，则可以将其传递用于其它分析。如果发现图像失焦，则向用户指示和/或采取补救措施。图像分析系统可以进一步分析图像以确定微生物的存在、不存在或量。然后，可以使用该分析的结果来确定哪种抗生素是最有效的。对于其中需要精确确定微观物体不存在的这种类型的分析，尤其重要的是可以确保图像聚焦。如果无法保证聚焦，那么存在此风险，即可能会错误地将失焦图像解释为显示没有微生物的图像。

RCP的高荧光检测

利用上述焦点结构12和焦点检查方法，如图6所示的设备的另一个用途是检测RCP。通过将图6的线检测器40适合为如下所述的专用高速荧光检测器械来分析含有标记的RCP的溶液。样品保持器100可以类似于US2015/293270的样品保持器，并且因此具有没有孔16的通道18，并且可以通过有利地利用如上所述的焦点结构12来代替US2015/293270的凹槽来调整样品保持器。将样品溶液推过横截面为200×40μm(W×H)的通道18。此种尺寸当然不是限制性的。通道18可以例如具有小于1000×100μm或小于5000×50μm的横截面。流动通道18在作为样品保持器100的CD格式的塑料盘上径向对准，其具有适当的光学透明盖和流体界面，从而允许在发生故障或堵塞的情况下快速改变通道18。

在该示例中，波长为488nm(Calypso，100mW，Cobolt AB，索尔纳，瑞典)、532nm(Samba 300mW，Cobolt AB)和640nm(Cube 640,40mW，Coherent Inc，圣克拉拉，加州)的三个激光器42通过可单独聚焦的光束扩展器44准直，从而使光束直径达到约8mm(1/e2)。对光束进行共线，并且共线光束穿过光束成形透镜46，其设计成与高数值物镜(ZeissFluar40x，NA 1.3，Carl Zeiss AB，斯德哥尔摩城，瑞典)一起产生在流动通道的询问体积上的线照明轮廓。最后，恰好在物镜入射光瞳之前，激光穿过激光通二向色镜52(SemrockInc，罗切斯特市，纽约)。

由使用注射泵(Tecan XLP6000，Tecan Nordic AB，默恩达尔，瑞典)在询问体积上泵送的RCP发射荧光，其中废弃样品流体传递到废物储存器50。发射的波长对应于与RCP结合的荧光标记的发射光谱。通过物镜收集的发射光被反射或通过二向色镜52和全镜54，之后其还由CCD线检测器40(DALSA Spyder 3，1024像素，5kHz线速率，Parameter AB，斯德哥尔摩城，瑞典)收集。二向色镜和带通滤光器(未示出)用于经由透镜58将来自每个特定荧光团的光引导到特定检测器40。一小部分荧光可以由光束采样器56重定向到CCD区域检测器60(μEyeUI-1545LE-M，Parameter AB，斯德哥尔摩城，瑞典)上以便允许通道对准和预聚焦。样品保持器100下方的LED 62可以用作预聚焦的光源。可以存在电动机64，其用于使样品保持器100和光学器件相对于彼此移动以便改变焦点。

将从每个检测器40运行的每个样品结果记录为一系列x-t图像，其中每个RCP通过图像分析进行识别。图像分析包括在检测器上的背景减影、模式识别、模式匹配以用于RCP和非特定事件的多荧光物体辨别，以及RCP计数。对于每种试剂，设定RCP数量的阈值以指定阳性样品。对于每个图像，识别焦点结构12，并且图像分析算法检查金字塔凹口30对焦。如果存在失焦图像，则可以采取补救措施。应当理解，通过在拍摄之后检查图像的焦点而不是在拍摄之前检查和设置每个图像的焦点，过程明显快于US 2015/293270的过程，并且此外，使用所提出的具有金字塔凹口的焦点结构12使得样品保持器100的制造更简单和更准确。

其它示例和变化

应当理解，图6的设备的特征可以改变，同时仍然利用与焦点检查方法和焦点结构12有关的新颖特征。例如，光学器件和成像设备40可以由其它系统代替，以获得样品和焦点结构30的数字图像。可以使用任何合适的成像技术。此外，本发明的新颖特征的优点不仅限于上述与显微镜AST和RCP检测有关的示例用途，而是它们可以应用于其它药物敏感性测试，以及在任何领域中的样品分析，其中需要获得用于基于图像的分析的样品的保证对焦的图像，尤其是在样品内的微观物体的情况下。

Claims (30)

1.一种对多个样品的基于图像的分析方法，所述方法包括：

使用样品保持器，所述样品保持器具有多个感兴趣位置和多个焦点结构，所述多个焦点结构中的每一者与所述多个感兴趣位置中的一者或多者相关联，其中所述多个样品分散在所述多个感兴趣位置上；

获得所述多个感兴趣位置的数字图像区域，从而获得多个数字图像区域以用于对所述多个样品的分析，其中每个所述数字图像区域包括所述感兴趣位置中的至少一者和所述焦点结构中的至少一者，其中每个所述数字图像区域是多个帧的复合帧，每个所述帧是通过线条相机成像的单行像素，其中当使用快速连续聚焦并在线条相机线上移动感兴趣位置时获得所述多个帧，但针对每个帧没有经由焦点结构检查焦点；

仅在获得多个所述数字图像区域之后，使用图像处理算法来分析每个所述数字图像区域并检查所述焦点结构是否指示所述数字图像区域处于清晰焦点；以及

如果所述图像处理算法指示有任何数字图像区域失焦，则提供指示和/或采取补救措施。

2.如权利要求1所述的方法，包括：检查所述焦点结构是否被清晰地成像，其中所述焦点结构位于所述样品的清晰成像所需的焦面中；或者在所述焦点结构位于所述样品的清晰成像所需的所述焦面之外的情况下，检查所述焦点结构是否以与所需焦面一致的方式成像。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述样品是如下样品：需要确定所述样品中微观物体的存在、量和/或不存在。

4.如权利要求1或2所述的方法，包括确定微观物体是否存在于所述数字图像区域中。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述微观物体是包含在样品流体中的物体，并且所述样品保持器上的所述感兴趣位置是用于容纳所述多个样品的样品流体的体积。

6.如权利要求1或2所述的方法，其中所述感兴趣位置包括在所述样品保持器中或所述样品保持器上的孔和/或通道，所述孔和/或通道提供容纳所述样品的体积。

7.如权利要求6所述的方法，其中每个焦点结构与一个或多个相关联的感兴趣位置的所述体积相邻并且足够靠近所述体积的边缘，使其能够与所述感兴趣位置处的所述样品包括在相同的数字图像区域中。

8.如权利要求7所述的方法，其中作为组合的成像设备和所述样品保持器布置成使得所述成像设备能够对所述感兴趣位置的所述体积与在所述相同的数字图像区域中的相关联的焦点结构一起进行成像。

9.如权利要求1或2所述的方法，其中所述样品保持器具有光学平坦表面。

10.如权利要求1或2所述的方法，其中所述焦点结构包括在所述样品保持器中形成为凹坑或突起的三维形状。

11.如权利要求1或2所述的方法，其中所述焦点结构包括成角度的侧，其中所述角度基于围绕所述焦点结构的材料的折射率设定，使得来自所述焦点结构下方的所有或大部分入射光在内部被反射。

12.如权利要求1或2所述的方法，其中所述样品是测试样品，其中微观物体的存在、量和/或不存在取决于测试结果。

13.如权利要求1或2所述的方法，用于药物敏感性测试。

14.一种用于基于显微镜的抗生素敏感性测试的、对多个样品的基于图像的分析方法，包括任一前述权利要求所述的方法。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述样品保持器和与多种不同抗生素和/或不同的抗生素浓度相关的多个感兴趣样品一起使用，并且其中所述数字图像区域用于确定微生物的存在或不存在和/或微生物的量，从而识别哪种抗生素和/或哪种浓度有效抑制微生物生长。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述微生物是细菌。

17.一种计算机存储介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序包含用于在对多个样品进行基于图像的分析的设备上执行的指令，所述设备包括：样品保持器，其具有多个感兴趣位置和多个焦点结构，所述多个焦点结构中的每一者与所述多个感兴趣位置中的一者或多者相关联，其中所述多个样品在使用中分散在所述多个感兴趣位置上；成像设备，所述成像设备包括线条相机；以及图像处理系统；

其中，所述指令在执行时将所述设备配置成：使用所述成像设备获得所述多个感兴趣位置的数字图像区域，其中每个所述数字图像区域包括所述感兴趣位置中的至少一个感兴趣位置和所述焦点结构中的至少一个焦点结构，其中每个所述数字图像区域是多个帧的复合帧，每个所述帧是通过所述线条相机成像的单行像素，其中当使用快速连续聚焦并在线条相机线上移动感兴趣位置时获得所述多个帧，但针对每个帧没有经由焦点结构检查焦点；

仅在获得多个所述数字图像区域之后，分析每个所述数字图像区域并检查所述至少一个焦点结构是否指示所述数字图像区域处于清晰焦点；以及如果图像处理算法指示有任何数字图像区域失焦，则提供指示和/或采取补救措施。

18.如权利要求17所述的计算机存储介质，其中所述指令布置成将所述设备配置为执行权利要求1至13中任一项所述的对多个样品的基于图像的分析方法的步骤或权利要求14至16中任一项所述的用于基于显微镜的抗生素敏感性测试的、对多个样品的基于图像的分析方法的步骤。

19.一种对多个样品进行基于图像的分析的设备，所述设备包括：

样品保持器，其具有多个感兴趣位置和多个焦点结构，所述多个焦点结构中的每一者与所述多个感兴趣位置中的一者或多者相关联，其中所述多个样品在使用中分散在所述多个感兴趣位置上；

成像设备，所述成像设备包括线条相机，其布置成获得所述多个感兴趣位置的数字图像区域，其中每个所述数字图像区域包括所述感兴趣位置中的至少一者和所述焦点结构中的至少一者，其中每个所述数字图像区域是多个帧的复合帧，每个所述帧是通过线条相机成像的单行像素，其中当使用快速连续聚焦并在线条相机线上移动感兴趣位置时获得所述多个帧，但针对每个帧没有经由焦点结构检查焦点；以及

图像处理系统，其布置成仅在获得多个所述数字图像区域之后分析每个所述数字图像区域并检查所述焦点结构是否指示所述数字图像区域处于清晰焦点；并且如果图像处理算法指示有任何数字图像区域失焦，则提供指示和/或采取补救措施。

20.如权利要求19所述的设备，包括在所述多个感兴趣位置处的多个样品，样品包括包含在样品流体中的微观物体。

21.如权利要求19或20所述的设备，其中所述样品保持器包括：光学平坦表面；分散在所述光学平坦表面上的多个感兴趣位置，所述多个感兴趣位置中的每一者在使用中对应于所述多个样品中的一个样品的位置；以及多个焦点结构，所述多个焦点结构与所述多个感兴趣位置相关联；其中每个所述焦点结构包括在所述光学平坦表面中的至少一个金字塔形凹口。

22.如权利要求21所述的设备，其中每个所述焦点结构包括在所述光学平坦表面中的多个金字塔形腔，其中每个所述金字塔具有相同的深度，使得所述焦点结构借助所述多个金字塔的顶点而具有多个焦点参考点。

23.如权利要求21所述的设备，其中所述样品保持器上的所述感兴趣位置是用于容纳所述多个样品的样品流体的体积，并且所述焦点结构与相关联的感兴趣位置的所述体积相邻并且足够靠近所述体积的边缘，使得所述焦点结构可以与所述样品包括在相同的数字图像区域中。

24.如权利要求21所述的设备，其中所述感兴趣位置包括沿通道间隔开的多个孔，所述通道提供所述孔之间的流体连通，其中所述焦点结构与所述通道的端部相邻。

25.如权利要求24所述的设备，包括多个通道，每个通道具有多个孔，所述多个孔沿所述通道间隔开并通过所述通道连接，并且每个通道具有相关联的焦点结构。

26.如权利要求21所述的设备，其中所述样品保持器或设备用于药物敏感性测试。

27.如权利要求26所述的设备，其中用于药物敏感性测试的所述样品保持器包括多个孔，其中在所述孔中的抗生素准备好与样品流体一起使用。

28.如权利要求27所述的设备，其中所述孔包括粉末形式的所述抗生素，其中不同的孔包括不同的抗生素和/或不同的抗生素浓度。

29.一种用于抗生素敏感性测试的系统，其包括如权利要求19至28中任一项所述的对多个样品进行基于图像的分析的设备。

30.一种用于抗生素敏感性测试和病原体识别的系统，其包括如权利要求19至28中任一项所述的对多个样品进行基于图像的分析的设备。

Images