CN109234314A - 用于敲除cxcl12基因的腺相关病毒重组载体及其构建方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于敲除CXCL12基因的腺相关病毒重组载体，所述重组载体至少包括如下可操作性连接的序列元件：5’末端反相重复序列，CMV启动子，sacas9序列，polyA信号序列，U6启动子序列，gRNA序列，3’末端反相重复序列。经过发明人研究发现，CXCL12基因敲除载体可以有效抑制U87细胞胶质瘤模型的移植瘤生长及肿瘤血管生成，能够有效抑制U87细胞裸鼠皮下胶质瘤模型的肿瘤生长及肿瘤的血管生成。说明本发明的技术方案可以适用于胶质瘤疾病的治疗。

Description

用于敲除CXCL12基因的腺相关病毒重组载体及其构建方法和 用途

技术领域

本发明涉及一种用于敲除CXCL12基因的腺相关病毒重组载体及其构建方法和用途，属于生物技术领域。

背景技术

CXCL12又称基质细胞衍生因子－1(SDF-1)是小分子的细胞因子，属于趋化因子蛋白家族。CXCL12与其受体(CXCR4)在很多生理和病理的发生发展中发挥重要的作用，在肿瘤中通过不同途径使细胞内信号发生改变，能够促进肿瘤细胞的增殖、运动、粘附、侵袭。影响肿瘤的发生、发展和预后。

腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)，是微小病毒科依赖病毒属，病毒颗粒大小约为20～26nm，完整的生活周期需要辅助病毒(通常为腺相关病毒或疱疹病毒)参与。它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。其中cap基因编码病毒衣壳蛋白， rep基因参与病毒的复制和整合。AAV有多种血清型，不同血清型对不同组织的亲和力不同，适用于各种体内感染实验。由于AAV的安全性能好和表达时效长的优点，目前已成为最有前景的基因治疗工具。人2型腺相关病毒伴随病毒(AAV-2)的基因组为4681个核苷酸的单链DNA，全部序列已测定。正链和负链DNA均可被包装到AAV病毒颗粒中。基因组的两末端为145bp的倒转末端重复序列(inverted terminal repeat,ITR)。ITR序列之间为AAV病毒的编码区，左侧的ORF编码4种Rep蛋白；右侧的ORF编码3种Cap蛋白。Cap基因编码衣壳蛋白，其转录从p40启动子开始，形成约2.6kb和2.3kb mRNA,拼接后分别编码三个结构蛋白VP1、VP2和VP3，分子量分别为87、73和61kDa，在成熟毒粒中的比例为1:1:10。没有 VP1时，VP2和VP3就可以包装子代单链DNA。但这样的毒粒感染性较低，提示VP1在病毒颗粒的稳定性或感染性上是需要的。VP2在病毒样空颗粒的装配中起重要作用。VP3似乎需要与其它两个中的一个一起，完成核定位任务。

近年来，AAV载体在临床试验上的安全性和良好治疗效果使人们对AAV载体的研究和开发充满了信心。随着AAV载体的研究和开发不断深入，其在基因治疗中存在的免疫原性、靶向性不强和转导效率不高等问题，通过改造AAV外壳蛋白，利用药物制剂、生物材料等方法也得到了一定的解决。日前欧洲监管机构建议批准由荷兰uniQure公司研制和申报的基因治疗药物Glyber上市。

CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats)是近期出现的一种由RNA指导的Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。在这一系统中，crRNA (CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点切断双链DNA。在基因组编辑过程中，tracrRNA和crRNA可以融合成为1条RNA(sgRNA)表达同样可以起到靶向剪切的作用。

1971年，Judah Folkman博士首次提出了“肿瘤生长依赖于血管生成(tumorangiogenesis)”的观点：一旦肿瘤发生，任何数量的肿瘤细胞增加，都必将伴有新毛细血管的形成。新生血管通过灌注形式为肿瘤细胞生长提供营养供给，同时它也是肿瘤细胞代谢产物排泄的有效途径；而在没有血管形成的情况下，肿瘤的营养供给及代谢物排泄仅能靠简单的物理弥散。这就是严重地限制了肿瘤细胞的生长。

肿瘤的生长和转移与肿瘤血管有着密切的关系。实体瘤大概在1～2mm大小时无新生血管，供给其生长的营养依赖于周围组织的弥散作用，生长极缓慢或处于“休眠”状态。当肿瘤进一步增长时新生血管形成是必要的，癌细胞从供应血管中不断摄取营养物质与氧，运走代谢产物，满足肿瘤细胞生长的需要。此时肿瘤的营养供应由弥散变为灌注，该阶段肿瘤快速增长并具有转移能力。目前抑制肿瘤血管的形成可作为肿瘤治疗的一种重要手段。

本领域技术人员一直致力于开发能够有效治疗肿瘤的基因技术。现有技术中问题是缺少有效治疗胶质瘤的基因手段和方法。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于敲除CXCL12基因的腺相关病毒重组载体及其构建方法和用途。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种用于敲除CXCL12基因的腺相关病毒重组载体，所述重组载体至少包括如下可操作性连接的序列元件：

5’末端反相重复序列，CMV启动子，sacas9序列，polyA信号序列，U6启动子序列，gRNA 序列，3’末端反相重复序列。

腺相关病毒是一种单链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺相关病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。

CXCL12基因在NCBI中的登录号为6387。

本发明利用天然的腺相关病毒经过基因改造后获得一种用于CXCL12基因敲除载体。

所述的“操作性连接”或“可操作性连接”是指两个或者多个核酸区域或核酸序列的功能性空间排列。例如，启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子的引导，从而，启动子区域可被“可操作性连接”到核酸序列上。

所述的“元件”是指一些对于蛋白的表达有用的一些列功能性核酸序列，本发明中，所述的“元件”被系统地构建以形成一种表达构建体。所述的“元件”序列是可以本发明中提供的，也包括他们的变体，只要这些元件上保留了所述“元件”的功能，其通过插入或者删除一些碱基，或者随机或定点突变等来获得。

所述各个元件的上游及下游位置，还可包括限制性内切酶的酶切位点，这些位点有利于各个元件的有机连接。

进一步地，重组载体序列如SEQ ID NO.1所示。具体如下：

CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGA CCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTC CATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCTCTAGACTCGAGGCGTTGACATTGATTATTGACTAG TTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCG TTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTG ACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCA ATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGC CAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCA GTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTA TTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCA CGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAA TCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGT AGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTACCGGTGCCA CCATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCCAAGCGGAACTACATCCTGGGCCTGGACATCGGCATCACCAGCGTGGGCTACGGCATCATCGA CTACGAGACACGGGACGTGATCGATGCCGGCGTGCGGCTGTTCAAAGAGGCCAACGTG GAAAACAACGAGGGCAGGCGGAGCAAGAGAGGCGCCAGAAGGCTGAAGCGGCGGAG GCGGCATAGAATCCAGAGAGTGAAGAAGCTGCTGTTCGACTACAACCTGCTGACCGAC CACAGCGAGCTGAGCGGCATCAACCCCTACGAGGCCAGAGTGAAGGGCCTGAGCCAG AAGCTGAGCGAGGAAGAGTTCTCTGCCGCCCTGCTGCACCTGGCCAAGAGAAGAGGCG TGCACAACGTGAACGAGGTGGAAGAGGACACCGGCAACGAGCTGTCCACCAAAGAGC AGATCAGCCGGAACAGCAAGGCCCTGGAAGAGAAATACGTGGCCGAACTGCAGCTGG AACGGCTGAAGAAAGACGGCGAAGTGCGGGGCAGCATCAACAGATTCAAGACCAGCG ACTACGTGAAAGAAGCCAAACAGCTGCTGAAGGTGCAGAAGGCCTACCACCAGCTGG ACCAGAGCTTCATCGACACCTACATCGACCTGCTGGAAACCCGGCGGACCTACTATGA GGGACCTGGCGAGGGCAGCCCCTTCGGCTGGAAGGACATCAAAGAATGGTACGAGAT GCTGATGGGCCACTGCACCTACTTCCCCGAGGAACTGCGGAGCGTGAAGTACGCCTAC AACGCCGACCTGTACAACGCCCTGAACGACCTGAACAATCTCGTGATCACCAGGGACG AGAACGAGAAGCTGGAATATTACGAGAAGTTCCAGATCATCGAGAACGTGTTCAAGCA GAAGAAGAAGCCCACCCTGAAGCAGATCGCCAAAGAAATCCTCGTGAACGAAGAGGA TATTAAGGGCTACAGAGTGACCAGCACCGGCAAGCCCGAGTTCACCAACCTGAAGGTG TACCACGACATCAAGGACATTACCGCCCGGAAAGAGATTATTGAGAACGCCGAGCTGC TGGATCAGATTGCCAAGATCCTGACCATCTACCAGAGCAGCGAGGACATCCAGGAAGA 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GAACAAGGGGTACAAGCACCACGCCGAGGACGCCCTGATCATTGCCAACGCCGATTTC ATCTTCAAAGAGTGGAAGAAACTGGACAAGGCCAAAAAAGTGATGGAAAACCAGATG TTCGAGGAAAAGCAGGCCGAGAGCATGCCCGAGATCGAAACCGAGCAGGAGTACAAA GAGATCTTCATCACCCCCCACCAGATCAAGCACATTAAGGACTTCAAGGACTACAAGT ACAGCCACCGGGTGGACAAGAAGCCTAATAGAGAGCTGATTAACGACACCCTGTACTC CACCCGGAAGGACGACAAGGGCAACACCCTGATCGTGAACAATCTGAACGGCCTGTAC GACAAGGACAATGACAAGCTGAAAAAGCTGATCAACAAGAGCCCCGAAAAGCTGCTG ATGTACCACCACGACCCCCAGACCTACCAGAAACTGAAGCTGATTATGGAACAGTACG GCGACGAGAAGAATCCCCTGTACAAGTACTACGAGGAAACCGGGAACTACCTGACCA AGTACTCCAAAAAGGACAACGGCCCCGTGATCAAGAAGATTAAGTATTACGGCAACA AACTGAACGCCCATCTGGACATCACCGACGACTACCCCAACAGCAGAAACAAGGTCGT GAAGCTGTCCCTGAAGCCCTACAGATTCGACGTGTACCTGGACAATGGCGTGTACAAGTTCGTGACCGTGAAGAATCTGGATGTGATCAAAAAAGAAAACTACTACGAAGTGAATA GCAAGTGCTATGAGGAAGCTAAGAAGCTGAAGAAGATCAGCAACCAGGCCGAGTTTA TCGCCTCCTTCTACAACAACGATCTGATCAAGATCAACGGCGAGCTGTATAGAGTGAT CGGCGTGAACAACGACCTGCTGAACCGGATCGAAGTGAACATGATCGACATCACCTAC CGCGAGTACCTGGAAAACATGAACGACAAGAGGCCCCCCAGGATCATTAAGACAATC GCCTCCAAGACCCAGAGCATTAAGAAGTACAGCACAGACATTCTGGGCAACCTGTATG AAGTGAAATCTAAGAAGCACCCTCAGATCATCAAAAAGGGCAAAAGGCCGGCGGCCA CGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGGGATCCTACCCATACGATGTTCCAG ATTACGCTTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTACCCATACGATGTTCCAGATTAC GCTTAAGAATTCCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCA TCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTC CTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCT GGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGAGAATAGCAGGC ATGCTGGGGAGGTACCGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGAT ACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGT ACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTAT GTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTT TATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCCGCGCTCTGCCTCAGCGACGTTTTAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGT TGGCGAGATTTTTGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTG CGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTG CCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCG GTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATA GTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTG ACCGCTACACTTGCCAGCGCCTTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTC GCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCG ATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTA GTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTT AATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACTCTATCTCGGGCTATTCTTT TGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGTCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAAC AAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTC AGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACC GTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGAC GAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCT TAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTT CTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAAT AATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTT TTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGA TGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGT AAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGT TCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCC GCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTT ACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACA CTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTT GCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAA GCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGC GCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGG ATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGT TTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGAAGCCGCGGTATCATTGCAGCACT GGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCA ACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATT GGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTT AATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAA CGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTG AGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAG CGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTC AGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTT CAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTG CTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGA TAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCG AACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTT CCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAG CGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTC GCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGG AAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA CATGT

进一步地，所述5’末端反相重复序列如SEQ ID NO.1中第1～141位所示；

进一步地，所述CMV启动子序列如SEQ ID NO.1中第154～737位所示；

进一步地，所述CMV启动子序列如SEQ ID NO.1中第154～737位所示；

进一步地，所述sacas9编码序列如SEQ ID NO.1中第762～3345位所示；

进一步地，所述polyA信号序列如SEQ ID NO.1中第4137～4344位所示；

进一步地，所述U6启动子序列如SEQ ID NO.1中第4351～4591位所示；

进一步地，所述gRNA序列如SEQ ID NO.1中第4600～4620位所示；

进一步地，所述3’末端反相重复序列如SEQ ID NO.1中第4710～4850位所示。

本发明的另外一个方面提供了上述腺相关病毒重组载体用于制备胶质瘤治疗药物的用途。

本发明的另外一个方面提供了一种细胞，所述细胞内含有上述腺相关病毒重组载体。

本发明的另外一个方面提供了一种试剂盒，所述的试剂盒中包括如上所述的腺相关病毒重组载体和药学上可接受的载体，或者如上所述的细胞和药学上可接受的载体。

本发明的另外一个方面提供了上述腺相关病毒重组载体的构建方法，方法至少包括以下步骤：

(1)gRNA设计和双链合成；

(2)AVV-sacas9重组载体构建。

进一步的，所述步骤(1)中gRNA扩增时采用的正向引物的序列如SEQ ID NO.2所示，反相引物的序列如SEQ ID NO.3所示。

SEQ ID NO.2:caccGCCGCGCTCTGCCTCAGCGAC

SEQ ID NO.3:aaacGTCGCTGAGGCAGAGCGCGGC

如上所述，本发明的用于敲除CXCL12基因的腺相关病毒重组载体及其构建方法和用途，具有以下有益效果：

获得的腺相关病毒过表达载体能够高效的敲除CXCL12基因的载体AAV-CXCL12-KO。

附图说明

图1显示为实施例1中使用的载体结构示意图。

图2显示为实施例2中在不同时间点测定实验组肿瘤体积表格。

图3显示为实施例2中对不同实验组测定MVD结果图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。

表1本实验相关仪器

实施例1

1、pHBAAV-CMV-Sacas9-U6-gRNA载体(结构如图1)用BsaI酶切，酶切体系如下：

2、载体酶切完成后胶回收

3、CXCL12-gRNA片段PCR的制备

上下游引物退火，其中正向引物的序列如SEQ ID NO.2所示，反相引物的序列如SEQ ID NO.3 所示。

表2

用PCR仪或水浴锅将以上混匀组分，于95℃温浴4min，然后取出放置在室温冷却

3、处理好的目的片段与载体连接反应体系(20μl)：

表3

以上反应体系置于22℃在温浴20min，反应完成之后如不能马上进行后续操作可将反应样品暂存储于﹣20℃；

5、转化(感受态细胞:stbl3)。

抗性:Amp，37℃，培养过夜

6、转化后的CXCL12-gRNA平板挑菌，37℃250转/分钟摇菌14小时，用菌液进行PCR鉴定，将阳性克隆菌液送测序公司测序。获得CXCL12敲除载体结果如SEQ ID NO.1所示。

实施例2

用于CXCL12敲除的腺相关病毒重组载体注射胶质瘤模型鼠抑制小鼠肿瘤生长及血管生成

1、实验材料

4-6周龄裸小鼠(该小鼠可购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)，体重16～20g。

2、实验方法

2.1小鼠肿瘤造模

24只裸鼠每只按1*10^8个U87细胞接种于前腋窝皮下。2周后将24只小鼠随机分成3 组，PBS组(空白对照组)、AAV-GFP组和AAV-CXCL12-KO组。每天观察裸鼠的生长情况。

2.2注射AAV-GFP组和AAV-CXCL12-KO、对照腺相关病毒以及PBS组

吸取5ul液体用微量注射针在距肿瘤5mm处进针，皮下移行到胶质瘤部位，缓慢注射。隔2天后再注射一次。对照腺相关病毒为AAV-GFP(具有绿色荧光蛋白的腺相关病毒)。空白对照组为PBS。

2.3肿瘤体积的监测及微血管密度测定

注射后每周用游标卡尺测量肿瘤的最长径(x)和最短径(y).肿瘤体积计算公式：V＝xy²/2。

实验结束后处死所有的裸鼠进行微血管密度测定。肿瘤组织放入甲醛固定，石蜡包埋。切片经二甲苯、乙醇脱蜡水化，血清封闭切片。按步骤先后加入CD34一抗、生物素化二抗。封片后光镜下观察并拍照。计算微血管密度(MVD)。

3、实验结果

AAV-CXCL12-KO腺相关病毒可以显著抑制胶质瘤模型的肿瘤生长和血管生成。

如图2所示，PBS组及AAV组相比，接种后不同天数移植瘤体积与微血管密度均无明显区别，施用本发明的重组腺相关病毒的实验组中，移植瘤体积明显小于前两组，42d时肿瘤体积只有对照组的49.7％。微血管密度与其它两组相比明显降低，42d时微血管数为对照的 26.4％。微血管密度与其它两组相比明显降低，具有统计学差异。

如图3所示，比较了PBS对照小鼠、AAV-GFP对照小鼠和AAV-CXCL12-KO注射的胶质瘤模型小鼠(敲除CXCL12基因的小鼠)的肿瘤体积及血管指标。

实验表明通过腺相关病毒敲除CXCL12能够有效抑制胶质瘤模型的肿瘤生长及血管生成。说明本发明的技术方案可适用于肿瘤胶质瘤疾病的治疗。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 汉恒生物科技（上海）有限公司

<120> 用于敲除CXCL12基因的腺相关病毒重组载体及其构建方法和用途

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7447

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct gcggcctcta gactcgaggc gttgacattg attattgact agttattaat 180

agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 240

ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 300

tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 360

atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 420

ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 480

gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc 540

ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc 600

tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa 660

aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg 720

tctatataag cagagctctc tggctaacta ccggtgccac catggcccca aagaagaagc 780

ggaaggtcgg tatccacgga gtcccagcag ccaagcggaa ctacatcctg ggcctggaca 840

tcggcatcac cagcgtgggc tacggcatca tcgactacga gacacgggac gtgatcgatg 900

ccggcgtgcg gctgttcaaa gaggccaacg tggaaaacaa cgagggcagg cggagcaaga 960

gaggcgccag aaggctgaag cggcggaggc ggcatagaat ccagagagtg aagaagctgc 1020

tgttcgacta caacctgctg accgaccaca gcgagctgag cggcatcaac ccctacgagg 1080

ccagagtgaa gggcctgagc cagaagctga gcgaggaaga gttctctgcc gccctgctgc 1140

acctggccaa gagaagaggc gtgcacaacg tgaacgaggt ggaagaggac accggcaacg 1200

agctgtccac caaagagcag atcagccgga acagcaaggc cctggaagag aaatacgtgg 1260

ccgaactgca gctggaacgg ctgaagaaag acggcgaagt gcggggcagc atcaacagat 1320

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accagctgga ccagagcttc atcgacacct acatcgacct gctggaaacc cggcggacct 1440

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agatgctgat gggccactgc acctacttcc ccgaggaact gcggagcgtg aagtacgcct 1560

acaacgccga cctgtacaac gccctgaacg acctgaacaa tctcgtgatc accagggacg 1620

agaacgagaa gctggaatat tacgagaagt tccagatcat cgagaacgtg ttcaagcaga 1680

agaagaagcc caccctgaag cagatcgcca aagaaatcct cgtgaacgaa gaggatatta 1740

agggctacag agtgaccagc accggcaagc ccgagttcac caacctgaag gtgtaccacg 1800

acatcaagga cattaccgcc cggaaagaga ttattgagaa cgccgagctg ctggatcaga 1860

ttgccaagat cctgaccatc taccagagca gcgaggacat ccaggaagaa ctgaccaatc 1920

tgaactccga gctgacccag gaagagatcg agcagatctc taatctgaag ggctataccg 1980

gcacccacaa cctgagcctg aaggccatca acctgatcct ggacgagctg tggcacacca 2040

acgacaacca gatcgctatc ttcaaccggc tgaagctggt gcccaagaag gtggacctgt 2100

cccagcagaa agagatcccc accaccctgg tggacgactt catcctgagc cccgtcgtga 2160

agagaagctt catccagagc atcaaagtga tcaacgccat catcaagaag tacggcctgc 2220

ccaacgacat cattatcgag ctggcccgcg agaagaactc caaggacgcc cagaaaatga 2280

tcaacgagat gcagaagcgg aaccggcaga ccaacgagcg gatcgaggaa atcatccgga 2340

ccaccggcaa agagaacgcc aagtacctga tcgagaagat caagctgcac gacatgcagg 2400

aaggcaagtg cctgtacagc ctggaagcca tccctctgga agatctgctg aacaacccct 2460

tcaactatga ggtggaccac atcatcccca gaagcgtgtc cttcgacaac agcttcaaca 2520

acaaggtgct cgtgaagcag gaagaaaaca gcaagaaggg caaccggacc ccattccagt 2580

acctgagcag cagcgacagc aagatcagct acgaaacctt caagaagcac atcctgaatc 2640

tggccaaggg caagggcaga atcagcaaga ccaagaaaga gtatctgctg gaagaacggg 2700

acatcaacag gttctccgtg cagaaagact tcatcaaccg gaacctggtg gataccagat 2760

acgccaccag aggcctgatg aacctgctgc ggagctactt cagagtgaac aacctggacg 2820

tgaaagtgaa gtccatcaat ggcggcttca ccagctttct gcggcggaag tggaagttta 2880

agaaagagcg gaacaagggg tacaagcacc acgccgagga cgccctgatc attgccaacg 2940

ccgatttcat cttcaaagag tggaagaaac tggacaaggc caaaaaagtg atggaaaacc 3000

agatgttcga ggaaaagcag gccgagagca tgcccgagat cgaaaccgag caggagtaca 3060

aagagatctt catcaccccc caccagatca agcacattaa ggacttcaag gactacaagt 3120

acagccaccg ggtggacaag aagcctaata gagagctgat taacgacacc ctgtactcca 3180

cccggaagga cgacaagggc aacaccctga tcgtgaacaa tctgaacggc ctgtacgaca 3240

aggacaatga caagctgaaa aagctgatca acaagagccc cgaaaagctg ctgatgtacc 3300

accacgaccc ccagacctac cagaaactga agctgattat ggaacagtac ggcgacgaga 3360

agaatcccct gtacaagtac tacgaggaaa ccgggaacta cctgaccaag tactccaaaa 3420

aggacaacgg ccccgtgatc aagaagatta agtattacgg caacaaactg aacgcccatc 3480

tggacatcac cgacgactac cccaacagca gaaacaaggt cgtgaagctg tccctgaagc 3540

cctacagatt cgacgtgtac ctggacaatg gcgtgtacaa gttcgtgacc gtgaagaatc 3600

tggatgtgat caaaaaagaa aactactacg aagtgaatag caagtgctat gaggaagcta 3660

agaagctgaa gaagatcagc aaccaggccg agtttatcgc ctccttctac aacaacgatc 3720

tgatcaagat caacggcgag ctgtatagag tgatcggcgt gaacaacgac ctgctgaacc 3780

ggatcgaagt gaacatgatc gacatcacct accgcgagta cctggaaaac atgaacgaca 3840

agaggccccc caggatcatt aagacaatcg cctccaagac ccagagcatt aagaagtaca 3900

gcacagacat tctgggcaac ctgtatgaag tgaaatctaa gaagcaccct cagatcatca 3960

aaaagggcaa aaggccggcg gccacgaaaa aggccggcca ggcaaaaaag aaaaagggat 4020

cctacccata cgatgttcca gattacgctt acccatacga tgttccagat tacgcttacc 4080

catacgatgt tccagattac gcttaagaat tcctagagct cgctgatcag cctcgactgt 4140

gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga 4200

aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag 4260

taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga 4320

agagaatagc aggcatgctg gggaggtacc gagggcctat ttcccatgat tccttcatat 4380

ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca 4440

aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt 4500

ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat 4560

ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga cgaaacaccg ccgcgctctg cctcagcgac 4620

gttttagtac tctggaaaca gaatctacta aaacaaggca aaatgccgtg tttatctcgt 4680

caacttgttg gcgagatttt tgcggccgca ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc 4740

ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg 4800

ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg ggcgcctgat 4860

gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatacgtc aaagcaacca 4920

tagtacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg 4980

accgctacac ttgccagcgc cttagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc 5040

gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga 5100

tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt tgggtgatgg ttcacgtagt 5160

gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat 5220

agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaactcta tctcgggcta ttcttttgat 5280

ttataaggga ttttgccgat ttcggtctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa 5340

tttaacgcga attttaacaa aatattaacg tttacaattt tatggtgcac tctcagtaca 5400

atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg 5460

ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg 5520

agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc 5580

gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gacgtcaggt 5640

ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca 5700

aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg 5760

aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc 5820

cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg 5880

ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt 5940

cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta 6000

ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat 6060

gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga 6120

gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca 6180

acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact 6240

cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc 6300

acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact 6360

ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt 6420

ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt 6480

ggaagccgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt 6540

atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata 6600

ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag 6660

attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat 6720

ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 6780

aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca 6840

aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt 6900

ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg 6960

tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc 7020

ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga 7080

cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc 7140

agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc 7200

gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca 7260

ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg 7320

tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta 7380

tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 7440

cacatgt 7447

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caccgccgcg ctctgcctca gcgac 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaacgtcgct gaggcagagc gcggc 25

Claims (7)

1.一种用于敲除CXCL12基因的腺相关病毒重组载体，其特征在于，所述腺相关病毒载体至少包括：如下可操作性连接的序列元件：

5’末端反相重复序列，CMV启动子，sacas9编码序列，polyA信号序列，U6启动子序列，gRNA序列，3’末端反相重复序列。

2.根据权利要求1所述的腺相关病毒重组载体，其特征在于：

所述重组载体序列如SEQ ID NO.1所示，

所述5’末端反相重复序列如SEQ ID NO.1中第1～141位所示；

所述CMV启动子序列如SEQ ID NO.1中第154～737位所示；

所述sacas9编码序列如SEQ ID NO.1中第762～3345位所示；

所述polyA信号序列如SEQ ID NO.1中第4137～4344位所示；

所述U6启动子序列如SEQ ID NO.1中第4351～4591位所示；

所述gRNA序列如SEQ ID NO.1中第4600～4620位所示；

所述3’末端反相重复序列如SEQ ID NO.1中第4710～4850位所示。

3.如权利要求1～2任一项所述腺相关病毒重组载体用于制备胶质瘤治疗药物的用途。

4.一种细胞，其特征在于，所述细胞内含有如权利要求1～2任一项所述腺相关病毒重组载体。

5.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括如权利要求1～2任一项所述的腺相关病毒重组载体和药学上可接受的载体，或者如权利要求4所述的细胞和药学上可接受的载体。

6.如权利要求1～2任一项所述用于敲除CXCL12基因的腺相关病毒重组载体的构建方法，其特征在于，所述方法至少包括以下步骤：

(1)gRNA设计和双链合成；

(2)AVV-sacas9重组载体构建。

7.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中gRNA扩增时采用的正向引物的序列如SEQ ID NO.2所示，反相引物的序列如SEQ ID NO.3所示。