CN109311914B - 用于细胞器特异性分子成像的镧系元素工具箱 - Google Patents

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Abstract

一种水溶性的简单稳定的基于三(N‑(叔丁基)乙酰胺)1,4,7,10‑四氮杂环十二烷的铕配合物HGEu001，其在初级纤毛中显示特异性亚细胞定位，在水中的量子产率高达10％，并且寿命为0.56ms。特别地，提供了配合物的设计和简易合成方法。在许多细胞系，例如HeLa、SN‑K‑SH和MRC5中进行了综合研究；基序结构HGEu002也被合成为阴性对照，用于体外成像研究。双光子体外成像在三个维度上进行，以突出HGEu001在初级纤毛中的特异性定位。这是直接初级纤毛成像的非常有限的实例之一。

Description

用于细胞器特异性分子成像的镧系元素工具箱
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年5月27日提交的美国临时专利申请系列号62/342,603和2017年5月25日提交的美国临时专利申请系列号15/604,660的优先权和权益，将其公开内容通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明涉及一系列水溶性的简单稳定的基于1,4,7,10-四氮杂环十二烷的镧系元素配合物HGEu001及其衍生物。具体地，本发明提供了基于三(N-(叔丁基)乙酰胺)1,4,7,10-四氮杂环十二烷的铕配合物HGEu001的合成方法，以及在活细胞初级纤毛荧光成像的方法。所述铕配合物HGEu001在初级纤毛中显示特异性亚细胞定位，在水中的量子产率高达10％，并且荧光寿命为0.56ms。本发明提供了用于细胞器特异性成像的镧系金属配合物的合成与应用。
发明背景
初级纤毛是一种单独的、非运动性的、基于微管的细胞器，其从大多数正常真核细胞的表面向外突出。研究表明初级纤毛积极参与哺乳动物中用于细胞迁移、稳态和细胞周期调节的各种细胞间信号传导途径，例如Hedgehog(Hh)、Wingless(Wnt)和PDGFRa。它还充当了细胞对外部刺激，如化学刺激、温度刺激和压力刺激的多感觉触角。
最近，大量新的、压倒性的证据支持初级纤毛与许多人类疾病和发育障碍(统称为纤毛疾病)显著相关，由此引发了对初级纤毛结构研究的重新关注。例如，已经发现初级纤毛信号传导的功能障碍与人多囊肾病、上皮性卵巢癌以及异常骨骼发育强相关；在胰腺、乳腺和前列腺肿瘤发生的整个阶段中也已经观察到初级纤毛的缺乏和附近蛋白质的过表达。
也就是说，到目前为止，对初级纤毛的作用知之甚少，其中主要原因是缺乏直接的特异性成像方法(例如可见-近红外荧光成像和磁共振成像)。目前有许多细胞器特异性标志物可用于线粒体、高尔基体和溶酶体。然而，到目前为止，初级纤毛的可视化只能通过使用抗体或绿色荧光蛋白进行免疫染色来实现，因为文献中尚未报道过初级纤毛特异性探针。这两种间接手段总是受到固定和递送问题的挑战；同时，自发荧光是不可避免的，并且通过它们获得的信息量是有限的。
为了解决所有上述问题，使用镧系金属配合物的直接的特异性成像工具是一种有前景的解决方案。铕的长发射寿命(微秒到毫秒区间)、高灵敏度、清晰可辨的指纹型光谱，与时间门控系统配对，可有效消除干扰性自发荧光，以及允许以时间分辨方式在体外或体内进行初级纤毛的特异性成像。
因此，事实证明，需要简化在初级纤毛中显示特异性亚细胞定位的配合物的设计和合成。对本部分或本申请的任何其他部分中的任何参考文献的引用或确认不应被解释为承认这样的参考文献可用作本申请的现有技术。
发明内容
因此，本发明的第一个目的涉及水溶性的、简单稳定的、基于三(N-(叔丁基)乙酰胺)1,4,7,10-四氮杂环十二烷的铕配合物HGEu001，其在初级纤毛中显示特异性亚细胞定位，在水中的量子产率高达10％，并且寿命为0.56ms的寿命。具体地，本发明提供了配合物HGEu001的设计和简易合成方法，这是本发明的一个实施方案的非常突出的方面。在许多细胞系，例如HeLa、SN-K-SH和MRC5中进行了综合研究；基序结构HGEu002也被合成为阴性对照，用于体外成像研究。双光子体外成像在三个维度上进行，以突出HGEu001在初级纤毛中的特异性定位。这是直接初级纤毛成像的非常有限的实例之一。
在本发明的第一方面，提供了用于使生物细胞中的棒状细胞器成像的化合物，所述化合物包括式(I)的分子：
Figure GDA0003003355710000031
其中Ln选自Eu、Tb、Gd、Yb、Er、Dy、Sm、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Tm和Y，X-选自Cl-、NO3 -、CH3COO-、ClO4 -或其他阴离子；A1选自C、N或Si；R1、R2和R3共同或单独地选自NH(叔)Bu、OH-或其他胺；R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10共同或单独地选自H、CF3、OMe、OEt、OH或NMe2；R11选自烷基、芳基醚、酯、酰胺或芳环；m为选自0、1、2或3的整数。更具体地，式(I)的分子的衍生物示于式(II)中：
Figure GDA0003003355710000032
其中R11选自：
Figure GDA0003003355710000041
其中R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19和R20共同或单独地选自H、CF3、OMe、OEt、OH或NMe2；A2选自C、N或Si。可选择地，每个衍生物中的X、A2和Rn(其中n＝4-20)的相应取代基定义如下：
HGL001：X＝CL，A2＝C，Rn＝H(n＝4-10、12-16)；
HGL002：X＝CL，A2＝C，Rn＝H(n＝4-10、12-15)，R16＝CF3；
HGL003：X＝CL，A2＝C，Rn＝H(n＝4-10、12-15)，R16＝OMe；
HGL004：X＝CL，A2＝C，Rn＝H(n＝4-10、12-15)，R16＝NMe2；
HGL005：X＝CL，A2＝N，Rn＝H(n＝4-10、12-15)；
HGL006：X＝CL，Rn＝H(n＝4-10、17-19)；
HGL007：X＝CL，Rn＝H(n＝4-10)，R20＝OH；
HGL008：X＝CL，Rn＝H(n＝4-10)，R20＝OEt；
HGL009：X＝CL，A2＝C，Rn＝H(n＝4-6、8、10、12-16)，R7＝R9＝OMe；
HGL010：X＝CL，A2＝C，Rn＝H(n＝4-6、8、10、12-15)，R7＝R9＝OMe，R16＝CF3；
HGL011：X＝CL，A2＝C，Rn＝H(n＝4-6、8、10、12-15)，R7＝R9＝R16＝OMe；
HGL012：X＝CL，A2＝C，Rn＝H(n＝4-6、8、10、12-15)，R7＝R9＝OMe，R16＝NMe2；
HGL013：X＝CL，A2＝N，Rn＝H(n＝4-6、8、10、12-15)，R7＝R9＝OMe；
HGL014：X＝CL，A2＝C，Rn＝H(n＝4-6、8、10、17-19)，R7＝R9＝OMe；
HGL015：X＝CL，A2＝C，Rn＝H(n＝4-6、8、10)，R7＝R9＝OMe，R20＝OH；
HGL016：X＝CL，A2＝C，Rn＝H(n＝4-6、8、10)，R7＝R9＝OMe，R20＝OEt；
其中Ln是指镧系元素；OMe是指甲氧基；NMe2是指硝基-二甲基；OEt是指乙氧基。
在本发明的第一方面的第一实施方案中，提供了用于使生物细胞中的棒状细胞器成像的化合物，所述化合物包括式(I)或式(II)的分子，其中所述生物细胞中的棒状细胞器是初级纤毛。
在本发明的第一方面的第二实施方案中，提供了用于使生物细胞中的棒状细胞器成像的化合物，所述化合物包括式(I)或式(II)的分子，其中所述成像可在活细胞中进行。
在本发明的第一方面的第三实施方案中，提供了用于使生物细胞中的棒状细胞器成像的化合物，所述化合物包括式(I)或式(II)的分子，其中所述成像使用线性荧光显微镜在UV光激发下进行或使用双光子共聚焦激光扫描显微镜进行。
在本发明的第一方面的第四实施方案中，提供了用于使生物细胞中的棒状细胞器成像的化合物，所述化合物包括式(I)的分子，其中所述分子包括HGEu001的化合物。HGEu001还可以由式(III)表示：
Figure GDA0003003355710000061
其中X为H；Ln为Eu。
在本发明的第一方面的第五实施方案中，提供了用于使生物细胞中的棒状细胞器成像的化合物，所述化合物包括式(I)、(II)或(III)的分子，所述化合物可以选择性结合于细胞中的蛋白质。
在本发明的第一方面的第六实施方案中，提供了用于使生物细胞中的棒状细胞器成像的化合物，所述化合物包括式(I)、(II)或(III)的分子，所述蛋白质可以是初级纤毛相关蛋白。
在本发明的第一方面的第七实施方案中，提供了用于使生物细胞中的棒状细胞器成像的化合物，所述化合物包括式(I)、(II)或(III)的分子，所述化合物用于定量分析初级纤毛相关蛋白。
在本发明的第一方面的第八实施方案中，提供了用于使生物细胞中的棒状细胞器成像的化合物，所述化合物包括式(I)、(II)或(III)的分子，所述化合物用作疾病诊断探针。
在本发明的第一方面的第九实施方案中，提供了用于使生物细胞中的棒状细胞器成像的化合物，所述化合物包括式(I)、(II)或(III)的分子，所述化合物用作靶向细胞器的特异性载体。
在本发明的第一方面的第十实施方案中，提供了用于使生物细胞中的棒状细胞器成像的化合物，所述化合物包括式(I)、(II)或(III)的分子，所述化合物与药物结合用于联合疾病治疗。
在本发明的第一方面的第十一实施方案中，所述式(I)、(II)或(III)的分子的使用包括将所述化合物溶解在水溶液中，然后在生物细胞中的棒状细胞器中积累，用于所述成像。
在本发明的第二方面，提供了用于使生物细胞中的棒状细胞器成像的方法，所述方法包括在生物细胞中的棒状细胞器中直接积累式(I)、(II)或(III)的化合物。
在本发明的第二方面的第一实施方案中，提供了用于使生物细胞中的棒状细胞器成像的方法，其中生物细胞中的棒状细胞器是初级纤毛。
在本发明的第二方面的第二实施方案中，提供了用于使生物细胞中的棒状细胞器成像的方法，所述方法包括积累式(I)、(II)或(III)的化合物，其中所述成像使用线性荧光显微镜在UV光激发下进行或使用双光子共聚焦激光扫描显微镜进行。
在本发明的第二方面的第三实施方案中，提供了用于使生物细胞中的棒状细胞器成像的方法，所述方法包括积累式(I)、(II)或(III)的化合物，其中所述成像可在活细胞中进行。
在本发明的第三方面，提供了用于定量分析初级纤毛相关蛋白的方法，所述方法包括在生物细胞中的棒状细胞器中直接积累式(I)、(II)或(III)的化合物。
在本发明的第四方面，提供了用于诊断初级纤毛相关疾病的方法，所述方法包括使用式(I)、(II)或(III)的化合物作为疾病诊断探针。
在本发明的第五方面，提供了用于靶向生物细胞中的初级纤毛的方法，所述方法包括使用式(I)、(II)或(III)的化合物作为靶向细胞器的特异性载体或试剂。
在本发明的第六方面，提供了用于治疗初级纤毛相关疾病的方法，所述方法包括将式(I)、(II)或(III)的化合物与药物结合施用，用于联合治疗。
在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括(include)”或“包含(comprise)”或诸如“包括(includes)”或“包含(comprises或comprising)”的变型将被理解为暗示包含所述整体(integer)或整体的组但不排除任何其他整体或整体的组。还应注意，在本公开内容中，特别是在权利要求和/或段落中，诸如“包括(included)”包含(comprises、comprised、comprising)”等术语可具有美国专利法中赋予其的含义；例如，它们可以表示“包括(includes、included、including)”等；并且诸如“基本上由…组成(consisting essentially of和consists essentially of)”的术语具有美国专利法中赋予它们的含义，例如，它们允许未明确列举的要素，但排除现有技术中存在的或影响本发明的基本或新颖特征的要素。
此外，在整个说明书和权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括(include)”或诸如“包括(includes或including)”的变型将被理解为暗示包括所述整体或整体的组但是不排除任何其他整体或整体的组。
本文选择使用的术语的其他定义可以在本发明的详细描述中找到并贯穿全文应用。除非另有定义，否则本文使用的所有其他技术术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
通过阅读随后的描述，本发明的其他方面和优点对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
附图简述
通过以下对本发明的描述，结合附图，本发明的上述目的和特征以及其他目的和特征将变得显而易见，在所述附图中：
图1A显示HGEu001在水溶液中的化学结构和发射光谱(10μM和λex＝340nm)。
图1B显示HGEu002在水溶液中的化学结构和发射光谱(10μM和λex＝340nm)。
图2A显示在HeLa细胞中孵育6小时后，来自HGEu001的红光发射的线性荧光显微图像(给药浓度＝10μM，λex＝375nm，带通＝610-630nm)。
图2B显示在HeLa细胞中孵育6小时后来自HGEu001的红光发射的线性荧光显微图像(给药浓度＝10μM，λex＝375nm，带通＝610-630nm)。
图2C显示在HeLa细胞中孵育6小时后来自HGEu001的红光发射的荧光显微图像(给药浓度＝10μM，λex＝375nm，带通＝610-630nm)。
图2D显示在HeLa细胞中的
Figure GDA0003003355710000091
Oregon Green的荧光显微图像(50nM，λex＝488nm，带通＝505-555nm)。
图2E显示在HeLa细胞中的
Figure GDA0003003355710000092
Green DND-26(L-7526)的荧光显微图像(50nM，λex＝488nm，带通＝505-555nm)。
图2F显示在HeLa细胞中的
Figure GDA0003003355710000093
Green FM(M-7514)的荧光显微图像(50nM，λex＝488nm，带通＝505-555nm)。
图2G显示图2A和2D的荧光显微镜合并图像。
图2H显示图2B和2E的荧光显微镜合并图像。
图2I显示图2C和2F的荧光显微镜合并图像。
图3A显示HGEu001在加入HeLa细胞后不同孵育时间点的双光子共聚焦成像。此为孵育3小时的显微成像。HGEu001的红光发射(箭头)定位在初级纤毛中。
图3B显示HGEu001在加入HeLa细胞后不同孵育时间点的双光子共聚焦成像。此为孵育6小时的显微成像。HGEu001的红光发射(箭头)定位在初级纤毛中。
图3C显示HGEu001在加入HeLa细胞后不同孵育时间点的双光子共聚焦成像。此为孵育18小时的显微成像。HGEu001的红光发射(箭头)定位在初级纤毛中。
图3D显示HGEu001在加入HeLa细胞后不同孵育时间点的双光子共聚焦成像。此为孵育24小时的显微成像。HGEu001的红光发射(箭头)定位在初级纤毛中。
图3E显示图3A中显示的荧光通道和亮视野通道的叠加图像(给药浓度＝10μM，λex＝700nm，滤波器带通＝550-665nm)。HGEu001的红光发射(箭头)定位在初级纤毛中。
图3F显示图3B中显示的荧光通道和亮视野通道的叠加图像(给药浓度＝10μM，λex＝700nm，滤波器带通＝550-665nm)。HGEu001的红光发射(箭头)定位在初级纤毛中。
图3G显示图3C中显示的荧光通道和亮视野通道的叠加图像(给药浓度＝10μM，λex＝700nm，滤波器带通＝550-665nm)。HGEu001的红光发射(箭头)定位在初级纤毛中。
图3H显示图3D中显示的荧光通道和亮视野通道的叠加图像(给药浓度＝10μM，λex＝700nm，滤波器带通＝550-665nm)。HGEu001的红光发射(箭头)定位在初级纤毛中。
图4A显示红色HGEu001的共染色实验的荧光显微镜图像，其具有针对初级纤毛的标记的距离(绿线)(给药浓度10μM HGEu001，在转染和表达GFP-ARL13B后孵育6小时)。
图4B显示绿色GFP-ARL13B的荧光显微镜图像，其具有针对初级纤毛的标记的距离(绿线)。
图4C显示图4A和4B的荧光显微镜图像的叠加，其具有针对初级纤毛的标记的距离(绿线)。
图4D显示HGEu001的强度。
图4E显示红色HGEu002(对照)的共染色实验的荧光显微镜图像，其具有针对初级纤毛的标记的距离(绿线)(给药浓度10μM HGEu002，在转染和表达GFP-ARL13B后孵育6小时)。
图4F显示绿色GFP-ARL13B的荧光显微镜图像，其具有针对初级纤毛的标记的距离(绿线)。
图4G显示图4E和4F的荧光显微镜图像的叠加，其具有针对初级纤毛的标记的距离(绿线)。
图4H显示HGEu002的强度。
图5A显示在HeLa细胞中孵育6小时的10μM HGEu001在xz平面中的三维体外成像和发射光谱(λex＝700nm)。
图5B显示在HeLa细胞中孵育6小时的10μM HGEu002在xz平面中的三维体外成像和发射光谱(λex＝700nm)。
图5C显示在HeLa细胞中孵育6小时的10μM HGEu001在xy平面中的三维体外成像和发射光谱(λex＝700nm)。
图5D显示在HeLa细胞中孵育6小时的10μM HGEu002在xy平面中的三维体外成像和发射光谱(λex＝700nm)。
图5E显示在HeLa细胞中孵育6小时的10μM HGEu001在xyz平面中的三维体外成像和发射光谱(λex＝700nm)。
图5F显示在HeLa细胞中孵育6小时的10μM HGEu002在xyz平面中的三维体外成像和发射光谱(λex＝700nm)。
图6A显示HGEu001的三维(通过z轴堆叠)双光子共聚焦体外图像，其中绿色GFP-ARL14B/GFP-IFT88/
Figure GDA0003003355710000111
Green FM(M-7514)共定位在HeLa细胞中(λex＝700nm)。HeLa细胞首先用GFP-ARL13B/GFP-IFT88转染或与
Figure GDA0003003355710000116
Green FM(M-7514)一起孵育15分钟，并进一步与10μM HGEu001一起孵育6小时。
图6B显示HGEu002(阴性对照)的三维(通过z轴堆叠)双光子共聚焦体外图像，其中绿色GFP-ARL14B/GFP-IFT88/
Figure GDA0003003355710000112
Green FM(M-7514)共定位在HeLa细胞中(λex＝700nm)。HeLa细胞首先用GFP-ARL13B/GFP-IFT88转染或与
Figure GDA0003003355710000113
Green FM(M-7514)一起孵育15分钟，并进一步与10μM HGEu002一起孵育6小时。
图6C显示HGEu001的暗视野的三维(通过z轴堆叠)双光子共聚焦体外图像，其中绿色GFP-ARL14B/GFP-IFT88/
Figure GDA0003003355710000114
Green FM(M-7514)共定位在HeLa细胞中(λex＝700nm)。HeLa细胞首先用GFP-ARL13B/GFP-IFT88转染或与
Figure GDA0003003355710000115
Green FM(M-7514)一起孵育15分钟，并进一步与10μM HGEu001一起孵育6小时。
图6D显示HGEu002(阴性对照)的暗视野的三维(通过z轴堆叠)双光子共聚焦体外图像，其中绿色GFP-ARL14B/GFP-IFT88/
Figure GDA0003003355710000121
Green FM(M-7514)共定位在HeLa细胞中(λex＝700nm)。HeLa细胞首先用GFP-ARL13B/GFP-IFT88转染或与
Figure GDA0003003355710000122
GreenFM(M-7514)一起孵育15分钟，并进一步与10μM HGEu002一起孵育6小时。
图7A显示HGEu001的HPLC谱。
图7B显示HGEu002的HPLC谱。
图8显示配合物HGEu001的HRMS(+ESI)谱。(C47H65EuN9O4[M–H2O–2H]+的m/z计算值：972.4372，实测值：972.4378；C47H66ClEuN9O4[M–H2O–H+Cl-]+的计算值：1008.4139，实测值：1008.4119；C47H67Cl2EuN9O4[M–H2O+2Cl]+的计算值：1044.3905，实测值：1044.3882)。
图9显示配合物HGEu002的HRMS(+ESI)谱。(C48H65EuF3N9O4[M–H2O–H]2+的m/z计算值：m/z＝1041.4324/2＝520.7162，实测值：520.7186。
图10显示HGEu001和HGEu002在水溶液中的吸收光谱(10μM)。
图11A显示HGEu001在水溶液中的发射光谱(10μM，λex＝340nm)。此为利用HoribaFlurolog-3分光光度计测得的发射光谱。将此光谱中各发射带和比率与如图1A-1B中的用Edinburgh instrument FLS920分光光度计测量的结果比较后，结果相同。
图11B显示HGEu002在水溶液中的发射光谱(10μM，λex＝340nm)。此为利用HoribaFlurolog-3分光光度计测得的发射光谱。将此光谱中各发射带和比率与如图1A-1B中的用Edinburgh instrument FLS920分光光度计测量的结果比较后，结果相同。
图12A显示配合物HGEu001在D2O和H2O中的发射衰变曲线(λem＝614nm。5D0→7F2。λex＝355nm)。
图12B显示配合物HGEu002在D2O和H2O中的发射衰变曲线(λem＝614nm。5D0→7F2。λex＝355nm)。
图13A显示表3中HGEu001的细胞毒性的原始数据。
图13B显示表3中HGEu002的细胞毒性的原始数据。
图14A显示HGEu002在加入HeLa细胞后不同孵育时间点的双光子共聚焦成像。此为孵育3小时的显微成像；HGEu002的红光发射定位在细胞质中(与图3A对应)。
图14B显示HGEu002在加入HeLa细胞后不同孵育时间点的双光子共聚焦成像。此为孵育6小时的显微成像；HGEu002的红光发射定位在细胞质中(与图3B对应)。
图14C显示HGEu002在加入HeLa细胞后不同孵育时间点的双光子共聚焦成像。此为孵育18小时的显微成像；HGEu002的红光发射定位在细胞质中(与图3C对应)。
图14D显示HGEu002在加入HeLa细胞后不同孵育时间点的双光子共聚焦成像。此为孵育24小时的显微成像；HGEu002的红光发射定位在细胞质中(与图3D对应)。
图14E显示图14A中显示的荧光通道和亮视野通道的叠加图像(给药浓度＝10μM，λex＝700nm，滤波器带通＝550–665nm)；HGEu002的红光发射定位在细胞质中(与图3E对应)。
图14F显示图14B中显示的荧光通道和亮视野通道的叠加图像(给药浓度＝10μM，λex＝700nm，滤波器带通＝550–665nm)；HGEu002的红光发射定位在细胞质中(与图3F对应)。
图14G显示图14C中显示的荧光通道和亮视野通道的叠加图像(给药浓度＝10μM，λex＝700nm，滤波器带通＝550-665nm)；HGEu002的红光发射定位在细胞质中(与图3G对应)。
图14H显示图14D中显示的荧光通道和亮视野通道的叠加图像(给药浓度＝10μM，λex＝700nm，滤波器带通＝550–665nm)；HGEu002的红光发射定位在细胞质中(与图3H对应)。
图15A显示在MRC-5细胞中孵育6小时的10μM HGEu001在xz平面中的三维体外成像(λex＝700nm，与图5A对应)。
图15B显示在MRC-5细胞中孵育6小时的10μM HGEu002在xz平面中的三维体外成像(λex＝700nm，与图5B对应)。
图15C显示在MRC-5细胞中孵育6小时的10μM HGEu001在xy平面中的三维体外成像(λex＝700nm，与图5C对应)。
图15D显示了在MRC-5细胞中孵育6小时的10μM HGEu002在xy平面中的三维体外成像(λex＝700nm，与图5D对应)。
图15E显示在MRC-5细胞中孵育6小时的10μM HGEu001在xyz平面中的三维体外成像(λex＝700nm，与图5E对应)。
图15F显示在MRC-5细胞中孵育6小时的10μM HGEu002在xyz平面中的三维体外成像(λex＝700nm，与图5F对应)。
图16显示化合物2的1H NMR谱(400MHz，DMSO-d6)。
图17显示化合物2的13C NMR谱(100MHz，DMSO-d6)。
图18显示化合物3的1H NMR谱(400MHz，DMSO-d6)。
图19显示化合物3的13C NMR谱(100MHz，DMSO-d6)。
图20显示化合物4的1H NMR谱(400MHz，DMSO-d6)。
图21显示化合物4的13C NMR谱(100MHz，DMSO-d6)
图22显示化合物5的1H NMR谱(400MHz，CDCl3)。
图23显示化合物5的13C NMR谱(100MHz，CDCl3)。
图24显示HGL001的1H NMR谱(400MHz，DMSO-d6)。
图25显示HGL001的13C NMR谱(100MHz，DMSO-d6)。
图26显示HGL002的1H NMR谱(400MHz,DMSO-d6)
图27显示HGL002的13C NMR谱(100MHz,DMSO-d6)。
图28显示用于初级纤毛特异性成像筛选的铕配合物的分子文库，所述铕配合物具有与HGEu001类似的结构。
图29显示HGEu001及其基序配合物HGEu002的合成方案(方案1)：(a)(4-乙炔基吡啶-2-基)甲醇，Pd(PPh3)4，CuI，DIPEA，THF；(b)MsCl，DIPEA，DCM；(c)1,4,7,10-四氮杂环十二烷，NaHCO3，CH3CN；(d)K2CO3，MeCN，60℃；(e)EuCl3-6H2O，H2O，MeOH，室温，24小时。
发明详述
本发明的第一个目的涉及水溶性的、简单稳定的、基于三(N-(叔丁基)乙酰胺)1,4,7,10-四氮杂环十二烷的铕配合物HGEu001，其在初级纤毛中显示特异性亚细胞定位，在水中的量子产率高达10％，并且寿命为0.56ms的寿命。具体地，本发明提供了配合物HGEu001的设计和简易合成方法，这是本发明的一个实施方案的非常突出的方面。在许多细胞系，例如HeLa、SN-K-SH和MRC5中进行了综合研究；基序结构HGEu002也被合成为阴性对照，用于体外成像研究。双光子体外成像在三个维度上进行，以突出HGEu001在初级纤毛中的特异性定位。这是直接初级纤毛成像的非常有限的实例之一。
在本发明的第一方面，提供了用于使生物细胞中的棒状细胞器成像的化合物，其包括式(I)的分子：
Figure GDA0003003355710000151
其中Ln选自Eu、Tb、Gd、Yb、Er、Dy、Sm、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Tm和Y、X-选自Cl-、NO3 -、CH3COO-、ClO4 -或其他阴离子；A1选自C、N或Si；R1、R2和R3共同或单独地选自NH(叔)Bu、OH-或其他胺；R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10共同或单独地选自H、CF3、OMe、OEt、OH或NMe2；R11选自烷基、芳基醚、酯、酰胺或芳环；m是选自0、1、2或3的整数。更具体地，式(I)的分子的衍生物显示在式(II)中：
Figure GDA0003003355710000161
其中R11选自：
Figure GDA0003003355710000162
其中R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19和R20共同或单独地选自H、CF3、OMe、OEt、OH或NMe2；A2选自C、N或Si。可选择地，每个衍生物中的X、A2和Rn(其中n＝4-20)的相应取代基定义如下：
HGL001：X＝Cl，A2＝C，Rn＝H(n＝4-10、12-16)；
HGL002：X＝Cl，A2＝C，Rn＝H(n＝4-10、12-15)，R16＝CF3；
HGL003：X＝Cl，A2＝C，Rn＝H(n＝4-10、12-15)，R16＝OMe；
HGL004：X＝Cl，A2＝C，Rn＝H(n＝4-10、12-15)，R16＝NMe2；
HGL005：X＝Cl，A2＝N，Rn＝H(n＝4-10、12-15)；
HGL006：X＝Cl，Rn＝H(n＝4-10、17-19)；
HGL007：X＝Cl，Rn＝H(n＝4-10)，R20＝OH；
HGL008：X＝Cl，Rn＝H(n＝4-10)，R20＝OEt；
HGL009：X＝Cl，A2＝C，Rn＝H(n＝4-6、8、10、12-16)，R7＝R9＝OMe；
HGL010：X＝Cl，A2＝C，Rn＝H(n＝4-6、8、10、12-15)，R7＝R9＝OMe，R16＝CF3；
HGL011：X＝Cl，A2＝C，Rn＝H(n＝4-6、8、10、12-15)，R7＝R9＝R16＝OMe；
HGL012：X＝Cl，A2＝C，Rn＝H(n＝4-6、8、10、12-15)，R7＝R9＝OMe，R16＝NMe2；
HGL013：X＝Cl，A2＝N，Rn＝H(n＝4-6、8、10、12-15)，R7＝R9＝OMe；
HGL014：X＝Cl，A2＝C，Rn＝H(n＝4-6、8、10、17-19)，R7＝R9＝OMe；
HGL015：X＝Cl，A2＝C，Rn＝H(n＝4-6、8、10)，R7＝R9＝OMe，R20＝OH；
HGL016：X＝Cl，A2＝C，Rn＝H(n＝4-6、8、10)，R7＝R9＝OMe，R20＝OEt；
其中Ln是指镧系元素；OMe是指甲氧基；NMe2是指硝基-二甲基；OEt是指乙氧基。
在本发明的第一方面的第一实施方案中，提供了用于使生物细胞中的棒状细胞器成像的化合物，所述化合物包括式(I)或式(II)的分子，其中所述生物细胞中的棒状细胞器是初级纤毛。
在本发明的第一方面的第二实施方案中，提供了用于使生物细胞中的棒状细胞器成像的化合物，所述化合物包括式(I)或式(II)的分子，其中所述成像可在活细胞中进行。
在本发明的第一方面的第三实施方案中，提供了用于使生物细胞中的棒状细胞器成像的化合物，所述化合物包括式(I)或式(II)的分子，其中所述成像使用线性荧光显微镜在UV光激发下进行或使用双光子共聚焦激光扫描显微镜进行。
在本发明的第一方面的第四实施方案中，提供了用于使生物细胞中的棒状细胞器成像的化合物，所述化合物包括式(I)的分子，其中所述分子包括HGEu001的化合物。HGEu001还可以由式(III)表示：
Figure GDA0003003355710000181
其中X为H；Ln为Eu。
在本发明的第一方面的第五实施方案中，提供了用于使生物细胞中的棒状细胞器成像的化合物，所述化合物包括式(I)、(II)或(III)的分子，所述化合物可以选择性结合于细胞中的蛋白质。
在本发明的第一方面的第六实施方案中，提供了用于使生物细胞中的棒状细胞器成像的化合物，所述化合物包括式(I)、(II)或(III)的分子，所述蛋白质可以是初级纤毛相关蛋白。
在本发明的第一方面的第七实施方案中，提供了用于使生物细胞中的棒状细胞器成像的化合物，所述化合物包括式(I)、(II)或(III)的分子，所述化合物用于定量分析初级纤毛相关蛋白。
在本发明的第一方面的第八实施方案中，提供了用于使生物细胞中的棒状细胞器成像的化合物，所述化合物包括式(I)、(II)或(III)的分子，所述化合物用作疾病诊断探针。
在本发明的第一方面的第九实施方案中，提供了用于使生物细胞中的棒状细胞器成像的化合物，所述化合物包括式(I)、(II)或(III)的分子，所述化合物用作靶向细胞器的特异性载体。
在本发明的第一方面的第十实施方案中，提供了用于使生物细胞中的棒状细胞器成像的化合物，所述化合物包括式(I)、(II)或(III)的分子，所述化合物与药物结合用于联合疾病治疗。
在本发明的第一方面的第十一实施方案中，所述式(I)、(II)或(III)的分子的使用包括将所述化合物溶解在水溶液中，然后在生物细胞中的棒状细胞器中积累，用于所述成像。
在本发明的第二方面，提供了用于使生物细胞中的棒状细胞器成像的方法，所述方法包括在生物细胞中的棒状细胞器中直接积累式(I)、(II)或(III)的化合物。
在本发明的第二方面的第一实施方案中，提供了用于使生物细胞中的棒状细胞器成像的方法，其中生物细胞中的棒状细胞器是初级纤毛。
在本发明的第二方面的第二实施方案中，提供了用于使生物细胞中的棒状细胞器成像的方法，所述方法包括积累式(I)、(II)或(III)的化合物，其中所述成像使用线性荧光显微镜在UV光激发下进行或使用双光子共聚焦激光扫描显微镜进行。
在本发明的第二方面的第三实施方案中，提供了用于使生物细胞中的棒状细胞器成像的方法，所述方法包括积累式(I)、(II)或(III)的化合物，其中所述成像可在活细胞中进行。
在本发明的第三方面，提供了用于定量分析初级纤毛相关蛋白的方法，所述方法包括在生物细胞中的棒状细胞器中直接积累式(I)、(II)或(III)的化合物。
在本发明的第四方面，提供了用于诊断初级纤毛相关疾病的方法，所述方法包括使用式(I)、(II)或(III)的化合物作为疾病诊断探针。
在本发明的第五方面，提供了用于靶向生物细胞中的初级纤毛的方法，所述方法包括使用式(I)、(II)或(III)的化合物作为靶向细胞器的特异性载体或试剂。
在本发明的第六方面，提供了用于治疗初级纤毛相关疾病的方法，所述方法包括将式(I)、(II)或(III)的化合物与药物结合施用，用于联合治疗。
通过以下实验或实施方案进一步阐释本发明，应当理解，所述实验或实施方案中公开的主题仅可用于说明目的，但不旨在限制本发明的范围：
材料和方法
HGEu001和HGEu002的合成和表征
合成的一般信息。通过氢化钙(CaH2)干燥四氢呋喃(THF)、二氯甲烷(DCM)、乙腈(CH3CN)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)。除非另有说明，否则所有反应均在氮气氛下用无水溶剂进行。所有试剂均商购获得，其质量高，并且无需进一步纯化即可使用。通过薄层色谱法(TLC)监测反应，所述薄层色谱法通过使用UV光作为可视化方法在硅胶板(0.25mm,60F-254)上进行。快速柱色谱法在200-300目硅胶上进行。在400(1H:400MHz,13C:100MHz)光谱仪上记录1H和13C NMR光谱。以下缩写用于解释多重性：s＝单重态，d＝双重态，t＝三重态，q＝四重态，dd＝双重态的双重态，m＝多重态，br＝宽(broad)。从ESI或MALDI-TOF质谱仪获得高分辨率质谱。初级纤毛特异性探针HGEu001及其基序配合物HGEu002的合成途径如图29所示。
N-(4-碘苯基)-4-(三氟甲基)苯甲酰胺(化合物2)的合成
在0℃，将4-(三氟甲基)苯甲酰氯(5.72mL,38.53mmol)于30min内逐滴加入4-碘苯胺(5g,46.23mmol)和DIPEA(13.42mL,77.06mmol)在DCM中的溶液(200mL)中。所得溶液在室温搅拌12小时后，将所得混合物的溶剂浓缩至100mL，过滤后收集白色沉淀物作为产物(13.41g,34.29mmol，产率＝89％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.57(s,1H),8.13(d,J＝4Hz,2H),7.92(d,J＝4Hz,2H),7.72(d,J＝4Hz,2H),7.63(d,J＝4Hz,2H)；(图16)13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ164.5,138.6,138.5,137.3,131.6,131.3,128.6,125.4,125.3,125.2,122.5,87.9；(图17)HRMS(MALDI-TOF)C14H10F3INO[M+H]+的m/z计算值：391.9759，实测值：391.9761。
N-(4-((2-(羟甲基)吡啶-4-基)乙炔基)苯基)苯甲酰胺(化合物3)的合成
将(4-乙炔基吡啶-2-基)甲醇(0.92g,6.8mmol)加入到N-(4-碘苯基)苯甲酰胺(化合物1)(3.36g,10.4mmol)、Pd(PPh3)2Cl2(136mg,0.21mmol)、CuI(80mg,0.42mmol)和DIPEA(20mL)在新蒸馏的THF中的溶液(200mL)中。在N2气的保护下，将所得混合物在45℃搅拌6小时。浓缩的残余物的硅胶快速柱色谱法(DCM:MeOH＝30:1)得到白色固体作为产物(2.16g,6.4mmol，产率＝94％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.49(s,1H),8.52(d,J＝2Hz,1H),7.96(d,J＝4Hz,2H),7.90(dd,J1＝4Hz,J2＝8Hz,2H),7.63-7.60(m,3H),7.57-7.53(m,3H),7.38(d,J＝2Hz,1H),5.52(br,1H),4.58(s,2H)；(图18)13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ165.8,162.5,148.9,140.4,134.7,132.4,131.8,130.8,128.4,127.7,123.2,121.4,120.1,115.9,93.6,86.6,63.9,53.5；(图19)HRMS(MALDI-TOF)C21H17N2O2[M+H]+的m/z计算值：329.1290，实测值：329.1295。
N-(4-((2-(羟甲基)吡啶-4-基)乙炔基)苯基)-4-(三氟甲基)苯甲酰胺(化合物4)的合成
将(4-乙炔基吡啶-2-基)甲醇(1.13g,8.52mmol)加入到N-(4-碘苯基)-4-(三氟甲基)苯甲酰胺(化合物2)(4g,10.22mmol)、Pd(PPh3)4(197mg,0.17mmol)、CuI(65mg,0.34mmol)和DIPEA(20mL)在新蒸馏的THF(200mL)中的溶液中。在N2气的保护下，将所得混合物在45℃搅拌6小时。浓缩的残余物的硅胶快速柱色谱法(DCM:MeOH＝30:1)得到白色固体作为产物(3.10g,7.84mmol，产率＝92％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.71(s,1H),8.52(d,J＝4Hz,1H),8.15(d,J＝4Hz,2H),7.93(d,J＝4Hz,2H),7.90(d,J＝4Hz,2H),7.64(d,J＝4Hz,2H),7.55(s,1H),7.36(d,J＝2Hz,1H),5.54(t,J＝4Hz,1H),4.14(d,J＝2Hz,2H)；(图20)13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ164.7,162.5,148.9,140.0,138.5,132.5,131.7,131.3,130.70,128.7,125.4,125.2,123.2,122.5,121.4,120.2,116.3,93.4,86.6,63.9；(图21)HRMS(MALDI-TOF)C22H16F3N2O2[M+H]+的m/z计算值：397.1164，实测值：397.1168。
2,2',2”-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三(N-(叔丁基)乙酰胺)(化合物5)的合成
将2-溴-N-(叔丁基)乙酰胺(10.1g,52.2mmol)加入到1,4,7,10-四氮杂环十二烷(3.0g,17.4mmol)的无水乙腈溶液(80mL)中，接着加入NaHCO3(21.9g,261mmol)。将所得溶液在室温搅拌24小时。过滤所得混合物后，浓缩滤液并从热水中重结晶，得到白色固体作为产物(4.8g,8.7mmol，产率＝50％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.78(s,1H),6.68(s,2H),3.05(s,4H),3.05(s,2H),2.70(m,16H),1.37(s,18H)1.36(s,9H)；(图22)13C NMR(100MHz,CDCl3):δ170.1,170.0,60.5,59.6,53.4,52.9,52.3,51.1,50.9,46.7,28.9,28.8；(图23)HRMS(MALDI-TOF)C26H54N7O3[M+H]+的m/z计算值：512.4288，实测值：512.4285。
2,2’,2”-(10-((4-((4-苯甲酰氨基苯基)乙炔基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三(N-(叔丁基)乙酰胺)(HGL001)的合成
将甲磺酰氯(0.22mL,2.73mmol)加入到N-(4-((2-(羟甲基)吡啶-4-基)乙炔基)苯基)苯甲酰胺(化合物3)(300mg,0.91mmol)在无水DCM(150mL)和DIPEA(1.59mL,9.11mmol)中的搅拌的溶液中。将得到的混合物在室温搅拌3小时。然后用饱和NaHCO3溶液、饱和NH4Cl溶液和盐水洗涤该溶液。将有机层用无水Na2SO4干燥并浓缩，得到浅黄色固体，为中间体化合物甲磺酸(4-((4-苯甲酰氨基苯基)乙炔基)吡啶-2-基)甲酯，其不经进一步纯化直接用于下一步骤。将浅黄色固体溶于无水CH3CN(50mL)中。加入2,2',2”-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三(N-(叔丁基)乙酰胺)(化合物5,0.50g,0.61mmol)和无水K2CO3(1.26g,9.1mmol)。将所得混合物在N2气下在50℃搅拌12小时。滤出固体并浓缩滤液。残余物的硅胶快速柱色谱法(CH2Cl2:MeOH＝12:1)得到浅黄色固体作为产物(378mg,0.46mmol，产率＝75％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.53(s,1H),8.38(d,J＝2Hz,1H),7.97(d,J＝4Hz,2H),7.94(d,J＝4Hz,2H),7.83(br,2H),7.60-7.53(m,7H),7.38(d,J＝2Hz,1H),3.66(br,2H),3.20-2.07(m,22H),1.30(s,9H),1.22(s,18H)；(图24)13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ170.5,169.9,165.9,158.7,149.0,140.5,134.7,132.3,131.8,131.1,128.5,128.2,127.8,125.1,123.5,120.1,115.9,93.9,86.3,58.1,57.9,57.2,50.4,50.3,28.3,28.1；(图25)HRMS(MALDI-TOF)C47H68N9O4[M+H]+的m/z计算值：822.5394，实测值：822.5390。
2,2',2”-(10-((4-((4-(4-(三氟甲基)苯甲酰氨基)苯基)乙炔基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三(N-(叔丁基)乙酰胺)(HGL002)的合成
将甲磺酰氯(0.18mL,2.28mmol)加入到N-(4-((2-(羟甲基)吡啶-4-基)乙炔基)苯基)-4-(三氟甲基)苯甲酰胺(化合物4)(300mg,0.76mmol)在无水DCM(150mL)和DIPEA(1.33mL,7.61mmol)中的搅拌的溶液中。将得到的混合物在室温搅拌3小时。然后用饱和NaHCO3溶液、饱和NH4Cl溶液和盐水洗涤溶液。有机层用无水Na2SO4干燥并浓缩，得到浅黄色固体，为中间体化合物甲磺酸(4-((4-(4-(三氟甲基)苯甲酰氨基)苯基)乙炔基)吡啶-2-基)甲酯，其不经进一步纯化直接用于下一步骤。将浅黄色固体溶于无水CH3CN(50mL)中。加入2,2',2”-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三(N-(叔丁基)乙酰胺)(化合物5,0.42g,0.51mmol)和无水K2CO3(1.05g,7.6mmol)。将所得混合物在N2气下在50℃搅拌12小时。滤出固体并浓缩滤液。残余物经硅胶快速柱色谱法(CH2Cl2:MeOH＝12:1)得到浅黄色固体产物(354mg,0.40mmol，产率＝78％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.78(s,1H),8.38(d,J＝2Hz,1H),8.18(s,1H),8.16(s,1H),7.91(d,J＝4Hz,4H),7.82(br,2H),7.62(d,J＝8Hz,2H),7.57(d,J＝4Hz,2H),7.39(d,J＝2Hz,1H),3.71(br,2H),2.87-2.17(m,22H),1.29(s,9H),1.27(s,18H)；(图26)13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ170.5,169.8,164.7,158.6,148.9,140.1,138.4,132.3,131.6,131.3,131.0,128.7,125.4,125.2,125.1123.4,122.5,120.2,116.2,93.7,86.4,58.1,57.9,57.2,54.9,50.4,50.3,49.4,28.3,28.1；(图27)HRMS(MALDI-TOF)C48H67F3N9O4[M+H]+的m/z计算值：890.5268，实测值：890.5264。
配合物HGEu001的合成
将氯化铕(III)六水合物(77mg,0.21mmol)加入到配体(HGL001,0.20mmol)的MeOH/H2O(100mL,v:v＝1:1)溶液中。用NaOH溶液(0.4M)将所得溶液保持在6.0-6.5的pH范围，并在室温搅拌所得溶液24小时。在真空下除去溶剂；将残余物溶于1mL甲醇中，并滴入到乙醚(50mL)中。过滤沉淀物，用二乙醚洗涤并在室温在真空下干燥。收集白色固体作为产物(222mg,0.19mmol，产率＝90％)。HRMS(+ESI)C47H65EuN9O4[M–H2O–2H]+的m/z计算值：972.4372，实测值：972.4378；C47H66ClEuN9O4[M–H2O–H+Cl-]+计算值：1008.4139，实测值：1008.4119；C47H67Cl2EuN9O4[M–H2O+2Cl]+计算值：1044.3905，实测值：1044.3882(图8)。HPLC表征：保留时间＝15.20min.(表1和图7A-7B)。HGEu001的化学结构可以由下式表示：
Figure GDA0003003355710000241
其中X为H；Ln为Eu。
配合物HGEu002的合成
用与HGEu001相同的程序从配体HGL002获得HGEu002(204mg,0.19mmol，产率＝95％)。HRMS(+ESI)C48H65EuF3N9O4[M–H]2+的m/z m/z计算值：m/z＝1041.4324/2＝520.7162，实测值：520.7186(图9)；HPLC表征：保留时间＝15.36min.(表1和图7A-7B)。HGEu002的化学结构可以由式(II)表示，其中X为CF3；Ln为Eu。
表1.用于表征HGEu001和HGEu002的HPLC的溶剂梯度。
Figure GDA0003003355710000242
Figure GDA0003003355710000251
流速＝1mL/min
光物理研究
通过HP Agilent UV-8453分光光度计记录200至1100nm光谱范围内的UV-可见吸收光谱。通过Horiba Fluorolog-3分光光度计测量HGEu001和HGEu002的发射光谱和发射衰变寿命，并通过Edinburgh instrument FLS920分光光度计测量以进行交叉检验。(两台分光光度计均配备有用于稳态发射测量的450W连续氙灯，用于发射寿命测量的60W氙气闪光灯，和在-20℃冷却216的UV-Vis PMT探测器-Hamamatsu-R928)。
通过铕发射滴定(emission titration)进行的稳定性测试
进行铕配合物的动力学稳定性，以研究配合物在稀释溶液中的稳定性和在100倍的[EDTA]2-和Ca2+存在下的稳定性。选择EDTA作为Eu3+离子的竞争配体。Ca2+阳离子充当配体的竞争离子，其可以结合于基于1,4,7,10-四氮杂环十二烷的大环配体。在室温将10μM的铕配合物与1mM的EDTA或Ca2+共孵育，并在不同的时间点(1、24和48小时)测量铕发射光谱。
材料
组织培养物
使人宫颈癌HeLa细胞在杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)中生长。人肺正常二倍体成纤维细胞MRC-5和神经母细胞瘤细胞SK-N-SH由中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供；将其在MEM(GIBCO41500034)中培养；使人源肝细胞QSG-7701细胞在RPMI-1640(GIBCO31800022)中生长；所有细胞均在37℃和5％CO2下补充10％(v/v)胎牛血清、1％青霉素和链霉素。
MTT细胞细胞毒性测定
用测试配合物处理24小时的HeLa、SK-N-SH、QSG-7701或MRC-5细胞进一步与MTT、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2和5-二苯基四唑溴(0.5mg/mL)一起孵育4小时，以在细胞代谢过程中产生甲臜。然后，用二甲基亚砜(DMSO)充分溶解甲臜，并在Bio-Rad iMark酶标仪(570nm)中测量溶液的吸光度。一式四份进行。通过GraphPad Prism 5软件运行数据分析和绘图。
双光子共聚焦体外成像
将细胞接种在35-mm培养皿中的盖玻片上过夜。然后与HGEu001或HGEu002(10μM)一起孵育6小时，并在成像前用PBS洗涤细胞3次。在不同的孵育时间(3、6、18和24小时)下观察到HGEu001和HGEu002的双光子延时体外图像。然后用PBS缓冲液洗去未吸收的配合物，并对细胞进行显微镜成像。HGEu001和HGEu002的体外成像使用线性荧光显微镜在375nm UV光激发下进行或使用配备有Ti:蓝宝石激光器(sapphire laser)(Libra II，相干)的共聚焦激光扫描显微镜Leica TCS SP8进行。由690nm至1080nm(fs激光)产生的激发光束通过63x油浸物镜聚焦在粘附细胞上。
通过Z-轴堆叠获得的3D显微图像，这一3D显微图像通过使用Leica TCS SP8双光子共聚焦显微镜的内置程序3D重建而成。
共定位成像
(a)HGEu001和HGEu002与初级纤毛标记物ARTL13B和IFT88的3D共定位成像。
从cDNA文库中PCR扩增全长ARTL13B(ADP-核糖基化因子样蛋白13B)，并使用XhoI/EcoRI的限制性消化位点将其插入到pEGFP-C3(CLONETECH,#6082-1)的多克隆位点(MCS)中，用于GFP-ARTL13B表达。通过测序证实经由卡那霉素选择的阳性重组体。表达GFP-IFT88的质粒mEmerald-IFT88-N-18(鞭毛内转运蛋白88同源物)是Michael Davidson赠送的(Addgene质粒#54125)。在大肠杆菌(E.coli)(DH5α)中扩增质粒，并使用StarPrep PlasmidMiniprep Kit(Genstar)将其纯化。用于初级纤毛追踪的GFP-ARL13B和GFP-ITF88均通过lipofectamine2000(目录号11668-019，Invitrogen)介导的转染在HeLa细胞中表达。简言之，根据制造商的说明，用4μg DNA加4μL lipofectamine2000混合物转染3.5cm培养皿的HeLa细胞(具有70-80％汇合)。孵育8小时后，加入10μM HGEu001或HGEu002并孵育6小时。
(b)HGEu001和HGEu002与细胞器的共定位成像。
细胞器(线粒体、溶酶体和高尔基体)的活细胞标记探针
Figure GDA0003003355710000271
Green FM(M-7514)、
Figure GDA0003003355710000273
Green DND-26(L-7526)和
Figure GDA0003003355710000272
Oregon Green(W6748，麦胚凝集素)分别从ThermoFisher Scientic Inc.购买并储存在-20℃。
首先将3个HeLa细胞(1×105个)培养皿与10μM HGEu001/HGEu002一起孵育6小时。然后将细胞器探针(各50nM)平行加入细胞中并进一步孵育15分钟。在线性荧光显微镜上成像之前，将细胞用PBS洗涤3次。在UV光(375nm)激发下，收集来自通道(610-630nm)的发射，这一信号源于HGEu001/HGEu002的发射信号。在488nm蓝光激发下，从细胞器染料的发射信号收集505和555nm范围内的成像通道。
结果
通过与方案1(图29)中所示类似的程序合成两种铕配合物HGEu001和HGEu002。用二乙醚重结晶粗制铕配合物，得到HGEu001和HGEu002，其产率为～95％。所有中间体均通过1H-NMR、13C-NMR和HRMS进行了充分的表征。通过高效液相色谱法和HRMS纯化和验证铕配合物HGEu001和HGEu002(图7A-7B、8-9)。配合物HGEu001在水中的强吸收带可以在340nm处达到峰值(ε>20,000cm-1，表2)，对应于π→π*跃迁(图10)。
在水溶液中记录HGEu001和HGEu002的光物理性质，其具有相似的铕发射量子产率(φ＝～10％)。观察到五种铕f-f发射5D0→7FJ谱带(J＝0-4)，这些f-f跃迁强度的比例与具有D2h对称性的典型的基于1,4,7,10-四氮杂环十二烷的铕配合物的文献报道一致(图1A-1B、图11A-11B和表2)。HGEu001和HGEu002显示相似的分子结构和光物理性质，其在HeLa、SK-N-SH、QSG-7701和MRC-5细胞中的毒性也类似地低(IC50为～390-440μM，表3)。然而，HGEu001和HGEu002的体外亚细胞定位是非常不同的，尤其是HGEu001——HGEu001在体外的红色发射与荧光显微镜中的常见商业细胞器特异性标志物(如线粒体、溶酶体和高尔基体)无关(图2A-2I)。
表2.铕配合物HGEu001和HGEu002的光物理性质。
Figure GDA0003003355710000281
a)在H2O中的吸收系数，298K；b)图12A-12B中的铕发射衰变(λem＝614nm。5D0→7F2。λex＝340nm)；c)派生的水合数，q(±20％)q＝1.2[(k(H2O)k(D2O))-(0.25+0.07x)](k＝τ-1,x＝羰基结合的酰胺NH振子数)；d)通过积分球得到的在H2O中的总体铕发射量子产率。
表3.配合物HGEu001和HGEu002针对HeLa、SK-N-SH、QSG-7701和MRC-5细胞系的细胞毒性(IC50/μM)。
Figure GDA0003003355710000282
孵育时间＝24小时；原始数据显示在图13A-13B中。
讨论
为了进一步证实HGEu001的初级纤毛特异性体外亚细胞定位性，在多光子共聚焦显微镜上进行HGEu001的体外成像(图3A-3H)。在HeLa细胞中孵育3小时后，在双光子激发(λex＝700nm，图3A-3H)下，在初级纤毛中的特别聚焦的区域中发现HGEu001的红色铕发射，并且最佳发射强度持续24小时。然而，发现HGEu002的红光发射分散在细胞质中(图14A-14H和15A-15F)。然而，HGEu001和HGEu002的细胞毒性在许多细胞系中是相同的，所述细胞系例如HeLa、SK-N-SH和MRC-5等(图13A-13B)。
为了证实HGEu001的这种亚细胞定位，发明人进行了阳性共定位对照实验。通过与初级纤毛标志物ARL13B融合的绿色荧光蛋白(GFP-ARL13B)进行共定位实验。使用绿色荧光蛋白“GFP”的优点是其明亮的发光和可用于体外追踪靶标上的细胞蛋白(例如抗体)的定位。然而，GFP在分子成像方面也为科学家们带来了很多麻烦，例如其复杂的克隆、转染过程，以及其宽的发射谱和短的发射寿命，带来了低信噪比问题。没有市售的简单的初级纤毛标记物，因此，本发明只能比较HGEu001和GFP-ARL13B(ARL13B是鞭毛轴丝(culinaryaxoneme)结构所需的纤毛特异性蛋白质)之间的亚细胞定位，并且以HGEu002作为阴性对照(图2A-2I)。
来自HGEu001的体外红光发射(给药浓度＝10μM，在GFP转染和表达后孵育6小时)与来自GFP-ARL13B的绿光发射(转染程序参见ESI)的完美重叠显示于图4A-4H中。还示出了合并图像的黄光发射(HGEu001,λex＝700nm,BP 550-665nm；和GFP-ARL13B,λex＝488nm,BP505-555nm)。另一方面，HGEu002的红光发射和GFP-ARL13B的绿光发射定位于细胞质的不同部分，并且在它们的合并图像中仅发现轻微的黄光发射(图4G)。这可以证实，HGEu001在初级纤毛中的选择性，而HGEu002不是这样。由于初级纤毛是棒状细胞器，二维荧光图像或共聚焦图像不足以显示HGEu001定位的特异性。利用它们的双光子诱导的发射特性，通过双光子共聚焦显微镜(z轴堆叠)在700nm激发下，在HeLa细胞中获得HGEu001和HGEu002的三维共聚焦图像(图5A-5F和6A-6D)。可以在HeLa细胞中发现红光发射，其被显示为红色柱(图5A)。在对照实验中，HGEu002在棒状细胞器中未显示任何铕发射(图5B)。然而，HGEu002似乎定位在细胞质的某些部分而不是初级纤毛中。
为了进一步证实HGEu001的选择性初级纤毛亚细胞定位，将HGEu001及其基序对照HGEu002的三维红色体外成像与初级纤毛特异性绿色GFP-ARL13B以及另一种初级纤毛标记物GFP-IFT88进行比较(IFT88是参与纤毛生物发生的IFT配合物B的组分)(图6A-6D)。只有HGEu001显示与GFP-ARL13B或GFP-139IFT88的共染色的黄色合并的体外发射。此外，HGEu001未显示与绿色mito-tracker合并的黄色体外发射。HGEu002也未显示与GFP-ARL13B、GFP-IFT88以及绿色mito-tracker任意之一的合并的黄色体外发射。图5A-5F和6A-6D中的体外成像的3D视频显示在支持信息中。
通常，通过综合性共染色亚细胞定位体外成像研究，可以以良好的置信度确认HGEu001在初级纤毛中的体外选择性。HGEu001和HGEu002具有非常相似的结构，然而，只有HGEu001优先定位于初级纤毛中。由于HGEu001在其他细胞器，如溶酶体、线粒体或高尔基体上没有显示任何非特异性染色(图2A-2I)，因此其结合于初级纤毛的结构成分(如纤毛膜、微管和相关蛋白)或其相关因子应该是对HGEu001在初级纤毛上的特异性定位的合理解释。
可以通过诸如蛋白质组学质谱的分析手段来研究本发明分子的结合机制。因此，本发明提供了用于开发一组靶向初级纤毛的探针的蓝图或策略，所述探针具有特殊功能或通过与HGEu001基序结构简单结合而向初级纤毛递送目标。事实上，在本发明中确立的成像方案也可用于验证任何未来探针与初级纤毛的特异性结合，重点在于通过3D成像使棒状结构可视化。
在本发明中提供了用于初级纤毛的直接成像工具，其是特异性的，并且可以被近红外(NIR)区域中的光激发。进行综合性体外研究和几个对照实验，以确认HGEu001的特异性初级纤毛定位，在共定位实验中显示出与GFP结合的初级纤毛标志物ARL13B和IFT88的很大程度的一致性。这些新的初级纤毛标志物可以帮助理解初级纤毛在生命科学，例如肿瘤发生中的功能和作用。
在本发明中还提供了用于设计初级纤毛特异性分子的合适的模板，其具有成为靶标特异性药物递送载体的潜在的修饰，以帮助理解初级纤毛的功能并发展成癌症或疾病治疗应用。已经开发了基于配合物HGEu001的分子库HGEu003-HGEu016(图28中所示的结构)，并且已经进行了初级纤毛成像筛选。还可以进行蛋白质组学质谱研究以评价HGEu001与初级纤毛中特定蛋白质的特异性结合。
工业实用性
本发明提供了一种水溶性的简单稳定的、基于三(N-(叔丁基)乙酰胺)1,4,7,10-四氮杂环十二烷的铕配合物HGEu001，其在初级纤毛中显示特异性亚细胞定位，在水中的量子产率高达10％，并且寿命为0.56ms的寿命。特别地，本发明提供了配合物HGEu001的设计和简易的合成方法。本发明的分子或配合物可用于使生物细胞中的初级纤毛成像，其充当初级纤毛的细胞器特异性探针，以确定与该特定细胞器相关的任何病症、疾病或癌症。目前，没有这样的适合的细胞器特异性探针，而本发明可以满足这种需要。

Claims (11)

1.一种化合物，所述化合物为式(II)的分子：
Figure FDA0003003355700000011
其中Ln选自Eu、Tb、Gd、Yb、Er、Dy、Sm、La、Ce、Pr、Nd、Pm和Tm；
X-选自Cl-；
R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10共同或单独地选自H、OMe或OEt；
R11是：
Figure FDA0003003355700000012
其中R12、R13、R14、R15、和R16共同或单独地选自H、CF3、OMe、OEt或NMe2；A2选自C。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述式(II)的分子选择性地结合生物细胞中的棒状细胞器中的蛋白质。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中所述蛋白质为初级纤毛相关蛋白。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中：
R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10选自H，
R12、R13、R14、R15、和R16选自H，并且
Ln为Eu。
5.权利要求1-4中任一项所述的化合物在制备用于使生物细胞中的棒状细胞器成像的制剂中的用途，所述成像包括在生物细胞中的棒状细胞器中直接积累权利要求1-4中任一项所述的化合物，其中所述生物细胞中的棒状细胞器为初级纤毛。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述成像使用线性荧光显微镜在UV光激发下进行或使用双光子共聚焦激光扫描显微镜进行。
7.根据权利要求5所述的用途，其中所述成像可在活细胞中进行。
8.权利要求1-4中任一项所述的化合物在制备用于定量分析初级纤毛相关蛋白的制剂中的用途，所述定量分析包括在生物细胞中的棒状细胞器中直接积累权利要求1-4中任一项所述的化合物。
9.权利要求1-4中任一项所述的化合物在制备用于诊断初级纤毛相关疾病的疾病诊断探针中的用途。
10.权利要求1-4中任一项所述的化合物在制备用于靶向生物细胞中的初级纤毛的特异性载体或试剂中的用途。
11.根据权利要求1-4中任一项所述的化合物在制备用于治疗初级纤毛相关疾病的药剂中的用途，其中所述药剂与药物结合施用，用于联合治疗。
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Two-photon microscopy study of the intracellular compartmentalization of emissive terbium complexes and their oligo-arginine and oligo-guanidinium conjugates;Filip Kielar et al.;《Chem. Commun.》;20080422;pages 2435-2437 *

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