CN109207548B - 一种花生衣低聚原花色素、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种花生衣低聚原花色素、其制备方法及应用，属于天然产物制备的技术领域。本发明的花生衣低聚原花色素由花生衣经微生物发酵，微波辅助提取后，富集而得；所述微生物发酵为酿酒酵母与枯草芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉中的一种进行复合微生物发酵。本发明采用混菌发酵的方式，对花生衣的原花色素进行降解，所得低聚原花色素的抗氧化活性显著提高；本发明制备低聚原花色素的方法易于操作、省时高效，低聚原花色素得率得到有效提高。

Description

一种花生衣低聚原花色素、其制备方法及应用
技术领域
本发明属于天然产物制备的技术领域，具体涉及一种花生衣低聚原花色素、其制备方法及应用。
背景技术
原花色素是一类黄烷-3-醇单体聚合而成的多酚类化合物，是植物次生代谢产物类黄酮类物质中的一种，广泛存在于诸如葡萄、山楂、银杏、花生、大麦等各种植物的核、皮或籽等部位。这些植物来源的原花色素因其具备抗氧化、增强免疫力、抗癌、抗炎、抑菌、降脂降压等多种生理活性而被广泛应用于食品、保健品、医药、化学品、纺织等工业领域中，具有重要的应用价值和经济效益。
然而，原花色素的功能与其结构中单体的聚合程度密切相关。天然的原花色素多为高聚物，分子量较大，具有空间位阻效应，阻碍了其通过生物膜，从而制约了高聚体原花色素生物活性的有效发挥，相反，具有较小分子量的低聚原花色素则呈现更高的生物活性。目前，低聚原花色素的获得方式主要通过化学法或超声波降解原花色素的高聚体，从而制备得到活性较高的原花色素产品。其中，化学法是目前最常用的方法。
化学法降解原花色素高聚体主要包括催化氢解法和酸降解法。催化氢解法是通过向反应体系中添加诸如重铬酸钾、高锰酸钾、氯酸钾等强氧化剂，同时外加氢气在高压条件下断裂多聚原花色素中结构单元之间的C4-C8键，从而将多聚原花色素降解为低聚体或单体。酸降解法则是采用苄硫醇或间苯三酚等亲和试剂存在的酸性条件下，利用原花色素C环的醚键相对不稳定、易发生开环反应的特性，将单元间C-C键断开形成低聚原花色素。然而，传统的化学法降解原花色素单体间的C-C键时，降解程度不易控制，并且，单体原花色素的活性在酸降解过程中会遭到破坏。因此，开发微生物降解原花色素的制备方法不仅可以弥补化学降解法的缺陷，而且微生物降解高聚原花色素的安全性和降解效果更明显。
发明内容
本发明的目的在于提供一种花生衣低聚原花色素、其制备方法及应用；本发明的花生衣低聚原花色素有效成分和安全性高且具有高抗氧化活性及广谱抑菌性，能够作为保健品、化妆品、医药、农药等的有效添加成分。本发明花生衣低聚原花色素的制备方法操作简单，易于工业化生产，环境污染小，低聚原花色素的得率高、安全绿色。
为了达到上述目的，本发明的技术方案为：
一种花生衣低聚原花色素由花生衣经微生物发酵，微波辅助提取后，富集而得。
在上述方案的基础上，所述微生物发酵为酿酒酵母与枯草芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉中的一种进行复合微生物发酵。
在上述方案的基础上，所述酿酒酵母的接种量为5～7％；所述枯草芽孢杆菌的接种量为2～4％，所述黑曲霉的接种量为2～4％；所述米曲霉的接种量为2～4％。
在上述方案的基础上，采用酿酒酵母与枯草芽孢杆菌进行复合微生物发酵。
在上述方案的基础上，发酵培养条件为：30～34℃，转速160～180r·min-1，发酵培养25～30h。
在上述方案的基础上，所述微波辅助提取的条件为：50～55℃，400～800W，40～70s。
一种花生衣低聚原花色素的制备方法，步骤如下：
(1)花生衣经清洗、烘干、粉碎后，与水混合，灭菌；
(2)向花生衣中添加5～7％酿酒酵母和2～4％枯草芽孢杆菌；
(3)30～34℃，转速160～180r·min-1，发酵培养25～30h；
(4)发酵结束后，微波辅助提取低聚原花色素，微波辅助提取的条件为：50～55℃，400～800W，40～70s；
(5)富集低聚原花色素。
在上述方案的基础上，所述花生衣与水混合的质量体积比为1:40～60。
在上述方案的基础上，所述富集低聚原花色素是将步骤4)中的提取液置于真空抽滤器中，并选用0.22μm的有机相微孔滤膜进行抽滤，抽滤后收集滤液，用截留分子量为3000Da的滤膜对滤液进行超滤，超滤透过液经纳滤后收集截留液，截留液经冷冻干燥得低聚原花色素干粉。
上述方法制备得到的花生衣低聚原花色素。
上述花生衣低聚原花色素在食品、化妆品、农药、医药、饲料方面的应用。
本发明的有益效果：
本发明采用混菌发酵的方式，对花生衣的原花色素进行降解，所得低聚原花色素的抗氧化活性显著提高，与同批次的普通花生衣原花色素提取液相比，低聚原花色素清除DPPH自由基和羟自由基的能力提高13.54％，铁还原能力提高了16.65％，且铁还原能力与VC相当。本发明使用的培养条件有助于酿酒酵母和枯草芽孢杆菌混菌发酵花生衣，提高二者的协同发酵性能，从而更有效地降解花生衣中高聚原花色素。本发明为低聚原花色素的制备提供了技术平台，也为花生活性物质的工业化及应用奠定了基础。
本发明的另一个有益效果是采用发酵与提取同步进行的低聚原花色素制备工艺，实现了操作高效、省时、简单可行的目的，与未经发酵的直接采用60％乙醇溶液浸提的低聚原花色素提取率相比，低聚原花色素提取率提高了3％。
采用超滤纳滤结合的工艺有效提高了所得液体中低聚原色素的含量，达到了富集的目的。所得低聚原色素溶液有效成分高，除了抗氧化活性显著提高外，还能够有效抑制大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、黑曲霉、米曲霉、黄曲霉、赭曲霉、尖孢镰刀菌和厚垣孢镰刀菌等多种细菌和真菌的生长，为其在食品、保健品、医药、化妆品、农药、饲料中的应用奠定了基础。
附图说明
图1低聚原花色素的抑菌性。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、米曲霉、黑曲霉均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号依次是CICC 10732、CICC 1012、CICC 2014、CICC 2041。
实施例1
酿酒酵母菌悬液的制备：取-80℃下20％甘油保藏的菌液，以1％接种量接种于YPD液体培养基中，30℃、转速为160r/min的摇床中培养24h，此时发酵液中酿酒酵母活菌数为5.5×108-9CFU/mL。
枯草芽孢杆菌菌悬液的制备：取-80℃下20％甘油保藏的菌液，以1％接种量接种于LB液体培养基中，35℃、转速为180r/min的摇床中培养12h，此时发酵液中枯草芽孢杆菌活菌数为1.1×1010-12CFU/mL。
花生衣经清洗、烘干、粉碎后，与水按质量体积比1:40混合，依次按照5％和4％的接种量(v/v)添加酿酒酵母和枯草芽孢杆菌的菌液。接种后的花生衣混合物于32℃条件下于转速为160～180r/min的摇床中发酵培养26h。发酵结束后，发酵液置于55℃、微波辅助提取600W的条件下50s。提取物置于真空抽滤器中，并选用0.22μm的有机相微孔滤膜进行抽滤，抽滤后收集滤液，选用截留分子量为3000Da的滤膜对滤液进行超滤，透过液经纳滤后收集截留液，经冷冻干燥的低聚原花色素干粉。
该方法中低聚原花色素提取率为7.7％，所得低聚原花色素对DPPH自由基和羟自由基清除能力的IC50分别为22.26μg/mL和24.31μg/mL，即当清除50％的DPPH自由基和羟自由基时，所需低聚原花色素的浓度分别为22.26μg/mL和24.31μg/mL；浓度为10μg/mL的低聚原花色素溶液与浓度为9.68μg/mL的VC溶液的铁还原力相当。
按0.5mg/mL的浓度将原花色素冻干粉溶于水，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉具有明显的抑制作用，其抑菌圈大小依次为11.92±0.37mm、9.06±0.34mm、8.01±0.31mm。当原花色素冻干粉的浓度增加至2.0mg/mL时，对酿酒酵母的抑菌圈大小为12.29±0.52mm；由菌体形态可知，该浓度下的原花色素溶液对黄曲霉的、赭曲霉、尖孢镰刀菌、厚垣孢镰刀菌液具有一定的抑制作用(如图1所示)
一、低聚原花色素对微生物生物抑制作用
1、菌株及培养条件：
大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的培养：以1％接种量接种于LB液体培养基中，37℃、转速为200r/min的摇床中培养12h。在超净工作台中吸取200μL菌悬液于50mL无菌的0.9％的生理盐水中混匀，吸取300μL菌悬液用一次性L型涂布棒涂布于LB固体培养基中，于超净台中晾干。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的培养：以1％接种量接种于YPD液体培养基中，34℃、转速为200r/min的摇床中培养24h。在超净工作台中吸取200μL菌悬液于50mL无菌的0.9％的生理盐水中混匀，吸取300μL菌悬液用一次性L型涂布棒涂布于PDA固体培养基中，于超净台中晾干。
米曲霉(Aspergillus oryzae)、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、产毒黄曲霉(Aspergillusflavus-TO)的培养：在PDA固体斜面培养基上划线静置培养，培养温度30℃，培养时间2-3天。用1mL无菌枪头挑取菌丝体点板于PDA固体培养基平板划分的区域中。
黑曲霉(Aspergillus niger)、厚垣孢镰刀菌(Fusarium chlamydosporum)的培养：在PDA固体斜面培养基上划线静置培养，培养温度28℃，培养时间2-3天。用1mL无菌枪头挑取菌丝体点板于PDA固体培养基平板划分的区域中。
其中，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、黑曲霉、米曲霉、黄曲霉、赭曲霉均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号依次是CICC 10220、CICC 10732、CICC 1012、CICC 2041、CICC 2014、CICC 2090、CICC 41473，尖孢镰刀菌和厚垣孢镰刀菌分别由山东省花生研究所育种和植保研究室提供。
牛津杯法测定抑菌圈：
将灭菌烘干的牛津杯竖直放置在上述含菌培养基表面，每个平板放置5个牛津杯，在牛津杯中加入等量的不同浓度(0.1mg/mL、0.5mg/mL、2.0mg/mL)的低聚原花色素，以无菌水作空白对照，盖上平皿盖，置于培养箱中静置培养，观察抑菌圈。
为了更加清晰发酵法制备所得低聚原花色素的功能性质及其应用前景，采用牛津杯法考察了实施例1所得低聚原花色素对大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A.oryzae)、黄曲霉(A.flavus-TO)、赭曲霉(A.ochraceus)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、厚垣孢镰刀菌(F.chlamydosporum)的抑菌性，如图1所示。
当低聚原花色素浓度为100μg/mL时，能够抑制E.coli和B.subtilis，但其余真菌未受到抑制，表明低浓度的低聚原花色素可以抑制受试细菌的生长；当低聚原花色素浓度为500μg/mL时，其对E.coli和B.subtilis的抑制效果更为明显，并且对A.niger和A.oryzae也略有抑制；当低聚原花色素浓度继续增加至2mg/mL时，S.cerevisiae、A.flavus-TO、A.ochraceus、F.oxysporum、F.chlamydosporum的生长也出现轻度的抑制，并且这五株真菌在随着低聚原花色素浓度增加的过程中，其生长呈现出逐渐被抑制的趋势；此外，抑菌性的鉴定进一步揭示制备低聚原花色素的发酵菌株B.subtilis、S.cerevisiae、A.niger和A.oryzae受到了花生衣降解产物的胁迫，它们对降解产物的耐受能力不同，而混菌发酵的方式能够增强菌株间的协同性，增强彼此的抗性。
实施例2
酿酒酵母菌悬液的制备：取-80℃下20％甘油保藏的菌液，以1％接种量接种于YPD液体培养基中，30℃、转速为160r/min的摇床中培养24h，此时发酵液中酿酒酵母活菌数为5.5×108-9CFU/mL。
黑曲霉(Aspergillus niger)的培养：在PDA固体斜面培养基上划线静置培养，培养温度28℃，培养时间2-3天。用灭菌的去离子水洗下培养基表面的孢子粉，制成孢子含量为106个/mL的孢子悬液用于接种。
花生衣经清洗、烘干、粉碎后，与水按质量体积比1:40混合，依次按照7％和3％的接种量(v/v)添加酿酒酵母和黑曲霉的菌液，接种后的花生衣混合物于30℃的条件下于转速为160～180r/min的摇床中发酵培养28h。发酵结束后，发酵液置于50℃条件下微波辅助提取600W 57s。提取液置于真空抽滤器中，并选用0.22μm的有机相微孔滤膜进行抽滤，抽滤后收集滤液，选用截留分子量为3000Da的滤膜对滤液进行超滤，透过液经纳滤后收集截留液，经冷冻干燥的低聚原花色素干粉。
该方法中低聚原花色素提取率为6.7％，所得低聚原花色素对DPPH自由基和羟自由基清除能力的IC50分别为27.13μg/mL和28.22μg/mL，即当清除50％的DPPH自由基和羟自由基时，所需低聚原花色素的浓度分别为27.13μg/mL和28.22μg/mL；浓度为10μg/mL的低聚原花色素溶液与浓度为7.86μg/mL的VC溶液的铁还原力相当；按0.5mg/mL的浓度将原花色素冻干粉溶于水，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉具有明显的抑制作用，其抑菌圈大小依次为10.92±0.56mm、8.96±0.45mm、7.81±0.38mm。
实施例3
酿酒酵母菌悬液的制备：取-80℃下20％甘油保藏的菌液，以1％接种量接种于YPD液体培养基中，30℃、转速为160r/min的摇床中培养24h，此时发酵液中酿酒酵母活菌数为5.5×108-9CFU/mL。
米曲霉(Aspergillus oryzae)的培养：在PDA固体斜面培养基上划线静置培养，培养温度30℃，培养时间2-3天。用灭菌的去离子水洗下培养基表面的孢子粉，制成孢子含量为106个/mL的孢子悬液用于接种。
花生衣清洗，花生衣经清洗、烘干、粉碎后，与水按质量体积比1:40混合，依次按照7％和4％的接种量(v/v)添加酿酒酵母和米曲霉的菌液，接种后的花生衣混合物于30℃的条件下于转速为160～180r/min的摇床中发酵培养30h。发酵结束后，发酵液置于55℃条件下微波处理功率600W 60s。提取液置于真空抽滤器中，并选用0.22μm的有机相微孔滤膜进行抽滤，抽滤后收集滤液，选用截留分子量为3000Da的滤膜对滤液进行超滤，透过液经纳滤后收集截留液，经冷冻干燥的低聚原花色素干粉。
该方法中低聚原花色素提取率为6.5％，所得低聚原花色素对DPPH自由基和羟自由基清除能力的IC50分别为30.44μg/mL和31.35μg/mL，即当清除50％的DPPH自由基和羟自由基时，所需低聚原花色素的浓度分别为30.44μg/mL和31.35μg/mL；浓度为10μg/mL的低聚原花色素溶液与浓度为7.43μg/mL的VC溶液的铁还原力相当；按0.5mg/mL的浓度将原花色素冻干粉溶于水，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉具有明显的抑制作用，抑菌圈大小依次为9.97±0.51mm、8.46±0.41mm、7.69±0.34mm。
对比例1
花生衣经清洗、烘干、粉碎后，与水按质量体积比1:40混合，添加酿酒酵母菌液，酿酒酵母的接种量为7％，接种后的花生衣混合物于32℃条件下于转速为160～180r/min的摇床中发酵培养26h。发酵结束后，发酵液置于55℃条件下微波辅助提取50s，微波功率为600W。提取液置于真空抽滤器中，并选用0.22μm的有机相微孔滤膜进行抽滤，抽滤后收集滤液，选用截留分子量为3000Da的滤膜对滤液进行超滤，透过液经纳滤后收集截留液，经冷冻干燥的低聚原花色素干粉。
该方法中低聚原花色素提取率为6.2％，所得低聚原花色素对DPPH自由基和羟自由基清除能力的IC50分别为36.78μg/mL和37.25μg/mL，即当清除50％的DPPH自由基和羟自由基时，所需低聚原花色素的浓度分别为36.78μg/mL和37.25μg/mL；浓度为10μg/mL的原花色素溶液与浓度为6.64μg/mL的VC溶液的铁还原力相当；按0.5mg/mL的浓度将原花色素冻干粉溶于水，此时对大肠杆菌具有明显的抑制作用，抑菌圈大小为9.36±0.39mm。
对比例2
花生衣经清洗、烘干、粉碎后，与水按质量体积比1:40混合，依次按照5％和4％的接种量(v/v)添加酿酒酵母和枯草芽孢杆菌的菌液。接种后的花生衣混合物于32℃条件下于转速为160～180r/min的摇床中发酵培养26h。发酵结束后，发酵液置于真空抽滤器中，并选用0.22μm的有机相微孔滤膜进行抽滤，抽滤后收集滤液，选用截留分子量为3000Da的滤膜对滤液进行超滤，透过液经纳滤后收集截留液，经冷冻干燥的低聚原花色素干粉。
该方法中低聚原花色素提取率为5.9％，所得低聚原花色素对DPPH自由基和羟自由基清除能力的IC50分别为35.86μg/mL和36.53μg/mL，即当清除50％的DPPH自由基和羟自由基时，所需低聚原花色素的浓度分别为35.86μg/mL和36.53μg/mL；浓度为10μg/mL的原花色素溶液与浓度为6.61μg/mL的VC溶液的铁还原力相当；按0.5mg/mL的浓度将原花色素冻干粉溶于水，此时对大肠杆菌具有明显的抑制作用，抑菌圈大小为9.31±0.37mm。
对比例3
花生衣经清洗、烘干、粉碎后，与水按质量体积比1:40混合，置于55℃条件下微波辅助提取50s，微波功率为600W。提取液置于真空抽滤器中，并选用0.22μm的有机相微孔滤膜进行抽滤，抽滤后收集滤液，选用截留分子量为3000Da的滤膜对滤液进行超滤，透过液经纳滤后收集截留液，经冷冻干燥的低聚原花色素干粉。
该方法中原花色素提取率为4.9％，所得原花色素对DPPH自由基和羟自由基清除能力的IC50分别为42.99μg/mL和44.46μg/mL，即当清除50％的DPPH自由基和羟自由基时，所需低聚原花色素的浓度分别为42.99μg/mL和44.46μg/mL；浓度为10μg/mL的低聚原花色素溶液与浓度为5.84μg/mL的VC溶液的铁还原力相当；按0.5mg/mL的浓度将原花色素冻干粉溶于水，此时对大肠杆菌具有抑制作用，抑菌圈大小为8.22±0.17mm。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (2)

1.一种花生衣低聚原花色素的制备方法，其特征在于：步骤如下：
(1)花生衣经清洗、烘干、粉碎后，与水混合，灭菌；
(2)依次按照5％(v/v)和4％(v/v)的接种量添加酿酒酵母和枯草芽孢杆菌的菌液；
(3)32℃，转速160～180r·min-1，发酵培养26h；
(4)发酵结束后，微波辅助提取低聚原花色素，微波辅助提取的条件为：55℃，600W，50s；
(5)富集低聚原花色素；
花生衣与水混合的质量体积比为1:40；
所述酿酒酵母菌液中活菌数为5.5×108-9CFU/mL；所述枯草芽孢杆菌菌液中活菌数为1.1×1010-12CFU/mL；
所述富集低聚原花色素是将步骤4)中的提取液置于真空抽滤器中，并选用0.22μm的有机相微孔滤膜进行抽滤，抽滤后收集滤液，用截留分子量为3000Da的滤膜对滤液进行超滤，超滤透过液经纳滤后收集截留液，截留液经冷冻干燥得低聚原花色素干粉。
2.权利要求1所述方法制备得到的花生衣低聚原花色素。
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