CN109265474A - 一种化合物、聚集诱导发光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物成像的技术领域，公开了一种化合物、聚集诱导发光探针及其制备方法与应用。所述化合物为式III或IV化合物。所述聚集诱导发光探针包含式III或IV化合物中至少一种。本发明还公开了式III和IV化合物的制备方法。本发明的化合物能有效克服传统荧光染料的聚集诱导猝灭的缺陷，实现Aβ斑块的特异性和高信噪比荧光成像，具有发光效率高、斯托克位移大等优点，可作为聚集诱导发光探针，并具有神经保护作用。另外，本发明还公开了化合物在Aβ斑块特异性荧光成像剂和神经细胞保护以及监测Aβ纤维形成或解聚Aβ纤维中应用。

Description

一种化合物、聚集诱导发光探针及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于荧光探针的技术领域，特别涉及一种化合物、聚集诱导发光探针及其制备方法与应用。
背景技术
阿尔茨海默病是一种发生在老年期的慢性渐进性中枢神经系统退行性疾病。随着我国老龄化社会的到来，阿尔茨海默病患者的数量也显著增加，成为亟待解决的重要医学和社会问题。目前诊断阿尔茨海默病的“金标准”之一是检测 Aβ斑块的形成。Aβ斑块及Aβ纤维主要由Aβ1-42肽的β-折叠构成，通过破坏突触膜，对周围的突触和神经元产生毒性作用，引起神经细胞死亡。因此特异性检测Aβ斑块的形成，对于诊断阿尔茨海默病具有极为重要的意义。
荧光成像具有高灵敏性、高时空分辨率、操作简单、成本低等优点。目前，用于Aβ斑块的荧光成像试剂主要包括硫磺素T、苝酰亚胺衍生物和Aβ抗体染色试剂等。然而，这些荧光成像试剂在聚集后容易发生荧光的自我猝灭。例如，苝酰亚胺染料在染色Aβ纤维时，在局部区域形成高浓度聚集，极易发生荧光的自我猝灭。而且，传统的染色Aβ斑块或纤维的荧光试剂还具有斯托克位移小、光稳定性差、信噪比低等缺陷，严重限制了其应用。因此亟需发展能够克服上述缺陷的且能够特异性染色Aβ斑块的荧光探针。
发明内容
为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种具有聚集诱导发光性质的化合物及利用该化合物得到的聚集诱导发光探针。本发明的化合物能够特异性染色Aβ斑块，对Aβ纤维检测的效果好，具有成像信噪比高、细胞毒性小、斯托克位移大等优点，作为聚集诱导发光探针使用。本发明的聚集诱导发光化合物(或探针)用于Aβ斑块荧光成像，具有非常好的效果。
本发明的另一目的在于提供上述化合物的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述化合物在Aβ斑块荧光成像和神经保护中的应用，作为Aβ斑块剂显影剂和神经细胞保护剂。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种化合物，其结构式为式III：
其中，R1，R2独立地为氢、C1～C8烷基、C3～6环烷基、羟基、C1～C8烷基氧基、NH2-、C1～C8烷基氨基、巯基、C1～C8烷基硫基、卤素、C1～C8烷酰基、硝基、C6～C20芳基(Ar-)、C6～C20芳基氧基(Ar-O-)、C6～C20芳基氨基(Ar-NH-)、芳基硫基(Ar-S-)、C4～C20杂芳基氧基、C4～C20杂芳基氨基、C4～C20杂芳基硫基或C3～C6杂环烷基。
上述C1～C8烷基是指具有1～8个碳原子的直链或支链的烷基，例如：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基、2-甲基-丁基、3-甲基-丁基、新戊基、己基、庚基、辛基等。
上述C3～C6环烷基是指具有3～6个碳原子的环烷基，例如：环丙基、环丁基、环戊基、环乙基等。
上述C1～C8烷基氧基是指具有1～8个碳原子的直链或支链的烷基氧基，例如：甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、2-甲基 -丁氧基、3-甲基-丁氧基、新戊氧基、己氧基、庚氧基、辛氧基等。
上述C1～C8烷基氨基是指具有1～8个碳原子的直链或支链的烷基氨基，例如：甲氨基、乙氨基、丙氨基、异丙氨基、丁氨基、叔丁氨基、戊氨基、2-甲基 -丁氨基、3-甲基-丁氨基、新戊氨基、己氨基、庚氨基、辛氨基等。
上述C1～C8烷基硫基是指具有1～8个碳原子的直链或支链的烷基硫基，例如：甲硫基、乙硫基、丙硫基、异丙硫基、丁硫基、叔丁硫基、戊硫基、2-甲基 -丁硫基、3-甲基-丁硫基、新戊硫基、己硫基、庚硫基、辛硫基等。
上述卤素是指氟、氯、溴、碘。
上述C1～C8烷酰基是指具有1～8个碳原子的直链或支链的烷酰基，例如：甲酰基、乙酰基、丙酰基、异丙酰基、丁酰基、叔丁酰基、戊酰基、2-甲基-丁酰基、3-甲基-丁酰基、新戊酰基、己酰基、庚酰基、辛酰基等。
上述C6～C20芳基、C6～C20芳基氨基和C6～C20芳基硫基中的芳基是指具有 6～20个碳原子的取代或者未取代的单环芳基、多环芳基、稠环的芳族基团，其中，所述取代基选自氢、卤素、硝基、羟基、C1～C3烷基、C1～C3烷基氧基、巯基、C1～C3烷基硫基、NH2-、C1～C3烷基氨基中至少一种。代表性的芳基如：苯基、甲基苯基、乙基苯基、丁基苯基、戊基苯基、己基苯基、对甲氧基苯基、对羟基苯基、对氨基苯基、α-萘基、β-萘基、蒽基、芘基等。
上述C4～C20杂芳基、C4～C20杂芳基氨基和C4～C20杂芳基硫基中的杂芳基是指取代或者未取代的具有1～4个选自N、O或S的杂原子，4～20个碳原子的单环、多环、稠环的杂芳族基团，碳与杂原子能够形成环状基团，其中，所述取代基选自氢、卤素、硝基、羟基、C1～C3烷基、C1～C3烷基氧基、巯基、C1～C3烷基硫基、NH2-、C1～C3烷基氨基中至少一种。代表性的杂芳基如：吡咯基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、噻唑基、吲哚基、氮杂萘基、氮杂蒽基、氮杂芘基。
上述C3～C6杂环烷基是指具有1～3个选自N、O、S的杂原子的3～6元环，例如：环乙胺基、环丙胺基、四氢吡咯基、吗啡啉基、哌啶基等。
优选地，R1为氢、C1～C4烷基或C1～C4烷基氧基。更优选地，R1为C1～C4烷基氧基。更优选地，R1为甲氧基。
优选地，R2为氢、羟基、NH2-、巯基或C1～C4烷基氧基。更优选地，R2为羟基、NH2-或巯基。更优选地，R2为羟基。
更优选的，所述化合物的式III中，R1为甲氧基，R2为羟基时，结构：
一种式III所示的化合物的制备方法，包括以下步骤：将式II化合物与三氟化硼乙醚在有机溶剂中反应，制得式III化合物。
式II化合物的结构式为式II：R1，R2如式III中所定义。
所述式II化合物与三氟化硼乙醚的摩尔比为1:(1～10)，优选为1：(2.5～3.5)。
所述有机溶剂为四氢呋喃、乙醚、1,4-二氧六环中至少一种。
所述反应的温度为50～80℃，优选为60～70℃。
所述反应在氮气或氩气保护下进行。
所述式II化合物通过以下方法制备得到：将式I化合物与甲酸铵在有机溶剂中反应，制得式II化合物。
式I化合物的结构式为式I：R1，R2如式III中所定义。
所述式I化合物与甲酸铵的摩尔比为1:(1～15)，所述有机溶剂为二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、乙醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷或四氢呋喃中至少一种，优选为N,N-二甲基甲酰胺和乙醇的混合液，N,N-二甲基甲酰胺和乙醇的体积比为1:(5.5～6.5)。
所述反应的温度为60～90℃，优选为75～85℃。
所述反应在氮气或氩气保护下进行。
式III的化合物在制备聚集诱导发光探针中的应用。本发明的聚集诱导发光探针，具有聚集态发光效率高(固态下的量子产率高达14.0％)、斯托克位移大 (高达145nm)、生物相容性好(在20μM时，神经细胞存活率仍高达100％)、成像信噪比高(高达10倍)等优点。
式III的化合物在Aβ纤维检测中的应用。本发明的式III的化合物作为聚集诱导发光探针，在高浓度时(4mM)，仍可有效监测Aβ纤维的形成，而传统的聚集猝灭发光探针，在高浓度使用时，易发生荧光的自我猝灭。
式III的化合物在Aβ斑块特异性荧光成像中的应用，作为Aβ斑块特异性荧光成像剂。通过将式III的化合物与Aβ斑块的抗体染料进行共染实验，证实了其具有优异的Aβ斑块特异性染色效果，不需要重复洗涤，即可实现高信噪比成像。
式III的化合物在神经保护中的应用。优选地，所述神经保护是神经元细胞保护。式III化合物可有效抑制Aβ纤维对神经细胞的毒害作用，增加神经元细胞突触的形成，具有神经保护功能。
所述聚集诱导发光探针包含式III化合物，在神经保护(特别是神经元细胞保护)中的应用。
所述聚集诱导发光探针包含式III化合物，具体是指在Aβ斑块特异性荧光成像剂和/或神经保护剂中的应用。
一种化合物，其结构为式IV：
其中，R3，R4独立地为氢、C1～C8烷基、C3～6环烷基、羟基、C1～C8烷基氧基、NH2-、C1～C8烷基氨基、巯基、C1～C8烷基硫基、卤素、C1～C8烷酰基、硝基、C6～C20芳基(Ar-)、C6～C20芳基氧基(Ar-O-)、C6～C20芳基氨基(Ar-NH-)、芳基硫基(Ar-S-)、C4～C20杂芳基氧基、C4～C20杂芳基氨基、C4～C20杂芳基硫基或C3～C6杂环烷基。
上述C1～C8烷基是指具有1～8个碳原子的直链或支链的烷基，例如：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基、2-甲基-丁基、3-甲基-丁基、新戊基、己基、庚基、辛基等。
上述C3～C6环烷基是指具有3～6个碳原子的环烷基，例如：环丙基、环丁基、环戊基、环乙基等。
上述C1～C8烷基氧基是指具有1～8个碳原子的直链或支链的烷基氧基，例如：甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、2-甲基 -丁氧基、3-甲基-丁氧基、新戊氧基、己氧基、庚氧基、辛氧基等。
上述C1～C8烷基氨基是指具有1～8个碳原子的直链或支链的烷基氨基，例如：甲氨基、乙氨基、丙氨基、异丙氨基、丁氨基、叔丁氨基、戊氨基、2-甲基 -丁氨基、3-甲基-丁氨基、新戊氨基、己氨基、庚氨基、辛氨基等。
上述C1～C8烷基硫基是指具有1～8个碳原子的直链或支链的烷基硫基，例如：甲硫基、乙硫基、丙硫基、异丙硫基、丁硫基、叔丁硫基、戊硫基、2-甲基 -丁硫基、3-甲基-丁硫基、新戊硫基、己硫基、庚硫基、辛硫基等。
上述卤素是指氟、氯、溴、碘。
上述C1～C8烷酰基是指具有1～8个碳原子的直链或支链的烷酰基，例如：甲酰基、乙酰基、丙酰基、异丙酰基、丁酰基、叔丁酰基、戊酰基、2-甲基-丁酰基、3-甲基-丁酰基、新戊酰基、己酰基、庚酰基、辛酰基等。
上述C6～C20芳基、C6～C20芳基氨基和C6～C20芳基硫基中的芳基是指具有 6～20个碳原子的取代或者未取代的单环芳基、多环芳基、稠环的芳族基团，其中，所述取代基选自氢、卤素、硝基、羟基、C1～C3烷基、C1～C3烷基氧基、巯基、C1～C3烷基硫基、NH2-、C1～C3烷基氨基中至少一种。代表性的芳基如：苯基、甲基苯基、乙基苯基、丁基苯基、戊基苯基、己基苯基、对甲氧基苯基、对羟基苯基、对氨基苯基、α-萘基、β-萘基、蒽基、芘基等。
上述C4～C20杂芳基、C4～C20杂芳基氨基和C4～C20杂芳基硫基中的杂芳基是指取代或者未取代的具有1～4个选自N、O或S的杂原子，4～20个碳原子的单环、多环、稠环的杂芳族基团，碳与杂原子能够形成环状基团，其中，所述取代基选自氢、卤素、硝基、羟基、C1～C3烷基、C1～C3烷基氧基、巯基、C1～C3烷基硫基、NH2-、C1～C3烷基氨基中至少一种。代表性的杂芳基如：吡咯基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、噻唑基、吲哚基、氮杂萘基、氮杂蒽基、氮杂芘基。
上述C3～C6杂环烷基是指具有1～3个选自N、O、S的杂原子的3～6元环，例如：环乙胺基、环丙胺基、四氢吡咯基、吗啡啉基、哌啶基等。
优选地，R3为氢、C1～C4烷基或C1～C4烷基氧基。更优选地，R3为C1～C4烷基氧基。更优选地，R3为甲氧基。
优选地，R4为氢、羟基、NH2-、巯基或C1～C4烷基氧基。更优选地，R4为羟基、NH2-或巯基。更优选地，R4为羟基。
更优选的，在所述化合物的式IV中，R3为甲氧基，R4为羟基时，结构式：
所述式IV化合物的制备方法，包括以下步骤：将式I化合物与三氟化硼乙醚在有机溶剂中反应，制得式IV化合物。
式I化合物为R3，R4如式IV中所定义。
所述式I化合物与三氟化硼乙醚的摩尔比为1:(1～10)，优选为1：(2.5～3.5)。所述有机溶剂为四氢呋喃、乙醚和1,4-二氧六环中至少一种。
所述反应的温度为50～80℃，优选为60～70℃。
所述反应在氮气或氩气保护下进行。
式IV化合物在Aβ斑块特异性荧光成像中的应用。通过将式IV化合物与硫磺素S(ThS)染料进行共染实验，证实了其具有优异的Aβ斑块特异性染色效果，不需要重复洗涤，即可实现高信噪比成像。
所述聚集诱导光探针包括式III或式Ⅳ中一种以上。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明的化合物具有聚集诱导发光优势，能有效克服传统荧光染料的聚集诱导猝灭的缺陷；作为聚集诱导发光探针具有非常好的效果；
(2)本发明的化合物用于Aβ斑块的特异性荧光成像，具有非常好的效果，不需要重复洗涤除去背景噪音，成像信噪比即可高达10倍以上；
(3)本发明的化合物作为聚集诱导发光探针，具有神经保护功能。
本发明的化合物(作为聚集诱导发光探针)能有效克服传统荧光染料的聚集诱导猝灭的缺陷，实现Aβ斑块的特异性和高信噪比荧光成像，具有发光效率高、斯托克位移大等优点，能有效抑制Aβ纤维的形成，具有神经保护作用。
附图说明
图1为化合物III-1染色Aβ纤维和保护神经细胞的示意图；
图2为实施例1制备的聚集诱导发光探针化合物III-1的紫外吸收和荧光发射光谱图；(A)化合物III-1在四氢呋喃中的归一化紫外吸收光谱图(10-5mol· L-1)；(B)化合物III-1在四氢呋喃和水的混合溶液中不断增加水含量的荧光发射光谱图；(C)化合物III-1在四氢呋喃和水的混合溶液中最大发射波长变化及最大发射荧光强度的比值变化图；
图3为实施例2制备的聚集诱导发光探针化合物IV-1的紫外吸收和荧光发射光谱图；(A)化合物IV-1在四氢呋喃中的归一化紫外吸收光谱图(10-5mol·L-1)；(B)化合物IV-1在四氢呋喃和水的混合溶液中不断增加水含量的荧光发射光谱图；(C)化合物IV-1在四氢呋喃和水的混合溶液中最大发射波长变化及最大发射荧光强度的比值变化图；
图4为基于理论计算的化合物III-1和化合物IV-1的HOMO和LUMO分子轨道图；
图5为实施例1中聚集诱导发光探针化合物III-1在甲醇和甘油混合溶剂中随甘油含量增加的(A)荧光光谱和(B)最大荧光发射强度变化图；
图6为实施例2中聚集诱导发光探针化合物IV-1在甲醇和甘油混合溶剂中随甘油含量增加的(A)荧光光谱和(B)最大发射荧光强度变化图；
图7中(A)为化合物III-1在水溶液和固态下的荧光光谱图(内部为相应的荧光照片)；(B)为化合物IV-1在水溶溶液和固态下的荧光光谱图(内部为相应的荧光照片)；
图8为化合物III-1，IV-1，I-1和ThT对小鼠海马神经元HT22细胞的毒性图；
图9为分别孵育0、1、4、7、10天形成Aβ1-42纤维与化合物III-1混合后的荧光强度图；
图10为不同浓度的化合物III-1，化合物I-1和ThT对Aβ1-42纤维染色的荧光强度变化图；
图11为化合物III-1与β淀粉样蛋白抗体对Aβ斑块的共染图：(A)化合物III-1对Aβ斑块的染色图；(B)β淀粉样蛋白抗体对Aβ斑块的染色图；(C) 为化合物III-1与β淀粉样蛋白抗体对Aβ斑块染色的叠加图；(D)化合物III-1 与β淀粉样蛋白抗体对Aβ斑块染色的荧光信号变化相关图；
图12为选定Aβ斑块共染区域中，化合物III-1与Aβ抗体的荧光信号变化相关图；
图13为化合物IV-1与硫黄素S对Aβ斑块的共染效果图：(A)化合物IV-1 对Aβ斑块的染色图；(B)硫黄素S对Aβ斑块的染色图；(C)为化合物IV-1 与硫黄素S对Aβ斑块染色的叠加图；(D)化合物IV-1与硫黄素S对Aβ斑块染色的荧光信号变化相关图；
图14为在Aβ1-42纤维存在下，化合物III-1对小鼠海马神经元细胞的保护效果图：(A)无Aβ1-42纤维存在时，HT22细胞的形态图；(B)在40μM Aβ1-42纤维存在下，HT22细胞的形态图；(C)在40μM Aβ1-42纤维和10μM式III-1 化合物存在下，HT22细胞的形态图；
图15为Aβ1-42纤维对小鼠海马神经元HT22细胞的细胞毒性结果；
图16为在Aβ1-42纤维(40μM)存在下，不同浓度的化合物III-1(0，5， 10μM)对小鼠海马神经元HT22细胞的保护效果图；
图17为以硫磺素T的荧光强度变化监测化合物III-1(10μM)抑制Aβ1-42纤维(20μM)形成的效果图；
图18为以硫磺素T的荧光强度变化监测化合物III-1(10μM)解聚Aβ1-42纤维(20μM)形成的效果图；
图19为化合物III-1针对正常小鼠脑切片的的荧光染色图：(A)为明场下脑切片图；(B)为荧光模式下脑切片图；(C)为(A)和(B)的叠加图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明的聚集诱导发光探针化合物III的合成路线为：
本发明的聚集诱导发光探针化合物III的制备：
(1)化合物II的合成：将式I化合物和甲酸铵溶解于溶剂1中，随后在氮气保护下加热至回流反应；待反应结束后，冷却至室温并在减压下旋蒸，残余物通过二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷层，通过无水硫酸镁干燥，随后减压下旋蒸，残余物通过硅胶柱层析分离，洗脱剂为二氯甲烷，得到式II化合物。
其中，所溶剂1选自二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷或四氢呋喃中至少一种。
(2)化合物III的合成：将三氟化硼乙醚加入到式II化合物的溶剂2的溶液中，在氮气保护下加热至回流反应；待反应结束后，冷却至室温并在减压下旋蒸，残余物通过硅胶柱层析分离，洗脱剂为二氯甲烷，得到聚集诱导发光探针式III化合物。所述溶剂2选自四氢呋喃、乙醚和1,4-二氧六环中至少一种。本发明的聚集诱导发光探针化合物IV的合成路线为
本发明的聚集诱导发光探针化合物IV的制备：
将三氟化硼乙醚加入到式I化合物的THF溶液中，在氮气保护下加热至回流反应；待反应结束后，冷却至室温并在减压下旋蒸，向残余物中加入正己烷，析出红色固体沉淀，过滤，真空下干燥，得到聚集诱导发光探针式IV化合物。
实施例1：聚集诱导发光探针化合物III-1的合成
合成路线为：
(1)化合物II-1的合成：
式I-1化合物(1.1g,3.0mmol)和甲酸铵(1.16g,15mmol)溶解于乙醇(30 mL)和N,N-二甲基甲酰胺(5mL)的混合溶剂中，随后在氮气保护下加热至回流反应12h；待反应结束后，冷却至室温并在减压下旋蒸，残余物通过二氯甲烷萃取(50mL×3)，合并的二氯甲烷层通过无水硫酸镁干燥，随后减压下旋蒸，残余物通过硅胶柱层析分离，洗脱剂为二氯甲烷，得到式II-1化合物(产率53％， 587mg)；式II-1化合物的有关结构表征数据如下：1H NMR(DMSO-d6,500MHz): δ9.84(br s,1H),9.45(br s,2H),7.50(br s,1H),7.28-7.37(m,2H),7.23(d,J＝2.0 Hz,1H),7.18(d,J＝2.0Hz,1H),7.05(dd,J1＝8.0Hz,J2＝2.0Hz,1H),6.98(dd,J1＝8.5Hz,J2＝2.0Hz,1H),6.78-6.82(m,2H),6.70(d,J＝15.5Hz,1H),6.52(d,J＝16.0Hz,1H),5.50(s,1H),3.83(s,3H),3.82(s,3H)；13C NMR(DMSO-d6,125 MHz):δ186.3,158.8,148.2,148.0,147.8,137.3,135.4,127.0,126.5,122.0,121.7, 121.4,115.7,115.6,110.8,110.1,96.6,55.6；HRMS(MALDI-TOF):m/z[M+H]+ calcd for C21H22NO5,368.1492,found 368.1491.
(2)化合物III-1的合成：
将三氟化硼乙醚(426mg,3.0mmol)加入到式II-1化合物(367mg,1.0 mmol)的THF(10mL)溶液中，在氮气保护下加热至回流反应2h；待反应结束后，冷却至室温并在减压下旋蒸，残余物通过硅胶柱层析分离，洗脱剂为二氯甲烷，得到聚集诱导发光探针式III-1化合物(产率31％，129mg)。式III-1 化合物的有关结构表征数据如下：1H NMR(DMSO-d6,500MHz):δ9.81(s,1H), 9.58(d,J＝8.5Hz,2H),7.77(d,J＝16.0Hz,1H),7.47(d,J＝15.5Hz,1H),7.31(d, J＝2.0Hz,1H),7.23(d,J＝2.0Hz,1H),7.13(td,J1＝9.0Hz,J2＝1.5Hz,2H),6.88 (d,J＝8.5Hz,1H),6.82(t,J＝6.5Hz,1H),6.78(d,J＝5.5Hz,1H),6.22(d,J＝1.5 Hz,1H),3.84(d,J＝2.0Hz,6H)；13C NMR(DMSO-d6,125MHz):δ168.3,166.1,149.9,149.0,148.0,147.9,143.0,138.7,126.6,126.0,123.0,122.5,119.7,118.2,115.9,115.7,111.2,111.0,94.5,55.6；HRMS(MALDI-TOF):m/z[M+H]+calcd forC21H20BF2NO5,415.1397,found 415.1402.
化合物III-1染色Aβ纤维和保护神经细胞的示意图如图1所示。
实施例2：化合物IV-1的合成
合成路线为：
将三氟化硼乙醚(227mg,1.6mmol)加入到式I化合物(184mg,0.5mmol) 的THF(10mL)溶液中，在氮气保护下加热至回流反应12h；待反应结束后，冷却至室温并在减压下旋蒸，向残余物中加入10mL正己烷，析出红色固体沉淀，过滤，真空下干燥，得到聚集诱导发光探针式IV-1化合物(产率79％，164 mg)。有关结构表征数据如下：1H NMR(DMSO-d6,500MHz):δ10.12(br s,2H), 7.94(s,1H),7.91(s,1H),7.48(d,J＝2.0Hz,2H),7.35(dd,J1＝8.5Hz,J2＝1.5Hz, 2H),7.04(s,1H),7.01(s,1H),6.88(d,J＝8.0Hz,2H),6.46(s,1H),3.86(s,6H)；13C NMR(DMSO-d6,125MHz):178.7,151.3,148.2,147.0,126.0,125.3,117.9,116.0,112.4,101.1,55.8；HRMS(MALDI-TOF):m/z[M+Na]+calcd for C21H19BF2NaO6,439.1135,found 439.1137.
实施例3：化合物III-1和IV-1的光物理性质表征(图2～图7)
化合物III-1和IV-1的紫外-可见吸收测试结果如图2～4所示。图2为实施例1制备的聚集诱导发光探针化合物III-1的紫外吸收和荧光发射光谱图；(A) 化合物III-1在四氢呋喃中的归一化紫外吸收光谱图(10-5mol·L-1)；(B)化合物III-1在四氢呋喃和水的混合溶液中不断增加水含量的荧光发射光谱图；(C)化合物III-1在四氢呋喃和水的混合溶液中最大发射波长变化及最大发射荧光强度的比值变化图。图3为实施例2制备的聚集诱导发光探针化合物IV-1的紫外吸收和荧光发射光谱图；(A)化合物IV-1在四氢呋喃中的归一化紫外吸收光谱图 (10-5mol·L-1)；(B)化合物IV-1在四氢呋喃和水的混合溶液中不断增加水含量的荧光发射光谱图；(C)化合物IV-1在四氢呋喃和水的混合溶液中最大发射波长变化及最大发射荧光强度的比值变化图。图4为基于理论计算的化合物III-1 和化合物IV-1的HOMO和LUMO分子轨道图。
实施例1中化合物III-1和实施例2中化合物IV-1的紫外-可见吸收在THF 溶液中测试。化合物III-1的最大吸收波长为427nm，化合物IV-1的最大吸收波长为501nm，相对于化合物III-1，化合物IV-1的最大吸收波长红移74nm(图 2-图3)。通过密度泛函理论计算(基组为B3LYP/6-31G(d,p))发现，化合物 III-1的最高占据轨道(HOMO)和最低未占轨道(LUMO)的能级差为3.21eV，而化合物IV-1的最高占据轨道(HOMO)和最低未占轨道(LUMO)的能级差为3.13eV(图4)。理论计算结果符合紫外-可见吸收测试结果。
将四氢呋喃和水按照不同的体积比(四氢呋喃:水＝100:0，90:10，80:20， 70:30，60:40，50:50，40:60，30:70，20:80，10:90，1:99)混合，形成含水量不同的混合液，将实施例1中化合物III-1和实施例2中化合物IV-1溶解到这些混合液中，使化合物的浓度为10- 5mol·L-1，随后检测荧光发射光谱，结果见图2- 图3。化合物III-1和IV-1在THF/H2O的混合溶剂中，随水含量的增加，其发光强度不断减弱，发光波长不断红移，这是由于扭曲的分子内电荷转移效应造成的。
图5为实施例1中聚集诱导发光探针化合物III-1在甲醇和甘油混合溶剂中随甘油含量增加的(A)荧光光谱和(B)最大荧光发射强度变化图；图6为实施例2中聚集诱导发光探针化合物IV-1在甲醇和甘油混合溶剂中随甘油含量增加的(A)荧光光谱和(B)最大发射荧光强度变化图。
在甲醇和甘油的混合溶剂体系中，随甘油含量的增加，粘度不断增加，化合物III-1和IV-1的荧光发射强度随之增强(图5-图6)。相比于甲醇中(粘度η＝0.59mPa S)，化合物III-1和IV-1在甘油中(粘度η＝945mPa S)的荧光强度分别增加了4倍和5倍，这是由于分子内运动受限造成的。
图7中(A)为化合物III-1在水溶液和固态下的荧光光谱图(内部为相应的荧光照片)；(B)为化合物IV-1在水溶溶液和固态下的荧光光谱图(内部为相应的荧光照片)。
通过测量实施例1的化合物III-1和实施例2的化合物IV-1在极性水溶液中和粉末态的荧光光谱，发现化合物III-1和IV-1在固态下的荧光强度比在极性水溶液中的荧光强度明显增加，且斯托克位移分别为145nm和154nm(图7)。
实施例6：化合物III-1、化合物IV-1和化合物I-1的细胞毒性测试(图8)
(S1)将已分化的HT22细胞用胰酶消化后以105/孔接种于96孔板后培养 24h；
(S2)弃去分化液，分别用含不同浓度(1.0、5.0、10、20、50μM)实施例1中化合物I-1、化合物III-1和实施例2中化合物IV-1的分化液以及硫磺素T (ThT)继续培养24h；
(S3)每孔加入20μL 5mg/mL的MTT溶液，培养4h；
(S4)弃去培养基，每孔加入150μL DMSO，低速震荡10min，待结晶物完全溶解；
(S5)通过酶标仪测定波长570nm处的吸收值，通过与对照组比较，计算细胞的存活率。测试结果如图8所示，当化合物III-1、IV-1、I-1和ThT的浓度均为20μΜ时，细胞的存活率分别为～100％、75.6％、37.8％和45.2％，表明化合物III-1具有优异的生物相容性。
本实施例中小鼠永生化海马神经元HT22细胞的体外培养方法为：
(S1)细胞复苏：从液氮中快速取出冻存管，放入37℃水中，不断轻轻摇晃冻存管，尽快使细胞冻存液完全溶解，75％的酒精棉球擦拭冻存管，在超净台内将冻存管内的细胞悬液吸入离心管中，续加约5mL的培养基，以1000r/min 离心5min，弃上清，加入含10％FBS的DMEM培养基吹打均匀后移至培养瓶，在37℃5％CO2的培养箱中培养。
(S2)细胞传代：HT22细胞在含有10％FBS，100U/L青霉素以及100mg/L 链霉素的DMEM高糖培养基中，37℃，5％CO2的培养箱内培养。当细胞生长至对数生长期即细胞融合至80％时进行传代。将原培养基弃去，无菌PBS洗涤两次，加入2mL 0.25％胰酶消化，显微镜下观察到原先贴壁的细胞逐渐收缩变圆后，迅速吸弃胰酶，1000r/min离心5min，弃上清，加入适量含血清培养基，用吸管将细胞吹打制成均匀的悬液，按1:3分装入新的细胞培养瓶中，置细胞培养箱内继续培养。
(S3)细胞冻存：弃去培养基，胰酶消化后以1000r/min离心5min，加入冻存液(10％DMSO，90％胎牛血清，现配现用)制成细胞悬液，调整细胞密度至(1～10)×106个/mL，将细胞悬液分装至冻存管，封口放置4℃冰箱20min，－ 20℃冰箱1h，最后移入-80℃超低温冰箱贮存。
(S4)细胞分化：在需要实验的前一天进行细胞分化，将原培养基弃去，无菌PBS洗涤两次，加入无血清的分化液(49mL neurobasal培养基，0.5mL N2 神经营养因子，0.5mLL-谷氨酰胺)4mL于培养瓶，继续培养24h。
该实验结果表明化合物III-1具有低细胞毒性和优异的生物相容性。
实施例7：化合物III-1监测Aβ纤维形成
(S1)Aβ纤维制备：将1mg Aβ1-42多肽溶于预冷的220μL六氟异丙醇中，室温下静置1h，超声30min后于-80℃冰箱冻存1.5h，真空下冷冻干燥过夜，除去残留的六氟异丙醇，将形成的肽膜溶于39.4μL DMSO，加入1068.6μL PBS 稀释至终浓度为200μM的Aβ1-42单体溶液，分装后于37℃下分别孵育0、1、4、 7、10天形成Aβ1-42纤维；
(S2)Aβ纤维形成监测(图9)：取孵育组的Aβ1-42 25μL和含10μM实施例1的化合物III-1的75μL PBS溶液于96孔板中充分混合，用酶标仪检测，计算三次独立实验的平均值作为每组的平均荧光强度。化合物III-1的激发波长为426nm，发射波长为565nm。图9为分别孵育0、1、4、7、10天形成Aβ1-42纤维与化合物III-1混合后的荧光强度图。
实施例8：不同浓度的化合物I-1，III-1和ThT检测Aβ纤维形成的荧光强度
在20μM的Aβ1-42溶液中，分别加入不同浓度(0-4.0mM)的实施例1的化合物I-1，实施例1的化合物III-1和ThT(硫磺素T)，通过酶标仪检测各自的荧光强度随浓度的变化，结果如图10所示。图10为不同浓度的化合物III-1，化合物I-1和ThT对Aβ1-42纤维染色的荧光强度变化图。
结果表明化合物III-1可有效克服聚集猝灭发光缺陷，随浓度增加(0-4mM)，其荧光强度不断增加；而化合物I-1与ThT由于聚集猝灭发光缺陷，当其浓度分别超过0.05和0.25mM时，即发生明显的荧光猝灭(图10)。
实施例9：APP/PS1小鼠脑片中Aβ斑块的荧光染色
(1)实验动物：APP/PS1转基因AD模型小鼠为敲入鼠/人APP695cDNA(S wedishK595M用596L)和人PS1(exong-deLetedvariant)，购买于广东省实验动物中心。小鼠单独饲养于干净的笼内并给予充分的饲料和饮水，室温维持23℃左右，以日光灯维持每天12h的光照(8:00AM-8:00PM)。采用10％水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，快速处死小鼠，灌注后取脑。脑组织置于用预冷的4％多聚甲醛固定液中，4℃冰箱固定24h。将固定好的组织块20％、30％蔗糖溶液梯度脱水。再将脑组织块从蔗糖溶液中取出，滤纸吸除蔗糖，在冰冻切片机里将脑组织放入OCT包埋剂，将包埋好的脑组织在冰冻切片机上作连续冠状切片，片厚20μm。
(2)化合物III-1与Aβ抗体的双重荧光染色(图11-图12)：
(S1)切片在PBS中漂洗5min×3次；
(S2)加入3％H2O2室温10min后用PBS漂洗5min×3次；
(S3)0.3％TritonX-100打孔1h后，PBS漂洗5min×3次；
(S4)封闭液封闭1h；
(S5)Aβ抗体(1:200)37℃孵育1h后转4℃冰箱继续孵育10h，PBS漂洗 10min×3次；
(S6)加入二抗罗丹明(1：100)，37℃避光孵育2h，PBS漂洗10min×3 次；
(S7)化合物III-1(100μM)室温孵育20min；
(S8)裱片后用50％甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察拍照。
(3)化合物IV-1与硫磺素S的双重荧光染色(图13)：
(S1)切片在PBS中漂洗5min；
(S2)1.0mg/mL硫磺素S(ThS)室温避光染色15min，依次放入70％和50％的乙醇中漂洗1min；
(S3)加入化合物IV-1(100μM)，室温孵育20min；
(S4)裱片后用50％甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察拍照。
图11为化合物III-1与β淀粉样蛋白抗体对Aβ斑块的共染图：(A)化合物III-1对Aβ斑块的染色图；(B)β淀粉样蛋白抗体对Aβ斑块的染色图；(C) 为化合物III-1与β淀粉样蛋白抗体对Aβ斑块染色的叠加图；(D)化合物III-1 与β淀粉样蛋白抗体对Aβ斑块染色的荧光信号变化相关图。
图12为选定Aβ斑块共染区域中，化合物III-1与Aβ抗体的荧光信号变化相关图。
图13为化合物IV-1与硫黄素S对Aβ斑块的共染效果图：(A)化合物IV-1 对Aβ斑块的染色图；(B)硫黄素S对Aβ斑块的染色图；(C)为化合物IV-1 与硫黄素S对Aβ斑块染色的叠加图；(D)化合物IV-1与硫黄素S对Aβ斑块染色的荧光信号变化相关图。
该实验表明化合物III-1和IV-1分别可以实现对对Aβ斑块的特异性荧光染色。
实施例10：阿尔默海茨病细胞模型的建立
(S1)将已提前分化好的HT22细胞用胰酶消化后以105/孔接种于96孔板后培养24h；
(S2)弃去分化液，用含不同浓度(0、5、10、20、40、80μM)Aβ1-42纤维的分化液继续培养细胞36h；在明场下观察0和40μM Aβ1-42纤维存在下的细胞明场下的形态(图14A-B)；
(S3)加入20μL/孔5mg/mL的MTT培养4h；
(S4)弃去培养基，加入150μL/孔的DMSO，低速震荡10min，待结晶物完全溶解；
(S5)酶标仪测定波长570nm处的吸收值，通过与对照组比较，计算细胞存活率(图15)。
图14为在Aβ1-42纤维存在下，化合物III-1对小鼠海马神经元细胞的保护效果图：(A)无Aβ1-42纤维存在时，HT22细胞的形态图；(B)在40μM Aβ1-42纤维存在下，HT22细胞的形态图；(C)在40μM Aβ1-42纤维和10μM式III-1 化合物存在下(实施例11)，HT22细胞的形态图；
图15为Aβ1-42纤维对小鼠海马神经元HT22细胞的细胞毒性结果图，该实验表明成功建立了阿尔默海茨病的细胞模型。
实施例11：在AD细胞模型中评估化合物III-1的神经细胞保护作用
(S1)将已提前分化好的HT22细胞用胰酶消化后以104/孔接种于96孔板后培养24h；
(S2)用适合浓度的Aβ1-42纤维提前干预细胞36h；
(S3)弃去分化液，加入含化合物III-1的分化液继续培养24h，在明场显微镜下观察细胞形态(图14C)；
(S4)加入20μL/孔5mg/mL的MTT培养4h；
(S5)弃去培养基，加入150μL/孔的DMSO，低速震荡10min，待结晶物完全溶解；
(S6)酶标仪测定波长570nm处的吸收值，通过与对照组比较，计算细胞存活率(图16)。
图16为在Aβ1-42纤维(40μM)存在下，不同浓度的化合物III-1(0，5， 10μM)对小鼠海马神经元HT22细胞的保护效果图。
该实验结果表明化合物III-1可有效抑制Aβ1-42纤维对神经元HT22细胞的细胞毒性。
实施例12：化合物III-1抑制Aβ纤维的形成和解聚已经形成的Aβ纤维
(1)将单体化Aβ1-42的溶液(100μM)与化合物III-1(50μM)混合后于 37℃下共同孵育不同时间；或者Aβ1-42纤维的溶液与化合物III-1(50μM)混合后于37℃下共同孵育不同时间；
(2)每孔以不同孵育液10μL和新鲜配制的10μM ThT 90μL充分混合后加入96孔板中(Aβ1-42测试终浓度为20μM，化合物III-1测试终浓度为10μM)；
(3)用多功能酶标仪检测单体化Aβ1-42孵育后溶液中或者Aβ1-42纤维孵育后溶液中ThT的荧光强度变化，激发波长为450nm，发射波长为482nm，计算三次独立实验的平均值，作为平均荧光强度(图17，图18)。
图17为以硫磺素T的荧光强度变化监测化合物III-1抑制Aβ1-42纤维形成的效果图。
图18为以硫磺素T的荧光强变化监测化合物III-1解聚已经形成的Aβ1-42纤维的效果图。
该实验结果表明化合物III-1可以抑制Aβ纤维的形成和解聚已经形成的 Aβ1-42纤维。Aβ纤维形成的量越少或者解聚的越多，荧光强度越小。
实施例13：化合物III-1对正常小鼠脑切片的荧光染色：
C57BL/6小鼠购买于中山大学动物实验中心，在中山大学动物实验中心饲养。
(S1)C57BL/6小鼠脑切片在PBS中漂洗5min×3次；
(S2)加入3％H2O2室温10min后用PBS漂洗5min×3次；
(S3)0.3％TritonX-100打孔1h后，PBS漂洗5min×3次；
(S4)封闭液封闭1h；
(S5)加入化合物III-1(100μM)室温孵育20min；
(S6)裱片后用50％甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察拍照(图19)。
图19为化合物III-1针对正常小鼠脑切片的的荧光染色图，(A)为明场下脑切片图；(B)为荧光模式下脑切片图；(C)为(A)和(B)的叠加图。该实验结果表明，化合物III-1可以选择性对Aβ斑块进行染色。
本发明建立了特异性染色Aβ斑块的聚集诱导发光探针，具有成像信噪比高、细胞毒性小、斯托克位移大等优点。而且所制备的聚集诱导发光探针还可用于监测Aβ纤维的形成以及保护神经，抑制Aβ纤维的细胞毒性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种化合物，其特征在于：其结构式为式III，
其中，R1，R2独立地为氢、C1～C8烷基、C3～6环烷基、羟基、C1～C8烷基氧基、NH2-、C1～C8烷基氨基、巯基、C1～C8烷基硫基、卤素、C1～C8烷酰基、硝基、C6～C20芳基、C6～C20芳基氧基、C6～C20芳基氨基、芳基硫基、C1～C20杂芳基氧基、C1～C20杂芳基氨基、C1～C20杂芳基硫基或C3～C6杂环烷基。
2.根据权利要求1所述化合物，其特征在于：R1为氢、C1～C4烷基或C1～C4烷基氧基；
R2为氢、羟基、NH2-、巯基或C1～C4烷基氧基。
3.根据权利要求2所述化合物，其特征在于：R1为甲氧基，R2为羟基时，其结构为
4.根据权利要求1～3任一项所述化合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将式II化合物与三氟化硼乙醚在有机溶剂中反应，制得式III化合物；式II化合物的结构式为式II：
5.根据权利要求4所述化合物的制备方法，其特征在于：
所述式II化合物与三氟化硼乙醚的摩尔比为1:(1～10)；所述有机溶剂为四氢呋喃、乙醚、1,4-二氧六环中至少一种；所述反应的温度为50～80℃；所述反应在氮气或氩气保护下进行；
所述式II化合物通过以下方法制备得到：将式I化合物与甲酸铵在有机溶剂中反应，制得式II化合物；
式I化合物的结构式为：
6.根据权利要求5所述化合物的制备方法，其特征在于：式II化合物的制备中，所述式I化合物与甲酸铵的摩尔比为1:(1～15)，所述有机溶剂为二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、乙醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷或四氢呋喃中至少一种；所述反应的温度为60～90℃；所述反应在氮气或氩气保护下进行。
7.一种化合物，其特征在于：其结构为式IV：
其中，R3，R4独立地为氢、C1～C8烷基、C3～6环烷基、羟基、C1～C8烷基氧基、NH2-、C1～C8烷基氨基、巯基、C1～C8烷基硫基、卤素、C1～C8烷酰基、硝基、C6～C20芳基、C6～C20芳基氧基、C6～C20芳基氨基、芳基硫基、C4～C20杂芳基氧基、C4～C20杂芳基氨基、C4～C20杂芳基硫基或C3～C6杂环烷基。
8.根据权利要求7所述化合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将式I化合物与三氟化硼乙醚在有机溶剂中反应，制得式IV化合物；
式I化合物为R3，R4如式IV所定义。
9.一种聚集诱导发光探针，其特征在于：含有权利要求1、2，3或7所述化合物中的至少一种。
10.根据权利要求1、2，3或7任一项所述化合物在Aβ斑块特异性荧光成像、监测Aβ纤维形成、解聚Aβ纤维和/或神经保护中的应用。
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