CN109196106A - 腺病毒的热灭活方法 - Google Patents

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Abstract

本发明总体涉及在热灭活期间保护含有AAV颗粒和辅助病毒颗粒的样品中AAV病毒颗粒基因组完整性和/或生物活性的方法。所述方法包括将含有辅助病毒颗粒、AAV颗粒和缓冲液的样品加热到45℃以上的温度。所述缓冲液包括浓度10mM以上的亲液盐和/或浓度10mM以上的二价或三价阳离子。

Description

腺病毒的热灭活方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年3月28日提交的美国临时申请序列号62/314,116的优先权的权益，题为“腺病毒的热灭活方法”，其全部内容通过引用整体并入本文所述。
背景技术
腺相关病毒(AAV)是一种无致病性、有复制缺陷的细小病毒。AAV载体具有许多独特的特征，使得它们作为在基因治疗载体时具有吸引力。具体的，AAV载体能够将治疗基因递送到分裂和非分裂的细胞，并且这些基因可以持续较长时间而不整合到目标细胞的基因组中。然而，为了制备AAV载体，必须提供辅助病毒功能，有时以活性感染病毒诸如腺病毒(AV)的形式提供。为分离出治疗性AAV载体，在AAV载体纯化过程中必须使辅助病毒颗粒失活。然而，常用的辅助病毒灭活方法，例如热灭活，也可导致AAV载体基因组的破坏或降解，从而降低可从灭活过程中恢复的AAV载体的质量和数量。这对较大的AAV载体基因组而言更是如此。因此，需要在本领域开发出一个在辅助病毒灭活过程中保护AAV载体完整性的方法。
发明内容
本发明总体涉及在热灭活时在含有AAV颗粒和辅助病毒颗粒的样品中保护AAV病毒颗粒基因组完整性和/或生物活性的方法。这些方法通常通过对辅助病毒颗粒的影响大于其对AAV颗粒的影响，得以选择性地灭活辅助病毒颗粒。所述方法包括将含有辅助病毒颗粒、AAV颗粒和缓冲液的样品加热到大于或等于45℃的温度。所述缓冲液包括浓度大于等于10mM的亲液盐和/或浓度大于等于10mM的二价或三价阳离子。
所述方法包括将样品加热至大于或等于45℃、大于或等于46℃、大于或等于47℃、大于或等于48℃、大于或等于49℃、大于或等于50℃、或大于或等于51℃的温度。在某些实施例中，样品被加热至45℃和65℃之间、45℃和60℃之间、45℃和55℃之间、47℃和53℃之间、48℃和51℃之间、或48℃和50℃之间的温度。例如，在某些实施例中，样品被加热至48℃和50℃之间、或至48℃或49℃。
加热样品的时间可以变化。例如，在某些实施例中，样品加热至目标温度1分钟到6小时之间，诸如10至180分钟之间、20至180分钟之间、20至60分钟之间、或20至40分钟之间。通常的，较高温度或加速辅助病毒颗粒灭活的其他条件与相对短暂的加热时间结合使用，反之亦然。
在一些方法中使用了含有浓度10mM以上的二价或三价金属阳离子的缓冲液。示例性阳离子包括下述金属的阳离子：形成如Mg2+、Ca2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Sr2+、Cu2+、Cr2+和Sc3+的阳离子的Mg、Ca、Mn、Ni、Zn、Co、Sr、Cu、Cr、Fe和Sc。在某些实施例中所述缓冲液包含浓度10mM以上的Mg2+和/或Ca2+。
在一组含有浓度10mM以上的二价或三价金属阳离子的缓冲液中，浓度大于15mM。例如，阳离子浓度可以大于20mM，大于50mM，大于100mM，或大于200mM。在另一组含有浓度10mM以上的二价或三价金属阳离子的缓冲液中，浓度是从10mM至500mM。例如，阳离子浓度可以从20mM至400mM，30mM至300mM，50mM至250mM，70mM至200mM，或浓度为50mM、100mM、150mM或200mM。
在某些方法中使用了含有浓度10mM以上的亲液盐的缓冲液。示例性亲液盐包括硫酸铵、乙酸铵、柠檬酸钠、乙酸钠、硫酸钠、磷酸钾和氯化铯，它们可以单独使用或以任何组合使用。如果存在的话，亲液盐通常以超过10mM的浓度使用，如在0.1M和1M之间；在0.2M和0.8M之间；在0.3M和0.7M之间；在0.4M和0.6M之间；或0.5M。
在某些方法中，使用的缓冲液含有离液盐。在一组含有离液盐的缓冲液中，离液盐是尿素盐或胍盐。在某些方法中，使用的缓冲液含有多元醇。在一组含有多元醇的缓冲液中，多元醇是甘油、丙二醇或1，6-己二醇。
在某些方法中，缓冲液在4℃和70℃之间的温度范围内可保持pH值。一组缓冲液在4℃和70℃的温度之间内可保持pH值在3.0和10.0之间。另一组缓冲液在4℃和70℃的温度之间内可保持pH值在7.0和9.0之间。
在某些方法中，缓冲液为tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、三唑胺缓冲液或1，3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷(BIS-TRIS propane)缓冲液。在一组tris和1，3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷缓冲液中，缓冲液包含附加成分，包括HEPES、柠檬酸盐(citrate)、NaCl和普朗尼克(Pluronic)F68。在一组1，3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷缓冲液中，缓冲液包含40mM 1，3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷、20mM HEPES、20mM柠檬酸盐、200mM NaCl、和0.001％(重量体积比w/v)普朗尼克F68。
本文公开的方法可用于保存任何AAV颗粒的基因组完整性。在一些方法中，AAV颗粒包括大约4.7kb的DNA、大于4.7kb的DNA、大于5.0kb的DNA或大约5.1kb的DNA的基因组。或者，AAV颗粒可以包括小于4kb的DNA，或约3kb的DNA的基因组。本文所公开的方法可以与单链或基本自身互补的基因组的AAV颗粒一起使用。
本发明的灭活方法可使活性辅助病毒的对数去除率大于5.0。一组该种方法使辅助病毒的对数去除率达到大于6或大于6.3。在某些方法中，辅助病毒会是腺病毒、疱疹病毒或杆状病毒。在一组所述方法中，其中辅助病毒是腺病毒，所述腺病毒是Ad5。
附图说明
图1示出了显示Ad5的病毒对数去除率(LRV)作为暴露温度和暴露温度下所花费时间的函数的等高线图。用Ad5感染试验测定Ad5颗粒的灭活水平。实际数据点用黑点表示，在所述数据点之间插入等值线图。该试验中LRV的定量限定为6.3。大于6.3的去除率为不可测得。
图2示出了显示各种AAV产物的得率作为暴露温度和暴露温度下所费时间的函数的等高线图。图2A示出了HEK293制备的hu37血清型截短产物的结果，图2B示出了HeLa制备的hu37血清型超大产物的结果，图2C示出了HEK293制备的AAV8血清型单链产物的结果，以及图2D示出了HEK293制备的AAV8血清型自身互补产物的结果。用DNA酶抗性颗粒qPCR(DRP-qPCR)试验测定AAV产物在暴露前和暴露后的水平。实际数据点用黑点表示，在所述数据点之间插入等值线图。
图3示出了使用DRP-qPCR法(暗条)和TCID50感染性试验(亮条)测定的回收率结果的比较。测试的样品与图2B所示的20分钟的曝光时间的相同。“对照”是在整个实验中保持冰冻的加载样品。
图4示出了两种AAV产物的得率作为暴露温度和暴露温度下所费时间的函数的等高线图。图4A示出了HeLa制备的hu37血清型超大产物的结果，图4B示出了HEK293制备的hu37血清型超大产物的结果。使用DRP-qPCR法测定AAV产物在暴露前和暴露后的水平。实际数据点用黑点表示，在所述数据点之间插入等值线图。
图5示出了HEK293制备的hu37血清型超大产物在不同背景缓冲液中的得率作为暴露温度和暴露温度下所费时间的函数的等高线图。图5A示出了40mM 1，3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷、20mM HEPES、20mM柠檬酸盐、200mM NaCl、0.001％(w/v)普朗尼克F68、pH 8.0的背景缓冲液的结果，图5B示出了0.5M硫酸铵的背景缓冲液的结果。使用DRP-qPCR法测定AAV产物在暴露前和暴露后的水平。实际数据点用黑点表示，在所述数据点之间插入等值线图。47℃处的虚线表示发生Ad5完全灭活的温度(如实施例1中测定的，参见图1)。
图6示出了HEK293制备的hu37血清型超大AAV载体在七种不同缓冲液中的回收率作为暴露于47℃下所费时间的函数的对比图。使用的是40mM 1，3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷、20mM HEPES、20mM柠檬酸盐、200mM NaCl、0.001％(重量体积比)普朗尼克F68、pH8.0，或添加了0.1mM、10mM、25mM、50mM或100mM MgCl2的背景缓冲液。使用DRP-qPCR法测定AAV产物在暴露前和暴露后的水平。“对照”是在整个实验中保持冰冻的加载样品。
图7示出了HEK293制备的hu37血清型超大AAV载体在两种不同缓冲液中的回收率作为暴露于49℃下所费时间的函数的对比图。使用的是40mM 1，3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷、20mM HEPES、20mM柠檬酸盐、200mM NaCl、0.001％(重量体积比)普朗尼克F68、pH8.0，添加了100mM或200mM MgCl2的背景缓冲液。使用DRP-qPCR法测定AAV产物在暴露前和暴露后的水平。“对照”是在整个实验中保持冰冻的加载样品。
图8示出了HEK293制备的hu37血清型超大AAV载体在两种不同缓冲液中的回收率作为暴露于51℃下所费时间的函数的对比图。使用的是40mM1，3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷、20mM HEPES、20mM柠檬酸盐、200mM NaCl、0.001％(重量体积比)普朗尼克F68、pH 8.0，添加了100mM或200mM MgCl2的背景缓冲液。使用DRP-qPCR法测定AAV产物在暴露前和暴露后的水平。“对照”是在整个实验中保持冰冻的加载样品。
图9示出了HEK293制备的hu37血清型超大AAV载体在两种不同缓冲液中的回收率作为暴露于53℃下所费时间的函数的对比图。使用的是40mM1，3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷、20mM HEPES、20mM柠檬酸盐、200mM NaCl、0.001％(重量体积比)普朗尼克F68、pH 8.0，添加了100mM或200mM MgCl2的背景缓冲液。使用DRP-qPCR法测定AAV产物在暴露前和暴露后的水平。“对照”是在整个实验中保持冰冻的加载样品。
图10示出了HEK293制备的hu37血清型超大产物在40mM1，3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷、20mM HEPES、20mM柠檬酸盐、200mM NaCl、0.001％(重量体积比)普朗尼克F68、pH8.0，添加了100mM MgCl2的背景缓冲液中的得率的等高线图。使用DRP-qPCR法测定AAV产物在暴露前和暴露后的水平。实际数据点用黑点表示，在所述数据点之间插入等值线图。
图11示出了HEK293制备的hu37血清型超大产物在40mM1，3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷、20mM HEPES、20mM柠檬酸盐、200mM NaC1、0.001％(重量体积比)普朗尼克F68、pH8.0，添加了200mM MgCl2的背景缓冲液中的得率的等高线图。使用DRP-qPCR法测定AAV产物在暴露前和暴露后的水平。实际数据点用黑点表示，在所述数据点之间插入等值线图。
具体实施方式
本文描述了在含有辅助病毒和AAV颗粒的样品中灭活诸如AV的辅助病毒的方法，从而提高具有完整基因组和/或生物活性的AAV颗粒的回收率。该方法包括在足够温度和足够时间下加热含有辅助病毒和AAV颗粒的样品和缓冲液以灭活辅助病毒颗粒。出乎意料的是，根据本发明，向缓冲液中添加二价或三价金属离子或亲液盐可增加含有完整基因组的AAV颗粒的回收率。
腺相关病毒
AAV是细小病毒家族的Dependoparvovirus属的小的无包膜二十面体病毒。AAV具有约4.7kb的单链线性DNA基因组。AAV包括许多血清学上可区分的类型，包括血清型AAV-1至AAV-12，以及来自非人灵长类动物的100多种血清型。参见，例如，Srivastava，J.CellBiochem.，105(1)：17-24(2008)；Gao et al.，J.Virol.，78(12)，6381-6388(2004)。任何AAV类型均可用于本发明的方法中。AAV能够感染多种组织类型的分裂细胞和静息细胞，不同的AAV血清型表现出不同的组织趋向性。AAV是非自主复制的，并且生命周期具有潜伏期和感染期。在潜伏期，细胞被AAV感染后，AAV可作为原病毒位点特异性地整合到宿主基因组中。除非细胞还被辅助病毒感染(例如，AV或单纯疱疹病毒)，使得AAV得以复制，并导致AAV和辅助病毒颗粒的生产，否则不会出现感染期。如果AAV要用作治疗载体，AAV颗粒和辅助病毒颗粒混合群体的制备会产生严重的问题，因为污染的辅助病毒由于其潜在的致病性和/或免疫原性必须被去除或被灭活。
野生型AAV基因组包含两个145个核苷酸的末端反向重复序列()ITR)，其包含指导AAV复制、基因组衣壳化和整合的信号序列。除了ITR外，三个AAV启动子p5、p19和p40驱动编码rep和cap基因的两个开放阅读框的表达。两个rep启动子，加上单个AAV内含子的差异性剪接，导致从rep基因产生四个rep蛋白(Rep 78、Rep 68、Rep 52和Rep 40)。Rep蛋白负责基因组复制。Cap基因由p40启动子表达，编码三个衣壳蛋白VP1、VP2和VP3，它们是cap基因的剪接变异体。这些蛋白形成AAV颗粒的衣壳。
因为用于复制、衣壳化和整合的顺式作用信号包含在ITR中，所以某些或全部的4.3kb内部基因组可以用外源DNA替换，例如，目的外源蛋白的表达盒。在这种情况下，rep和cap蛋白以反式作用方式结合到如质粒上。为了制备AAV载体，允许AAV复制的细胞系必须表达rep和cap基因、ITR侧翼的表达盒以及辅助病毒提供的辅助功能，例如AV基因E1a、E1b55K、E2a、E4orf6和VA。(Weitzman等，腺相关病毒生物。腺相关病毒：方法和技术规范，1-23页，2011年)AAV载体的产生还可能导致辅助病毒颗粒的产生，在使用AAV载体之前必须将其去除或灭活。许多细胞类型适合产生AAV载体，包括HEK293细胞、COS细胞、HeLa细胞、Vero细胞以及昆虫细胞。(参见例如美国专利号6,156,303、美国专利号5,387,484、美国专利号5,741,683、美国专利号5,691,176、美国专利号5,688,676、美国专利号8,163,543、US20020081721、WO 00/47757、WO 00/24916和WO 96/17947)。AAV载体通常在这些细胞类型中由一个包含ITR侧翼表达盒的质粒和一个以上提供附加AAV和辅助病毒基因的附加质粒产生。
本发明可使用任意血清型的AAV载体。类似地，可以考虑使用和AV类型，并且本领域技术人员将能够识别适合于生产他们期望的AAV载体的AAV和AV类型。AAV和AV颗粒可以最小量纯化，例如通过亲和层析、碘量梯度或CsCl梯度。进一步纯化的含有AAV和AV颗粒的样品也可以用于本发明的方法中，以及较少纯化的样品。本发明的方法中也可使用进一步纯化的含有AAV和AV颗粒的样品，以及较少纯化的样品。
野生型AAV基因组是单链DNA且是4.7kb。AAV载体可以具有4.7kb大小的单链基因组，或大于或小于4.7kb的单链基因组，包括大至5.2kb的超大基因组或小至3.0kb的基因组。此外，载体基因组可以基本上是自身互补的，因此在病毒内基因组基本上是双链的。如此处所示，具有超大基因组的AAV载体对热降解的敏感性增加。因此，在本发明的方法中优选使用具有超大基因组的AAV载体。然而，本领域技术人员将理解，在热灭活期间提高所有类型的AAV载体的稳定性是有价值的，因为它允许越来越严格的灭活条件。因此，含有所有类型基因组的AAV载体均适合用于本发明的方法。
辅助病毒
如上所述，AAV需要与辅助病毒共感染，以便进入其生命周期的感染期。辅助病毒包括腺病毒(AV)和单纯疱疹病毒(HSV)，以及为使用杆状病毒在昆虫细胞中制备AAV而存在的系统。也有提出，乳头瘤病毒也可能对病毒提供了辅助功能。参见Hermonat等，分子治疗学9，289-290页(2004年)。辅助病毒包括能够制备允许AAV复制的任何病毒。本发明可以使用任何辅助病毒，只要它具有比AAV更低的热稳定性。AV是一种无包覆的核DNA病毒，具有约36kb的双链DNA基因组。AV能够通过提供E1a、E1b55K、E2a、E4orf6和VA基因，允许AAV复制和衣壳化，拯救细胞中潜伏的AAV原病毒。
HSV是具有相对较大的双链线性DNA基因组的病毒家族，其被包裹在脂质双层包膜中的二十面体衣壳中。HSV具有传染性和高度传染性。以下的HSV-1复制蛋白被鉴定为AAV复制所必需的：解旋酶/引物酶复合物(UL5、UL8和UL52)和由UL29基因编码的DNA结合蛋白ICP8，以及增强辅助功能的其它蛋白。
本发明中可使用其他辅助病毒，例如杆状病毒，只要它们能够支持AAV复制，无论是天然的还是修饰的形式，并且它们表现出比AAV更低的热稳定性水平。
AAV载体的制备
AAV载体可通过本领域已知的多种方法在哺乳动物或昆虫细胞中制备。只要生产方法的结果是含有AAV和辅助病毒的样品，任何生产方法均将适用于生产本发明的起始原料。制造过程包括向细胞提供含有AAV载体基因组、具有AAV rep和cap基因功能以及附加的辅助功能的质粒。其他辅助功能可以通过例如AV感染、通过携带所有必需的AV辅助功能基因的质粒、或者通过诸如HSV或杆状病毒之类的其他病毒来提供。适用于本发明方法的AAV生产方法包括Clark等，人类基因治疗6：1329-1341(1995)；Martin等，人类基因治疗方法24：253-269(2013)；Thorne等，人类基因治疗20：707-714(2009)；Fraser Wright，人类基因治疗20：698-706(2009)；Virag等，人类基因治疗20：807-817(2009)中公开的内容。
AAV产品从细胞裂解液或细胞培养基中收获。初级纯化步骤包括亲和和离子交换色谱以除去细胞污染物。将纯化后的样品过滤并储存在≤-60℃。
细胞裂解
可以通过裂解细胞从感染的细胞获得AAV颗粒。AAV感染细胞的裂解可以通过化学或酶处理细胞以释放感染病毒颗粒的方法来完成。这些方法包括使用核酸酶，诸如全能核酸酶(Benzonase)或DNA酶，蛋白酶，诸如胰蛋白酶，或洗涤剂或表面活性剂。也可以使用物理破坏，例如匀浆或研磨，或通过微射流压力传感器施加压力，或冻融循环。或者，可以从AAV感染细胞中收集上清液，而不需要细胞裂解。
病毒颗粒的提纯
在本发明的灭活方法之前，可能需要纯化含有AAV和辅助病毒颗粒的样品，以去除例如由细胞裂解产生的细胞碎片。本领域已知辅助病毒和AAV颗粒的最小量纯化方法，并且任何适当的方法均可用于制备包含AAV和辅助病毒颗粒的样品，以用于本发明的方法。两种示例性纯化方法是氯化铯(CsCl)和碘克沙醇的密度梯度纯化。两种方法均描述在如Strobel等，人类基因治疗方法，26(4)：147-157(2015)中。还可以使用亲和层析法，例如使用AVB琼脂糖亲和树脂(GE医疗生物科学，瑞典乌普萨拉)实现最小量纯化。用AVB琼脂糖亲和树脂纯化AAV的方法在描述如Wang等，Mol Ther Methods Clin Dev.，2：15040(2015)中。
热灭活
热灭活技术是基于AAV和辅助病毒颗粒不同的热稳定性。例如，AAV颗粒可被加热到高达56℃的温度，并且仍然保持完整，而AV颗粒则变得不活跃。Conway等，基因治疗6，986-993，1999，描述了含AAV的样品中HSV的差异性热灭活。热灭活可以通过任何已知的方法来完成。在下面描述的实施例中，使用热循环仪完成热灭活，以快速加热和冷却300μL以下的样品体积。选择这个系统是因为它主要依赖于导热的传热，使它成为连续流动系统和采用主动混合的大批量系统的可行模型。连续流动系统的示例包括将样品通过连续流动换热器，例如用于生物治疗制造的DHXTM单用换热器(赛默飞科学，宾西法尼亚州米勒斯堡)。这种系统允许操作人员通过控制样品通过热交换器的流速，进而控制加热过程的持续时间和热交换器的温度，进而控制热灭活温度来控制热灭活过程。
可选地，热灭活可以使用不同尺寸的批量系统来完成。例如，可以以1L的比例完成热灭活，将含有AAV的样品放入1L的PETG瓶中，并将瓶子放入水浴中，在期望的灭活温度下放置一段时间，通过混合，可以将样品加热到47℃保持20分钟。在较大规模时，热灭活可以通过将含有AAV的样品放置在5L的生物处理袋中，将袋放置于设定了期望灭活温度的温控水平摇床上，并持续期望的时间来完成。例如，摇床可以设置49℃，速度30RPM，角度12°混匀40分钟。
热灭活可在AAV颗粒和辅助病毒颗粒之间的稳定性有充分差异的任何温度下发生，以使辅助病毒颗粒基本上被灭活，而活性AAV颗粒仍然存在。在本发明中，含有AAV和辅助病毒颗粒的样品被加热到大于或等于45℃的温度，并且通常加热到45℃和55℃之间的温度，最常使用的温度是49℃±2℃。样品通常在此温度下保持1至60分钟，最常用的是10至40分钟。然而，如图1所示，热失活在很大程度上与时间无关，因此加热步骤的持续时间将是使整个样品达到温度所需的时间的函数。例如，300μL的样品量可以在几秒钟内达到均一的温度，而多升罐可能需要几分钟才能达到均一的温度。此外，本领域技术人员将理解，可能需要更高的温度以实现更大程度的AV去除率。
灭活效力测定
一旦完成热失活，就有必要或期望测定灭活的效率。通过检测辅助病毒复制能力存在与否的试验，例如噬斑试验，来测定灭活方案的效力。用于辅助病毒的噬斑试验对于本领域的人来说是众所周知的，包括AV、HSV、杆状病毒等的噬菌斑试验。腺病毒的噬斑试验可以使用任何合适的细胞类型，例如HeLa或HEK293细胞来进行。标准噬斑试验的描述可见于例如，当前人类遗传学技术规范，2003。用于测量腺病毒滴度的替代方法包括那些允许通过免疫细胞化学染色检测病毒蛋白(如六聚体蛋白)来鉴定培养物中受感染细胞的方法。这种检测包括QuickTiterTM腺病毒滴度免疫分析试剂盒(细胞生物实验室，加利福尼亚州圣地亚哥)。灭活效力通常被报告为病毒的对数去除率(LRV)。
AAV颗粒统计
由于AAV感染在体外不会导致细胞病变，因此斑块试验不能用于测定感染滴度，而使AAV颗粒的定量变得复杂。然而，AAV颗粒可以用许多方法定量，包括定量聚合酶链式反应(qPCR)(Clark et al.，Hum.Gene Ther.10，1031-1039(1999))或斑点杂交(Samulski etal.，J.Virol.63，3822-3828(1989))，或通过高度纯化的载体制备的光密度(Sommer etal.，Mol.Ther.7，122-128(2003))。DNA酶抗性颗粒(DRP)可以通过在热循环器(例如，iCycler iQ 96孔板格式热循环仪(伯乐，加利福尼亚州赫拉克勒斯))中的实时定量聚合酶链反应(DRP-qPCR)进行定量。含有AAV颗粒的样品在DNase I(100U/ml；Promega，威斯康辛州麦迪逊)存在下在37℃下孵育60分钟，然后蛋白酶K(英潍捷基，加利福尼亚州卡尔斯巴德)在50℃消化60分钟，然后在95℃变性30分钟。所使用的引物-探针组应该对AAV载体基因组的非天然部分具有特异性，例如目的蛋白的多聚A序列(poly(A)序列)。根据引物、探针和扩增序列的长度和组成，PCR产物可以使用任何适当的循环参数集进行扩增。可选的方案公开于，例如Lock等，人类基因治疗方法25(2)：115-125(2014)中。
AAV颗粒的传染性可以通过TCID50(50％时的组织培养感染剂量)实验来测定，如例如Zhe等，人类基因治疗15：709-715(2004)中所述。在该测定中，在该测定中，AAV载体颗粒被连续稀释并AV颗粒一起感染96孔板中的ReP/CAP表达细胞系。感染后48小时，从感染和对照孔中提取总细胞DNA。然后使用带有转基因特异探针和引物的qPCR测定AAV载体的复制数。使用10倍系列稀释的AAV阳性孔率，用Karber方程计算每毫升TCID50感染率(TCID50/ml)。
背景缓冲液
本发明的方法包括使用背景缓冲液。背景缓冲液可以是能够在较宽的温度范围内保持稳定pH的任何缓冲液，例如，当缓冲液温度在4℃至70℃改变时，将pH保持在3.0至10.0范围内。缓冲液也可以在当缓冲液温度在4℃至70℃改变时，将pH保持在7.0至9.0范围内。示例性背景缓冲液包括利用甘氨酸、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸盐、MES(2-(N-吗啉基)乙磺酸)、双三(双-(2-羟乙基)-亚氨基三-(羟基甲基)-甲烷)、磷酸盐、pipes(1，4-哌嗪二乙磺酸)、mopso(3-吗啉-2-羟基丙磺酸)、BTP(1，3-双(三羟甲基)氨基丙烷)、MOPS(3-吗啉丙烷-1-磺酸)，TES 2〔[1，3-二羟基-2-(羟甲基)丙基-2-基]氨基〕乙磺酸、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)、TEA(tris碱、醋酸和EDTA)、tris、三甘酸、双甘酸、乳酸，甲酸盐，和MMA(2-甲基丙二酸)。一种背景缓冲液的实施例包括：40mM1，3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷、20mM HEPES、20mM柠檬酸盐、200mM NaCl、0.001％(重量体积比)普朗尼克F68，室温下pH8.0。
二价或三价金属离子
本发明中使用的一组缓冲剂中含有或多个二价或三价金属阳离子。例如，Mg2+、Ca2 +、Mn2+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Sr2+、Cu2+、Cr2+、和Sc3+也可以使用上述阳离子的盐。当在本发明中使用时，二价或三价阳离子以大于10mM的总浓度存在。如下述实施例所示，经检测所有含有超过10mM二价或三价阳离子的缓冲液与对照缓冲液相比对加热的样品均提供了显著的保护。在含有50mM至200mM MgCl2的缓冲液中观察到了最高水平的保护作用。对于高溶解性的金属离子，例如Ca或Mg的阳离子，本领域技术人员将理解，将阳离子的浓度增加到超过实现AAV的最大保护所需的量不会对AAV的保护产生负面影响，并且会产生等效的结果。本发明的缓冲剂还可以包括离液盐，包括尿素盐或胍盐。缓冲剂还可以包括多元醇，优选的多元醇是甘油、丙二醇和1，6-己二醇。
亲液盐
本发明使用的一组缓冲液包含亲液盐。亲液盐是有助于水-水相互作用的稳定性和结构的共溶剂。亲液盐也可稳定溶液中的蛋白质、膜和疏水性聚合体。在本发明的一个实施例中，所述缓冲液包括一种以上亲液盐，特别是强亲液盐，例如硫酸铵、乙酸铵、柠檬酸钠、乙酸钠、硫酸钠、磷酸钾和氯化铯。在本发明中，亲液盐的有用浓度是大于10mM，例如浓度为0.1M至1M、0.2M至0.8M、0.3M至0.7M、0.4M至0.6M、或0.5M。
实施例
下面的实施例并非旨在限制本发明的范围，而是用于说明本发明方法的各个方面。本发明的许多其它实施例对于本领域的技术人员而言是显而易见的。
实施例1
使用标准技术生产Ad5AV颗粒，并通过CsCl梯度进行最小量纯化。Ad5颗粒被透析成背景缓冲液中(40mM 1，3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷、20mM HEPES、20mM柠檬酸盐、200mM NaCl、0.001％(重量体积比)普朗尼克F68、pH 8.0)。使用热循环仪进行加热，以立即将样品加热到所需温度，保持在所需温度，然后立即冷却样品。缓冲液中的Ad5颗粒容纳在聚丙烯管，体积为300μL以下。将Ad5AV样品加热至45℃、47℃、49℃或51℃，持续10分钟、15分钟或40分钟，加热至51℃的Ad5AV样品除外，其仅在该温度下保持10分钟。热处理之后，根据制造商的说明，使用QuickTiterTM腺病毒滴定免疫分析试剂盒(细胞生物实验室，加利福尼亚州圣地亚哥)测量Ad5的感染性。
图1示出了Ad5AV的热灭活数据，显示为Ad5病毒的病毒对数去除率(LRV)，期望值为＞6LRV。如图1所示，Ad5物质的灭活高度依赖于温度，而温度下的时间对灭活没有显著影响。基于这些数据，可以在47℃以上的温度下实施灭活步骤。
实施例2
检测不同血清型和含有不同基因组类型和大小的AAV载体，测试AV热灭活方案对AAV基因组稳定性的影响。检测了两种血清型，AAV8和hu37，和三种不同的基因组。以下为检测AAV载体：
(A)含有单链构建体的hu37衣壳(4.7kb)
(B)含有超大单链构建体的hu37衣壳(5.1kb)
(C)含有一个小型单链构建体的AAV8衣壳(4.1kb)
(D)含有自身互补构建体的AAV8衣壳(4.6kb)
在HEK293细胞中制备AAV载体(A)(C)和(D)，在HeLa细胞中制备颗粒(B)。所有载体通过亲和层析或碘量梯度使用标准技术进行最小量纯化。载体被透析成背景缓冲液中(40mM 1，3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷、20mM HEPES、20mM柠檬酸盐、200mM NaCl、0.001％(重量体积比)普朗尼克F68、pH 8.0)。使用热循环仪进行加热，以立即将样品加热到所需温度，保持在所需温度，然后立即冷却样品。载体样品容纳在聚丙烯管，体积为300μL以下。载体样品所暴露的热灭活条件如下：将载体(A)(B)和(C)加热至45℃、47℃、或49℃，将载体(B)加热至45℃、47℃、49℃、51℃、或53℃。在加热10、20或40分钟后测试所有载体。热处理后的样品通过DRP-qPCR法分析基因组稳定性。
图2示出了此实验的数据。用DRP-qPCR方法测定灭活后AAV产物的基因组降解，并以qPCR产率百分比表示。通过与未暴露于升高的温度并保持在4℃的起始样品进行比较，测定qPCR产率百分比。如图所示，对于具有＜4.7kb长度的单链或自身互补构建体(分别为图2C和图2D)的血清型AAV8，升高的温度和温度下的时间没有显著降解AAV物质。相反，与AAV8中制备的类似大小的构建体相比，具有单链构建体(4.7kb)的hu37血清型对热和时间更敏感(图2A对比图2C)。最后，对于hu37血清型，与正常基因组大小(4.7kb)的构建体相比，超大构建体(5.1kb)对热稳定性具有显著的负面影响(图2B对比图2A)。这些结果表明不同的血清型有不同的热稳定性曲线，但更重要的是，构建体大小对衣壳的稳定性有显著的影响。
实施例3
比较了两种测定AAV载体基因组完整性的方法。将含有超大基因组(5.1kb)的hu37载体样品加热至22℃、45℃、47℃、49℃、51℃或53℃，加热20分钟，用DRP-qPCR法或TCID50感染试验测定回收率。对照样品保持冷冻直至检测基因组完整性。
图3示出了收集的DRP-qPCR法与TCID50感染试验的对比数据。如图所示，两种方法所得的回收率在质量上相似，且随温度升高在衣壳质量上有相同下降趋势。这些数据加强了DRP-qPCR法可用作初步检查模型，以减轻暴露于升高的温度时的衣壳降解。
实施例4
通过比较不同细胞类型制备的AAV载体的热稳定性，检测细胞制备系统对热敏感性的影响。用HeLa细胞或HEK293细胞制备含有超大基因组(5.1kb)的血清型hu37的载体。将载体样品加热至45℃、47℃、49℃、51℃或53℃，加热10、20、40分钟，用DRP-qPCR法检测基因组完整性。如图4所示，两种载体类型并非所有的数据点都会进行重复。然而，这两个实验的结果定性相似。这些数据表明，用于产生AAV物质的细胞系制备系统对产生的AAV的热稳定性没有显著影响。此外，这些数据支持了包含超大构建体物质的hu37血清型对Ad5灭活所需的加热条件高度敏感的总体发现(如图1所示)。
实施例5
如实施例2所述，制备含有超大基因组的hu37血清型的AAV载体样品。样品被透析到(A)标准背景缓冲液(40mM1，3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷、20mM HEPES、20mM柠檬酸盐、200mM NaCl、0.001％(重量体积比)普朗尼克F68、pH 8.0)或含有0.5M硫酸铵的标准背景缓冲液。样品加热如下：45℃加热10至40分钟、47℃加热20分钟、49℃加热10至40分钟，以及51℃加热20分钟。用DRP-qPCR法检测基因组完整性。
如图5所示，在背景缓冲液中添加0.5M硫酸铵可提高AAV载体的热稳定性(图5A对比图5B)。这些数据表明，通过向在热灭活步骤中使用的缓冲液配方中添加强亲液盐，可以保护AAV载体免受升高温度对降解的影响。
这些数据表明AAV对Ad5病毒热灭活所需的条件敏感。AAV的稳定性似乎是血清型依赖的，并且使用超大构建体(超大的定义为长度为4.7kb以上的构建体)可能对AAV物质的稳定性产生显著有害的影响。此报告中显示的数据还表明，添加亲液盐可以产生有益的影响，在AAV物质暴露于升高的温度时增加其稳定性。
实施例6
如实施例2所述，制备含有超大基因组的hu37血清型的AAV载体样品。样品被透析到(A)标准背景缓冲液(40mM 1，3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷、20mM HEPES、20mM柠檬酸盐、200mM NaCl、0.001％(重量体积比)普朗尼克F68、pH 8.0)，含有(B)0.1mM MgCl2、(C)10mM MgCl2、(D)25mM MgCl2、(E)50mM MgCl2、(F)100mM MgCl2或(G)200mM MgCl2的标准背景缓冲液。样品被加热到如表1所示的温度和持续时间。用DRP-qPCR法检测AAV颗粒的基因组完整性。表2示出了该实验的结果。通过与未暴露于升高的温度并保持在4℃的起始样品进行比较，测定残留滴度。
图6示出47℃加热40分钟以上，在含有0至100mM MgCl2的缓冲液中AAV载体的回收率。在含有小于25mM MgCl2的缓冲液中，在所有时间点都有明显的较低的回收率。
图7示出47℃加热180分钟以上，在含有100mM或200mM MgCl2的缓冲液中AAV载体的回收率。图8示出51℃加热180分钟以上，在含有100mM或200mM MgCl2的缓冲液中AAV载体的回收率。图9示出53℃加热180分钟以上，在含有100mM或200mM MgCl2的缓冲液中AAV载体的回收率。总的来说，这些数据表明，含有200mM MgCl2的缓冲液在延长加热期间提供了稍微更好的对于防止降解的保护。图10和图11描述了这些差异，其显示出含有100mM MgCl2的缓冲液与含有200mM MgCl2的缓冲液相比，随着持续时间和温度的增加，载体损耗略有增加。
表1.
表2.
等效
对本领域技术人员而言，从此文献的完整内容包括本文引用的科学及专利文献参考中，除本文所示的及描述的外，本发明的多种修改及其多个进一步实施例将变得显而易见。本文的主题包含可被本发明在其多种实施例及等效物中实践采用的重要的额外信息、例证及指导。

Claims (55)

1.一种在含有辅助病毒颗粒、腺相关病毒颗粒和缓冲液的样品中灭活辅助病毒的方法，该方法包括：
将样品加热至温度大于或等于45℃，
其中缓冲液包含浓度为10mM以上的二价或三价阳离子，或浓度为10mM或以上的亲液盐。
2.如权利要求1所述的方法，其中加热所述样品至45℃和65℃之间的温度。
3.如权利要求1所述的方法，其中加热所述样品至45℃和60℃之间的温度。
4.如权利要求1所述的方法，其中加热所述样品至45℃和55℃之间的温度。
5.如权利要求1所述的方法，其中加热所述样品至47℃和53℃之间的温度。
6.如权利要求1所述的方法，其中加热所述样品至48℃。
7.如权利要求1所述的方法，其中加热所述样品至49℃。
8.如权利要求1所述的方法，其中保持所述样品在所述温度1分钟至6小时之间的时间。
9.如权利要求1所述的方法，其中保持所述样品在所述温度10至180分钟之间的时间。
10.如权利要求1所述的方法，其中保持所述样品在所述温度20至180分钟之间的时间。
11.如权利要求1所述的方法，其中保持所述样品在所述温度20至60分钟之间的时间。
12.如权利要求1所述的方法，其中保持所述样品在所述温度20至40分钟之间的时间。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述方法导致辅助病毒的对数去除率为6.3以上。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述腺相关病毒颗粒包含大于4.7kb的DNA的基因组。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述腺相关病毒颗粒包含约5.1kb的DNA的基因组。
16.如权利要求1中任一项所述的方法，其中所述腺相关病毒颗粒包含约4.7kb的DNA的基因组。
17.如权利要求1中任一项所述的方法，其中所述腺相关病毒颗粒包含约4.0kb的DNA的基因组。
18.如权利要求1中任一项所述的方法，其中所述腺相关病毒颗粒包含约3.0kb的DNA的基因组。
19.如权利要求1中任一项所述的方法，其中所述腺相关病毒颗粒包含基本上自身互补的基因组。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述缓冲液还包含离液盐。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述离液盐是尿素盐。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述离液盐是胍盐。
23.如权利要求1所述的方法，其中所述缓冲液还包含选自甘油、丙二醇和1，6-己二醇的多元醇。
24.如权利要求1所述的方法，其中所述缓冲液在4℃和70℃之间的温度维持pH在3.0和10.0之间。
25.如权利要求1所述的方法，其中所述缓冲液在4℃和70℃之间的温度维持pH在7.0和9.0之间。
26.如权利要求1中所述的方法，其中所述缓冲液还包含：40mM 1，3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷、20mM HEPES、20mM柠檬酸盐、200mM NaCl和0.001w/v％(重量体积比)普朗尼克F68。
27.如权利要求24所述的方法，其中所述缓冲液是Tris缓冲液。
28.如权利要求24所述的方法，其中所述缓冲液是磷酸盐缓冲液。
29.如权利要求24所述的方法，其中所述缓冲液是三唑胺缓冲液。
30.如权利要求1所述的方法，其中所述辅助病毒是腺病毒。
31.如权利要求28所述的方法，其中所述腺病毒是Ad5。
32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述二价或三价阳离子浓度大于15mM。
33.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述二价或三价阳离子浓度大于20mM。
34.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述二价或三价阳离子浓度大于50mM。
35.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述二价或三价阳离子浓度大于100mM。
36.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述二价或三价阳离子浓度大于200mM。
37.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述二价或三价阳离子浓度是10mM至500mM。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述二价或三价阳离子浓度是20mM至400mM。
39.如权利要求37所述的方法，其中所述二价或三价阳离子浓度是30mM至300mM。
40.如权利要求37所述的方法，其中所述二价或三价阳离子浓度是50mM至250mM。
41.如权利要求37所述的方法，其中所述二价或三价阳离子浓度是70mM至200mM。
42.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述缓冲液包含浓度10mM以上的二价或三价金属阳离子，所述金属选自由Mg、Ca、Mn、Ni、Zn、Co、Sr、Cu、Cr、Fe和Sc组成的组。
43.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述阳离子是二价阳离子。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述阳离子选自由Mg2+、Ca2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Sr2+、Cu2+和Cr2+组成的组。
45.如权利要求43所述的方法，其中所述阳离子是Ca2+。
46.如权利要求43所述的方法，其中所述阳离子是Mg2+。
47.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述阳离子是三价阳离子。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述阳离子是Sc3+。
49.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述缓冲液包含浓度10mM以上的亲液盐，所述亲液盐选自包含硫酸铵、乙酸铵、柠檬酸钠、乙酸钠、硫酸钠、磷酸钾和氯化铯的组。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述缓冲液包含浓度10mM以上的硫酸铵。
51.如权利要求49或50所述的方法，其中所述亲液盐浓度为0.1M至1M。
52.如权利要求49或50所述的方法，其中所述亲液盐浓度为0.2M至0.8M。
53.如权利要求49或5550中所述的方法，其中所述亲液盐浓度为0.3M至0.7M。
54.如权利要求49或50所述的方法，其中所述亲液盐浓度为0.4M至0.6M。
55.如权利要求49或50所述的方法，其中所述亲液盐浓度为0.5M。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112017009497A2 (pt) 2014-11-05 2018-02-06 Voyager Therapeutics, Inc. polinucleotídeos de aadc para o tratamento da doença de parkinson
ES2878451T3 (es) 2014-11-14 2021-11-18 Voyager Therapeutics Inc Polinucleótidos moduladores
US10597660B2 (en) 2014-11-14 2020-03-24 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
EP3230441A4 (en) 2014-12-12 2018-10-03 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scaav
KR20240056729A (ko) 2016-05-18 2024-04-30 보이저 테라퓨틱스, 인크. 조절성 폴리뉴클레오티드
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
US20210238580A1 (en) * 2018-05-11 2021-08-05 Qiagen Gmbh Lysis method for plant samples
US20220017922A1 (en) 2018-12-18 2022-01-20 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Methods and compositions for treating glycogen storage diseases
CA3136246A1 (en) 2019-04-12 2020-10-15 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Engineered producer cell lines and methods of making and using the same
WO2023172491A1 (en) 2022-03-07 2023-09-14 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Modified batch aav production systems and methods

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5688676A (en) * 1995-06-07 1997-11-18 Research Foundation Of State University Of New York In vitro packaging of adeno-associated virus DNA
US5932468A (en) * 1995-11-03 1999-08-03 Grupo Grifols, S.A. Method of inactivating viruses in proteins
CN1347450A (zh) * 1999-04-09 2002-05-01 阿文蒂斯药物股份有限公司 用于保存感染性重组腺病毒的组合物
CN101472941A (zh) * 2006-03-31 2009-07-01 沃弗-威斯康星校友研究基金会 用于疫苗的高滴度重组流感病毒
CN102803478A (zh) * 2009-06-16 2012-11-28 建新公司 用于纯化重组aav载体的改进方法

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US5387484A (en) 1992-07-07 1995-02-07 International Business Machines Corporation Two-sided mask for patterning of materials with electromagnetic radiation
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
JP4216350B2 (ja) * 1994-09-19 2009-01-28 大日本住友製薬株式会社 動物細胞感染用の組換えｄｎａウイルスベクター
US5872005A (en) 1994-11-03 1999-02-16 Cell Genesys Inc. Packaging cell lines for adeno-associated viral vectors
WO1996017947A1 (en) 1994-12-06 1996-06-13 Targeted Genetics Corporation Packaging cell lines for generation of high titers of recombinant aav vectors
US6924128B2 (en) 1994-12-06 2005-08-02 Targeted Genetics Corporation Packaging cell lines for generation of high titers of recombinant AAV vectors
IL116816A (en) 1995-01-20 2003-05-29 Rhone Poulenc Rorer Sa Cell for the production of a defective recombinant adenovirus or an adeno-associated virus and the various uses thereof
US5741683A (en) 1995-06-07 1998-04-21 The Research Foundation Of State University Of New York In vitro packaging of adeno-associated virus DNA
US6027931A (en) 1995-08-03 2000-02-22 Avigen, Inc. High-efficiency AA V helper functions
US6004797A (en) * 1995-11-09 1999-12-21 Avigen, Inc. Adenovirus helper-free recombinant AAV Virion production
JP2001506133A (ja) 1996-12-18 2001-05-15 ターゲティッド ジェネティクス コーポレイション 組換えａａｖベクターの産生における使用のための、ａａｖスプリット−パッケージング遺伝子およびこのような遺伝子を含む細胞株
US6156303A (en) 1997-06-11 2000-12-05 University Of Washington Adeno-associated virus (AAV) isolates and AAV vectors derived therefrom
US6566118B1 (en) 1997-09-05 2003-05-20 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
US6989264B2 (en) 1997-09-05 2006-01-24 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
AU9319198A (en) 1997-09-19 1999-04-05 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Methods and vector constructs useful for production of recombinant aav
IT1297074B1 (it) 1997-11-21 1999-08-03 Angeletti P Ist Richerche Bio Forme ormone-dipendenti delle proteine rep del virus adeno-associato (aav-2), sequenze di dna codificanti per esse, vettori che le
WO2000009675A1 (en) * 1998-08-14 2000-02-24 Aventis Pharmaceuticals Products Inc. Adenovirus formulations for gene therapy
EP1124976A1 (en) 1998-10-27 2001-08-22 Crucell Holland B.V. Improved aav vector production
DE19905501B4 (de) 1999-02-10 2005-05-19 MediGene AG, Gesellschaft für molekularbiologische Kardiologie und Onkologie Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Adeno-assoziierten Virus, geeignete Mittel hierzu sowie Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittels
US20040235173A1 (en) 2000-07-03 2004-11-25 Gala Design, Inc. Production of host cells containing multiple integrating vectors by serial transduction
DE10061533B4 (de) 2000-12-11 2006-05-04 Amphenol-Tuchel Electronics Gmbh Selbsttragende Kontaktfeder, insbesondere für einen Smartcard-Connector
US6723551B2 (en) 2001-11-09 2004-04-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of adeno-associated virus in insect cells
US7271002B2 (en) 2001-11-09 2007-09-18 United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Production of adeno-associated virus in insect cells
CA2369985A1 (en) 2002-01-18 2003-07-18 Duke University Generation of recombinant adeno-associated viral vectors by a complete adenovirus-mediated approach
US7510872B2 (en) 2003-02-26 2009-03-31 Nationwide Children's Hospital Recombinant adeno-associated virus production
EP3290513B1 (en) * 2004-06-01 2022-09-07 Genzyme Corporation Compositions and methods to prevent aav vector aggregation
US7195394B2 (en) 2004-07-19 2007-03-27 Vijay Singh Method for resonant wave mixing in closed containers
US8980247B2 (en) 2004-10-21 2015-03-17 The Penn State Research Foundation Parvovirus methods and compositions for killing neoplastic cells
US8163543B2 (en) 2005-10-20 2012-04-24 Amsterdam Molecular Therapeutics B.V. AAV vectors produced in insect cells
AU2007261806B2 (en) 2006-06-21 2013-08-15 Uniqure Ip B.V. Vectors with modified initiation codon for the translation of AAV-Rep78 useful for production of AAV in insect cells
GB0706638D0 (en) 2007-04-04 2007-05-16 Mbda Uk Ltd A high-dielectric material
US8580755B2 (en) 2008-02-19 2013-11-12 University Of Rochester Methods and compositions for treating inflammatory conditions
CA2742151A1 (en) 2008-11-07 2010-05-14 Intelligentnano Inc. Transfection with magnetic nanoparticles and ultrasound
WO2013096955A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Case Western Reserve University Targeted gene modification using hybrid recombinant adeno-associated virus
AU2014205604B2 (en) 2013-01-08 2020-01-02 Genzyme Corporation Use of iNOS inhibitors to increase viral yield in culture

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5688676A (en) * 1995-06-07 1997-11-18 Research Foundation Of State University Of New York In vitro packaging of adeno-associated virus DNA
US5932468A (en) * 1995-11-03 1999-08-03 Grupo Grifols, S.A. Method of inactivating viruses in proteins
CN1347450A (zh) * 1999-04-09 2002-05-01 阿文蒂斯药物股份有限公司 用于保存感染性重组腺病毒的组合物
CN101472941A (zh) * 2006-03-31 2009-07-01 沃弗-威斯康星校友研究基金会 用于疫苗的高滴度重组流感病毒
CN102803478A (zh) * 2009-06-16 2012-11-28 建新公司 用于纯化重组aav载体的改进方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WEI-FENG LIU ET AL.: "Effect of magnesium ions on the thermal stability of human poly(A)-specific ribonuclease", 《FEBS LETTERS》 *
董小岩等: "新型重组AAV5/5载体及包装系统", 《生物工程学报》 *

Also Published As

Publication number Publication date
DK3436593T3 (da) 2023-02-20
KR102389674B1 (ko) 2022-04-21
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US11013774B2 (en) 2021-05-25
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US20240252562A1 (en) 2024-08-01
ES2938833T3 (es) 2023-04-17
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US20220072073A1 (en) 2022-03-10
EP3436593A1 (en) 2019-02-06
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US11944658B2 (en) 2024-04-02
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SG11201808183PA (en) 2018-10-30
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US20190083554A1 (en) 2019-03-21
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