CN109200292B - 具有治疗阿尔茨海默病功效的纳米复合体及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有治疗阿尔茨海默病功效的纳米复合体及其制备方法，该纳米复合体包括由卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、磷脂酸合成的脂质体和脂质体内部包含的具有治疗阿尔茨海默病功效的药物；脂质体表面修饰有聚乙二醇及转铁蛋白。本发明利用Pep63抑制早期阿尔茨海默病患者脑内的ADDLs的神经毒性作用，同时结合磷脂酸对Aβ的亲和作用，针对阿尔茨海默发病的不同病理过程发挥双重协调治疗作用；同时脂质体表面修饰转铁蛋白，使多功能纳米复合体具有脑靶向能力，可以通过血脑屏障进入脑内或在外周发挥治疗作用；且具有高度的安全性、生物相容性，副作用小等优点。

Description

具有治疗阿尔茨海默病功效的纳米复合体及其制备方法与 应用
技术领域
本发明涉及一种具有治疗阿尔茨海默病功效的药物，尤其涉及一种具有治疗阿尔茨海默病功效的纳米复合体及其制备方法与应用，属于药物技术领域。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，简称AD)俗称老年痴呆，是一种常见的原发性退行性脑病，临床常表现为记忆减退，认知功能下降，甚至有精神症状，导致生活不能自理，直接给患者及其家庭带来一定的情感和经济负担，同时增加了医疗卫生行业的压力，也给政府财政造成了沉重的负担。目前仍没有安全有效的药物及治疗手段治愈该疾病，现有药物只能缓解AD症状。
研究证实由数个Aβ单聚体聚集形成的可溶性的寡聚体，即ADDLs在阿尔茨海默病早期的学习记忆减退中发挥重要作用。ADDLs以高度亲和力与受体酪氨酸激酶家族的一员——B2 型产促红细胞生成素肝癌细胞受体(EphB2)的胞外Ⅲ型纤维连接蛋白重复区(FN区)直接结合，并诱导EphB2受体内吞、降解，直接导致EphB2受体的数量减少，干扰了依赖于EphB2 受体的NMDA受体的磷酸化及其膜定位，因此NMDA受体的功能受到严重干扰、突触功能异常，最终导致AD早期认知功能障碍。
Pep63(其氨基酸序列为VFQVRARTVA)是一种针对ADDLs作用靶点，利用多肽阵列方法设计而成的可以有效抑制ADDLs与EphB2受体的结合的干扰小肽，对阿尔茨海默病具有神经保护作用，但由于分子量大且稳定性差，无法通过血脑屏障发挥作用。
脂质体是一种临床公认的安全性较高的纳米载体，具有稳定性，低毒性，生物相容性，缓释等作用。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，本发明通过大量实验筛选研究制备得到脂质体，然后将药物包裹于脂质体内。本发明在脂质体表面修饰聚乙二醇 PEG，可以躲避网状内皮系统的识别和吞噬而延长脂质体半衰期。并且本发明在脂质体表面修饰转铁蛋白、载脂蛋白、乳铁蛋白等配体可以识别脑血管内皮细胞上的受体，通过生理性的胞转作用进入脑内。其中转铁蛋白受体在脑内皮细胞上表达最为丰富，脑靶向效率高。
负性磷脂如磷脂酸由于多价相互作用对Aβ有高度亲和力，并能促进外周及中枢的吞噬细胞对Aβ的清除。本发明针对ADDLs作用靶点的载神经保护小肽的多功能纳米复合体，结合 Pep63以及负性磷脂的双重治疗作用，同时具有脑靶向能力，取得了非常好的技术效果。
技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为
一种具有治疗阿尔茨海默病功效的纳米复合体，所述纳米复合体包括由卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、磷脂酸合成的脂质体和脂质体内部包含的具有治疗阿尔茨海默病功效的药物；脂质体表面修饰有聚乙二醇及转铁蛋白。本发明可以通过识别脑内皮细胞上的转铁蛋白受体，将治疗作用的药物运载入脑，发挥抑制ADDLs毒性的作用。
作为优选方案，以上所述的具有治疗阿尔茨海默病功效的纳米复合体，具有治疗阿尔茨海默病功效的药物包括具有治疗阿尔茨海默病功效的神经保护性小肽Pep63和其它药物，神经保护性小肽Pep63其氨基酸序列为VFQVRARTVA，该神经保护性小肽Pep63可以改善可溶性Aβ寡聚体的神经毒性作用。
作为优选方案，以上所述的具有治疗阿尔茨海默病功效的纳米复合体，药物与脂质体的质量比为1:10～30。特别优选药物与脂质体的质量比为1:29。
作为优选方案，以上所述的具有治疗阿尔茨海默病功效的纳米复合体，纳米复合体的粒径范围为1-180nm。
本发明采取的技术方案是脂质体原料中加入负性磷脂——磷脂酸，结合磷脂酸吞噬Aβ的作用，合成多重治疗作用的载Pep63纳米复合体。
本发明所述的具有治疗阿尔茨海默病功效的纳米复合体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将卵磷脂，胆固醇，磷脂酸，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧酸溶解于二氯甲烷和甲醇的混合液中，真空旋蒸除去溶剂，得到的脂质薄膜用具有治疗阿尔茨海默病功效的药物溶液水化，在水浴中超声，然后将混合溶液置于透析膜中密闭，于HEPES缓冲溶液中搅拌透析过夜；
(2)次日用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧酸中的羧基，然后再将转铁蛋白与活化的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧酸混合，室温轻柔搅拌孵育过夜，通过二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧酸末端的羧基与转铁蛋白的氨基进行缩合反应而结合为一体；产物用葡聚糖凝胶 G-100过滤，除去未反应产物，产物再用细胞超声仪冰浴处理，最终得到纳米复合体。
作为优选方案，以上所述的具有治疗阿尔茨海默病功效的纳米复合体的制备方法，步骤 (1)卵磷脂，胆固醇，磷脂酸和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧酸的摩尔比为60:20:3:6；二氯甲烷和甲醇的的体积比为2:1。
作为优选方案，以上所述的具有治疗阿尔茨海默病功效的纳米复合体的制备方法，步骤 (1)药物与脂质体的质量比为1:10～30。
作为优选方案，以上所述的具有治疗阿尔茨海默病功效的纳米复合体的制备方法，步骤 (2)中的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、转铁蛋白和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧酸的摩尔比为100:100:1:2。
本发明所述的具有治疗阿尔茨海默病功效的纳米复合体适用性强，可以分散于多种缓冲溶液环境中4℃储存，缓冲溶液包括磷酸盐缓冲液、生理盐水、人工脑脊液，或者通过冻干工艺制备成粉末室温保存。
一种静脉注射剂或者鼻腔给药剂，所述的静脉注射剂或者鼻腔给药剂包含本发明所述的具有治疗阿尔茨海默病功效的纳米复合体。
本发明所述的具有治疗阿尔茨海默病功效的纳米复合体能通过血脑屏障，具有亲和Aβ的作用，在中枢和外周均能发挥治疗作用。
本发明所述脂质体制备方法，采用薄膜水化法，转铁蛋白通过氨基和羧基的缩合反应连接在二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇末端的羧酸上。
有益效果：本发明和现有技术相比具有以下优点：
(1)本发明利用Pep63抑制早期阿尔茨海默病患者脑内的ADDLs的神经毒性作用，同时结合磷脂酸对Aβ的亲和作用，针对阿尔茨海默发病的不同病理过程发挥双重协调治疗作用；
(2)本发明载Pep63的多功能纳米复合体既可以用于阿尔茨海默病的预防，也可应用于阿尔茨海默病患者延缓病理进程及治疗；
(3)本发明利用脂质体递送系统，增加神经保护性小肽Pep63的稳定性，同时具有脂质体药物的缓释作用、纳米药物的表面效应；
(4)脂质体表面修饰转铁蛋白，使多功能纳米复合体具有脑靶向能力，可以通过血脑屏障进入脑内或在外周发挥治疗作用；且具有高度的安全性、生物相容性，副作用小。
附图说明
图1是载Pep63纳米复合体示意图。
图2是载Pep63纳米复合体透射电镜图。
图3是载Pep63多功能纳米复合体稳定性评价的曲线图。
图4是载Pep63多功能纳米复合体对神经元细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞的存活率影响的柱状图。
图5是给小鼠尾静脉注射荧光染料Cy5.5标记的载Pep63多功能纳米复合体后，药物在活体内的分布情况。
图6是给阿尔茨海默病模型小鼠(APP/PS1转基因小鼠)尾静脉注射载Pep63多功能纳米复合体后，水迷宫(Morris Water Maze)行为学结果显示其明显改善模型小鼠(APP/PS1) 空间学习记忆能力情况图。
图7是给阿尔茨海默病模型小鼠(APP/PS1转基因小鼠)尾静脉注射载Pep63多功能纳米复合体后，条件恐惧记忆(Fear Conditoning)实验结果的柱状图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式做详细说明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各自等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
下属实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂、原料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1载Pep63多功能纳米复合体的制备，包括以下步骤：
(1)将卵磷脂Epc，胆固醇Chol，磷脂酸PA，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧酸 DSPE-PEG2000-COOH按摩尔比为60:20:3:6溶解于二氯甲烷和甲醇的混合液中(体积比为 2:1)，真空旋蒸除去溶剂，得到的脂质薄膜用保护性小肽Pep63溶液水化(药脂投料质量比为1:10)，超声(250mM，5mL)水浴5min，将混合溶液置于透析膜(MWCO 3，000Da)中密闭，于HEPES缓冲溶液中(HBS,25mM HEPES,150mM NaCl)搅拌透析过夜。
(2)次日用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(PH 5.5)活化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺PEG羧酸(DSPE-PEG2000-COOH) 中的羧基，再将转铁蛋白Tf与活化的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺PEG羧酸(PH 7.5)混合。 EDC·HCL：NHS：Tf：DSPE-PEG2000-COOH摩尔比为100:100:1:2。室温轻柔搅拌孵育过夜，通过DSPE-PEG2000-COOH末端的羧基与转铁蛋白Tf的氨基进行缩合反应而结合为一体。然后产物用葡聚糖凝胶G-100过滤，除去未反应产物。产物再用细胞超声仪(200w)冰浴处理10min，最终得到载Pep63多功能纳米复合体，其结构如图1所示，于4℃保存。
实施例2载Pep63多功能纳米复合体的表征及稳定性评价。
1、将实施例1制备得到的载Pep63多功能纳米复合体滴于铜网表面5分钟，滤纸小心吸干多余液体，2％醋酸双氧铀负染3分钟，透射电镜观察其形态；动态激光粒度仪(DLS)检测其粒径、电位、聚合物分散性指数(PDI)；高效液相色谱分析HPLC检测Pep63包封率；七天粒径变化情况反映其稳定性。如表1所示，动态激光粒度仪(DLS)检测转铁蛋白修饰的载Pep63纳米复合体(Tf-Pep63-Lip)的平均粒径为116.58±3.97nm，Zeta电位为-5.78±1.10mV，聚合物分散性指数PDI为0.237，均反映该纳米复合体体外性质较稳定。如图2所示，透射电镜(TEM)获得载Pep63纳米复合体(Tf-Pep63-Lip)的图像，大小与DLS检测的粒径一致，形态为纳米级球形颗粒。如图3所示，七天粒径均无明显变化，说明其体外理化性质稳定。
表1多功能纳米复合体粒径及Zeta电位
粒径(d，nm) Zeta电位(mV) PDI
Tf-Pep63-Lip 116.58±3.97 -5.78±1.10 0.237
2、载Pep63多功能纳米复合体的安全性评价
在96孔板中加入100μl细胞悬液，在培养箱中预培养过夜。次日，在孔内分别加入10μl 实施例1制备得到的载Pep63多功能纳米复合体(Tf-Pep63-Lip)及其它对照组(Tf-Lip、 Pep63-Lip、Con)，培养箱中培养4小时后加入10μlCCK-8溶液，2小时后用酶标仪测定在450nm 处的吸光度OD值。细胞存活率＝(实验孔吸光度-空白孔吸光度)/(对照孔吸光度-空白孔吸光度)。如图4所示，与空白对照相比，载Pep63多功能纳米复合体(Tf-Pep63-Lip)脑靶向纳米复合体(Tf-Lip)、载Pep63纳米复合体(Pep63-Lip)对脑组织内的海马细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞的存活率均无明显影响，显示药物安全性较好。
3、载Pep63多功能纳米复合体的脑靶向评价。
将卵磷脂Epc，胆固醇Chol，磷脂酸PA，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧酸DSPE-PEG2000-COOH及荧光标记的DSPE-PEG2000-Cy5.5按摩尔比为60:20:3:3:3溶解于二氯甲烷和甲醇的混合液中，其余同前制备步骤。小鼠尾静脉注射5mg/kgCy5.5标记的实施例1制备得到的载Pep63多功能纳米复合体2小时后用LB983NightOWL-2小动物活体成像仪进行成像分析。图5所示，与尾静脉注射Cy5.5溶液的对照小鼠相比，载Pep63多功能纳米复合体(Tf-Pep63-Lip)在脑内有明显分布。
4、载Pep63多功能纳米复合体对阿尔茨海默病模型小鼠(APP/PS1转基因小鼠)空间学习记忆能力的功效评价。
将饲养至6个月的同窝小鼠按基因型分为WT(野生型，正常对照小鼠)和APP(APP/PS1 转基因型，阿尔茨海默病模型小鼠)组，分别尾静脉注射5mg/kg本发明实施例1制备得到的载Pep63的多功能纳米复合体(Tf-Pep63-Lip)、脑靶向纳米复合体(Tf-Lip)及相同剂量的生理盐水(NS)连续十天，注射后实验者对小鼠均进行抚摸适应。进行实验前，将实验所用小鼠置于行为学房间适应30min。该实验在一个直径1.2米的圆形水池里进行，池中有一平台隐藏在水面以下2厘米处。小鼠在水池中连续接受5天寻找平台的训练，每天4次，每次90s，每次在平台上逗留30s，记录小鼠分别从四个象限不同入水点入水找到平台所需的时间，即上台潜伏期(Latency Time)。4次潜伏期成绩的平均值作为当日最终上台潜伏期进行最后统计。如果小鼠在90s内未找到平台，需引导其找到平台，并在平台上逗留30s，且其潜伏期按90s 计算。第6天进行测试，记录90s内小鼠的游泳轨迹及上台潜伏期。迷宫上方安置带有显示系统的摄像机，计算机自动跟踪计时并记录游泳轨迹，Anymaze软件分析结果。如图6所示，尾静脉注射生理盐水(NS)、脑靶向纳米复合体(Tf-Lip)、载Pep63的多功能纳米复合体 (Tf-Pep63-Lip)的野生型小鼠(WT)上台潜伏期没有明显差异，且较模型小鼠(APP)都能更快找到平台，说明三种剂型对其空间学习记忆没有影响。且与注射生理盐水(NS)对照的模型小鼠(APP)相比，脑靶向纳米复合体(Tf-Lip)及载Pep63的多功能纳米复合体 (Tf-Pep63-Lip)的小鼠均可以减少模型小鼠(APP)的上台潜伏期，改善其空间学习记忆，且载Pep63的多功能纳米复合体(Tf-Pep63-Lip)的改善效果(P＜0.01)较脑靶向纳米复合体(Tf-Lip)更显著(P＜0.05)，说明脑靶向纳米复合体Tf-Lip及治疗药物Pep63均发挥了治疗作用，且两者具有协同治疗的效果。
5、载Pep63多功能纳米复合体对阿尔茨海默病模型小鼠(APP/PS1转基因小鼠)条件恐惧记忆能力的功效评价。
将饲养至6个月的同窝小鼠按基因型分为WT(野生型，正常对照小鼠)和APP(APP/PS1 转基因型，阿尔茨海默病模型小鼠)组，分别尾静脉注射5mg/kg本发明实施例1制备得到的载Pep63的多功能纳米复合体(Tf-Pep63-Lip)、脑靶向纳米复合体(Tf-Lip)及相同剂量的生理盐水(NS)连续十天，注射后实验者对小鼠均进行抚摸适应。进行实验前，将实验所用小鼠置于行为学房间适应30min。场景依赖和声音依赖条件性恐惧记忆在一个自动化系统中进行(Near Infrared(NIR)Video Fear Conditioning)，Video Freeze软件记录并分析结果。训练时小鼠单独暴露于箱体3min，后跟一个30s的声音(10Hz；75dB)和足底电击(2s；0.7mA 恒流)。两名观察者未知实验条件，24h后测试恐惧记忆。置于原箱体环境下3min，运动阈值小于18记为静止(Freeze)，记录静止时间(Freeze Time)占总时间的值，反映场景(Context) 依赖的恐惧记忆；置于一个完全不同的新箱体中，前30s无任何刺激，后30s给予声音刺激 (10Hz；75dB)，运动阈值小于18记为静止(Freeze),记录静止时间(Freeze Time)占总时间的值，反映声音(Tone)依赖的恐惧记忆。如图7所示，尾静脉注射脑靶向纳米复合体(Tf-Lip) 及载Pep63的多功能纳米复合体(Tf-Pep63-Lip)的小鼠均可以减少模型小鼠(APP)情景依赖和声音依赖的恐惧记忆，且载Pep63的多功能纳米复合体(Tf-Pep63-Lip)的改善效果(P ＜0.01)较脑靶向纳米复合体(Tf-Lip)更显著(P＜0.05)，并且三种剂型对野生型小鼠(WT) 的条件恐惧记忆均没有负面影响。说明脑靶向纳米复合体Tf-Lip及治疗药物Pep63均发挥了治疗作用，且两者具有协同治疗的效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理和构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种具有治疗阿尔茨海默病功效的纳米复合体，其特征在于，所述纳米复合体包括由卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、磷脂酸合成的脂质体和脂质体内部包含的具有治疗阿尔茨海默病功效的药物；脂质体表面修饰有聚乙二醇及转铁蛋白；
具有治疗阿尔茨海默病功效的药物为具有治疗阿尔茨海默病功效的神经保护性小肽Pep63，其氨基酸序列为VFQVRARTVA，该神经保护性小肽Pep63具有改善可溶性Aβ寡聚体的神经毒性作用。
2.根据权利要求1所述的具有治疗阿尔茨海默病功效的纳米复合体，其特征在于，药物与脂质体的质量比为1:10~30。
3.根据权利要求1所述的具有治疗阿尔茨海默病功效的纳米复合体，其特征在于，纳米复合体的粒径范围为1-180nm。
4.权利要求1至3任一项所述的具有治疗阿尔茨海默病功效的纳米复合体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将卵磷脂，胆固醇，磷脂酸，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧酸溶解于二氯甲烷和甲醇的混合液中，真空旋蒸除去溶剂，得到的脂质薄膜用具有治疗阿尔茨海默病功效的药物溶液水化，在水浴中超声，然后将混合溶液置于透析膜中密闭，于HEPES缓冲溶液中搅拌透析过夜；
（2）次日用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧酸中的羧基，然后再将转铁蛋白与活化的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧酸混合，室温轻柔搅拌孵育过夜，通过二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧酸末端的羧基与转铁蛋白的氨基进行缩合反应而结合为一体；产物用葡聚糖凝胶G-100过滤，除去未反应产物，再用细胞超声仪冰浴处理，最终得到纳米复合体。
5.根据权利要求4所述的具有治疗阿尔茨海默病功效的纳米复合体的制备方法，其特征在于，步骤（1）卵磷脂，胆固醇，磷脂酸和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧酸的摩尔比为60:20:3:6；二氯甲烷和甲醇的体积比为2:1。
6.根据权利要求4所述的具有治疗阿尔茨海默病功效的纳米复合体的制备方法，其特征在于，步骤（1）药物与脂质体的质量比为1:10~30。
7.根据权利要求4所述的具有治疗阿尔茨海默病功效的纳米复合体的制备方法，其特征在于，步骤（2）中的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、转铁蛋白和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧酸的摩尔比为100:100:1:2。
8.一种静脉注射剂或者鼻腔给药剂，所述的静脉注射剂或者鼻腔给药剂包含权利要求1至3任一项所述的具有治疗阿尔茨海默病功效的纳米复合体。
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