CN109295216A - 预测高血压个体化药物药效的snp位点和检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了预测高血压个体化药物药效的SNP位点和检测试剂盒。一种检测CYP2C19和CPY3A5上SNP位点基因型的试剂在制备预测依贝沙坦降压药效的试剂盒中的应用，所述SNP位点为CYP2C19上681 G>A（rs4244285）、CYP2C19上636 G>A（rs4986893）和CPY3A5上189‑237 G>A（rs776746）。本申请还提供了相应试剂盒和SNP位点组合。

Description

预测高血压个体化药物药效的SNP位点和检测试剂盒
技术领域
本申请属于分子生物学检测领域和心脑血管疾病领域，具体地，本申请提供了一种检测CYP2C19和CPY3A5上SNP位点基因型的试剂在制备预测依贝沙坦降压药效的试剂盒中的应用，以及相应试剂盒和SNP位点组合。
背景技术
依贝沙坦（Irbesartan），也成为伊贝沙坦或厄贝沙坦，属于血管紧张素II受体拮抗剂，其可以高特异性地与血管紧张素II的1型受体（AT1）结合，通过导致血管扩张、减少血液增压素类激素/因子的分泌、减少醛固酮产生等机理降低血压。依贝沙坦属于临床上常用的降压药物，其疗效和耐受性广受肯定。但众多临床实践和相关研究均表明，依贝沙坦的降压效果在不同患者之间存在显著差异，这种差异的产生可能与遗传因素相关（见例如，Jiang S等，merican Journal of Hypertension，2016，29（5）：553；Kurland L等，Am JHypertens，2008，21（7）：826-839以及Schelleman H等，Drugs，2004，64（16）：1801-1816）。截止目前，依贝沙坦尚未有与之显著关联的，特别是实际用于临床的SNP位点公开。
细胞色素P450属于硫醇盐蛋白超家族亚铁血红素，是一种末端加氧酶，已知其参与包括依贝沙坦在内的近千种药物的代谢过程。P450家族包括数十个家族/亚家族，其中有功能意义的约有50种以上，每种中均含有大量SNP位点。因此虽然已知P450上多态性位点与多种药物，特别是降压药物药效的关联（见例如CN 107557432 A、CN 1850987 A、WO2008137778 A2、WO03102178 A1等）。研究P450上SNP位点与某种具体药物，如依贝沙坦效果的关联，仍然是一项繁重而富有意义的工作
目前，尚少见细胞色素P450上，特别是CYP2C19和CYP2C19上多态性与依贝沙坦降压药效之间关联的研究。这方面的研究，对丰富依贝沙坦药效预测标准，尽早找到临床可用的SNP位点组合具有重要意义。
发明内容
申请人选取了亚洲人，特别是中国北方人中常见的19个P450上SNP位点，统计了其与依贝沙坦降压药效的关系，发现CYP2C19上681 G>A（rs4244285）、CYP2C19上636 G>A（rs4986893）和CPY3A5上189-237 G>A（rs776746）与依贝沙坦降压药效有显著关联。这些位点的发现，首次明确了P450，特别是CYP2C19和CPY3A5与依贝沙坦代谢/生效有关联，对于丰富依贝沙坦药效预测标准，乃至进一步制备临床可用的依贝沙坦药效预测试剂盒具有重要的意义。
一方面，本申请提供了检测CYP2C19上681 G>A（rs4244285）、CYP2C19上636 G>A（rs4986893）和CPY3A5上189-237 G>A（rs776746）中一个或多个SNP位点基因型的试剂在制备预测依贝沙坦降压药效的试剂盒中的应用。
进一步地，其中检测的SNP位点为CYP2C19上681 G>A（rs4244285）、CYP2C19上636G>A（rs4986893）以及CPY3A5上189-237 G>A（rs776746）。
进一步地，其中所述试剂为测序试剂、Taqman检测试剂、SNPshot检测试剂或基因芯片。
另一方面.本申请提供了预测依贝沙坦降压药效的试剂盒，其包括检测CYP2C19上681 G>A（rs4244285）、CYP2C19上636 G>A（rs4986893）和CPY3A5上189-237 G>A（rs776746）中一个或多个SNP位点基因型的试剂。
进一步地，所述试剂盒包括检测CYP2C19上681 G>A（rs4244285）、CYP2C19上636 G>A（rs4986893）以及CPY3A5上189-237 G>A（rs776746）的试剂。
进一步地，所述试剂盒还包括检测能预测依贝沙坦降压药效的其他SNP位点基因型的试剂。
进一步地，其中能预测依贝沙坦降压药效的其他SNP位点为MTHFR上677 C>T（rs1801133）。
进一步地，其中所述试剂为测序试剂、Taqman检测试剂、SNPshot检测试剂或基因芯片。
进一步地，所述试剂盒包括说明书，所述说明书记载所检测SNP位点基因型与依贝沙坦降压药效的关系。
另一方面，本申请提供了预测依贝沙坦降压药效的SNP组合，包括检测CYP2C19上681 G>A（rs4244285）、CYP2C19上636 G>A（rs4986893）和CPY3A5上189-237 G>A（rs776746）。
本申请的应用和试剂盒可以采用本领域已知的和尚在开发中的各种SNP检测方法，包括但不限于直接测序，如自动或手动的第1至4代测序方法，基于PCR技术的检测方法，如Taqman检测和SNPshot检测，基于电泳的检测方法，如PCR-RFLP、PCR-SSCP以及基因芯片检测、质谱分型方法等。试剂的具体类型包括但不限于引物、探针、基因芯片、电泳芯片、荧光标记物、聚合酶等。
本申请的应用和试剂盒可用于依贝沙坦以及现有或开发中的结构/代谢过程与依贝沙坦类似的其他药物，或其他的血管紧张素II受体拮抗剂药效预测或健康检查，包括但不限于氯沙坦、替米沙坦、缬沙坦、他索沙坦、依普罗沙坦、坎地沙坦等。
本申请的应用和试剂盒可以与其他已知或研究中的依贝沙坦疗效预测方法联合使用，包括但不限于MTHFR上677 C>T（rs1801133）等。
具体实施方式
研究对象：
招募自北京三家二甲/三甲医院的原发高血压患者285名，其中男性145名，女性140名，年龄40—60岁（平均年龄52.7岁）。所述研究对象有收缩压大于等于140mm Hg或舒张压大于等于90mm Hg的明显高血压症状；目前无吸烟成瘾和酗酒情况；根据临床指症和身体状况适合使用依贝沙坦；体检无其他明显心脑血管疾病、肝肾疾病、血液疾病和代谢疾病；开始服用依贝沙坦前两周内未服用其他降血压的中西药药物，入组之前未使用过沙坦类降压药。
研究过程：
1基线血压测定和采血
在研究第0日，研究对象经过整夜（10小时以上）禁食（包括酒、茶以及相关饮品）后，在研究地点卧床休息半小时后使用水银血压计测量收缩压和舒张压，测量三次，取平均值作为基线血压。
随后以抗凝真空采血管采集研究对象全血10ml。
2 血样基因分型
以全血为材料进行基因组DNA提取，SNP位点分型采用Sequenom MassARRAYY®基因分型系统（原理为多重PCR扩增加质谱），包括引物设计合成在内的分型过程委托华大基因进行（选取了亚洲人，特别是中国北方人中常见的19个P450上SNP位点，经过统计计算后选取了CYP2C19上681 G>A（rs4244285）、CYP2C19上636 G>A（rs4986893）和CPY3A5上189-237 G>A（rs776746）可用，篇幅所限，其余由于Hardy Weinberg平衡和关联度问题而未采用位点的相关数据未显示）。
3 依贝沙坦治疗过程
使用的药品为赛诺菲公司商品名为安博维®的依贝沙坦片剂（规格：0.15g每片），按照说明书要求以每日一次0.15g剂量给药，患者每7日复研究中心进行随访（测量血压并观察副作用），治疗共进行28日。
4 数据分析
将第28日测得的血压值与基线血压值的差值△SBP、△DBP（收缩压、舒张压）作为评价降压效果的主要指标。
显效：DBP 下降大于等于10 mm Hg 并降至正常，或DBP下降大于等于20 mmHg；
有效：DBP 下降小于10 mm Hg 并降至正常，或DBP下降10-19mmHg，或SBP 下降大于等于30mmHg；
无效：未达到上述标准。
数据分析使用SPSS 19.0软件进行。
研究结果和解读：
表1. 基因分型结果
根据现有数据，研究对象中基因型分布未出现显著差异，符合Hardy Weinberg平衡（p=0.752），可用于分析。
表2 CYP2C19上681 G>A（rs4244285）基因多态性与治疗后血压变化的关联
*期间4名研究对象脱访，2人中途因不良反应退出。
表3 CYP2C19上636 G>A（rs4986893）基因多态性与治疗后血压变化的关联
*期间4名研究对象脱访，2人中途因不良反应退出。
表4 CPY3A5上189-237 G>A（rs776746）基因多态性与治疗后血压变化的关联
*期间4名研究对象脱访，2人中途因不良反应退出。
以上筛选研究中初步证明了YP2C19上681 G>A（rs4244285）、CYP2C19上636 G>A（rs4986893）和CPY3A5上189-237 G>A（rs776746）与依贝沙坦降压药效的密切关联。三个位点的G>A的突变均对依贝沙坦的降压效果有显著影响，其中CYP2C19上636 G>A（rs4986893）与依贝沙坦△DBP，CPY3A5上189-237 G>A（rs776746）与依贝沙坦△SBP和△DBP也有关联。这些位点均有单独或联合使用用于预测依贝沙坦药效的能力。
由于样本量和多样性丰富程度所限，筛选研究中未纳入性别、年龄、体脂、血糖、吸烟等因素及其相互影响，加入这样因素的关联分析以及对上述三个SNP的进一步筛选/适用人群确定留待进一步大样本研究中进行。

Claims (10)

1. 检测CYP2C19上681 G>A（rs4244285）、CYP2C19上636 G>A（rs4986893）和CPY3A5上189-237 G>A（rs776746）中一个或多个SNP位点基因型的试剂在制备预测依贝沙坦降压药效的试剂盒中的应用。
2. 权利要求1所述的应用，其中检测的SNP位点为CYP2C19上681 G>A（rs4244285）、CYP2C19上636 G>A（rs4986893）以及CPY3A5上189-237 G>A（rs776746）。
3.权利要求1或2任一项的所述的应用，其中所述试剂为测序试剂、Taqman检测试剂、SNPshot检测试剂或基因芯片。
4. 预测依贝沙坦降压药效的试剂盒，其包括检测CYP2C19上681 G>A（rs4244285）、CYP2C19上636 G>A（rs4986893）和CPY3A5上189-237 G>A（rs776746）中一个或多个SNP位点基因型的试剂。
5. 权利要求4所述的试剂盒，其包括检测CYP2C19上681 G>A（rs4244285）、CYP2C19上636 G>A（rs4986893）以及CPY3A5上189-237 G>A（rs776746）的试剂。
6.权利要求4或5任一项所述的试剂盒，其还包括检测能预测依贝沙坦降压药效的其他SNP位点基因型的试剂。
7. 权利要求6所述的试剂盒，其中能预测依贝沙坦降压药效的其他SNP位点为MTHFR上677 C>T（rs1801133）。
8.权利要求4-7任一项所述的试剂盒，其中所述试剂为测序试剂、Taqman检测试剂、SNPshot检测试剂或基因芯片。
9.权利要求4-8任一项的试剂盒，其包括说明书，所述说明书记载所检测SNP位点基因型与依贝沙坦降压药效的关系。
10. 用于预测依贝沙坦降压药效的SNP组合，包括检测CYP2C19上681 G>A（rs4244285）、CYP2C19上636 G>A（rs4986893）和CPY3A5上189-237 G>A（rs776746）。
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