CN109211817A - 一种基于微量法的辅酶a含量测定试剂盒及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于微量法的辅酶A含量测定试剂盒及其方法，该试剂盒的组分包括由Tris‑HCl、巯基乙醇、PMSF和甘油组成的试剂一，由Tris‑HCl和水组成的试剂二，由MgCl2、酮戊二酸、鱼藤酮和TPP组成的试剂三，由NAD组成的试剂四，由α‑酮戊二酸脱氢酶组成的试剂五。该方法的原理为α‑酮戊二酸脱氢酶可催化辅酶A、α‑酮戊二酸和NAD+生成琥珀酰辅酶A、二氧化碳和NADH，NADH在340 nm有特征吸收峰，在反应体系中加入α‑KGDH、α‑酮戊二酸和NAD+，辅酶A含量和NADH的生成速率成正比。本发明具有适用范围广泛，检测灵敏度高，检测时间短，试剂用量少，成本极低的优点。
Description
技术领域
本发明属于生命科学领域，具体涉及一种基于微量法的辅酶A含量测定试剂盒及其方法。
背景技术
辅酶A是生物体内转酰酶和α-酮戊二酸脱氢酶的辅酶，对糖的分解、脂肪酸的合成和分解、氨基酸的代谢等多种生化反应起重要作用。辅酶A在临床上主要用于脂类代谢异常引起的疾病和其他疾病的辅助治疗。
目前市面上已有的辅酶A含量测定方法为高效液相色谱法，该方法的缺点在于：1、对仪器设备的要求较高，2、所用流动相较高浓度的磷酸盐对色谱柱的损耗较高，3、不能适用于动物、植物和微生物等多种样本的辅酶A的检测，4、单个样本检测时间太长，5、最低检测限不够低。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明旨在提供一种基于微量法的辅酶A含量测定试剂盒及其方法，具有适用性广泛，灵敏度高，检测时间短，药剂用量小等特点。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
一种基于微量法的辅酶A含量测定试剂盒，包括以下试剂：
试剂一，液体100mL×1瓶，由Tris-HCl缓冲溶液、巯基乙醇、PMSF和甘油组成，置于100mL容量瓶中， 4℃保存；
试剂二，液体20mL×1瓶，由Tris-HCl缓冲溶液和水组成，置于20mL容量瓶中，4℃保存；
试剂三，粉剂×1瓶，由MgCl2、α-酮戊二酸、鱼藤酮和TPP组成，置于1.5mL EP管中，-20℃保存；
试剂四，粉剂×1支，由NAD组成，置于1.5mL EP管中，-20℃保存；
试剂五，粉剂×1支，由α-酮戊二酸脱氢酶组成，置于1.5mL EP管中，-20℃保存。
进一步的，所述试剂一中含有的Tris-HCl缓冲溶液的物质的量浓度为50mM，pH为7.5，体积为100mL，巯基乙醇的体积为74uL，PMSF的物质的量浓度为100mM，体积为1mL，甘油的体积为 5mL。
进一步的，所述试剂二中含有的Tris-HCl缓冲溶液的物质的量浓度为50mM ，体积为16.2mL， pH为7.4，水的体积为3.8mL。
进一步的，所述试剂三中含有的MgCl2的质量为4.2mg，α-酮戊二酸的质量为3mg，鱼藤酮的质量为4mg，TPP的质量为2mg。
进一步的，所述试剂四中含有的NAD的质量为23mg。
进一步的，所述试剂五中含有的α-酮戊二酸脱氢酶的酶活力为2500U/mg，质量为0.4mg。
一种利用上述试剂盒的基于微量法的辅酶A含量测定方法，具体步骤如下：
步骤1 仪器和用品的准备；
准备紫外分光光度计或酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿或96孔板、研钵、冰和蒸馏水；
步骤2 样本的前处理；
1）细菌或培养细胞的前处理：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；然后按比例加入试剂一，超声波破碎细菌或细胞；最后在离心率8000g，4℃下离心10min，取上清，置冰上待测；
2）组织的前处理：
先称取组织；然后按照比例加入试剂一，进行冰浴匀浆；最后在离心率8000g，4℃下离心10min，取上清，置冰上待测
步骤3 将分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零；
步骤4 样本测定；
1）工作液的配制，临用前将试剂三、试剂四、试剂五转移到试剂二中充分溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min，现配现用；
2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本和190μL所述工作液，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值A1和 2min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1；
步骤5 辅酶A含量的计算；
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
标准条件下测定的回归方程为y = 7.038x - 0.007；
其中，x为标准品浓度，单位为μmol/mL，y为吸光值，取值为ΔA；
1）按照蛋白浓度计算：
辅酶A含量(nmol/mg prot) = ( (ΔA＋0.007)÷7.038×V1)÷(V1×Cpr)×1000 =142×(ΔA＋0.007)÷Cpr；
2）按照样本质量计算：
辅酶A含量(nmol/g 鲜重) = ( (ΔA＋0.007)÷7.038×V1)÷(W×V1÷V2)×1000 =142×(ΔA＋0.007)÷W；
3）按照细菌或细胞密度计算：
辅酶A含量(nmol/104) = ( (ΔA＋0.007)÷7.038×V1)÷(500×V1÷V2)×1000 =0.284×(ΔA＋0.007)；
b.使用96孔板测定的计算公式如下：
标准条件下测定的回归方程为y = 3.519x - 0.007；
其中，x为标准品浓度，单位为μmol/mL，y为吸光值，取值为ΔA；
1）按照蛋白浓度计算：
辅酶A含量(nmol/mg prot) = ( (ΔA＋0.007)÷3.519×V1)÷(V1×Cpr)×1000 =284×(ΔA＋0.007)÷Cpr；
2）按照样本质量计算：
辅酶A含量(nmol/g 鲜重) = ( (ΔA＋0.007)÷3.519×V1)÷(W×V1÷V2)×1000 =284×(ΔA＋0.007)÷W；
3）按照细菌或细胞密度计算：
辅酶A含量(nmol/104) = ( (ΔA＋0.007)÷3.519×V1)÷(500×V1÷V2)×1000 =0.568×(ΔA＋0.007)；
其中，V1表示加入反应体系中样本体积，且V1 = 0.01mL；
V2表示加入提取液体积，且V2 = 1 mL；
Cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/mL；
W表示样本质量，单位为g；
500表示细胞或细菌总数，代表500万个；
1000表示1μmol/mL=1000nmol/mL。
进一步的，步骤2的1）中，试剂一的加入比例为细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1（建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一）。
进一步的，步骤2的1）中，所述的超声波破碎细菌或细胞的方法为先冰浴样本，然后采用功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次的超声条件超声破碎样本。
进一步的，步骤2的2）中，试剂一的加入比例为组织质量（g）：试剂一体积（mL）为1：5~10（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）。
本发明的测定原理为α-酮戊二酸脱氢酶可催化辅酶A、α-酮戊二酸和NAD+生成琥珀酰辅酶A、二氧化碳和NADH，NADH在340 nm有特征吸收峰，在反应体系中加入α-KGDH、α-酮戊二酸和NAD+，辅酶A含量和NADH的生成速率成正比。目前尚未发现有文献和已有发明采用此方法检测辅酶A含量。
本发明的有益效果是：
1、本发明的试剂盒和测定方法适用于动物、植物、微生物和培养细胞等各种样本的辅酶A的检测，适用范围广泛。
2、本发明的试剂盒和测定方法最低检测限为0.2 nmol/mg prot，大大提高了检测灵敏度。
3、本发明的试剂盒和测定方法操作简便，仅需2min即可完成一个样本的测定，大大节约了检测时间。
4、本发明的测定方法的反应体系为200μL，相比于分光光度法的3mL反应体系，大大缩小了试剂用量，成本极低。
5、本发明的测定方法的重复性较好，变异系数(CV值)在2％以内。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明。本发明的具体实施方式由以下实施例详细给出。
具体实施方式
下面将结合实施例，来详细说明本发明。
一种基于微量法的辅酶A含量测定试剂盒，包括以下试剂：
试剂一，液体100mL×1瓶，由100mL PH7.5 50mM Tris-HCl缓冲溶液，74uL 巯基乙醇，1mL 100mM PMSF和5mL甘油组成，置于100mL容量瓶中， 4℃保存；
试剂二，液体20mL×1瓶，由16.2mL pH 7.4 50mM Tris-HCl缓冲溶液和3.8mL水组成，置于20mL容量瓶中，4℃保存；
试剂三，粉剂×1瓶，由4.2mg MgCl2，3mg 酮戊二酸，4mg鱼藤酮和2mg TPP组成，置于1.5mL EP管中，-20℃保存；
试剂四，粉剂×1支，由23mg NAD组成，置于1.5mL EP管中，-20℃保存；
试剂五，粉剂×1支，由0.4mg 2500U/mg的α-酮戊二酸脱氢酶组成，置于1.5mL EP管中，-20℃保存。
一种利用上述试剂盒的基于微量法的辅酶A含量测定方法，具体步骤如下：
步骤1 仪器和用品的准备；
准备紫外分光光度计或酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿或96孔板、研钵、冰和蒸馏水；
步骤2 样本的前处理；
1）细菌或培养细胞的前处理：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；然后按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例加入试剂一（建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一），超声波破碎细菌或细胞（先冰浴，然后采用功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；最后在离心率8000g，4℃下离心10min，取上清，置冰上待测；
2）组织的前处理：
先称取组织；然后按照按组织质量（g）：试剂一体积（mL）为1：5~10的比例加入试剂一（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一），进行冰浴匀浆；最后在离心率8000g，4℃下离心10min，取上清，置冰上待测
步骤3 将分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零；
步骤4 样本测定；
1）工作液的配制，临用前将试剂三、试剂四、试剂五转移到试剂二中充分溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min，现配现用；
2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本和190μL所述工作液，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值A1和2min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1；
步骤5 辅酶A含量的计算；
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
标准条件下测定的回归方程为y = 7.038x - 0.007；
其中，x为标准品浓度，单位为μmol/mL，y为吸光值，取值为ΔA；
1）按照蛋白浓度计算：
辅酶A含量(nmol/mg prot) = ( (ΔA＋0.007)÷7.038×V1)÷(V1×Cpr)×1000 =142×(ΔA＋0.007)÷Cpr；
2）按照样本质量计算：
辅酶A含量(nmol/g 鲜重) = ( (ΔA＋0.007)÷7.038×V1)÷(W×V1÷V2)×1000 =142×(ΔA＋0.007)÷W；
3）按照细菌或细胞密度计算：
辅酶A含量(nmol/104) = ( (ΔA＋0.007)÷7.038×V1)÷(500×V1÷V2)×1000 =0.284×(ΔA＋0.007)；
b.使用96孔板测定的计算公式如下：
标准条件下测定的回归方程为y = 3.519x - 0.007；
其中，x为标准品浓度，单位为μmol/mL，y为吸光值，取值为ΔA；
1）按照蛋白浓度计算：
辅酶A含量(nmol/mg prot) = ( (ΔA＋0.007)÷3.519×V1)÷(V1×Cpr)×1000 =284×(ΔA＋0.007)÷Cpr；
2）按照样本质量计算：
辅酶A含量(nmol/g 鲜重) = ( (ΔA＋0.007)÷3.519×V1)÷(W×V1÷V2)×1000 =284×(ΔA＋0.007)÷W；
3）按照细菌或细胞密度计算：
辅酶A含量(nmol/104) = ( (ΔA＋0.007)÷3.519×V1)÷(500×V1÷V2)×1000 =0.568×(ΔA＋0.007)；
其中，V1表示加入反应体系中样本体积，且V1 = 0.01mL；
V2表示加入提取液体积，且V2 = 1 mL；
Cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/mL；
W表示样本质量，单位为g；
500表示细胞或细菌总数，代表500万个；
1000表示1μmol/mL=1000nmol/mL。
上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种基于微量法的辅酶A含量测定试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：
试剂一，液体100mL×1瓶，由Tris-HCl缓冲溶液、巯基乙醇、PMSF和甘油组成，置于100mL容量瓶中， 4℃保存；
试剂二，液体20mL×1瓶，由Tris-HCl缓冲溶液和水组成，置于20mL容量瓶中，4℃保存；
试剂三，粉剂×1瓶，由MgCl2、α-酮戊二酸、鱼藤酮和TPP组成，置于1.5mL EP管中，-20℃保存；
试剂四，粉剂×1支，由NAD组成，置于1.5mL EP管中，-20℃保存；
试剂五，粉剂×1支，由α-酮戊二酸脱氢酶组成，置于1.5mL EP管中，-20℃保存。
2.根据权利要求1所述的基于微量法的辅酶A含量测定试剂盒，其特征在于：所述试剂一中含有的Tris-HCl缓冲溶液的物质的量浓度为50mM，pH为7.5，体积为100mL，巯基乙醇的体积为74uL，PMSF的物质的量浓度为100mM，体积为1mL，甘油的体积为 5mL。
3.根据权利要求1所述的基于微量法的辅酶A含量测定试剂盒，其特征在于：所述试剂二中含有的Tris-HCl缓冲溶液的物质的量浓度为50mM ，体积为16.2mL， pH为7.4，水的体积为3.8mL。
4.根据权利要求1所述的基于微量法的辅酶A含量测定试剂盒，其特征在于：所述试剂三中含有的MgCl2的质量为4.2mg，α-酮戊二酸的质量为3mg，鱼藤酮的质量为4mg，TPP的质量为2mg。
5.根据权利要求1所述的基于微量法的辅酶A含量测定试剂盒，其特征在于：所述试剂四中含有的NAD的质量为23mg。
6.根据权利要求1所述的基于微量法的辅酶A含量测定试剂盒，其特征在于：所述试剂五中含有的α-酮戊二酸脱氢酶的酶活力为2500U/mg，质量为0.4mg。
7.一种利用如权利要求1所述的试剂盒的基于微量法的辅酶A含量测定方法，其特征在于，具体步骤如下：
步骤1 仪器和用品的准备；
准备紫外分光光度计或酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿或96孔板、研钵、冰和蒸馏水；
步骤2 样本的前处理；
细菌或培养细胞的前处理：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；然后按比例加入试剂一，超声波破碎细菌或细胞；最后在离心率8000g，4℃下离心10min，取上清，置冰上待测；
组织的前处理：
先称取组织；然后按照比例加入试剂一，进行冰浴匀浆；最后在离心率8000g，4℃下离心10min，取上清，置冰上待测；
步骤3 将分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零；
步骤4 样本测定；
工作液的配制，临用前将试剂三、试剂四、试剂五转移到试剂二中充分溶解，置于37℃或25℃水浴10min，现配现用；
在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本和190μL所述工作液，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值A1和 2min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1；
步骤5 辅酶A含量的计算；
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
标准条件下测定的回归方程为y = 7.038x - 0.007；
其中，x为标准品浓度，单位为μmol/mL，y为吸光值，取值为ΔA；
1）按照蛋白浓度计算：
辅酶A含量(nmol/mg prot) = ( (ΔA＋0.007)÷7.038×V1)÷(V1×Cpr)×1000 =142×(ΔA＋0.007)÷Cpr；
2）按照样本质量计算：
辅酶A含量(nmol/g 鲜重) = ( (ΔA＋0.007)÷7.038×V1)÷(W×V1÷V2)×1000 =142×(ΔA＋0.007)÷W；
3）按照细菌或细胞密度计算：
辅酶A含量(nmol/104) = ( (ΔA＋0.007)÷7.038×V1)÷(500×V1÷V2)×1000 =0.284×(ΔA＋0.007)；
其中，V1表示加入反应体系中样本体积，且V1 = 0.01mL；
V2表示加入提取液体积，且V2 = 1 mL；
Cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/mL；
W表示样本质量，单位为g；
500表示细胞或细菌总数，代表500万个；
1000表示1μmol/mL=1000nmol/mL；
b.使用96孔板测定的计算公式如下：
标准条件下测定的回归方程为y = 3.519x - 0.007；
其中，x为标准品浓度，单位为μmol/mL，y为吸光值，取值为ΔA；
1）按照蛋白浓度计算：
辅酶A含量(nmol/mg prot) = ( (ΔA＋0.007)÷3.519×V1)÷(V1×Cpr)×1000 =284×(ΔA＋0.007)÷Cpr；
2）按照样本质量计算：
辅酶A含量(nmol/g 鲜重) = ( (ΔA＋0.007)÷3.519×V1)÷(W×V1÷V2)×1000 =284×(ΔA＋0.007)÷W；
3）按照细菌或细胞密度计算：
辅酶A含量(nmol/104) = ( (ΔA＋0.007)÷3.519×V1)÷(500×V1÷V2)×1000 =0.568×(ΔA＋0.007)；
其中，V1表示加入反应体系中样本体积，且V1 = 0.01mL；
V2表示加入提取液体积，且V2 = 1 mL；
Cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/mL；
W表示样本质量，单位为g；
500表示细胞或细菌总数，代表500万个；
1000表示1μmol/mL=1000nmol/mL。
8.根据权利要求7所述的基于微量法的辅酶A含量测定方法，其特征在于：步骤2的1）中，试剂一的加入比例为细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1。
9.根据权利要求7所述的基于微量法的辅酶A含量测定方法，其特征在于：步骤2的1）中，所述的超声波破碎细菌或细胞的方法为先冰浴样本，然后采用功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次的超声条件超声破碎样本。
10.根据权利要求7所述的基于微量法的辅酶A含量测定方法，其特征在于：步骤2的2）中，试剂一的加入比例为组织质量（g）：试剂一体积（mL）为1：5~10。
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