CN109280069B - 3β-羟基-麦角甾-5-烯甾类衍生物及其药物用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了3β‑羟基‑麦角甾‑5‑烯甾类化合物的结构，以及该化合物和其药学上可接受的化学保护形式或者前药在制备具有预防或治疗LXRβ相关代谢症药物中的应用，所述的LXRβ相关代谢综合症为高血脂、动脉粥样硬化或高血压。通过动物体内降酯活性评价发现，该类化合物降脂效果明显，具有进一步开发成新型降脂药物的潜力。

Description

3β-羟基-麦角甾-5-烯甾类衍生物及其药物用途

技术领域

本发明属于药学领域，具体的，涉及一类3β-羟基-麦角甾-5-烯甾类衍生物及其在制备用于预防或治疗代谢综合症药物中的新用途。

背景技术

代谢综合症多由人体新陈代谢不正常引起，临床症状表现为高血压、高血糖、高血脂、动脉粥样硬化以及肥胖等。代谢综合症的病理基础为糖、脂肪和蛋白质代谢失常，虽然不会直接危及生命，但却可以诱发其它严重威胁生命安全的疾病。根据作用靶点的不同，临床上用于治疗代谢综合症疾病的药物也分为很多种类，例如用于降压的ACE抑制剂培哚普利，用于降脂的贝特类药物利贝特及他汀类药物辛伐他汀，用于减肥的胃肠道脂肪酶抑制剂奥利司他等。随着现代生活节奏的不断加快，代谢综合症疾病的发病几率呈现逐年递增的趋势。

高脂血症(hyperlipidemia)是代谢综合症中危害性相当大的一类病症。高脂血症是指，由于脂肪代谢异常或脂肪转运异常而导致血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及总脂质等浓度超过正常标准。高血脂症的主要危害是导致动脉粥样硬化，进而导致众多的相关疾病。其中，最常见的一种致命性疾病就是冠心病；严重乳糜微粒血症可导致急性胰腺炎，是另一致命性疾病。此外，高血脂症也是促进高血压、糖耐量异常、糖尿病的一个重要危险因素。高血脂症还可导致脂肪肝、肝硬化、胆石症、胰腺炎、眼底出血、失明、周围血管疾病、跛行、高尿酸血症。有些原发性和家族性高血脂症患者还可出现腱状、结节状、掌平面及眼眶周围黄色瘤、青年角膜弓等。因此，研制与开发具有全新作用靶点的新型降血脂药物不但具有重要的社会意义，也将产生巨大的经济效益。

肝脏是脂质代谢的主要器官，多种基因和蛋白参与脂质代谢的调节。肝X受体(liver X-activated receptor，LXR)是体内控制胆固醇的转运、吸收和分解的感受器，是细胞核受体超家族的成员之一，包括两种同源亚型LXRα(NR1H3)和LXRβ(NR1H2)。LXRα的表达具有组织特异性，它主要表达在肝脏、肠、肾和巨噬细胞，其中在肝脏表达最高，而LXRβ几乎在所有组织中都有表达，其中在脑表达最高。LXRs被内源性配体氧化甾醇或人工合成配体激活后，先与RXR形成异二聚体，再与其靶基因的LXR调控元件结合，通过转录调节调控胆固醇的代谢、储存、吸收和转运，从而维持甾醇和脂肪酸代谢平衡。此外，LXRs也参与糖代谢调节，活化的LXRs可通过抑制肝脏糖异生而改变II型糖尿病动物的血糖水平。因此， LXRs有望成为治疗动脉粥样硬化和II型糖尿病的新靶点(吴静等，“LXRs在脂质代谢中的作用”，生理科学进展，2004年，第35卷第1期，第69-72页)。

目前LXR激动剂有甾类激动剂和人工合成的非甾类激动剂。由于LXRα和LXRβ同源性较高，大多数LXR激动剂是LXRα/β双激动剂。它们在发挥降血脂等药效的同时，常造成甘油三酯升高和脂肪肝等副作用。这是由于LXRα是肝脏中调节脂肪合成的主要形式，被激活后能上调肝脏SREBP-lc基因表达导致。因此，选择性激活LXRβ亚型而不激活LXRα亚型，可以达到预期的促进胆固醇向体外排泄而不增加患上脂肪肝风险的目的。发明专利CN102861023公开了“一种马尾藻甾醇的用途”，该发明公开了结构如式I所示的马尾藻甾醇用于制备LXR激动剂的用途，尤其是24(S)-马尾藻甾醇作为肝X受体(liver X receptos，简称LXRs)β激动剂的用途。然而，该发明所述的24(S)-马尾藻甾醇对LXRβ的选择性不高，并且24(S)-马尾藻甾醇需要从马尾藻属植物中提取，难以大量获得；此外，24(S)-马尾藻甾醇化学合成制备的难度很大，至今尚未见报道，从而极大的限制了其作为药物开发的用途。

根据文章报道，3β-羟基-麦角甾-5-烯甾类衍生物为NMDA(NR1a/NR2A)受体的激动剂，可用于调节脑兴奋性以预防和治疗CNS相关的病症。(The Journal of Neuroscience,October 30, 2013·33(44):17290–17300)目前，尚没有关于3β-羟基-麦角甾-5-烯甾类衍生物在制备用于预防或治疗LXRβ相关代谢综合症中的新用途的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种3β-羟基-麦角甾-5-烯甾类衍生物和药学上可接受的化学保护形式或者前药及其新用途，即用于制备预防或治疗LXRβ相关代谢综合症的药物。这是因为，本发明通过体外药理活性筛选，首次发现该类化合物具有抑制油酸诱导肝细胞脂肪聚集的活性。

本发明一方面提供了一种通式为(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)的3β-羟基-麦角甾-5-烯甾类化合物和其药学上可接受的化学保护形式或者前药。

其中，R₁为氢、叔丁基二甲基硅基、C₁-C₁₂烷基、C₁-C₁₂烷酰基、芳酰基、杂环基酰基、C₁-C₁₂烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳基烷氧基羰基；R₂为氢、叔丁基二甲基硅基、C₁-C₁₂烷基、C₁-C₁₂烷酰基、芳酰基、杂环基酰基、C₁-C₁₂烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳基烷氧基羰基；以上基团任选被取代，典型的取代基包括但不限于卤素、羟基、羧基、叔丁氧羰基、叔丁基二甲基硅氧基或甲基。

上述通式为(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)的3β-羟基-麦角甾-5-烯甾类化合物，不包括以下化合物：

优选地，所述化合物具体为：

本发明的另一方面，提供了一种通式为(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)的3β-羟基-麦角甾-5-烯甾类化合物和其药学上可接受的化学保护形式或者前药在制备具有预防或治疗LXRβ相关代谢症药物中的应用，所述的LXRβ相关代谢综合症为高血脂、动脉粥样硬化或高血压。

其中，R₁为氢、叔丁基二甲基硅基、C₁-C₁₂烷基、C₁-C₁₂烷酰基、芳酰基、杂环基酰基、C₁-C₁₂烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳基烷氧基羰基；R₂为氢、叔丁基二甲基硅基、C₁-C₁₂烷基、C₁-C₁₂烷酰基、芳酰基、杂环基酰基、C₁-C₁₂烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳基烷氧基羰基；以上基团任选被取代，典型的取代基包括但不限于卤素、羟基、羧基、叔丁氧羰基、叔丁基二甲基硅氧基或甲基。

上述通式为(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)的3β-羟基-麦角甾-5-烯甾类化合物，具体为以下化合物：

本发明的有益效果：本发明提供了一种3β-羟基-麦角甾-5-烯甾类衍生物和药学上可接受的化学保护形式或者前药及其用于制备预防或治疗LXRβ相关代谢综合症的药物的新用途。通过动物体内降酯活性评价发现，该类化合物降脂效果明显，具有进一步开发成新型降脂药物的潜力。

附图说明

附图1是实施例17中油红对肝细胞聚集脂肪染色的结果；其中，a：正常对照组；b：OA导致肝HepG2细胞内脂质堆积；c：辛伐他汀对OA刺激的肝HepG2细胞内脂质堆积的影响；d：化合物1对OA刺激的肝HepG2细胞内脂质堆积的影响。

附图2是实施例19中大鼠主动脉根部脂肪染色结果；其中，a：空白组主动脉根部血管壁；b：模型组血管壁；c：辛伐他汀处理后，主动脉血管壁未见脂肪堆积；d：化合物1处理后，主动脉血管壁未见脂肪堆积。

附图3是脂代谢相关基因示意图。

附图4是实施例20中化合物1对LXRα、LXRβ转录活性的影响。

附图5A：实施例21中化合物1对脂质摄入基因(FAT/CD36)表达的影响；附图5B：实施例20中化合物1对脂质合成相关基因(SREBP-1c、SREBP-2、ACC、HMGR和FAS) 表达的影响。

附图6A是实施例21中化合物1对脂质氧化相关基因(PPARα、CPT-1和ACOX-1) 表达的影响；附图6B：实施例21中化合物1对胆固醇代谢相关基因ABCG5、ABCG8、ABCG1 表达的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1：化合物1的合成

(1)中间体1-b的合成

①依次将89mg二水合锇酸钾、383mg吡啶、1.14gN-甲基-N-氧化吗啉加入至70ml二氧六环-水(体积比为10:1)混合溶液中，剧烈搅拌约4h，有明显的两相分界，底层为亮黄色，后经降温至室温，分批加入1.0g豆甾醇1-a，整个反应液保持温度继续搅拌20h。②反应完毕后，加入亚硫酸钠溶液，经过乙酸乙酯萃取，有机层先后经氢氧化钾溶液、盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和食盐水洗涤后，干燥，浓缩得到中间体双羟化产物。③上述中间体粗品，降温至0℃，加入2.07g NaIO₄，反应液搅拌4～6h。④反应完毕后经亚硫酸钠洗涤，乙酸乙酯萃取，有机相再经饱和食盐水洗涤，干燥得到粗品，重结晶(乙酸乙酯：正己烷＝1：6)得到320mg白色固体1-b(40％)。

(2)中间体1-c的合成

依次将320mg 1-b、1.35g乙氧甲酰基亚甲基三苯膦，20ml二氯甲烷加入到50mL的反应瓶中，氮气保护，常温搅拌约36h，反应完毕后反应液直接浓缩完毕，柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝5:1)，得到310mg白色固体1-c(80％)。

(3)中间体1-d的合成

依次将310mg 1-c、83mg 10％钯碳、10ml乙酸乙酯加入到25mL的反应瓶中，氢气球加压，常温搅拌约24h，反应完毕后抽滤，滤液直接浓缩得到310mg白色固体1-d(100％)。

(4)化合物1的合成

依次将310mg 1-d、10ml无水四氢呋喃加入到25mL的反应瓶中，氮气保护，保持0℃下滴加1.6M MeLi乙醚溶液(2.5mL，3.85mmol)，后缓慢升温至常温搅拌约2h。反应完毕后，反应液经过滴加饱和氯化铵溶液淬灭，加入乙酸乙酯进行萃取，有机相经过饱和食盐水洗涤、干燥，浓缩得到白色粗品。粗品经过重结晶(乙酸乙酯:正己烷＝1:3)，得到180mg化合物1(60％)。

表1.实施例1各反应步骤产物的表征结果

实施例2：化合物2的合成

将化合物1(38.8mg，0.1mmol)溶于干燥2ml二氯甲烷中，0℃下加入三氟化硼乙醚溶液 (30.0mg，0.1mmol)，然后升至室温，反应2h。反应完毕后加入水淬灭，用二氯甲烷萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，干燥并浓缩。将所得粗品经柱层析纯化(30％乙酸乙酯/石油醚) 得到化合物2(22.3mg，60％)。

表2.实施例2产物的表征结果

实施例3：化合物3的合成

依次将化合物1(38.8mg,0.1mmol)，咪唑(20.4mg,0.3mmol)和叔丁基二甲基氯硅烷(30 mg,0.2mmol)加入到二氯甲烷(5mL)中，室温搅拌16h。水洗，食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。粗品通过硅胶快速色谱法纯化(石油醚：乙酸乙酯＝5：1)，得到化合物3(35mg，70％)。

表3.实施例3产物的表征结果

实施例4：化合物4的合成

依次将化合物1(60mg，0.155mmol)，三氟乙酸酐(0.2mL)，碘(6.0mg,0.15eq)，DCM(2mL)加入到8mL的反应瓶中。反应在室温下搅拌8h。滴加饱和硫代硫酸钠溶液，加入乙酸乙酯20mL，然后，用饱和的NaCl溶液清洗，有机相由无水硫酸钠干燥。浓缩，后经层析柱分离得到化合物(20mg，30％)。

表4.实施例4产物的表征结果

实施例5：化合物5的合成

将化合物1(38.8mg,0.1mmol)，丁二酸酐(15mg,0.15mmol)和4-二甲胺基吡啶(36.6 mg,0.3mmol)加入到二甲基亚砜(1mL)中，140℃反应16h.降至室温，用水淬灭(5mL)，二氯甲烷萃取(5mL x 2)。结合有机相，水洗，食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。粗品通过硅胶快速色谱法纯化(DCM/MeOH＝7/1)得到化合物5(14.7mg，30％)。

表5.实施例5产物的表征结果

实施例6：化合物6的合成

将化合物1(38.8mg,0.1mmol),苯甲酸(12.2mg,0.1mmol),4-二甲胺基吡啶(37mg,0.3 mmol)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(38mg,0.2mmol)加入到干燥的二氯甲烷(1mL)中，室温反应16h.用二氯甲烷稀释，水洗，食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。粗品通过硅胶快速色谱法纯化(石油醚：乙酸乙酯＝4：1)得到化合物6(30.5mg，62％)。

表6.实施例6产物的表征结果

实施例7：化合物7的合成

依次将化合物1(50mg，0.129mmol)，氢化钠(30mg，1.2mmol)，Br(CH₂)₅OTBS(145.2mg，0.516mmol)，四氢呋喃(2～3mL)加入到8mL的反应瓶中。反应在50℃下搅拌12h，取样展板，原料有一点剩余。然后，滴加氯化铵水溶液，调节PH值为6.0～7.0，加入乙酸乙酯20mL，用饱和的NaCl溶液清洗，有机相由无水硫酸钠干燥。浓缩，后经层析柱分离得到化合物7(30mg，40％)。

表7.实施例7产物的表征结果

实施例8：化合物8的合成

将化合物1(38.8mg,0.1mmol),Boc-L-脯氨酸(12.2mg,0.1mmol),4-二甲胺基吡啶(37mg, 0.3mmol)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(38mg,0.2mmol)加入到干燥的二氯甲烷(1mL)中，室温反应16h.用二氯甲烷稀释，水洗，食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。粗品通过硅胶快速色谱法纯化(石油醚：乙酸乙酯＝3：1)得到化合物8(40mg， 68％)。

表8.实施例8产物的表征结果

实施例9：化合物9的合成

依次将化合物1(80mg，0.21mmol)，醋酸酐(0.2mL)，吡啶(1mL)加入到8mL的反应瓶中，常温搅拌8h。滴加1N稀盐酸，调节PH值为6.0～7.0。加入乙酸乙酯20mL，有机相分层后，经饱和氯化钠溶液洗涤后，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩，后经柱层析分离得到化合物9(65mg，70％)。

表9.实施例9产物的表征结果

实施例10：化合物10的合成：

依次将化合物9(30mg，0.070mmol)，三乙胺(0.2mL)，乙酰氯(25mg，4.0eq)，二氯甲烷(2mL)加入到8mL的反应瓶中。反应在室温下搅拌2h。加入1N稀盐酸，调节PH值为 6.0～7.0，加入乙酸乙酯20mL，用饱和的NaCl溶液清洗，有机相由无水硫酸钠干燥。浓缩，后经柱层析分离得到化合物10(20mg，60％)。

表10.实施例10产物的表征结果

实施例11：化合物11的合成

依次将化合物1(60mg,0.155mmol)，对甲苯磺酰氯(89mg,0.465mmol,3.0eq),4-二甲胺基吡啶(2.84mg,0.0233mmol,0.15eq)，吡啶(3mL)加入到8mL的反应瓶中。反应在0℃下搅拌2h。加入1N稀盐酸，调节PH值为6.0～7.0，加入乙酸乙酯20mL，有机相用饱和NaCl 溶液清洗，无水硫酸钠干燥。浓缩，后经柱层析分离得到化合物11(50mg，60％)。

表11.实施例11产物的表征结果

实施例12：化合物12的合成

将化合物11(20mg,0.037mmol)和4-甲苯磺酸一水合物(14mg,0.074mmol)加入甲苯(0.5mL)中，升温至70℃反应3h.降至室温，用乙酸乙酯稀释，水洗，食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。粗品通过柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝6：1)得到化合物12(13mg，68％)。

表12.实施例12产物的表征结果

实施例13：化合物13的合成

依次将化合物1(38mg，0.10mmol)，甲基磺酰氯(32.0mg,3.0eq)，二氯甲烷(2mL)加入到8mL的反应瓶中。反应在0℃下搅拌2h。加入1N稀盐酸，调节PH值为6.0～7.0，加入乙酸乙酯20mL，用饱和的NaCl溶液清洗，有机相用无水硫酸钠干燥。浓缩，后经柱层析分离得到化合物13(35mg，76％)。

表13.实施例13产物的表征结果

实施例14：化合物14的合成

依次将化合物11(20mg,0.037mmol)，三乙胺(18.6mg,0.18mmol)，乙酰氯(6mg,0.074 mmol)加入到干燥的二氯甲烷中(1mL)，在室温下反应30min。用二氯甲烷稀释，水洗，食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，后经柱层析分离得到化合物14(10mg，47％)。

表14.实施例14产物的表征结果

实施例15：化合物15的合成

依次将化合物1(38mg，0.10mmol)，三乙胺(0.1mL)，4-二甲胺基吡啶(1.83mg,0.015mmol, 0.15eq)，氯甲酸苄酯(86mg,5.0eq)和二氯甲烷(2mL)加入到8mL的反应瓶中。反应在室温下搅拌12h。然后，加入1N稀盐酸，调节pH值为6.0～7.0，加入乙酸乙酯20mL，用饱和NaCl溶液清洗，有机相用无水硫酸钠干燥。浓缩，后经柱层析分离得到化合物15(9mg，20％)。

表15.实施例15产物的表征结果

实施例16：化合物16的合成

依次将化合物1(60mg，0.155mmol)，间氯过氧苯甲酸(49.5mg,0.20mmol,1.3eq)，二氯甲烷(5mL)加入到反应瓶中。反应在0℃下搅拌4h。滴加饱和硫代硫酸钠溶液，加入乙酸乙酯20mL，然后，有机相用饱和食盐水洗涤，无水Na₂SO₄干燥。浓缩，后经层析柱分离得到化合物16(20mg，30％)。

表16.实施例16产物的表征结果

实施例17：化合物1-16体外降脂活性的评价

实验采用油酸(Oleic Acid,OA)作用于人肝癌细胞HepG2，导致细胞内脂质堆积，并使用降脂药物辛伐他汀(Simvastatin)作为阳性药观察降脂效果。油红O染色后通过对比OD358 来比较化合物降脂效果(如图1所示)。

表17.化合物体外降脂活性评价结果列表

试验方法：取对数生长期HepG2细胞12000个/孔接种于96孔板，100μl/孔；12h后融合度达到70-80％后换成无血清DMEM培养基，每孔80μl，饥饿12h。12h后，空白对照加入 20μl无血清培养基，其他组每孔加入诱导剂OA(终浓度80uM)，10μl/孔。在此基础上，模型组补充10μl无血清培养，给药组加入10μl待测化合物，终浓度见表17所示，培养箱孵育 24h。24h孵育完毕后，弃掉培养基，用PBS(室温)缓冲液洗1次，每孔加入80μl 4％多聚甲醛固定液室温固定0.5h，PBS洗1次，60％异丙醇润洗10min后每孔加入60μl 0.3％油红O (SigmaO0625)染液室温染色1h，然后用PBS缓冲液洗3次；用DMSO溶解，100μl/孔，酶标仪358nm处测OD值。

实验结果：通过对比OD₃₅₈，模型组(OA)可明显诱导脂质堆积，阳性药辛伐他汀在10μM 能显著性(P<0.05)降低胞内脂质含量，具有统计学意义。化合物1,2,5在10μM剂量下均具有显著的降脂效果，作用强度与阳性药辛伐他汀相当；而且明显优于马尾藻甾醇。

实施例18：化合物1的小鼠体内降脂活性试验

试验方法：所有小鼠基础饲料喂养7d，禁食12h后，按体重随机分为5组，分别为空白组、模型组、阳性药辛伐他汀组(23.9μM，10mg/kg)、化合物1低剂量组(100μM，38.9mg/kg)、化合物1高剂量组(200μM，77.7mg/kg)。每组10只小鼠，其中，空白组继续饲喂基础饲料，其他组饲喂高脂饲料，4w末取血检测血脂，确定造模成功。

从5w开始，分别按各自灌胃剂量给药，1次/d，连续给药4w，给药4w后，禁食12h，取血，2500rpm 10min离心分离血浆，检测甘油三酯(TG)、胆固醇(TCHO)和低密度脂蛋白(LDL)含量。

表18.受试样品对高脂血模型小鼠血脂的影响

*p<0.05vs.空白，#p<0.05vs.模型

数据处理：全部数据采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，所得数据用

表示(如表18所示)，各组数据运用t检验分析，进行组间比较。

检测结果及分析：给药4w后，阳性药辛伐他汀表现出降低血浆TCHO、LDL-C水平的趋势，与模型组相比差异显著(p<0.05)。化合物1对小鼠血中TG、TCHO、LDL-C有显著降低趋势，作用与阳性药相当。各给药组小鼠HDL-C水平与模型组相比未有统计学差异(表 18)。以上结果表明，化合物1具有降血脂活性。

实施例19：化合物1的大鼠体内降脂活性试验

试验方法：所有大鼠基础饲料喂养7d，禁食12h后，按体重随机分为6组，空白组，模型组，阳性药辛伐他汀组(5mg/kg)，化合物1低、中、高剂量组(50、100、200μM，即19.5、38.9、77.7mg/kg)，每组8只大鼠，其中空白组继续饲喂基础饲料，其他组饲喂高脂饲料。高脂喂养4wk取血检测血脂，确定造模成功。

从5wk开始，分别按各自灌胃剂量给药，1次/d，连续给药4wk，给药期间记录体重与摄食量。给药4wk后，禁食12h，各组大鼠10％水合氯醛麻醉，腹腔静脉取血，2500rpm 15min离心分离血浆，检测甘油三酯(TG)、胆固醇(TCHO)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量，打开腹腔取出附睾、肾周脂肪，电子天平称湿重并记录。

取各组大鼠心脏，于主动脉根部横断面冰冻切片，入10％中性福尔马林固定15min，蒸馏水冲洗2min，60％异丙醇水溶液2s，入油红O工作液染15min，60％异丙醇水溶液2s，蒸馏水洗2min，Mayer氏苏木精染核8min，水洗1min，分化2s，水洗1min，返蓝1s，水洗1min，甘油封片，镜检照相。

数据处理：全部数据采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，所得数据用

表示(结果详见表19)，各组数据运用t检验分析，进行组间比较。

检测结果及分析：高脂饲料饲喂4wk后，各组大鼠血浆中TCHO水平均有明显的上升，且与空白组相比显著差异，(p<0.05)，但TG含量未有显著差异，说明高脂饲料喂养大鼠致高胆固醇型高脂血模型复制成功。造模成功后，连续治疗性给药4周，阳性药辛伐他汀是临床常用药物，实验结果表明，给药4wk后，阳性药辛伐他汀表现出降低血浆TCHO、LDL-C水平的趋势，与模型组相比差异显著(p<0.05)。化合物1对大鼠血中TCHO、LDL-C有显著降低趋势，作用与阳性药辛伐他汀相当，结果表明化合物1具有降血脂活性。

表19.化合物1对高脂大鼠血脂的影响

*p<0.05vs.空白，#p<0.05vs.模型

病理结果分析可见，与空白组主动脉根部血管壁相比，模型组血管壁内可见大量橘红色脂肪空泡，为脂质沉积血管壁的表现，辛伐他汀与化合物1处理后，大鼠主动脉血管壁未见脂肪堆积，说明化合物1能改善主动脉脂质堆积(图2)。

实施例20：LXRβ激活作用的测试：

利用双荧光素酶报告基因分析技术，检测LXRβ的转录激活作用。在293T细胞中转入含有UAS元件的TATA-LUC质粒，含LXRα和LXRβ的LBD结构域的Gal4融合蛋白表达质粒，对照质粒RL-TK，检测化合物1对LXRα、LXRβ转录活性的影响。具体实验步骤如下：

(1)细胞转染，配置转染试剂，每孔用量如下：管1：opti-MEM:20μL；Gal4-LXRα-LBD或Gal4-LXRβ-LBD:0.025μg；TATA-LUC:0.075μg；RL-TK:0.002μg；混匀。管2：opti-MEM: 20μL；Lipo-2000:0.25μL；混匀。将两管混合，室温5min后，加入96孔板中，每孔40μL， HEK293T细胞以每孔15000个铺于白色不透明底的96孔板中，进行转染；

(2)培养24h后，加入化合物1、NP(马尾藻甾醇)、T0901317(是LXRα和LXRβ外源性人工合成配体，非选择性激活LXRα和LXRβ，它们在促进胆固醇向体外排出的同时，上调SREBP-1c和脂肪酸合成酶基因的表达，增加肝脏中TG的含量)，终浓度为10μM，培养箱孵育16h；

(3)双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测化合物1对LXR转录活性的影响。

结果表明，10uM浓度下，化合物1对LXRα的激活倍数是1.02倍，对LXRβ的激活倍数是2.59倍，化合物1是LXRβ选择性激动剂。由图4可知，与现有技术中马尾藻甾醇对LXRβ的选择倍数是2倍相比，化合物1对LXRβ的选择倍数接近3倍，提高了将近50％，说明化合物1大大提高了其对LXRβ的选择性。

实施例21：化合物1对HepG2细胞脂代谢相关基因表达的影响

利用人肝癌细胞HepG2、人肾上皮细胞293T，分别从脂质的摄取、合成与代谢探究化合物化合物1的降脂机理。

FAT/CD36是脂肪酸易位酶，在肝脏中表达，影响肝脏脂肪酸的摄入，因此，抑制FAT/CD36 的表达，导致脂肪酸摄入下降。固醇调节元件结合蛋白(sterol-regulatoryelement binding proteins,SREBPs)及其下游基因脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FAS)、乙酰辅酶A羧化酶 (ACC)、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMGR) 可促进体内胆固醇、脂肪酸及甘油三酯的合成和积聚，被称作成脂基因(lipogenic genes)。相反，过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisone proliferators-activated receptor alpha,PPAR α)及其下游基因乙酰辅酶A氧化酶(ACOX)和肉毒碱棕榈酰转移酶I(CPT-1)等可以通过促进脂肪酸β氧化而降低脂质水平。

肝X受体(liver X-activated receptor，LXR)是体内控制胆固醇的转运、吸收和分解的感受器，是细胞核受体超家族的成员之一，有两种亚型：LXRα和LXRβ。LXRα的表达具有组织特异性，它主要表达在肝脏、肠、肾和巨噬细胞，其中在肝脏表达最高，而LXRβ几乎在所有组织中都有表达，其中在脑表达最高。T0901317是其外源性人工合成配体，LXRα和 LXRβ作为转录因子，与配体结合激活后，与其下游基因上特定的顺式作用元件结合，上调相关基因的转录表达，在胆固醇的吸收、排出、转化及脂肪酸的合成等多个方面发挥调节作用，如促进脑神经细胞内胆固醇向胞外转运(ABCA1和ABCG1)，促进外周组织的胆固醇向肝组织逆向转运(ABCA1、ABCG1和apoE)，促进肝胆固醇向胆汁酸的转变(CYP7A1)，增加肝胆固醇向胆汁中的直接排放(ABCG5和ABCG8)，抑制小肠对胆固醇的吸收(ABCG5 和ABCG8)等(如图3所示)。

激活LXR也会上调胆固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP-1c)、FAS的表达，增加脂肪酸的合成，会导致肝脏中甘油三酯(triglyceride，TG)水平的升高，诱导脂肪肝的形成。研究发现，在肝脏中LXRα对TG的形成影响较为显著，因此选择性激活LXRβ亚型而不激活 LXRα亚型可以达到预期的促进胆固醇向体外排泄而不增加患上脂肪肝风险的目的。

实验材料：

DMEM培养基，FBS血清，谷氨酰胺，青霉素，链霉素，96孔板，人肝癌细胞HepG2，人肾上皮细胞293T，油酸，辛伐他汀，T0901317，转染试剂Lipo-2000，Opti-MEM，Trizol RNA提取液，氯仿，乙醇，DEPC水，反转录试剂盒，荧光定量PCR试剂盒，荧光素酶报告基因检测试剂盒；上述实验材料均为市售。

主要仪器：

细胞培养箱Thermo 150i；多功能酶标仪MD Versa Max；多功能酶标仪SpectraMaxL；冷冻离心机Allegra X-15R；超低温冰箱-80度DW86L626；核酸定量仪NanoDrop One； BIO-RAD DNA Engine系列PCR仪T100；实时荧光定量PCR仪瑞士LightCycler96 Roche Life Science、05815916001。

实验方法：

1.采用荧光定量PCR检测化合物1作用于油酸诱导的脂质堆积细胞HepG2，对脂质摄入基因(FAT/CD36)、脂质合成相关基因(SREBP-1c、SREBP-2、ACC、HMGR和FAS)和脂质氧化相关基因(PPARα、CPT-1和ACOX-1)表达的影响。

1)取对数生长期HepG2细胞25万个/孔接种于6孔板，2ml/孔；

2)12h后融合度达到70-80％，换成无血清DMEM培养基，每孔2ml，饥饿12h。12h 后，空白对照加入无血清培养基，其他组每孔加入诱导剂OA(终浓度80μM)；在此基础上，加入辛伐他汀、化合物1终浓度10μM，培养箱孵育24h；

3)24h孵育完毕后，弃掉培养基，用PBS(室温)缓冲液洗2次，每孔加入500μlTrizol 裂解细胞，吹打均匀，室温放置5min，加入100μl氯仿，剧烈震荡15s静置3min，离心4℃，12000r/min，15min。上清液移入EP管中，加入250μl异丙醇，颠倒几下，静置10min，离心。弃上清，75％乙醇重悬，离心。弃上清，晾干。加入20μl DEPC水溶解RNA，测定浓度；

4)用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，首先去除基因组DNA反应：

表20.去除基因组DNA反应反应液组份

试剂	使用量
		5×qDNA Eraser Buffer	2.0μl
gDNA Eraser	1.0μl
		Total RNA	＊1
RNase Free dH<sub>2</sub>O	up to 10μl

42℃，2min(或者室温5min)；4℃。

反转录反应：37℃，15min，85℃，5sec，4℃

表21.反转录反应反应液组份

5)荧光定量PCR反应：

按下列组份配制PCR反应液(反应液配制请在冰上进行)。

表22.荧光定量PCR反应反应液组份

试剂	使用量	终浓度
			SYBR Premix Ex Taqll(Tli RNaseH Plus)(2×)	12.5μl	1×
PCR Forward Primer(10μM)	1.0μl	0.4μM<sup>＊1</sup>
			PCR Reverse Primer(10μM)	1.0μl	0.4μM<sup>＊1</sup>
RT反应液(cDNA溶液)	2μl<sup>＊2</sup>
			dH<sub>2</sub>O(灭菌蒸馏水)	8.5μl
Total	25μl

两步法PCR扩增标准程序：

Stage 1：预变性

Repeat：1

95℃，30s

Stage 2：PCR反应

Repeat：40

95℃，5s

60℃，30-60s

Stage 3：Dissociation

2.采用荧光定量PCR检测化合物1作用于HepG2细胞，对胆固醇代谢相关基因ABCG5、ABCG8、ABCG1表达的影响。

1)取对数生长期HepG2细胞30万个/孔接种于6孔板，2ml/孔；

2)12h后融合度达到70-80％后加入化合物1、阳性对照T0901317，终浓度为10μM，培养箱孵育24h；

3)提取RNA，进行荧光定量PCR反应，方法如上。

实时定量PCR结果表明，化合物1能够抑制脂质摄入相关基因FAT/CD36的表达(P＜0.05)(图5A)；显著性抑制胆固醇合成相关基因HMGR的表达(P＜0.01)(图5B)；同时还可显著性提高脂质氧化相关基因PPARα、CPT-1的表达(P＜0.01)(图6A)；提高下游基因 ABCG1的表达(P＜0.05)(图6B)。

以上结果充分表明，化合物1能通过抑制脂肪酸摄入，增强脂肪酸代谢，抑制胆固醇合成，增强胆固醇代谢达到降脂的效果。

实施例22.安全性初步评价实验

实验动物：

雄性KM鼠5只，体重27±1g，购自于济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号：SCXK 鲁20140007。饲养温度为24℃，湿度为60％，饲以固体饲料(北京华阜康生物科技股份有限公司)，自由饮水，禁食12小时后给药，不禁水。

受试药物：

化合物1 100mg加200μL乙醇助溶，加入0.5％羧甲基纤维素钠至2mL，配制成溶液，每只小鼠灌服0.2mL/10g，相当于1g/kg。

实验方法：

小鼠空腹12小时后给药。给药后自由饮食，每天上、下午各观察1次，连续观察3天。观察指标：

神经系统方面：①行为及反应(包括不正常叫声、烦躁、不安、易怒、感觉过敏、少动、嗜睡或昏迷等)；②运动(包括肌肉抽搐、僵硬、强迫运动、松弛、麻痹等)；③瞳孔及分泌物(瞳孔有否缩小或放大、流涎、流泪等)。

呼吸及心血管：呼吸状态、鼻分泌、触心前区心率快慢等。

胃肠方面：腹部胀气或收缩、大便性状和色泽等。

泌尿生殖系统：阴唇、乳腺肿胀，会阴部肮脏。

皮肤和毛：颜色、完整性、有无充血、紫绀、苍白、发诊、皮毛松散等。

眼：有无眼睑下垂、眼球突出、震颤等。

其它：每天检测食量和体重。

结果：

灌胃前后状态分析：在观察期间无1只动物死亡，所有观察指标均无异常。

灌胃前后体重变化：灌胃前小鼠体重27.1±1g(26.0～28.1g)，灌胃后第3天小鼠体重35.8 ±1.3g(34.5～37.0g)，空白小鼠体重35.6±1.7g(34.0～37.3g)，灌胃后体重无明显变化。

结论：

本实验所观察的各项指标均正常，未见动物死亡，表明在口服剂量100倍的测试条件下，化合物1无明显急性毒性作用。

Claims (1)

1.一种3β-羟基-麦角甾-5-烯甾类化合物在制备具有预防或治疗LXRβ相关代谢症药物中的应用，其特征在于：所述化合物的结构式如下所示：

；

所述的LXRβ相关代谢综合症为高血脂、动脉粥样硬化或高血压。

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