CN109234212A - 一种以餐厨垃圾为基质培养硅酸盐细菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种以餐厨垃圾为基质培养硅酸盐细菌的方法，餐厨垃圾干燥后作为培养基的碳源和氮源使用；扩大培养硅酸盐细菌。将餐厨垃圾沥干水，挑除垃圾中的杂质，置于搅拌机内混匀，使用离心机进行脱水至含水量10～20％，之后置于烘干箱内120℃～150℃烘干10～15min，将干燥后的垃圾置于粉碎机内粉碎至40～60目，得到餐厨垃圾粉。餐厨垃圾粉与豆粕，钾长石粉，NaCl，MgSO4·7H2O，FeCl3进行配比，配比后的培养基可以大规模发酵生产硅酸盐细菌，培养后的硅酸盐细菌具有较强的解钾能力。

Description

一种以餐厨垃圾为基质培养硅酸盐细菌的方法

技术领域

本发明涉及微生物技术及废物再利用领域，具体涉及一种以餐厨垃圾为基质培养硅酸盐细菌的方法。

背景技术

硅酸盐细菌，是细菌的一种。该菌具有极强的适应能力，在无氮培养基中长势良好。作为一种重要的功能性细菌，硅酸盐细菌的应用广泛，尤其是在农学方面。中国的土壤存在既富钾又缺钾的状况，钾肥靠大量的进口。硅酸盐细菌的特殊性就在于，可以将土壤中的难溶性钾、硅、磷等转化为可溶性，培养基中的激素类物质能够促进植物的生长和吸收。此外，还能增强农作物的抗病能力。

餐厨垃圾是城市生活中重要的废弃物，不仅造成了城市污染，同时也带来了资源浪费。餐厨垃圾中，含有多种有机物，进行适当处理后，其含有的碳源、氮源、无机盐等可以作为微生物生长的基质，使用处理后的垃圾进行硅酸盐细菌的培养研究，解决了硅酸盐细菌培养基昂贵的价格，同时也实现了餐厨垃圾废物再利用的目的。

专利201510225797.X报道了一种无污染硅酸盐细菌肥料及其制备方法；专利201610798354.4报道了一种利用生物碳培养的硅酸盐细菌及其制备方法和用途，所述制备方法以生物碳作为吸附载体；专利201510589506.5报道了一种硅酸盐细菌培养基及其制备方法和用途，该培养基以鸡粪作为培养基的碳氮源(发酵底物)，以粉碎秸秆作为菌株吸附剂。专利CN201310315492.9报道了一种解磷、解钾生物有机肥及其制备方法，虽使用餐厨垃圾为培养基的原料，但是培养的不是硅酸盐细菌，文献“利用餐厨垃圾渗滤液培养苏云金芽孢杆菌”(化学与生物工程，2017年第7期)也使用了餐厨垃圾作为培养基的组成，但以上专利和文献报道均没有研究使用餐厨垃圾对硅酸盐细菌进行培养。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种以餐厨垃圾为基质培养硅酸盐细菌的方法，大规模发酵生产硅酸盐细菌，培养后的硅酸盐细菌具有较强的解钾能力。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案实现：

一种以餐厨垃圾为基质培养硅酸盐细菌的方法，餐厨垃圾干燥后作为培养基的碳源和氮源使用；包括以下步骤：

(1)餐厨垃圾的预处理

将餐厨垃圾沥干水，挑除垃圾中的杂质，置于搅拌机内混匀，使用离心机进行脱水至含水量10～20％，之后置于烘干箱内120℃～150℃烘干10～15min，将干燥后的垃圾置于粉碎机内粉碎至40-60目，得到餐厨垃圾粉，备用；

(2)液体发酵培养基的制备

a.制备活化、纯化硅酸盐细菌菌种

b.硅酸盐细菌种子液的制备

c.餐厨垃圾液体发酵培养基的制备

①按比例称取餐厨垃圾干粉15～20g，豆粕7～10g，钾长石粉3～5g，NaCl 1～3g，MgSO4·7H2O 0.5～2g，FeCl₃ 0.005～0.02g，蒸馏水1～1.5L，将蒸馏水倒入锅中，小火烧开，依次将药品倒入锅内，加热并不断搅拌，直到所有药品彻底溶于水中制得液体培养基；

②液体培养基的进一步处理，将熬好的培养基先经纱布粗过滤取滤液，然后在转速为1000～3000r/min下离心5～10min，取上清液发酵培养基，然后将所得培养基倒入250mL锥形瓶中，塞上棉塞并用纸包好，将其置于高压蒸汽灭菌锅中，在121～130℃温度下灭菌30～60min制得餐厨垃圾液体发酵培养基，备用；

③接种，在无菌条件下，按1：100比例将硅酸盐细菌种子液接种于灭菌后的餐厨垃圾液体发酵培养基中，将接种后的培养基置于恒温摇床上，在25～30℃，180～200r/min条件下培养36～48h。

与现有的技术相比，本发明的有益效果是：

本发明公开了一种以餐厨垃圾为基质培养硅酸细菌的方法，通过对餐厨垃圾进行分类和预处理后，与一定量的培养基原料进行配比，配比后的培养基可以大规模发酵生产硅酸盐细菌，培养后的硅酸盐细菌具有较强的解钾能力。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步说明：

以下实施例对本发明进行详细描述。这些实施例仅是对本发明的最佳实施方案进行描述，并不对本发明的范围进行限制。

实施例

一种以餐厨垃圾为基质培养硅酸盐细菌的方法，餐厨垃圾干燥后作为培养基的碳源和氮源使用；包括以下步骤：

步骤一：餐厨垃圾的预处理

将餐厨垃圾沥干水，挑除垃圾中的杂质，置于搅拌机内混匀，使用离心机进行脱水至含水量10～20％，之后置于烘干箱内120℃～150℃烘干10～15min，将干燥后的垃圾置于粉碎机内粉碎至40-60目，得到餐厨垃圾粉，备用；

步骤二：液体发酵培养基的制备

1)制备活化、纯化硅酸盐细菌

a.硅酸盐细菌的分离培养

①硅酸盐细菌培养基的制备

称取1L的水倒入锅中。小火烧开后，将称取好的蔗糖、琼脂、碳酸钙、磷酸氢二钠、硫酸镁以及三氯化铁倒入锅内，小火煮至琼脂以及药品彻底溶于水中。期间要不停的搅拌，避免琼脂糊在锅底，造成实验误差。用报纸包好准备倒入培养基的空平皿，准备灭菌。

②种子固体斜面培养基

称取500ml的水倒入锅中。小火烧开后，将按比例称取好的蔗糖、琼脂、碳酸钙、磷酸氢二钠、硫酸镁以及三氯化铁倒入锅内，小火煮至琼脂以及药品彻底溶于水中。期间要不停的搅拌，避免琼脂糊在锅底，造成实验误差。将熬好的培养基倒入试管中，控制培养基倒入试管的四分之一处，不宜过多，避免摆斜面时培养基溢出。用报纸包好试管，准备灭菌。

③培养方法

倒平皿：将硅酸盐细菌培养基分装至锥形瓶中，将倒好培养基的试管立在烧杯里，再用报纸包好空试管，以及锥形瓶和一些移液枪的枪头放入灭菌锅中。经蒸汽式高压灭菌锅在121℃下灭菌30min后，将平皿和试管等放置在无菌室，将试管摆成斜面，趁着培养基未凝固，在无菌条件下倒好培养基在平皿里，待试管和平皿中的培养基凝固后进行无菌操作。

制备土壤悬液：在无菌的操作条件下，将取自作物根际深5-20cm的土壤称取10g，溶在90ml的无菌水里，充分震荡以保证土样分散、均匀混合。用移液枪在9个空试管中依次装入9ml的无菌水以待备用。而后，用移液枪取已混匀的土壤悬液1ml装入第一个装9ml无菌水的试管中。混匀后，取第一个试管中的土壤悬液1ml装入第二个试管中。以此类推，对其他的试管依次进行稀释。这些试管被分别梯度稀释成10^-2、10^-3、10^-4……10^-9的土壤悬液。

接种：无菌条件下，用移液枪在已经稀释好的9个试管中各取100μl土壤悬液均匀涂布在硅酸盐细菌的培养基中，在37℃的培养箱里进行倒置培养3d。在这些平板中挑选出透明、光滑、有弹性的半玻璃状菌落进行下一步的纯化培养。

b.硅酸盐细菌的纯化培养

①硅酸盐细菌纯化培养基的制备

称取1L的水倒入锅中。小火烧开后，将称取好的蔗糖、琼脂、碳酸钙、磷酸氢二钠、硫酸镁以及三氯化铁倒入锅内，小火煮至琼脂以及药品彻底溶于水中。期间要不停的搅拌，避免琼脂糊在锅底，造成实验误差。用报纸包好准备倒入培养基的20个空平皿，准备灭菌。

②硅酸盐细菌的纯化培养方法

倒平皿：将硅酸盐细菌培养基分装至锥形瓶中，将包好的平皿放入灭菌锅中，经蒸汽式高压灭菌锅在121℃下灭菌30min后，将平皿放置在无菌室，趁着培养基未凝固，在无菌条件下倒好培养基在平皿里，待平皿中的培养基凝固后进行无菌操作。

接种：在无菌条件下，用接种环挑取光滑、透明、有弹性的半玻璃状菌落在已凝固的平板上均匀划线，在此过程中要注意不要划破培养基，以及保证接种的无菌条件。在37℃的培养箱中倒置培养3d。而后得到被纯化的菌种。

筛选的8株疑似硅酸盐细菌菌种在硅酸盐细菌培养基上两天内开始长出菌落。对这8株疑似细菌进行菌落鉴定。结果显示，纯化培养的8株硅酸盐细菌中有4株细菌的菌落呈透明、无色、表面光滑，边缘整齐，半玻璃状，并且挑起易拉丝，极具弹性。这些形状符合硅酸盐细菌的特征。分别标记为K1、K2、K3、K4。剩余4株菌落形状不规则，表面粗糙，没有弹性。排除其作为硅酸盐细菌的可能性。

K1、K2、K3、K4硅酸盐细菌，革兰氏染色显示菌体呈阴性，菌落透明，表面光滑，有弹性，挑起时可以拉出很长的丝。菌体形状为杆状，有厚厚的荚膜。细菌在37℃的培养条件下，培养24h后菌落直径为1-2mm，培养48-72h的菌落直径在4-6mm。

2)硅酸盐细菌种子液的制备：

量取1L水倒入锅中，小火烧开后，将称取好的药品(酵母膏1.0～2g，MgSO₄·7H₂O0.5～2g,可溶性淀粉5.0～10g，CaCO₃ 0.1～0.3g)倒入锅中小火加热，制备培养基。将熬好的培养基倒入6个锥形瓶中，用棉塞封口，准备灭菌。将配置的培养基置于蒸汽式高压灭菌锅在121～130℃下，灭菌30～60min。将制备的活化后的纯化硅酸盐细菌菌种在无菌条件下接种于锥形瓶中。接种后置于25～30℃全温振荡培养箱中，以转速180～200r/m in,摇床培养36～48h作为硅酸盐细菌种子液备用。

3)餐厨垃圾液体发酵培养基的制备

a.按比例称取餐厨垃圾干粉15～20g，豆粕7～10g，钾长石粉3～5g，NaCl 1～3g，MgSO4·7H2O 0.5～2g，FeCl3 0.005～0.02g，蒸馏水1～1.5L。将蒸馏水倒入锅中，小火烧开。依次将药品倒入锅内，加热并不断搅拌，直到所有药品彻底溶于水中。

b.液体培养基的进一步处理，将熬好的培养基先经纱布粗过滤取滤液，然后在转速为1000～3000r/min下离心5～10min，取上清液发酵培养基。然后将所得培养基倒入250mL锥形瓶中，塞上棉塞并用报纸包好。将其置于高压蒸汽灭菌锅中，在121～130℃温度下灭菌30～60min后制得餐厨垃圾液体发酵培养基备用。

c.在无菌条件下，按1：100比例将硅酸盐细菌种子液接种于灭菌后的餐厨垃圾液体发酵培养基中。将接种后的培养基置于恒温摇床上。在25～30℃，180～200r/min条件下培养36～48h，。

硅酸盐细菌在餐厨垃圾液态发酵培养基中生长所得发酵培养液的解钾能力测定。

将适量发酵培养液用30％的过氧化氢溶液进行消煮，直到荚膜消失，在离心机中离心10～20min，转速为3000～6000r/min，分离出上清液，倒进50mL容量瓶中定容。在火焰亮度计上先用空白溶液调节亮度计的零点，将标准溶液系列的最高浓度调到仪器满刻度至40分度时测量样品溶液，对仪器的显示数值作出记录。详细操作参照土壤理化分析实验指导书。

培养基中的不可溶性钾可以被硅酸盐细菌分解，变成可溶性钾离子并被检测出来。

硅酸盐细菌的解钾能力见表1；

表1：硅酸盐细菌的解钾能力

盆栽试验

采集足够土样，自然风干后将其碾碎，过8～10目筛。将等量土壤装入花盆中。将裁剪好的绿萝枝种在花盆土壤中，每盆种4～6棵。取培养好的发酵液和无菌水各20～30ml,各自施入对应的花盆中，留一个花盆不施加菌液作为对照组。每天对绿萝苗进行灌溉等管理，其他条件不变。20～25d后观察绿萝苗的生长情况，并作出记录。

绿萝盆栽试验中，与空白组相比，K4的促生作用最为明显。K3的株高与空白组无显著差异，其他三组的株高和根长明显高于对照组。硅酸盐细菌对绿萝的促生作用见表2；

表2:硅酸盐细菌对绿萝的促生作用

Claims (1)

1.一种以餐厨垃圾为基质培养硅酸盐细菌的方法，其特征在于，餐厨垃圾干燥后作为培养基的碳源和氮源使用；包括以下步骤：

(1)餐厨垃圾的预处理

将餐厨垃圾沥干水，挑除垃圾中的杂质，置于搅拌机内混匀，使用离心机进行脱水至含水量10～20％，之后置于烘干箱内120℃～150℃烘干10～15min，将干燥后的垃圾置于粉碎机内粉碎至40～60目，得到餐厨垃圾粉，备用；

(2)液体发酵培养基的制备

a.制备活化、纯化硅酸盐细菌菌种

b.硅酸盐细菌种子液的制备

c.餐厨垃圾液体发酵培养基的制备

①按比例称取餐厨垃圾干粉15～20g，豆粕7～10g，钾长石粉3～5g，NaCl 1～3g，MgSO4·7H2O 0.5～2g，FeCl₃ 0.005～0.02g，蒸馏水1～1.5L，将蒸馏水倒入锅中，小火烧开，依次将药品倒入锅内，加热并不断搅拌，直到所有药品彻底溶于水中制得液体培养基；

②液体培养基的进一步处理，将熬好的液体培养基先经纱布粗过滤取滤液，然后在转速为1000～3000r/min下离心5～10min，取上清液发酵培养基，然后将所得培养基倒入250mL锥形瓶中，塞上棉塞并用纸包好，将其置于高压蒸汽灭菌锅中，在121～130℃温度下灭菌30～60min制得餐厨垃圾液体发酵培养基，备用；

③接种，在无菌条件下，按1：100比例将硅酸盐细菌种子液接种于灭菌后的餐厨垃圾液体发酵培养基中，将接种后的培养基置于恒温摇床上，在25～30℃，180～200r/min条件下培养36～48h。