CN109251189B - 3位哌嗪基查尔酮衍生物、其药物组合物及其应用 - Google Patents
3位哌嗪基查尔酮衍生物、其药物组合物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种3位哌嗪基查尔酮衍生物，所述的衍生物的结构式如通式(I)所示，
其中，R为取代或未取代的苯基、稠环基、取代或未取代的杂环基中的一种。本发明还提供了上述3位哌嗪基查尔酮衍生物的药物组合物及其应用，通过针对P‑gp靶点的活性测试，都显示出较好的活性，对于治疗肿瘤的多药耐药十分具有实用价值，解决了现有技术中使用的逆转剂的合成较为困难、成本高的技术问题，十分具有意义。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别涉及药物化学合成领域，具体是指知一种3位哌嗪基查尔酮衍生物、其药物组合物及其应用。
背景技术
恶性肿瘤是严重威胁人们生命健康的重大疾病之一，肿瘤的化学药物治疗仍然是肿瘤治疗不可或缺的重要手段，而接受长期化疗的癌症病人会在治疗过程中出现多药耐药性 (multiple drugresistance，MDR)。MDR是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性的同时，对结构和作用机制不同的其它抗肿瘤药物也产生交叉耐药性。产生MDR的最主要原因是P- 糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)对抗肿瘤药物的外排作用，其它原因还有多药耐药相关蛋白 (MRP)、肺耐药蛋白(LRP)、谷胱甘肽及谷胱甘肽-S-转移酶、PKC和TopoII等。P-gp是MDR1基因表达产物，为ABC(ATP-bindingcassette)家族成员，含两个跨膜结构域，两个ATP结合结构域。P-gp的底物结合位点结合，消耗两分子ATP泵出一分子药物。而与MDR 有关的药物大多为一些亲脂性的天然产物，如：紫杉醇，阿霉素等。对P-gp逆转剂的作用机制研究可为逆转P-gp机制导致的肿瘤多药耐药性提供一定思路。P-gp的抑制剂是逆转MDR 的常用药物。包括：钙通道阻滞剂(维拉帕米)、环孢菌素A、抗激素类化合物(他莫昔芬) 等。而这些逆转剂的作用机制也不相同，有些作用于MDR1基因，降低P-gp的表达；有些与底物竞争结合P-gp；有些与P-gp ATP结合部位结合抑制其作用等，而这些逆转剂的合成较为困难，成本高。
查尔酮类化合物广泛存在于自然界中，其基本骨架结构为1,3-二苯基丙烯酮。查尔酮类化合物的二个苯基上有不同取代基团，表现出不同的生物活性。已有关于查尔酮类化合物的活性包括抗炎活性、抗血管增生活性、抗微生物活性、抗菌活性、光学记录材料、抗抑郁药、农药、抗肿瘤等。但是天然查尔酮类分子仍存在针对性不强，活性普遍偏低等缺点，以查尔酮结构为结构模型，经过结构修饰与改造，发现高活性的分子已受到广泛重视。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述现有技术中的缺失，提供一种活性高的3位哌嗪基查尔酮衍生物、其药物组合物及其应用。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种3位哌嗪基查尔酮衍生物，其中所述的衍生物的结构式如通式(I)所示，
其中，R为取代或未取代的苯基、稠环基、取代或未取代的杂环基中的一种。
较佳地，所述的稠环基包括萘基；所述的取代或未取代的杂环基中的杂环包括呋喃、噻吩、吡咯或者吡啶中的一种或多种，所述的取代的苯基、取代的杂环基中的取代基包括羟基、卤素、硝基、烷基、烯基、环烷基、烷氧基、烷氨基、烷基酰胺基、硫氧基、杂环基或杂芳基中的一种或多种。
较佳地，所述的衍生物的结构式如通式(II)所示，
其中R1、R2、R3、R4独立的选自羟基、卤素、硝基、烷基、烯基、环烷基、烷氧基、烷氨基、烷基酰胺基、硫氧基、杂环基和杂芳基中的一种；或者，
R1与R2一起或者R3与R4一起形成被羟基、卤素、硝基、烷基、烯基或硫氧基中的一个或多个取代的杂环。
较佳地，所述的R1、R2、R3、R4独立的选自羟基、甲氧基、C1-C5的直链或支链的烷基、C1-C5的直链或支链的烯基中的一种；或者，
R1与R2一起或者R3与R4一起形成被C1-C2的烷基取代的杂环。
较佳地，所述的衍生物为以下化合物中的一种，
本发明还提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包含所述的3位哌嗪基查尔酮衍生物或其药学上可接受的盐/前药、任选的药学上可接受的载体、或其光学活性异构体或溶剂化物。
较佳地，所述的药学上可接受的盐包括锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铁盐、铜盐、有机铵盐、盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、乙二酸盐或柠檬酸盐中的一种或多种。
本发明还提供了一种所述的药物组合物在制备治疗抗耐药肿瘤药物中的应用。
较佳地，所述的抗耐药肿瘤药物包括：抗耐紫杉醇肿瘤药物、抗耐阿霉素肿瘤药物、抗耐顺铂肿瘤(例如，乳腺癌)药物、抗耐阿霉素乳腺癌药物或抗耐奥沙利铂结直肠癌药物。更佳地，包括耐紫杉醇、耐长春新碱、耐阿霉素或耐顺铂的肿瘤。
采用本发明的3位哌嗪基查尔酮衍生物、其药物组合物及其应用，进行了体外和体内抗肿瘤增敏活性的测试，结果显示其可以通过抑制耐药细胞株的P-gp活性和减少P-gp的表达，减少化疗药物从细胞中泵出，从而增强了化疗药物的作用，起到增敏作用显示出较好的活性，对于治疗肿瘤的多药耐药十分具有实用价值，解决了现有技术中使用的逆转剂的合成较为困难、成本高的技术问题，十分具有意义；特别地，在活性测试中加入了4位哌嗪基查尔酮衍生物作为活性对照，结果是4位哌嗪基查尔酮其逆转活性大大降低，且逆转倍数在1～3之间低于阳性对照维拉帕米的逆转倍数，而本发明的3位哌嗪基查尔酮衍生物却表现了较好的逆转活性，其在无毒性的浓度下逆转倍数最高达到了50。本发明的3位哌嗪基查尔酮类化合物除了在抗耐药肿瘤方面具有显著优势，在物理化学性质上也具有结构新颖，合成简单，原料便宜、溶解性能好等重要优点。
附图说明
图1为本发明实施例11的Western blot实验结果图。
图2为本发明实施例11的RT-QPCR实验结果图。
图3A～3C为本发明实施例12的实验结果图。
图4为本发明实施例13的小鼠肿瘤的抑制实验结果图。
图5为本发明实施例13的体重的变化实验结果图。
图6为本发明实施例13的体积的变化实验结果图。
图7为本发明实施例13的治疗结束后肿瘤的重量变化实验结果图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，下面对本发明的具体实施方法作进一步说明。
除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。
实施例1
3位哌嗪基查尔酮衍生物MY1-MY2的制备，其反应式如下：
(1)3-(N-BOC)哌嗪苯甲醛乙缩醛(中间体S1)的制备
在干燥的150mL三颈瓶中投入Pd(OAc)2(24mg，1mol％Pd)，配体BINAP(0.15 mmol，1.5mol％)，NaO-t-Bu(1.34g，14mmol)，重蒸过的20mL甲苯溶剂，再称取反应原料3-溴苯甲醛乙缩醛2.3g(10mmol)，和1-叔丁氧羰基哌嗪(12mmol)(必须在 NaO-t-Bu之后放入反应混合物中)放入反应瓶中同时用N2保护，然后缓慢加热至100℃反应24h后TLC检测，直到原料反应完，然后用乙酸乙酯萃取3次，每次80mL，合并有机溶剂，依次用水，饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥。几分钟后，减压蒸去有机溶剂，得到的产物无需纯化，直接用于下一步反应。
(2)3-(N-BOC)哌嗪苯甲醛(中间体S2)的制备
将上一步得到的中间体S1用30ml的二氯甲烷溶解在250ml的圆底烧瓶中，然后缓慢加入FeCl3·6H2O(3.5eq.)，在室温下搅拌3h，然后加入50ml的饱和的碳酸氢钠溶液淬灭反应，然后用乙酸乙酯萃取3次，每次60mL，合并有机溶剂，依次用水，饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥。15min后，减压蒸去有机溶剂，反应粗产品用硅胶柱进行纯化，得到中间体S2。
(3)中间体S3和S4的制备
2,4-二甲氧基苯乙酮或者3,4,5-三甲氧基苯乙酮(1mmol)用15mL无水乙醇溶解，在冰浴条件下逐滴加入约5mL的40％的氢氧化钠的水溶液，有大量白色固体出现。3- (N-BOC)哌嗪苯甲醛(中间体S2)(1.2mmol)用10ml无水乙醇溶解，逐滴加入到反应体系中。滴加完毕，在冰浴条件下继续反应30min钟，去除冰浴，在常温条件下反应过夜。反应结束，减压蒸掉反应体系中的乙醇，加适量水稀释，乙酸乙酯萃取3次，每次50mL，合并有机溶剂，依次用水，饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥。15min后，减压蒸去有机溶剂，反应粗产品用硅胶柱层析纯化，得到黄色固体S3和S4。
(4)查尔酮化合物MY1-MY2的制备
由上步得到的中间体S3或S4(1mmol)用15mL二氯甲烷溶解，然后加入10eq.的TFA，在室温下搅拌0.5h，然后用饱和的碳酸氢钠溶液调PH＝9，然后用二氯甲烷萃取3次，每次50mL，合并有机溶剂，依次用水，饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥。15min 后，减压蒸去有机溶剂，反应粗产品用硅胶柱进行纯化，得到黄色固体化合物MY1或MY2，产率为85％。
化合物MY1，黄色固体，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.74(d,J＝8.6Hz,1H),7.61(d, J＝15.8Hz,1H),7.47(d,J＝15.8Hz,1H),7.32(t,J＝7.8Hz,1H),7.23(d,J＝7.5Hz,1H),7.09(s,1H),6.94(d,J＝7.8Hz,1H),6.56(dd,J＝8.6,1.8Hz,1H),6.50(s,1H),3.89(s,3H), 3.87(s,3H),3.45(s,4H),3.37(s,4H).HRMS(ESI):Calcd for C21H24N2O3[M+H]+353.1865； Found 353.1864。
化合物MY2，黄色固体，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.74(d,J＝15.6Hz,1H),7.46(d, J＝15.6Hz,1H),7.34(t,J＝7.8Hz,1H),7.29(s,1H),7.26(s,2H),7.14(s,1H),6.98(d,J＝7.9 Hz,1H),3.93(s,9H),3.46(s,4H),3.40(s,4H).HRMS(ESI):Calcd for C22H26N2O4[M+H]+383.1971；Found 383.1972。
实施例2
4位哌嗪基查尔酮衍生物YH1的制备
仅将实施例1中的3-溴苯甲醛乙缩醛换成4-溴苯甲醛乙缩醛，其他的实验条件和方法保持不变，最后得到目标化合物2’,4’-二甲氧基-4-哌嗪基查尔酮YH1，产率为87％。
化合物YH1，黄色固体，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.74(d,J＝8.6Hz,2H),7.62(d,J＝15.7Hz,1H),7.54(d,J＝8.6Hz,2H),7.40(d,J＝15.7Hz,1H),6.91(d,J＝8.6Hz,1H),6.57(dd,J＝8.6,2.1Hz,1H),6.50(d,J＝2.0Hz,1H),3.90(s,3H),3.87(s,3H),3.52(s,4H),3.35(s,4H). HRMS(ESI):Calcd for C21H24N2O3[M+H]+353.1865；Found 353.1861。
实施例3
3位哌嗪基查尔酮衍生物MY3的制备，其反应式如下:
(1)2,4,6-三羟基苯乙酮(中间体S5)的制备
称取10g(0.08mol)间苯三酚置于反应容器中，加入40mL乙酸乙酯溶解，再加入10mL醋酸酐，室温搅拌下缓慢加入BF3·Et2O溶液8mL，然后缓慢加热至40℃反应，反应过程中前6h每两小时补加醋酸酐2mL，BF3·Et2O溶液1mL，反应10h检查原料已反应完全。向反应液中加入150mL水，搅拌，减压蒸馏除去溶剂，蒸馏瓶中析出大量黄色固体。用水将黄色固体重结晶，放置析晶，抽滤，干燥称重得到中间体S5，产率为90％。
(2)3-异物烯基-2,4,6-三羟基苯乙酮(中间体S6)
在室温条件下，将中间体S5(1.68g，0.01mol)、异物烯基溴(1.17mL，0.01mol) 加至甲苯(150mL)中，再加入DBU(1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯)(1.49mL，0.1mol)，然后在35℃下反应24h冷却至室温，向体系中加入30ml水然后用乙酸乙酯萃取3次，每次80mL，合并有机相，经无水硫酸钠干燥后过滤，滤液减压浓缩至干，残余物经硅胶柱进行纯化得到淡黄色油状中间体S6，1.72g，产率为73％。
(3)5-异物烯基-6-羟基-2，4-二甲氧基苯乙酮(中间体S7)
在干燥的150mL三颈瓶中投入1.18g(5mmol)3-异物烯基-2，4，6-三羟基苯乙酮(中间体S6)，加入150mL乙醇溶液，再投入1.4g(10mmol)碳酸钾和1.9mL(12.5mol) 对甲基苯磺酸甲酯，加热至80℃，回流3h，停止反应，加入500mL水稀释反应液并放置过夜，抽滤便得粗品，用甲醇重结晶得到白色晶体S7，898mg，产率为68％。
(4)中间产物S7(264mg，1mmol)用15mL无水乙醇溶解，在冰浴条件下逐滴加入约5mL的40％的氢氧化钠的水溶液，有大量白色固体出现。3-(N-BOC)哌嗪苯甲醛(中间体S2)(1.2mmol)用10ml无水乙醇溶解，逐滴加入到反应体系中。滴加完毕，在冰浴条件下继续反应30min，去除冰浴，在常温条件下反应过夜。反应结束，减压蒸掉反应体系中的乙醇，加适量水稀释，乙酸乙酯萃取3次，每次40mL，合并有机溶剂，依次用水，饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥。15min后，减压蒸去有机溶剂，反应粗产品用硅胶柱层析纯化，得到黄色固体S8。
(5)由上步得到的产物S8(536mg，1mmol)用15mL二氯甲烷溶解，然后加入2eq. 的HCl(1M，氯化氢乙醚溶液)，在室温下搅拌0.5h，然后用饱和的碳酸氢钠溶液调PH＝9，然后用二氯甲烷萃取3次，每次50mL，合并有机溶剂，依次用水，饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥。15min后，减压蒸去有机溶剂，反应粗产品用硅胶柱进行纯化，得到黄色固体MY3，397mg，产率为88％。
化合物MY3，黄色固体，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.83(d,J＝15.6Hz,1H),7.72(d, J＝15.6Hz,1H),7.30(t,J＝7.9Hz,1H),7.17(d,J＝7.6Hz,1H),7.10(s,1H),6.95(dd,J＝8.1, 2.1Hz,1H),6.00(s,1H),5.32–5.08(m,1H),3.93(d,J＝7.3Hz,3H),3.91(s,3H),3.64–3.56(m, 4H),3.30(d,J＝7.0Hz,2H),3.21–3.13(m,4H),1.78(s,3H),1.67(s,3H).HRMS(ESI):Calcd for C26H32N2O4[M+H]+437.2440；Found 437.2445。
实施例4
4位哌嗪基查尔酮衍生物YH2的制备
仅将实施例6中的3-(N-BOC)哌嗪苯甲醛换成4-(N-BOC)哌嗪苯甲醛，其他的实验条件和方法保持不变，最后得到目标化合物YH2，产率为82％。
化合物YH2，黄色固体，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.76(s,2H),7.51(d,J＝8.5Hz,2H),6.89(d,J＝8.5Hz,2H),5.99(s,1H),5.21(s,1H),3.93(s,3H),3.89(s,3H),3.29(d,J＝7.3 Hz,2H),3.28–3.23(m,4H),3.04(s,4H),1.78(s,3H),1.67(s,3H).HRMS(ESI):Calcdfor C26H32N2O4[M+H]+437.2440；Found 437.2443。
实施例5
3位哌嗪基查尔酮衍生物MY4的制备，其反应式如下：
由实施例4得到的中间体S8(468mg，1mmol)用15mL二氯甲烷溶解，然后加入10 eq.的TFA，在室温下搅拌0.5h，然后用饱和的碳酸氢钠溶液调PH＝9，然后用二氯甲烷萃取3次，每次50mL，合并有机溶剂，依次用水，饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥。15min后，减压蒸去有机溶剂，反应粗产品用硅胶柱进行纯化，得到黄色固体MY4， 318mg，产率为73％。
化合物MY4，黄色固体，1H NMR(400MHz DMSO)δ7.88(d,J＝15.6Hz，1H),7.70 (d,J＝15.6Hz,1H)7.38(t,J＝7.8Hz,1H),7.32(d,J＝7.6Hz，1H)，7.27(s,1H)7.03(dd,J ＝7.9,1.9Hz,1H),6.29(s,1H),3.99(s,3H),3.92(s,3H),3.15(m,4H),3.03(m,2H),2.89(m,4H),2.83(m,2H),1.24(s,6H).HRMS(ESI):Calcd for C26H32N2O4[M+H]+437.2440；Found437.2442。
实施例6
3位哌嗪基查尔酮衍生物MY5的制备，其反应式如下：
(1)2-羟基-4,6-二甲氧基苯乙酮(中间体S9)的制备
在干燥的150mL三颈瓶中投入16.8g(0.1mol)2,4,6-三羟基苯乙酮(中间体S5)，加入250mL乙醇溶液，再投入28g(0.2mol)碳酸钾和38mL(0.25mol)对甲基苯磺酸甲酯，加热至80℃，回流3h，停止反应，加入500mL水稀释反应液并放置过夜，抽滤便得粗品，用甲醇重结晶得到化合物重结晶得白色晶体13.3g，产率为68％。
(2)中间体S10的制备
由(1)得到的中间体S9(196mg，1mmol)用15mL无水乙醇溶解，在冰浴条件下逐滴加入约5mL的40％的氢氧化钠的水溶液，有大量白色固体出现。3-(N-BOC)哌嗪苯甲醛(中间体S2)(1.2mmol)用10ml无水乙醇溶解，逐滴加入到反应体系中。滴加完毕，在冰浴条件下继续反应30min，去除冰浴，在常温条件下反应过夜。反应结束，减压蒸掉反应体系中的乙醇，加适量水稀释，乙酸乙酯萃取3次，每次30mL，合并有机溶剂，依次用水，饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥。15min后，减压蒸去有机溶剂，反应粗产品用硅胶柱层析纯化，得到黄色固体S10。
(3)查尔酮化合物MY5的制备
由上步得到的产物S7(468mg，1mmol)用15mL二氯甲烷溶解，然后加入10eq.的TFA，在室温下搅拌0.5h，然后用饱和的碳酸氢钠溶液调PH＝9，然后用二氯甲烷萃取3次，每次50mL，合并有机溶剂，依次用水，饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥。15min 后，减压蒸去有机溶剂，反应粗产品用硅胶柱进行纯化，得到黄色固体化合物MY5，397mg，产率为85％。
化合物MY5，黄色固体，1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.70(d,J＝15.7Hz，1H),7.59 (d,J＝15.7Hz,1H),7.31(t,J＝7.9Hz,1H),7.25(s,1H),7.19(d,J＝7.5Hz,1H),7.04(d,J＝8.1Hz,1H),6.17(d,J＝2.0Hz,1H),6.14(d,J＝2.1Hz,1H),3.88(s,3H),3.82(s,3H),3.31–3.24(m,4H),3.05(d,J＝4.6Hz,4H).HRMS(ESI):Calcd for C21H24N2O4[M+H]+369.1814；Found:369.1810。
实施例7
4位哌嗪基查尔酮衍生物YH3的制备
仅将实施例3中的3-(N-BOC)哌嗪苯甲醛换成4-(N-BOC)哌嗪苯甲醛，其他的实验条件和方法保持不变，最后得到目标化合物YH3，产率为82％。
化合物YH3，黄色固体，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.82(d,J＝15.5Hz,1H),7.75(d,J＝15.6Hz,1H),7.56(d,J＝8.7Hz,2H),6.92(d,J＝8.8Hz,2H),6.11(d,J＝2.3Hz,1H),5.97(d, J＝2.3Hz,1H),3.92(s,3H),3.84(s,3H),3.54(s,4H),3.37(s,4H).HRMS(ESI):Calcdfor C21H24N2O4[M+H]+369.1892；Found 369.1896.
实施例8
3位哌嗪基查尔酮衍生物MY6-MY10的制备，其反应式如下：
(1)2-甲基-3,5-二甲氧基苯酚(中间体S11)
称取4,6-二甲氧基水杨醛1.82g(10mmol)置于反应容器中，加入20eq.的三氟乙酸溶液和2.5eq.的(C2H5)3SiH，在室温下搅拌10h，TLC检测，直到原料反应完然后向反应液中加入20mL水，搅拌0.5h然后用乙酸乙酯萃取3次，每次80mL，合并有机溶剂，依次用水，饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥。15min后，减压蒸去有机溶剂，得到的产物无需纯化，直接用于下一步反应。
(2)3-甲基-4,6-二甲氧基-2-羟基苯乙酮(中间体S12)的制备
将上步得到的粗产品0.84g(5mmol)置于反应容器中，加入25mL乙酸乙酯溶解，再加入0.625mL醋酸酐，室温搅拌下缓慢加入BF3·Et2O溶液0.5mL，然后缓慢加热至40℃反应，反应过程中前6h每两小时补加醋酸酐0.125mL，BF3·Et2O溶液0.0625mL，反应10 h检查原料已反应完全。向反应液中加入20mL水，搅拌，减压蒸馏除去溶剂，蒸馏瓶中析出大量黄色固体。用水将黄色固体重结晶，放置析晶，抽滤，干燥称重得到中间体S12，产率为90％。
(3)中间体S13的制备
称取10g(0.08mol)间苯三酚置于反应容器中，加入40mL乙酸乙酯溶解，再加入相应的酸酐(1.5ep.)，室温搅拌下缓慢加入BF3·Et2O溶液8mL，然后缓慢加热至40℃反应，反应过程中前6h每两小时补加醋酸酐2mL，BF3·Et2O溶液1mL，反应10h检查原料已反应完全。向反应液中加入150mL水，搅拌，减压蒸馏除去溶剂，蒸馏瓶中析出大量黄色固体。用水将黄色固体重结晶，放置析晶，抽滤，干燥称重得到中间体S13，产率为90％。
(4)中间体S14的制备
在干燥的150mL三颈瓶中投入相应的中间体S10(10mmol)，加入150mL乙醇溶液，再投入2.8g(20mmol)碳酸钾和3.8mL(25mmol)对甲基苯磺酸甲酯，加热至80℃，回流3h，停止反应，加入500mL水稀释反应液并放置过夜，抽滤便得粗品，用甲醇重结晶得到化合物重结晶得白色晶体S14，产率为68％。
(5)中间体S15的制备
称取相应的中间体S14(1mmol)置于反应容器中，加入20eq.的三氟乙酸溶液和2.5eq. 的(C2H5)3SiH，在室温下搅拌10h，TLC检测，直到原料反应完然后向反应液中加入20mL 水，搅拌0.5h然后用乙酸乙酯萃取3次，每次30mL，合并有机溶剂，依次用水，饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥。几分钟后，减压蒸去有机溶剂，得到的产物无需纯化，直接用于下一步反应。
(6)中间产物S16的制备
将上步得到的粗产品置于反应容器中，加入10mL乙酸乙酯溶解，再加入0.125mL醋酸酐，室温搅拌下缓慢加入BF3·Et2O溶液0.1mL，然后缓慢加热至40℃反应，反应过程中前6h每两小时补加醋酸酐0.025mL，BF3·Et2O溶液0.0125mL，反应10h检查原料已反应完全。向反应液中加入10mL水，搅拌，减压蒸馏除去溶剂，蒸馏瓶中析出大量黄色固体。用水将黄色固体重结晶，放置析晶，抽滤，干燥称重得到中间体S16，产率为87％。
(7)中间体S18的的制备
中间体S17用10mL无水乙醇溶解，在冰浴条件下逐滴加入约5mL的40％的氢氧化钠的水溶液，有大量白色固体出现。中间体S2(348mg，1.2mmol)用10ml无水乙醇溶解，逐滴加入到反应体系中。滴加完毕，在冰浴条件下继续反应30min，去除冰浴，在常温条件下反应过夜。反应结束，减压蒸掉反应体系中的乙醇，加适量水稀释，乙酸乙酯萃取3次，每次40mL，合并有机溶剂，依次用水，饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥。15min后，减压蒸去有机溶剂，反应粗产品用硅胶柱层析纯化，得到3’-乙基-3-(1- 叔丁氧羰基)哌嗪-6’-羟基-2’,4’-二甲氧基查尔酮(中间体S18)。
(8)查尔酮化合物MY6-MY10的制备
由上步得到的产物S18(1mmol)用15mL二氯甲烷溶解，然后加入10eq.的TFA，在室温下搅拌0.5h，然后用饱和的碳酸氢钠溶液调PH＝9，然后用二氯甲烷萃取3次，每次 50mL，合并有机溶剂，依次用水，饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥。15min后，减压蒸去有机溶剂，反应粗产品用硅胶柱进行纯化，得到黄色固体化合物MY6-MY10，产率为85％。
化合物MY6，黄色固体，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.83(dd,J＝15.4,11.3Hz,1H),7.71(dd,J＝15.6,9.1Hz,1H),7.29(dd，J＝14.3,6.0Hz,1H),7.16(d，J＝7.7Hz,1H),7.11(d,J＝6.3Hz,1H),7.00–6.91(m,1H),6.02(s,1H),3.93(s,3H),3.90(s,3H),3.17(dd,J＝29.0, 25.3Hz,8H),2.04(s,3H).HRMS(ESI):Calcd for C22H26N2O4[M+H]+383.1971；Found383.1970。
化合物MY7，黄色固体，1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.86(d,J＝14.6Hz，1H),7.68 (d,J＝10.1Hz,1H),7.34(s,1H),7.20(d,J＝19.2Hz,1H),7.14(s,1H),7.00(s,1H),6.08(s,1H),3.98(s,3H),3.93(s,3H),3.33(d,J＝7.1Hz,8H),2.58(s,2H),1.05(s,3H).HRMS(ESI): Calcd for C23H28N2O4[M+H]+397.2127；Found 397.2128。
化合物MY8，黄色固体，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.83(t,J＝13.7Hz,1H),7.71(dd,J＝15.1,11.9Hz,1H),7.33–7.24(m,1H),7.18–7.12(m,1H)，7.10(s,1H),6.99–6.92(m,1H),5.99(s,1H),3.93(d,J＝5.3Hz,3H),3.88(s,3H),3.17(s,4H),3.05(s,4H),2.61–2.53(m, 2H)，1.51(dd,J＝13.8,6.5Hz,2H),0.93(dd,J＝13.2,6.0Hz,3H).HRMS(ESI):Calcdfor C24H30N2O4[M+H]+411.2284；Found 411.2285。
化合物MY9，黄色固体，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.82(dd,J＝15.5，9.9Hz,1H),7.70(dd,J＝15.5,8.0Hz,1H),7.31–7.25(m,1H),7.14(d,J＝7.6Hz，1H),7.09(d,J＝7.3Hz,1H),6.93(dd,J＝14.5,8.0Hz,1H),3.91(d,J＝4.7Hz，3H),3.87(t,J＝4.1Hz,3H),3.24–3.02(m,8H),2.62–2.54(m,2H),1.52–1.41(m,2H),1.35(ddd,J＝21.3,14.3,7.2Hz,2H),0.91(dd,J＝15.4,8.1Hz,3H).HRMS(ESI):Calcd for C25H32N2O4[M+H]+425.2440；Found425.2441。
化合物MY10，黄色固体，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.84(d,J＝15.6Hz,1H),7.69 (d,J＝15.6Hz,1H),7.28(dd,J＝9.2,6.6Hz,1H),7.17(d,J＝7.6Hz,1H),7.04(s,1H),6.94–6.88(m,1H),5.95(s,1H),3.90(s,3H),3.86(s,3H),3.34(d,J＝16.6Hz,4H),3.22(d,J＝54.0 Hz,4H),2.61–2.52(m,2H),1.53–1.40(m,2H),1.34(dd,J＝7.1,3.3Hz,4H),0.92–0.84(m, 3H).HRMS(ESI):Calcd for C26H34N2O4[M+H]+439.2597；Found 439.2596。
实施例9
3位N-甲基哌嗪基和吗啉基查尔酮衍生物YH4-YH-9的制备，其反应式如下:
仅将实施例1中的3-(N-BOC)哌嗪换成N-甲基哌嗪或者吗啉，其他的实验条件和方法保持不变，最后得到目标化合物YH4-YH9，产率为82％。
化合物YH4，黄色固体，1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.70(d,J＝15.7Hz,1H),7.59(d, J＝15.7Hz,1H),7.28(dd,J＝10.2,5.5Hz,1H),7.22(s,1H),7.15(d,J＝7.5Hz,1H),7.02(d,J ＝8.0Hz,1H),6.16(d,J＝2.0Hz,1H),6.13(d,J＝2.1Hz,1H),3.88(s,1H),3.82(s,1H),3.19 (s,4H),2.46(s,4H),2.23(s,3H).HRMS(ESI):Calcd for C22H26N2O4[M+H]+383.1971；Found: 383.1976。
化合物YH5，黄色固体，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.87(d,J＝15.6Hz,1H),7.75(d, J＝15.6Hz,1H),7.32(t,J＝7.9Hz,1H),7.18(d,J＝7.6Hz,1H),7.09(s,1H),6.99–6.92(m,1H),6.11(d,J＝2.2Hz,1H),5.97(d,J＝2.2Hz,1H),3.91(s,3H),3.91–3.86(m,4H),3.84(s, 3H),3.25–3.17(m,4H).HRMS(ESI):Calcd for C21H23NO5[M+H]+370.1654；Found370.1651。
化合物YH6，黄色固体，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.73(d,J＝15.6Hz,1H),7.47(d, J＝15.6Hz,1H),7.36(t,J＝7.8Hz,1H),7.30(d,J＝7.7Hz,1H),7.15(s,1H),7.00(d,J＝7.8Hz,1H),3.95(s,6H),3.94(s,3H),3.48(s.4H),3.40(s,4H).2.21(s,3H).HRMS(ESI):Calcdfor C23H26N2O4[M+H]+397.2127；Found 397.2126。
化合物YH7，黄色固体，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.77(d,J＝15.6Hz,1H),7.47–7.40(m,1H),7.34(t,J＝7.9Hz,1H),7.27(s,2H),7.21(d,J＝7.7Hz,1H),7.12(s,1H),6.98(d, J＝7.8Hz,1H),3.95(d,J＝3.2Hz,9H),3.91–3.86(m,5H),3.26–3.18(m,4H).HRMS(ESI): Calcd for C22H25NO5[M+H]+384.1811；Found 384.1813。
化合物YH8，黄色固体，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.83(d,J＝15.6Hz,1H),7.72(d, J＝15.6Hz,1H),7.31–7.27(m,1H),7.16(dd,J＝13.8,7.8Hz,2H),7.11(s,1H),6.98–6.94(m,1H),5.99(s,1H),5.20(t,J＝6.9Hz,1H),3.93(s,3H),3.90(s,3H),3.30(d,J＝7.0Hz,2H), 3.28–3.23(m,4H),2.65–2.57(m,4H),2.37(s,3H),1.78(s,3H),1.67(s,3H).HRMS(ESI): Calcd for C27H34N2O4[M+H]+451.2597；Found 451.2592。
化合物YH9，黄色固体，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.87–7.80(m,1H),7.72(d,J＝15.6Hz,1H),7.31(t,J＝7.9Hz,1H),7.26(s,1H),7.17(d,J＝7.7Hz,1H),7.08(s,1H),6.94(dd,J＝8.2,2.2Hz,1H),5.99(s,1H),5.20(t,J＝7.0Hz,1H),3.94(s,3H),3.90(s,3H),3.89(dd, J＝6.1,3.6Hz,4H),3.30(d,J＝7.0Hz,2H),3.24–3.15(m,4H),1.77(d,J＝8.0Hz,3H),1.67 (s,3H).HRMS(ESI):Calcd for C26H31NO5[M+H]+438.2280；Found438.2283。
实施例10
3位哌嗪基查尔酮衍生物抗肿瘤耐药细胞实验如下：
细胞增殖抑制测试
(1)试剂材料
MCF-7/DOX(人乳腺癌阿霉素耐药细胞株)：来自中国科学院细胞库(中国上海)。盐酸阿霉素(盐酸多柔比星)：Sigma公司；RPMI Medium1640：美国Gibico公司；胎牛血清：杭州四季青生物科技有限公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)：Sigma公司；二甲基亚砜(DMSO)：上海精析化工有限公司。
(2)实验仪器
CO2培养箱：Thermo公司，USA；SW-CJ-2FD超净化工作台：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；XSP-17C倒置生物显微镜：上海长方光学仪器有限公司；多功能酶标仪：Thermo公司，USA；FA2004A型电子天平：上海精密科学仪器有限公司。
(3)主要溶液配制
1)1640细胞培养液：RPMI 1640 10.4g，HEPES 5.95g，NaHCO3 2.1g，L-谷氨酰胺0.3g，青霉素10万单位，链霉素10万单位，加双蒸水至1000mL溶解，pH调节为7.2-7.4，用直径0.22μm一次性微孔滤膜滤器抽滤除菌，分装，置于4℃保存。使用前加入适当体积的已经过56℃水浴30分钟灭活的胎牛血清(FBS)，最终为含10％FBS的RPMI 1640。
2)PBS：NaCl 8.00g，KCl 0.20g，NaHCO3·12H2O 3.49g，KH2PO4 0.20g，用双蒸馏水充分溶解，定容至1000mL。高压灭菌，4℃保存备用。
3)MTT溶液：取25mg MTT放入小烧杯中，加5mL PBS，在电磁力搅拌机上搅拌30分钟，充分溶解，用0.22μm的微孔滤器除菌，4℃保存，2周内有效。
(4)实验方法
将MCF-7/DOX细胞培养于含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基中，并将细胞培养于37℃含5％的CO2培养箱中(恒温)；使用含有浓度为50ng/mL DOX的培养基维持MCF-7/DOX细胞的耐药性。实验前细胞株在无阿霉素条件下培养14天，取对数生长期的细胞，以1×104个细胞/孔的密度接种于96孔培养板中，在37℃、5％CO2条件下培养。过夜后分组，分别为空白对照组、受试化合物与阿霉素联用组。在96孔板中加入不同的受试化合物，终浓度均为12.5μmol/L，同时加入不同浓度梯度的阿霉素。培养48小时后每孔加入20μL的MTT (5mg/mL，溶剂为PBS)，再培养4小时，弃去培养液，每孔加入100μL DMSO溶解，然后在酶标仪上采取双波长检测的方法(波长1为492nm，波长2为630nm)读取吸光度值，计算在不同受试化合物存在的条件下阿霉素的IC50。计算各化合物的逆转倍数。
其中，IC50＝抑制肿瘤生长达50％时的化合物浓度，上述数据为至少三次独立重复实验的平均值。
抑制率(IR)＝(试验组OD平均值/对照组OD平均值)×100％
逆转倍数(RF)＝IC50A/IC50B。
其中，IC50A为阿霉素单药作用MCF-7/DOX细胞所得的IC50，IC50B为阿霉素和受试化合物联合作用MCF-7/DOX细胞所得的IC50。
(5)实验结果
1)3位哌嗪基查尔酮衍生物逆转MDR的测试结果：
表1查尔酮衍生物与DOX共同作用于MCF-7/DOX时DOX的IC50值及逆转倍数(RF) (化合物编号对应于实施例中化合物的编号)
| 与DOX联合使用的化合物(浓度为12.5μM) | DOX半数抑制浓度(μM) | 逆转倍数(RF) |
| 无 | 51.19±0.95 | |
| MY1 | 4.90±0.38 | 10.45 |
| MY 2 | 3.68±0.11 | 13.92 |
| MY 3 | 1.02±0.04 | 50.19 |
| MY 4 | 4.97±0.34 | 10.30 |
| MY 5 | 2.63±0.04 | 19.46 |
| MY 6 | 4.00±0.12 | 12.78 |
| MY 7 | 4.69±0.09 | 10.92 |
| MY 8 | 5.12±0.43 | 10.00 |
| MY 9 | 3.57±0.16 | 14.33 |
| MY 10 | 23.59±1.52 | 2.17 |
| YH1 | 25.34±1.08 | 2.02 |
| YH2 | 14.84±1.21 | 3.45 |
| YH3 | 16.62±1.18 | 3.08 |
| YH4 | 17.96±0.52 | 2.85 |
| YH5 | 18.75±1.68 | 2.73 |
| YH6 | 43.38±2.45 | 1.18 |
| YH7 | 27.67±1.49 | 1.85 |
| YH8 | 23.59±1.52 | 2.17 |
| YH9 | 31.60±1.14 | 1.62 |
| 维拉帕米 | 10.10±1.24 | 5.07 |
在本实验条件下，得到的结论是：
表1结果表明：本发明的3位哌嗪基查尔酮衍生物中化合物MY1、MY2、MY3、MY4、MY5、MY6、MY7、MY8和MY9与DOX共同作用于P-gp高表达的MCF-7/DOX乳腺癌耐药细胞株时，逆转耐药倍数均等于或大于维拉帕米，是强效的多药耐药逆转剂；而化合物MY10、 YH1、YH2、YH3、YH4、YH5、YH6、YH7、YH8和YH9的逆转耐药倍数均小于维拉帕米，为低效的多药耐药逆转剂。
2)3位哌嗪基查尔酮衍生物毒性测试结果：
用MTT方法分别检测新合成的化合物在6.25μM、12.5μM、25μM、50μM和100μM时对肿瘤细胞MCF-7、耐药肿瘤细胞MCF-7/DOX等的抑制率，计算半数抑制浓度。毒性测试结果如表2所示。
表2 3位哌嗪基查尔酮类化合物对肿瘤细胞的生长抑制活性IC50值
表2结果表明本发明的3位哌嗪基查尔酮衍生物对肿瘤细胞MCF-7、耐药肿瘤细胞MCF-7/DOX的半数抑制浓度均大于83μM，证明本发明的3位哌嗪基查尔酮衍生物为安全的多药耐药逆转剂。
实施例11
针对P-gp活性抑制测试
A、Western blot实验
(1)试剂材料
MCF-7/DOX(人乳腺癌阿霉素耐药细胞株)：来自中国科学院细胞库(中国上海)；盐酸阿霉素(盐酸多柔比星)：Sigma公司；RPMI Medium1640：美国Gibico公司；胎牛血清：杭州四季青生物科技有限公司；P-gp抗体以及β-actin抗体：GeneTex公司；考马斯亮蓝(G250)：北京索莱宝科技有限公司；NBT/BCIP显色试剂：Promega公司；RIPA裂解液(弱)：碧云天生物技术研究所；苯甲基磺酰氟(PMSF)：北京索莱宝科技有限公司；二硫苏糖醇(DTT)： Amresco公司；牛血清白蛋白(BSA)：Sigma-Aldrich公司；四甲基乙二胺(TEMED)： Sigma-Aldrich公司；0.45μm孔径聚偏氟乙烯(PVDF)膜：Merck Millipore。
(2)实验仪器
CO2培养箱：Thermo公司，USA；SW-CJ-2FD超净化工作台：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；XSP-17C倒置生物显微镜：上海长方光学仪器有限公司；多功能酶标仪：Thermo公司，USA；TL-18M台式高速冷冻离心机：上海离心机械研究所；FA2004A型电子天平：上海精密科学仪器有限公司；DYY-8C电泳仪：北京六一仪器厂；ZD-9556水平摇床：太仓市科教器材厂；FKR-93手压式封口机：上海虹口冰箱厂。
(3)主要溶液配制
1)5×蛋白质免疫印迹转膜液
称取58g Tris、29g甘氨酸及3.7g SDS，加入超纯水混合均匀搅拌溶解，并定容至2000mL，常温保存；临用时量取适量转膜液，加入4倍体积超纯水稀释至1×工作液。
2)10×TBS缓冲液
称取80g氯化钠及24.2g Tris，加入超纯水搅拌溶解完全并定容至1000mL，常温保存。
3)牛奶封闭液
称取脱脂奶粉7.5g，加入TBST缓冲液150mL搅拌均匀，4℃保存。
4)TBST缓冲液
取吐温20 1mL和10×TBS缓冲液100mL，再加入超纯水混合搅拌均匀，定容至1000mL，常温保存。
5)考马斯亮蓝(G250)染色液
称取G250 50mg，量取50mL 95％乙醇及100mL 85％磷酸，将上述试剂混合加入超纯水，搅拌均匀并定量至1000mL，双层滤纸过滤后4℃保存。
6)AP显色工作液
将33μL BCIP和66μL NBT加入到10mL AP显色缓冲液，混合搅拌均匀后用于显色。
7)PAGE凝胶存储液
分别称取N，N’-亚甲双丙烯酰胺3.2g及丙烯酰胺120g，加入超纯水溶解完全并定容至400 ml。随后用双层滤纸过滤至棕色瓶中，于4℃避光保存。
8)10％SDS工作液
称取2g SDS溶解于200ml超纯水中，分装保存于-20℃。
9)10％过硫酸铵工作液
称取0.5g过硫酸铵溶解于50mL超纯水中，分装并保存于-20℃。
10)1M Tris-HCl(pH 6.8)缓冲液
称取30.29g Tris溶解于100ml超纯水中，盐酸调节PH至6.8。随后定容至250ml，于4℃保存。
11)1.5M Tris-HCl(pH 8.8)缓冲液
称取45.43g Tris溶解于100ml超纯水中，盐酸调节PH至8.8。随后定容至250ml，于4℃保存。
12)DTT存储液
称取DTT 6.2g溶解于40mL 0.01M乙酸钠溶液中，溶解完全后于-20℃保存。
13)PMSF存储液
称取2g PMSF溶解于100mL异丙醇中，溶解完全后保存于-20℃。
(4)实验方法
4.1.细胞处理
将MCF-7/DOX细胞培养于含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基中，并将细胞培养于含5％的CO2培养箱中，37℃恒温培养。我们使用含有浓度为50ng/mL DOX的培养基维持MCF-7/DOX细胞的耐药性。实验前细胞株在无阿霉素条件下培养14天，取对数生长期的细胞，以2.5×105个细胞/孔的密度接种于96孔培养板中，在37℃、5％CO2条件下培养。过夜后分组，分别为空白对照组、受试化合物组、阿霉素作用组、联用组，根据分组给药并继续培养24小时以及48小时。
4.2.细胞内总蛋白提取
1)弃去原六孔培养板中培养基，用事先预冷的PBS缓冲液润洗细胞并弃去洗涤液，重复三次。每1000μL的PBS缓冲液预先加入5μL的PMSF，涡旋振荡器涡旋混合均匀。
2)配备细胞裂解液：每1000μL RIPA裂解液(弱)加入5μL PMSF存储液、1μL DTT 存储液及10μL亮肽，涡旋混匀。向每个细胞孔中加入100μL裂解液，慢慢倾斜六孔板，保证培养板底完全被裂解液覆盖浸润，冰上放置裂解30分钟。
3)待裂解时间达到后，用微量移液器将含有蛋白的细胞裂解液转移至EP管中，12000rpm、 4℃离心20分钟。
4)小心吸取上清液转移至新的EP管中，取出少量样品用于蛋白定量分析；剩余蛋白样品根据体积加入适量6×蛋白上样缓冲液，使其终浓度为1×；用微量移液器轻轻吹打混合均匀，随后于95℃加热蛋白样品10分钟使蛋白变性；变性后的蛋白样品保存于-20℃。
4.3.蛋白定量分析
1)提取的细胞内总蛋白采用Braford法进行定量分析，首先在96孔培养板中配备绘制标准曲线的标准样品孔。标准曲线由10个浓度梯度组成，每个浓度对应3个复孔，每个孔加入考马斯亮蓝(G250)染色液、生理盐水及1mg/mL BSA溶液具体体积如下表：
表3蛋白定量标准孔配置
2)配备完成后用酶标仪检测595nm处的吸光度(OD)值，随后以三个复孔OD值得平均值作为横坐标，以上表中对应标准曲线蛋白浓度作为纵坐标绘制标准曲线，经Excel软件计算得出标准曲线方程。
3)在同一块96孔培养板中配备待测样品孔。每个样品也设置三个复孔，每孔加入生理盐水19μL、G250染色液180μL和待测样品1μL。随后用酶标仪检595nm处OD值：根据上一步得出的标准曲线方程与测得OD值计算出待测样品蛋白浓度。
4.4.SDS-PAGE蛋白凝胶电泳及蛋白免疫印迹(Western Blot)
1)首先装配制胶器，于小烧杯中配备下层分离胶：对于每10mL的分离胶需要量取PAGE 凝胶存储液3.4mL、1.5M Tris-HCl(pH 8.8)缓冲液2.6mL及超纯水3.8mL，再加入10％过硫酸铵溶液100μL、10％SDS溶液100μL及TEMED 4μL，最后用微量移液器吹打混合均匀。
2)吸取上述混合液加至制胶器玻璃板间，最终保持胶液液面距上样梳下边缘约1厘米。胶液上滴加1mL异丙醇压胶，室温凝固；
3)待分离胶凝固后弃去上层异丙醇，滴加适量超纯水润洗三次后室温风干。
4)配置上层浓缩胶：于小烧杯中配备上层浓缩胶，每6mL的浓缩胶需要PAGE凝胶存储液1.0mL、1.5M Tris-HCl(pH 8.8)缓冲液0.75mL及超纯水4.1mL，然后加入10％过硫酸铵溶液60μL、10％SDS溶液60μL及TEMED 6μL，最后用微量移液器吹打混合均匀。
5)将浓缩胶加至分离胶上层并插入上样梳，补加胶液，保证胶液充满制胶器整个玻璃板间空隙，室温凝固。
6)待浓缩胶凝固后，小心拔出上样梳，将玻璃板由制胶器转移至电泳槽内，将事先稀释好的1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液加入槽内，保持电泳槽内电泳液面超过凝胶上表面且电泳槽内侧面液面高度超过外侧液面。
7)将经过高温变性的蛋白样品慢慢加注至上样孔中，同一实验中不同样品的上样体积，具体根据测得蛋白样品浓度在相同蛋白上样量情况下算得。
8)完成上样后，装配电泳槽通电，70V恒定电压电泳至溴酚蓝指示条带迁移至凝胶底部边缘停止电泳。
9)小心将凝胶转移至转移孔板之间，转移孔板上预先从底往上依次放置海绵和三层滤纸，将PVDF膜轻轻覆盖于凝胶上(注意排除凝胶与PVDF膜之间的气泡)，依次再叠加三层滤纸和海绵。
10)装配完全转移孔板后转移至转移槽中，将用超纯水稀释为1×的蛋白质免疫印迹转移液注入转移槽中，转移槽和转膜液均先预冷。
11)装配好转移槽盖后接通电源，300mA恒定电流转膜。根据所需检测蛋白分子量大小和所使用抗体确定转膜时间，经过预实验优化再确定。转膜过程中将转移槽放置于冰盒内冰浴处理，根据转膜时间更换或添加冰，保持转膜液低温。
12)转膜完成后，小心取出PVDF膜，1×TBST缓冲液于摇床上润洗3次，每次10分钟。之后小心将PVDF膜转移至脱脂奶粉封闭液中(5％脱脂牛奶)，室温下封闭2小时。
13)封闭完全后，将PVDF膜放置于一抗中，一抗用5％脱脂牛奶封闭，4℃孵育过夜。
14)第二天小心取出PVDF膜，1×TBST缓冲液洗涤3次，每次10分钟。之后把PVDF膜置于二抗稀释液中，二抗的稀释比例根据抗体说明书经预实验优化确定，二抗孵育时间2小时。
15)二抗孵育完全后，取出PVDF膜，用1×TBST缓冲液润洗3次，每次10分钟。之后用NBT/BCIP显色试剂显色，于电泳图像分析系统中拍照记录。
(5)实验结果
Western blot法测定P-gp蛋白在野生型细胞MCF-7以及耐药细胞MCF-7/DOX中的表达及受试化合物、DOX对P-gp蛋白在这两株细胞中表达量的影响结果如图1所示。
图1中显示了Western blot检测P-gP的蛋白表达量，结果表明，与野生株相比，耐药细胞 MCF-7/DOX中P-gP表达量大幅上升。单独用DOX或者化合物MY3处理都只能稍减少P-gp蛋白的表达量。而化合物MY3与DOX联用时显著的降低了P-gp在耐药细胞中的表达且随着时间的推移(48h时)P-gp的表达量也逐渐减少。
B、RT-qPCR实验
(1)试剂材料
MCF-7/DOX(人乳腺癌阿霉素耐药细胞株)：来自中国科学院细胞库(中国上海)。盐酸阿霉素(盐酸多柔比星)：Sigma公司；RPMI Medium1640：美国Gibico公司；胎牛血清：杭州四季青生物科技有限公司；TRIzolTM试剂：Invitrogen公司；异丙醇：上海凌峰化学试剂有限公司；乙醇：上海凌峰化学试剂有限公司；DL5000DNA Marker：宝生物工程大连有限公司；EasyTaq DNA Polymerase PCR试剂盒：北京全式金生物技术有限公司。
(2)实验仪器
CO2培养箱：Thermo公司，USA；SW-CJ-2FD超净化工作台：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；XSP-17C倒置生物显微镜：上海长方光学仪器有限公司；TL-18M台式高速冷冻离心机：上海离心机械研究所；FA2004A型电子天平：上海精密科学仪器有限公司；T100TMPCR仪：Bio-Rad Laboratories；FR-980生物电泳图像分析系统：上海复日科技有限公司；96孔PCR 板：上海懋康生物科技有限公司；CFX96荧光定量PCR仪：Bio-Rad Laboratories。
(3)实验方法
细胞铺板按照Western Blot实验铺板进行，之后提取细胞内总RNA以及反转录PCR，并进行实时荧光定量PCR检测(Realtime quantitative PCR，qPCR)
1)待药物处理达到指定时间后，弃去原六孔培养板中培养基，每孔加入1mLTRIzol RNA分离试剂。冰上静置5分钟以后，用1000μL规格微量移液枪仔细反复吹打细胞培养板底面，保证细胞全部脱落。
2)将含有细胞的TRIzol RNA分离试剂转移至EP管中，每管细胞悬液加入200μL氯仿，震荡混匀，随后冰上静置2分钟。
3)12000rpm、4℃离心10分钟，此时EP管中液体分为下层粉红色溶液与上次透明溶液，吸取上层透明溶液至无RNA酶的EP管中，注意不要吸取到下层溶液，否则要重新离心。
4)加入500μL异丙醇与上一步吸取的上清液混合，混匀后冰上静置10分钟；
5)12000rpm、4℃离心10分钟，弃去原管内液体；加入预冷的75％乙醇1000μL，用微量移液器吹打洗涤RNA沉淀；
6)12000rpm、4℃离心10分钟，弃去原管内液体，室温干燥沉淀10分钟，最终白色沉淀成无色凝胶状。
7)溶解RNA沉淀用DEPC处理后的水，溶解完全后取出适量样品用核酸蛋白测定仪中检测RNA的纯度；另外取适量样品进行琼脂糖凝胶电泳，以此验证RNA的完整性。
8)下一步进行反转录PCR，体系配置如下：
表4反转录PCR反应体系
反转录PCR反应程序为：42℃反转录15分钟，85℃加热5秒种使酶失活。
9)将得到的cDNA样品加入适量DEPC处理后的水进行稀释、保存于-20℃。
10)称取琼脂糖粉末1g放于锥形瓶中，加入2mL 50×TAE电泳缓冲液和超纯水98mL，混匀后于微波炉中加热至琼脂糖溶解完全。
11)每次煮沸后，取出轻摇锥形瓶除去溶液里的气泡。重复3次本步骤，以保证琼脂糖完全溶解。
12)室温冷却琼脂糖溶液于50℃以下后，加入浓度为10mg/mL的EB溶液5μL，轻微晃动至充分混合均匀，随后将溶液倒入制胶器中，安置样品梳；
13)待琼脂糖凝胶完全凝固后，轻轻拔出样品梳，将凝胶转移至相应电泳槽中；用超纯水将50×TAE电泳缓冲液稀释至1×，倒入电泳槽中，保证液面高过凝胶上表面0.5厘米；
14)向反转好的cDNA中加入1/4体积的5×DNA上样缓冲液，用微量移液枪轻微吹打充分混匀，取5μL加入到凝胶的上样孔中；Marker孔中加入5μL DL5000或DL2000DNA Marker用于指示电泳条带的相对大小。
15)盖上电泳槽盖通电，120V恒定电压下电泳至溴酚蓝条带迁移至适当位置。
16)取出凝胶置于生物电泳图像分析系统观察并用紫外光拍照记录。
17)实时荧光定量PCR检测(Realtime quantitative PCR，qPCR)
qPCR反应体系如下表：
表5 qPCR反应体系
根据试剂盒说明书推荐程序，采用两步法进行qPCR检测，具体程序见下表：
表6 qPCR反应程序
得出数据用2-ΔΔt法处理计算。
(4)实验结果
RT-qPCR法检测P-gp在野生型细胞MCF-7以及耐药细胞MCF-7/DOX中的表达及受试化合物对P-gp基因表达量结果如图2所示
图2显示了RT-QPCR检测P-gp的基因表达量，结果表明，与野生型细胞相比，耐药细胞 MCF-7/DOX中P-gp基因表达量大幅上升。单独用受试化合物或者DOX能减少mRNA的表达量但与野生型细胞相比，P-gp依然高表达。而化合物MY3与DOX联用时可以显著地降低P-gp基因且几乎可以恢复到与野生细胞相同的水平。显著性差异用*p<0.05，**p<0.01以及***p< 0.001vs空白对照组；#p<0.05，##p<0.01以及###p<0.001vs DOX单药作用组。
实施例12
细胞蓄积实验
(1)试剂材料
MCF-7/DOX(人乳腺癌阿霉素耐药细胞株)：来自中国科学院细胞库(中国上海)。盐酸阿霉素(盐酸多柔比星)：Sigma公司；RPMI Medium1640：美国Gibico公司；胎牛血清：杭州四季青生物科技有限公司；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)：上海翊圣生物科技有限公司。
(2)实验仪器
CO2培养箱：Thermo公司，USA；SW-CJ-2FD超净化工作台：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；XSP-17C倒置生物显微镜：上海长方光学仪器有限公司；多功能酶标仪：Thermo公司，USA；FA2004A型电子天平：上海精密科学仪器有限公司；ZD-9556水平摇床：太仓市科教器材厂；荧光显微镜：Nikon公司。
3)实验方法
将MCF-7/DOX细胞培养于含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基中，并将细胞培养于含5％的CO2培养箱中，37℃恒温培养。我们使用含有浓度为50ng/mL DOX的培养基维持MCF-7/DOX细胞的耐药性。实验前细胞株在无阿霉素条件下培养14天，取对数生长期的细胞，以1×105个细胞/孔的密度接种于24孔培养板中，在37℃、5％CO2条件下培养。过夜后分组，分别为空白对照组、阿霉素单药给药组、受试化合物与阿霉素联用组，根据分组给药并继续培养48小时。吸弃上层培养基，用PBS洗3遍，使用DAPI(5μL/mL)工作液常温染色20分钟，弃去染色液，PBS洗3遍，使用荧光显微镜观察并拍照。
(5)实验结果
荧光显微镜拍照检测阿霉素在耐药细胞MCF-7/DOX中的蓄积，图3结果表明，与阿霉素单药作用组相比，受试化合物与阿霉素联用能显著地增加阿霉素在MCF-7/DOX中的蓄积，从而发挥抗肿瘤效果。DAPI染细胞核，在荧光显微镜下观察呈现出蓝色，DOX呈现出橙红色荧光，使用Image软件将两张图片合并，即可以直观的看出阿霉素在细胞内的蓄积情况。
实施例13
体内活性测试
(1)试剂材料
MCF-7/DOX(人乳腺癌阿霉素耐药细胞株)：来自中国科学院细胞库(中国上海)。盐酸阿霉素(盐酸多柔比星)：Sigma公司；RPMI Medium1640：美国Gibico公司；胎牛血清：杭州四季青生物科技有限公司；BALB/C裸小鼠：上海杰斯捷实验动物有限公司；基质胶：上海集奇生物科技有限公司。
(2)实验仪器
CO2培养箱：Thermo公司，USA；SW-CJ-2FD超净化工作台：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；XSP-17C倒置生物显微镜：上海长方光学仪器有限公司；FA2004A型电子天平：上海精密科学仪器有限公司；TDL-60B型低速台式离心机：上海安亭科学仪器厂。
(3)实验方法
荷瘤小鼠皮下成瘤实验按照相关文献进行操作。
将MCF7/DOX细胞(1×107个细胞/200uL/只)通过皮下注射接种于BALB/C雌性小鼠的右侧腋窝下。将小鼠随机分成六组：对照组(记为：NC)、化合物MY3低剂量给药组 (记为：MY3 low)、化合物MY3高剂量给药组(记为：MY3 high)、DOX单药组(记为：DOX组)、化合物MY3低剂量和DOX联用组(记为：DOX+MY3 low)、化合物 MY3高剂量和DOX联用组(记为：DOX+MY3high)。待小鼠瘤体积长到50mm3时(约 3个星期)开始给药，采取的给药方式为尾静脉给药，每两天一次。给药30天后将小鼠处死。期间每两天分别用直尺量取肿瘤体积、称重并在取瘤后用天平测量瘤重。肿瘤体积计算公式为：长×2×0.5。实验动物均是饲养在无菌的环境中，均保持合适的温度和湿度，并且自由饮水和进食。所有动物的相关实验均严格按照中华人民共和国科学技术部的操作规程进行相关操作。
给药剂量：
对照组(记为：NC)：生理盐水。
化合物MY3低剂量给药组(记为：MY3 low)：5mg/kg
化合物MY3高剂量给药组(记为：MY3 high)：15mg/kg
DOX单药组(记为：DOX组)：2mg/kg
化合物MY3低剂量和DOX联用组(记为：DOX+MY3 low)：DOX(2mg/kg)+化合物MY3低剂量(5mg/kg)
化合物MY3高剂量和DOX联用组(记为：DOX+MY3 high)：DOX(2mg/kg)+化合物MY3低剂量(15mg/kg)
4)实验结果
不同治疗方法对小鼠肿瘤的抑制情况如图4所示，图4结果表明，与单药治疗组小鼠相比，联用组小鼠的肿瘤得到抑制，且化合物MY3以浓度依赖性方式增加DOX的抗肿瘤效果。
小鼠在治疗过程中体重的变化如图5所示，图5结果表明，与查尔酮衍生物单药治疗组小鼠相比，阿霉素单药组以及联用组小鼠体重减轻，但联用组与阿霉素单药治疗组相比，体重差异不大。
小鼠在治疗过程中瘤体积的变化如图6所示，图6结果表明，与单药治疗组小鼠相比，联用组小鼠的肿瘤得到抑制，且化合物MY3以浓度依赖性方式增加DOX的抗肿瘤效果。显著性差异用*p<0.05，**p<0.01以及***p<0.001vs空白对照组；#p<0.05，##p<0.01以及###p<0.001vs DOX单药作用组。
小鼠治疗结束后肿瘤的重量情况如图7所示，图7结果表明，与单药治疗组小鼠相比，联用组小鼠的肿瘤得到抑制，且化合物MY3以浓度依赖性方式增加DOX的抗肿瘤效果。显著性差异用*p<0.05，**p<0.01以及***p<0.001vs空白对照组；#p<0.05，##p<0.01以及###p<0.001vs DOX单药作用组。
体内实验结果表明：
(1)化合物MY3作用组的小鼠肿瘤未得到抑制，化合物MY3无抗肿瘤活性。
(2)DOX单药治疗组的小鼠肿瘤得到一定的抑制，但抑制程度并不显著。
(3)联用组小鼠的肿瘤得到抑制，且化合物MY3以浓度依赖性方式增加DOX的抗肿瘤效果。
本发明的3位哌嗪基查尔酮衍生物可作为口服用药或非肠道用药。作为口服用药可以是片剂、胶囊剂或包衣剂，非经肠道用药剂型有注射剂和栓剂等。这些制剂均可按照本领域的技术人员所熟知的方法制备。为制造片剂、胶囊剂、包衣剂所用的辅料是常规用的助剂，例如淀粉、明胶、阿拉伯胶、硅石或聚乙二醇；液体剂型所用的溶剂例如水、乙醇、丙二醇、植物油类如玉米油、花生油或橄榄油等。含有本发明化合物的制剂中还可有其他助剂，例如表面活性剂、润滑剂、崩解剂、防腐剂，矫味剂或色素等。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (5)
1.一种3位哌嗪基查尔酮衍生物，其特征在于，所述的衍生物为以下化合物中的一种，
2.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包含根据权利要求1所述的3位哌嗪基查尔酮衍生物或其药学上可接受的盐/前药、任选的药学上可接受的载体。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述的药学上可接受的盐包括锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铁盐、铜盐、有机铵盐、盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、乙二酸盐或柠檬酸盐中的一种或多种。
4.一种根据权利要求2或3所述的药物组合物在制备治疗基于P-gp高表达的抗耐药肿瘤药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的药物组合物在制备治疗抗耐药肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的抗耐药肿瘤药物包括：抗耐紫杉醇肿瘤药物、抗耐阿霉素肿瘤药物、抗耐顺铂肿瘤药物、抗耐阿霉素乳腺癌药物或抗耐奥沙利铂结直肠癌药物。
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