CN109195981A - 作为抗癌剂的氨基磷酸酯核苷衍生物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及式(I)的克拉屈滨衍生物。该化合物是氨基磷酸酯衍生物,其中氨基磷酸酯部分位于克拉屈滨的3'‑羟基上。本发明还涉及克拉屈滨衍生物的药物制剂及其在治疗方法中的用途。该化合物可用于治疗癌症。
Description
技术领域
本发明涉及克拉屈滨(cladribine)的衍生物。该化合物是氨基磷酸酯衍生物,其中氨基磷酸酯部分位于克拉屈滨的3'-羟基上。本发明还涉及克拉屈滨衍生物的药物制剂及其在治疗方法中的用途。该化合物可用于治疗癌症。
背技术景
已知一些经过修饰的嘌呤核苷显示出有效的生物学特性,包括化学治疗潜力。一个例子是克拉屈滨1,它是一种有用但有毒的药物。它通过输注给予,用于治疗白血病,特别是毛细胞白血病。它也用于使用烷化剂的标准方案失败的患者的慢性淋巴细胞白血病。
与所有核苷类似物一样,这些试剂需要细胞内激酶介导的活化,活化成其生物活性5'-磷酸形式。
WO2006100439描述了克拉屈滨的一些氨基磷酸酯衍生物及其抗癌活性。WO2006100439中描述的氨基磷酸酯位于克拉屈滨的5'-羟基上,例如化合物Y,并且氨基磷酸酯部分充当一磷酸核苷的前药。
氨基磷酸酯如化合物Y被称为磷酰胺酯前药(ProTide)。通过增加效力或通过避免固有的和获得性耐药机制,磷酰胺酯前药可以在提高核苷的抗癌特性方面提供显著优势(‘Application of ProTide Technology to Gemcitabine:A Successful Approach toOvercome the Key Cancer Resistance Mechanisms Leads to a New Agent(NUC-1031)in Clinical Development’;Slusarczyk等人;J.Med.Chem.;2014,57,1531-1542;Phosphoramidate ProTides of the anticancer agent FUDR successfully deliverthe preformed bioactive monophosphate in cells and confer advantage over theparent nucleoside;J.Med.Chem.;2011,54,7247-7258;和Vande Voorde等人;Thecytostatic activity of NUC-3073,a phosphoramidate prodrug of 5-fluoro-2'-deoxyuridine,is independent of activation by thymidine kinase and insensitiveto degradation by phosphorolytic enzymes;Biochem.Pharmacol.;2011,82,441-452)。
然而,虽然5'-氨基磷酸酯显示出优异的抗癌活性,但3'-氨基磷酸酯通常不是这样,它通常仅表现出差的抗癌活性。
本发明某些实施方案的目的是提供新的抗癌化合物。本发明某些实施方案的目的是提供比现有技术化合物更有效的抗癌化合物。
本发明某些实施方案的目的是提供靶向癌症干细胞的新化合物。本发明某些实施方案的目的是提供比现有技术化合物更有效靶向癌症干细胞的化合物。
本发明某些实施方案的目的是提供比现有技术化合物更少受支原体感染影响的化合物。
本发明某些实施方案的目的是提供比现有技术化合物更少受癌症耐药机制影响的化合物。
本发明的某些实施方案实现了上述目的中的一些或全部。
发明内容
根据本发明,提供了式(I)化合物或其药学上可接受的盐:
R1为芳基;
R2选自C1-C24-烷基、C3-C24-烯基、C3-C24-炔基、C0-C4-亚烷基-C3-C7-环烷基或C0-C4-亚烷基-芳基;
R3和R4各自独立地选自H、C1-C6-烷基和C1-C3-亚烷基-R9;或其中R3和R4与它们所连接的原子一起形成3至6元的环烷基或杂环烷基;
R5和R7各自独立地选自H或C1-C4烷基;
R6独立地选自H或C(O)R10;
R8独立地选自H、C(O)OR10或C(O)R10;
R9独立地选自芳基(例如苯基)、咪唑、吲哚、SRa、ORa、CO2Ra、CO2NRaRa、NRaRb和NH(=NH)NH2;
R10每次出现时独立地选自C1-C24-烷基、C3-C24-烯基、C3-C24-炔基、C0-C4-亚烷基-C3-C7-环烷基或C0-C4-亚烷基-芳基;
其中任何芳基是苯基、萘基或四氢萘基,并且其中任何苯基、烷基、炔基、烯基、亚烷基、环烷基、萘基或四氢萘基任选地被1-4个选自下列的取代基取代:卤素、硝基、氰基、NRaRa、NRaS(O)2Ra、NRaC(O)Ra、NRaCONRaRa、NRaCO2Ra、ORa;SRa、SORa、SO3Ra、SO2Ra、SO2NRaRa、CO2RaC(O)Ra、CONRaRa、CRaRaNRaRa、C1-C4-烷基、C2-C4-烯基、C2-C4-炔基和C1-C4-卤代烷基;
其中Ra每次出现时独立地选自:H和C1-C4-烷基;且Rb每次出现时独立地选自:H和C1-C4-烷基、C(O)-C1-C4-烷基、S(O)2-C1-C4-烷基。
令人惊讶的是,本发明的3'-克拉屈滨氨基磷酸酯倾向于比相应的5'-克拉屈滨磷酰胺酯前药更有效。这与针对其他核苷更普遍观察到的趋势相反。
已显示本发明的某些3'-克拉屈滨氨基磷酸酯靶向癌症干细胞。
与克拉屈滨和5'-克拉屈滨磷酰胺酯前药相比,本发明的3'-克拉屈滨氨基磷酸酯在支原体感染的细胞中的效力减少的量更小。
在一个实施方案中,式(I)的化合物是式(II)的化合物:
其中R1、R2、R3和R4是如上对式(I)化合物所述的。
以下陈述适用于式(I)或(II)的化合物。这些陈述是独立且可互换的。换句话说,任何一个以下陈述中描述的任何特征可以(在化学上允许的情况下)与下面的一个或多个其他陈述中描述的特征组合。特别地,在本说明书中举例说明或图示一种化合物的情况下,可以组合以下任何两个或更多个描述该化合物的特征的陈述(以任何通用性水平表示),以代表预期在本说明书中形成本发明公开内容的一部分的主题。
R1可以是取代的或未取代的苯基。R1可以是取代的或未取代的萘基(例如1-萘基)。
优选地,R1是未取代的。因此,R1可以是未取代的苯基或未取代的萘基(例如1-萘基)。因此,R1可以是未取代的苯基。或者,R1可以是未取代的萘基(例如1-萘基)。R1可以是四氢萘基。
R2可以选自C2-C10-烷基、C5-C7-环烷基或CHR11-苯基;其中R11选自H和C1-C4烷基。R2基团可以是未取代的。
优选地选择R2使得其包含五个或更多个碳原子。因此可以选择R2使得它包含六个或更多个碳原子。优选地选择R2使得其仅包含碳原子和氢原子。R2可以选自C5-C7-环烷基、C5-C8-烷基和苄基,任选地其中所述基团是未取代的。
R2可以为C2-C10-烷基。R2可以为C4-C8-烷基。因此,R2可以选自异丁基、叔丁基、正丁基、正戊基、CH2C(Me)3或正己基。
R2可以为C5-C7-环烷基。因此,R2可以为环己基。
R2可以为CHR11-苯基;其中R11选自H和C1-C4-烷基。R2可以为苄基。
R2优选是未取代的。
可以是:R3和R4之一是H而另一个被选择使得它是选自以下的氨基酸的侧链:甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、组氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、酪氨酸和色氨酸。可以是:R3和R4之一是H而另一个被选择使得它是选自以下的氨基酸的侧链:甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸。可以是:R3和R4之一是H而另一个被选择使得它是选自以下的氨基酸的侧链:丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸。
可以是:R4是H而R3被选择使得它是选自以下的氨基酸的侧链:甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、组氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、酪氨酸和色氨酸。可以是:R4是H而R3被选择使得它是选自以下的氨基酸的侧链:甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸。可以是:R4是H而R3被选择使得它是选自以下的氨基酸的侧链:丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸。因此,衍生出氨基磷酸酯部分的氨基酸(NH2CR3R4CO2H)可以是L-氨基酸。
R4可以是H。R3可以选自H、C1-C6-烷基和C1-C3-亚烷基-R9。R3可以选自C1-C6-烷基和C1-C3-亚烷基-R9。R9可以是苯基。
可以是:R3和R4之一是H,而另一个选自:H、Me、异丙基、异丁基和苄基。可以是:R3和R4之一是H,而另一个选自:Me、异丙基、异丁基和苄基。可以是:R3和R4之一是H,而另一个是Me。
可以是:R4是H,而R3选自:H、Me、异丙基、异丁基和苄基。可以是:R4是H,而R3选自:Me、异丙基、异丁基和苄基。可以是:R4是H,并且R3是Me。
R3可以是C1-C4-烷基。R3可以选自异丙基、异丁基和甲基。R3可以是CH2苯基。
R3可以是H。R4可以选自H、C1-C6-烷基和C1-C3-亚烷基-R9。R4可以选自C1-C6-烷基和C1-C3-亚烷基-R9。R9可以是苯基。
R4可以是C1-C4-烷基。R4可以选自异丙基、异丁基和甲基。R4可以是CH2-苯基。
R4和R3可以各自是甲基。
可以是:R4是H,R3是Me,并且R2是苄基。
R5可以是C1-C4-烷基。然而,优选地R5是H。
R6可以是C(O)R10。在该实施方案中,R10可以为C1-C4-烷基。然而,优选地R6是H。
R7可以是C1-C4-烷基。然而,优选地R7是H。
R8可以是C(O)R10。R8可以是C(O)OR10。在这些实施方案中,R10可以为C8-C24-烷基。然而,优选地R8是H。
优选地,R和R8分别是H。优选地,R5、R6、R7和R8分别是H。
式(I)的化合物可以是选自如下的化合物:
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(乙氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(叔丁氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(苯甲氧基-D-丙氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(苯甲氧基-甘氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(苯甲氧基-L-亮氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[1-萘基-(2,2-二甲基丙氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[1-萘基-(戊氧基-L-亮氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[1-萘基-(环己氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(环己氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(2,2-二甲基丙氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(乙氧基-2,2-二甲基甘氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(苯甲氧基-L-苯丙氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[1-萘基-(苯甲氧基-L-苯丙氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(苯甲氧基-L-缬氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(异丙氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(2-丁氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-((S)-1-苯基乙氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[1-萘基-(苯甲氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯和
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(苯甲氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯。
式(I)的化合物可以是选自如下的化合物:
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[1-萘基-(苯甲氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯和
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(苯甲氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯。
式(I)化合物可以是一种游离碱。
本发明的化合物在磷原子上包含一个手性中心。该化合物可以作为磷酸酯非对映异构体的混合物存在,作为磷原子上的(S)-差向异构体以基本上非对映异构体纯的形式存在,或作为磷原子上的(R)-差向异构体以基本上非对映异构体纯的形式存在。对于本发明的目的,“基本上非对映异构体纯的”定义为非对映异构体纯度大于约90%。如果以基本上非对映异构体纯的形式存在,则该化合物可具有大于95%、98%、99%或甚至99.5%的非对映异构体纯度。或者,该化合物可以作为磷酸酯非对映异构体的混合物存在。
化合物的(R)-和/或(S)-差向异构体可以通过色谱法例如HPLC,任选使用手性柱,以基本上非对映异构体纯的形式获得。或者,化合物的(R)-和/或(S)-差向异构体可以通过从适当的溶剂或溶剂体系中结晶而以基本上非对映异构体纯的形式获得。在另一个替代方案中,化合物的(R)-和/或(S)-差向异构体可以通过将适当保护的克拉屈滨衍生物与非对映异构体富集的氨基磷酸酯前体偶联并随后脱保护而以基本上非对映异构体纯的形式获得。化合物的(R)-和/或(S)-差向异构体可以通过直接合成,例如使用WO2014/076490中描述的方法,以基本上非对映异构体纯的形式获得。
根据本发明的第二方面,提供了第一方面的化合物,其用于治疗方法。
根据本发明的第三方面,提供了第一方面的化合物,其用于预防或治疗癌症。
根据本发明的第四方面,提供了第一方面的化合物在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途。
根据本发明的第五方面,提供了预防或治疗癌症的方法,包括向需要这种治疗的患者施用有效剂量的第一方面的化合物。
本发明的第三、第四和第五方面中的每一方面均可包括与其他癌症疗法组合使用的用于治疗癌症的实施方案。其他癌症疗法的实例包括放射疗法和/或其他化学疗法。
关于本发明的第三、第四和第五方面中的每一方面,本发明的实施方案包括选自血液学肿瘤和实体瘤的癌症。特别地,癌症可选自由以下组成的组:白血病、多发性骨髓瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、头颈癌、神经母细胞瘤、甲状腺癌、皮肤癌(包括黑素瘤)、口腔鳞状细胞癌、膀胱癌、Leydig细胞瘤、结肠癌、结直肠癌和妇科癌症包括卵巢癌、子宫癌和宫颈癌(包括宫颈上皮细胞癌)。在优选的实施方案中,癌症是白血病并且可以选自由以下组成的组:急性成淋巴细胞性白血病、急性髓源性(myelogenous)白血病(也称为急性髓性(myeloid)白血病或急性非淋巴细胞白血病)、急性早幼粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓源性白血病(也是称为慢性髓性白血病、慢性髓细胞(myelocytic)白血病或慢性粒细胞白血病)、慢性淋巴细胞白血病、单核细胞白血病和毛细胞白血病。在进一步优选的实施方案中,癌症是急性成淋巴细胞性白血病。
已经发现,与5'-克拉屈滨磷酰胺酯前药相比,体现了本发明的某些化合物在治疗实体瘤以及白血病方面具有增强的抗癌活性。适合于通过本发明化合物治疗的实体瘤的实例包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、宫颈癌和淋巴瘤。适用于通过本发明化合物治疗的淋巴瘤的实例包括霍奇金淋巴瘤(Hodgkin Lymphoma)和非霍奇金淋巴瘤。适用于通过本发明化合物治疗的白血病的实例包括髓性白血病、多发性骨髓瘤、慢性髓源性白血病、急性髓源性白血病和急性淋巴细胞白血病。
本发明化合物可用于治疗具有支原体感染的细胞的患者的癌症。因此,本发明可提供一种治疗具有支原体感染的细胞的患者的癌症的方法。通常,支原体感染的细胞将是支原体感染的癌细胞。
本发明提供了用于靶向癌症干细胞的本发明化合物。
本发明提供了本发明化合物在制备用于靶向癌症干细胞的药物中的用途。
本发明提供了靶向癌症干细胞的方法,所述方法包括向癌症干细胞群提供足以靶向该癌症干细胞的量的本发明化合物。
本发明中提及的癌症干细胞的靶向可用于预防或治疗癌症。在此类实施方案中,癌症干细胞群可能在需要这种靶向的患者的癌症或癌前病况中,并且该方法可包括向患者施用治疗有效量的本发明化合物。
本发明提供了用作抗癌症干细胞药物的本发明化合物。本发明化合物的这种用途也可用于预防或治疗癌症。
本发明提供了一种确定患有癌症或癌前病况的患者是否将受益于用本发明化合物预防或治疗癌症的方法,所述方法包括:
测定患者中代表癌症或癌前病况的生物样品中是否存在癌症干细胞;其中生物样品中存在癌症干细胞表明患者将受益于用本发明化合物治疗。
本发明提供了一种为患有癌症或癌前病况的患者确定合适的治疗方案的方法,所述方法包括:
测定患者中代表癌症或癌前病况的生物样品中是否存在癌症干细胞;其中生物样品中存在癌症干细胞表明合适的治疗方案将包括用本发明化合物治疗患者。
本发明提供了用于预防或治疗通过以下方法选择的进行这种治疗的患者的癌症的本发明化合物:
测定患者中代表癌症或癌前病况的生物样品中是否存在癌症干细胞;其中生物样品中存在癌症干细胞表明患者适合用本发明化合物治疗。
上述方法可以进一步包括使用本发明化合物预防或治疗癌症或癌前病况的步骤。
在本发明方法的合适实施方案中,癌症是复发性或难治性癌症。本发明化合物可用于治疗这种复发性或难治性癌症。
本发明提供了用于治疗受试者的难治性癌症的本发明化合物。受试者可以是人类患者。
本发明提供了本发明化合物在制备用于治疗人类患者的复发性或难治性癌症的药物中的用途。
本发明提供了一种治疗受试者的复发性或难治性癌症的方法,所述方法包括向需要这种治疗的受试者提供治疗有效量的本发明化合物。
根据本发明的其他方面,提供了用于预防或治疗方法的本发明化合物、本发明化合物在制备用于预防或治疗方法的药物中的用途以及一种预防或治疗患者的方法,包括向有此需要的患者施用本发明的化合物,其中,在每种情况下,预防或治疗方法包括预防或治疗骨髓增生异常综合征的方法。
根据本发明的第六方面,提供了一种药物组合物,其包含第一方面的化合物,结合药学上可接受的赋形剂。
根据本发明的第七方面,提供了一种制备药物组合物的方法,其包括将第一方面的化合物与药学上可接受的赋形剂组合的步骤。
本发明的各个方面基于以下发现:本发明的化合物能够优先减少癌症干细胞数量。该发现是出人意料的,因为已知癌症干细胞对许多化学治疗剂具有耐药性,并且以前没有暗示本发明化合物或克拉屈滨(衍生本发明化合物的母体化合物)能够靶向癌症干细胞。因此,本发明化合物能够靶向癌症干细胞并因此减少其数量这一发现(发明人已经证实该发现适用于大范围的癌症)代表了出人意料的突破性进展,这使得本发明化合物的一系列新治疗应用成为可能。
具体实施方式
本发明制剂中的化合物可以以药学上可接受的盐的形式获得、储存和/或施用。合适的药学上可接受的盐包括但不限于药学上可接受的无机酸的盐,所述无机酸例如盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸、硼酸、氨基磺酸和氢溴酸,或药学上可接受的有机酸的盐,所述有机酸例如乙酸、丙酸、丁酸、酒石酸、马来酸、羟基马来酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸、乳酸、粘酸、葡萄糖酸、苯甲酸、琥珀酸、草酸、苯乙酸、甲磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、水杨酸、磺胺酸、天冬氨酸、谷氨酸、依地酸、硬脂酸、棕榈酸、油酸、月桂酸、泛酸、单宁酸、抗坏血酸和戊酸。合适的碱盐由形成无毒盐的碱形成。实例包括铝盐、精氨酸盐、苄星青霉素盐、钙盐、胆碱盐、二乙胺盐、二乙醇胺盐、甘氨酸盐、赖氨酸盐、镁盐、葡甲胺盐、乙醇胺盐、钾盐、钠盐、氨丁三醇盐和锌盐。也可以形成酸和碱的半盐,例如半硫酸盐、半草酸盐和半钙盐。优选地,本发明的化合物不是盐的形式,即它们是游离碱/游离酸的形式。
术语Cm-Cn是指具有m至n个碳原子的基团。
术语“烷基”是指直链或支链饱和烃基。烷基是单价的。例如,C1-C6-烷基可以指甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基和正己基。烷基优选是未取代的。
术语“环烷基”是指环状饱和烃基。烷基是单价的。例如,C5-C7-环烷基可以指环戊基、环己基或环庚基。环烷基优选是未取代的。
术语“亚烷基”是指直链饱和烃链。亚烷基是二价的。例如,C1-亚烷基可以指CH2基团。C2-亚烷基可以指-CH2CH2-基团。亚烷基优选是未取代的。
术语“烯基”是指含有至少一个碳-碳双键的支链或直链烃链。双键可以作为E或Z异构体存在。双键可以在烃链的任意可能位置。例如,“C2-C4-烯基”可以指乙烯基、烯丙基和丁烯基。烯基优选是未取代的。
术语“炔基”是指含有至少一个碳-碳三键的支链或直链烃链。三键可以在烃链的任意可能位置。例如,“C2-C6-炔基”可以指乙炔基、丙炔基、丁炔基。炔基优选是未取代的。
术语“芳基”是指苯基、萘基和四氢萘基。术语“芳基”可以指苯基或萘基。芳基(例如萘基或苯基)可以是未取代的。
本发明还包括化合物的所有药学上可接受的同位素标记形式,其中一个或多个原子被具有相同原子序数但原子质量或质量数不同于自然界中通常存在的优势同位素的原子质量或质量数的原子取代。
适合包含在本发明化合物中的同位素的实例包括氢的同位素,例如2H和3H,碳的同位素,例如11C、13C和14C,氯的同位素,例如36Cl,氟的同位素,例如18F,碘的同位素,例如123I和125I,氮的同位素,如13N和15N,氧的同位素,如15O、17O和18O,磷的同位素,如32P,和硫的同位素,如35S。
某些同位素标记的化合物,例如掺入了放射性同位素的化合物,可用于药物和/或底物组织分布研究。鉴于其易于掺入和现成的检测手段,放射性同位素氚(即3H)和碳-14(即14C)和18F特别适用于此目的。
用较重的同位素例如氘(即2H)取代可以提供某些治疗优势,这是因为代谢稳定性更高,例如体内半衰期延长或剂量需求减少,因此在某些情况下可以是优选的。
同位素标记的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过类似于使用适当的同位素标记的试剂代替先前使用的非标记试剂描述的那些的方法制备。
本发明的化合物可用于治疗人体。它们可用于治疗动物体。特别是,本发明化合物可用于治疗商业动物如家畜。或者,本发明化合物可用于治疗伴侣动物,例如猫、狗等。
本发明的化合物可以以单晶体形式或以晶体混合物形式存在,或者它们可以是无定形的。因此,意图用于药物用途的本发明化合物可以作为结晶或无定形产品施用。它们可以通过例如沉淀、结晶、冷冻干燥或喷雾干燥或蒸发干燥等方法获得,例如作为固体塞(solid plug)、粉末或薄膜。微波或射频干燥可用于此目的。
对于本发明的上述化合物,施用剂量当然会随所用化合物、施用方式、所需治疗和所示病症而变化。例如,如果本发明化合物肠胃外施用,则本发明化合物的剂量范围可以为0.1至5g/m2,例如0.5至2g/m2。根据众所周知的医学原理,本发明化合物用于治疗目的的剂量大小将根据病况的性质和严重性、动物或患者的年龄和性别以及施用途径而自然变化。
预期本发明化合物的剂量水平、给药频率和治疗持续时间根据制剂和临床适应症、患者的年龄和共患疾病(co-morbid medical condition)而不同。
本发明的化合物或其药学上可接受的盐可以单独使用,但通常以药物组合物的形式施用,所述药物组合物中本发明的化合物或其药学上可接受的盐与药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体组合。例如,Pharmaceuticals-The Science of Dosage Form Designs",M.E.Aulton,Churchill Livingstone,1988中描述了用于选择和制备合适药物制剂的常规程序。
根据本发明化合物的施用方式,用于施用本发明化合物的药物组合物将优选包含0.05至99%w(重量百分比)的本发明化合物,更优选0.05至80%w的本发明化合物,还更优选0.10至70%w的本发明化合物,甚至更优选0.10至50%w的本发明化合物,所有重量百分比均基于总组合物。
对于口服施用,可以将本发明的化合物与佐剂或载体混合,所述佐剂或载体例如乳糖,蔗糖,山梨糖醇,甘露糖醇;淀粉,例如马铃薯淀粉,玉米淀粉或支链淀粉;纤维素衍生物;粘合剂,例如明胶或聚乙烯吡咯烷酮;和/或润滑剂,例如硬脂酸镁,硬脂酸钙,聚乙二醇,蜡,石蜡等,然后压制成片剂。如果需要包衣片剂,则如上所述制备的片芯可用浓缩的糖溶液包衣,所述糖溶液可包含例如阿拉伯树胶、明胶、滑石和二氧化钛。或者,片剂可以用溶解在易挥发性有机溶剂中的合适的聚合物包衣。
为了制备软明胶胶囊,本发明的化合物可以与例如植物油或聚乙二醇混合。硬明胶胶囊可以含有化合物颗粒,使用上述片剂的赋形剂。也可将本发明化合物的液体或半固体制剂填充入硬明胶胶囊中。
用于口服应用的液体制剂可以是糖浆剂或混悬剂的形式,例如含有本发明化合物的溶液,其余为糖和乙醇、水、甘油和丙二醇的混合物。任选地,这样的液体制剂可以含有着色剂、调味剂、甜味剂(例如糖精)、防腐剂和/或羧甲基纤维素作为增稠剂或本领域技术人员已知的其它赋形剂。
对于肠胃外(例如静脉内)施用,本发明化合物可以作为无菌水性或油性溶液施用。本发明的化合物是非常亲脂性的。因此,水性制剂可能也将含有药学上可接受的极性有机溶剂。
根据众所周知的医学原理,本发明化合物用于治疗目的的剂量大小将根据病况的性质和严重性、动物或患者的年龄和性别以及施用途径而自然变化。
预期本发明化合物的剂量水平、给药频率和治疗持续时间根据制剂和临床适应症、患者的年龄和共患疾病而不同。
除了本发明的化合物之外,用于治疗癌症的治疗方法或化合物可以包括常规手术或放疗或化疗。这种化疗可包括施用一种或多种其他活性剂。
当另外的活性剂作为本发明的治疗方法的一部分施用时,这种组合治疗可以通过同时、相继或分开施用治疗的各个组分来实现。此类组合产品使用上文所述的治疗有效剂量范围内的本发明化合物和其批准剂量范围内的一种或多种其他药物活性剂。
因此,本发明的药剂制剂可包含另一种活性剂。
所述一种或多种其他活性剂可以是以下类别的抗肿瘤剂中的一种或多种:
(i)抗增殖/抗肿瘤药物及其组合,例如烷化剂(例如环磷酰胺,氮芥,苯达莫司汀(bendamustin),美法仑(melphalan),苯丁酸氮芥(chlorambucil),白消安(busulphan),替莫唑胺(temozolamide)和亚硝基脲);抗代谢物(例如,吉西他滨和抗叶酸剂如氟嘧啶如5-氟尿嘧啶和替加氟(tegafur),雷替曲塞(raltitrexed),甲氨蝶呤(methotrexate),培美曲塞(pemetrexed),阿糖胞苷(cytosine arabinoside)和羟基脲);抗生素(例如蒽环类药物(anthracyclines)如阿霉素(adriamycin),博莱霉素(bleomycin),多柔比星,道诺霉素(daunomycin),表柔比星(epirubicin),伊达比星(idarubicin),丝裂霉素-C,放线菌素和光神霉素(mithramycin));抗有丝分裂剂(例如长春花生物碱如长春新碱(vincristine),长春花碱(vinblastine),长春地辛(vindesine)和长春瑞滨(vinorelbine)以及紫杉烷类如紫杉酚和泰索帝(taxotere)和polo激酶(polokinase)抑制剂);蛋白酶体抑制剂,例如卡非佐米(carfilzomib)和硼替佐米(bortezomib);干扰素疗法;铂(例如顺铂(cicplatin)和卡波铂(carboplatin));和拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素如依托泊苷(etoposide)和替尼泊苷(teniposide),安吖啶(amsacrine),拓扑替康,米托蒽醌(mitoxantrone)和喜树碱(camptothecin));
(ii)细胞生长抑制剂(cytostatic agent),例如抗雌激素药(例如他莫昔芬(tamoxifen),氟维司群(fulvestrant),托瑞米芬(toremifene),雷洛昔芬(raloxifene),屈洛昔芬(droloxifene)和吲哚昔芬(iodoxyfene)),抗雄激素药(例如比卡鲁胺(bicalutamide),氟他胺(flutamide),尼鲁米特(nilutamide)和醋酸环丙孕酮(cyproterone acetate)),LHRH拮抗剂或LHRH激动剂(例如戈舍瑞林(goserelin),亮丙瑞林(leuprorelin)和布舍瑞林(buserelin)),孕激素(例如醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)),芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑(anastrozole),来曲唑(letrozole),伏氯唑(vorazole)和依西美坦(exemestane))和5α-还原酶抑制剂如非那甾胺(finasteride);
(iii)抗侵袭剂,例如达沙替尼(dasatinib)和波舒替尼(bosutinib)(SKI-606);以及金属蛋白酶抑制剂,尿激酶型纤溶酶原激活物受体功能抑制剂或乙酰肝素酶抗体;
(iv)生长因子功能抑制剂:例如,这样的抑制剂包括生长因子抗体和生长因子受体抗体,例如抗erbB2抗体曲妥珠单抗(trastuzumab)[HerceptinTM],抗EGFR抗体帕尼单抗(panitumumab),抗erbB1抗体西妥昔单抗(cetuximab),酪氨酸激酶抑制剂,例如表皮生长因子家族抑制剂(例如EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂,如吉非替尼(gefitinib),厄洛替尼(erlotinib)和6-丙烯酰氨基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉代丙氧基)-喹唑啉-4-胺(CI1033),erbB2酪氨酸激酶抑制剂如拉帕替尼(lapatinib));肝细胞生长因子家族抑制剂;胰岛素生长因子家族抑制剂;细胞凋亡调控蛋白质调节剂(例如Bcl-2抑制剂);血小板衍生的生长因子家族抑制剂,例如伊马替尼(imatinib)和/或尼罗替尼(nilotinib)(AMN107);丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂(例如Ras/Raf信号传导抑制剂如法呢基转移酶抑制剂,例如索拉非尼(sorafenib),替比法尼(tipifarnib)和洛那法尼(lonafarnib)),通过MEK和/或AKT激酶的细胞信号传导抑制剂,c-kit抑制剂,abl激酶抑制剂,PI3激酶抑制剂,Plt3激酶抑制剂,CSF-1R激酶抑制剂,IGF受体,激酶抑制剂;极光激酶抑制剂和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂,例如CDK2和/或CDK4抑制剂;
(v)抗血管生成剂,例如抑制血管内皮生长因子作用的那些,[例如抗血管内皮细胞生长因子抗体贝伐单抗(bevacizumab)(AvastinTM));沙利度胺(thalidomide);来那度胺(lenalidomide);例如VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂,例如凡德他尼(vandetanib),瓦他拉尼(vatalanib),舒尼替尼(sunitinib),阿西替尼(axitinib)和帕唑帕尼(pazopanib);
(vi)基因疗法,包括例如替代异常基因例如异常p53或异常BRCA1或BRCA2的方法;
(vii)免疫疗法,包括例如抗体疗法,例如阿仑单抗(alemtuzumab),利妥昔单抗(rituximab),替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)和奥法木单抗(ofatumumab);干扰素如干扰素α;白细胞介素例如IL-2(阿地白介素(aldesleukin));白细胞介素抑制剂,例如IRAK4抑制剂;癌症疫苗,包括预防性和治疗性疫苗,如HPV疫苗,例如Gardasil,Cervarix,Oncophage和Sipuleucel-T(Provenge);和toll样受体调节剂,例如TLR-7或TLR-9激动剂;以及
(viii)细胞毒性剂,例如氟达拉滨(fludaribine)(福达华(fludara)),克拉屈滨(cladribine),喷司他丁(pentostatin)(NipentTM);
(ix)类固醇如皮质类固醇,包括糖皮质激素和盐皮质激素,例如阿氯米松(aclometasone),阿氯米松双丙酸酯,醛固酮,安西奈德(amcinonide),倍氯米松(beclomethasone),倍氯米松双丙酸酯,倍他米松(betamethasone),倍他米松双丙酸酯,倍他米松磷酸钠,倍他米松戊酸酯,布地奈德(budesonide),氯倍他松(clobetasone),氯倍他松丁酸酯,氯倍他索丙酸酯,氯泼尼醇(cloprednol),可的松(cortisone),醋酸可的松,可的伐唑(cortivazol),去氧皮质酮(deoxycortone),地奈德(desonide),去羟米松(desoximetasone),地塞米松(dexamethasone),地塞米松磷酸钠,地塞米松异烟酸酯,二氟可龙(difluorocortolone),氟氯洛龙(fluclorolone),氟米松(flumethasone),氟尼缩松(flunisolide),氟轻松(fluocinolone),氟轻松安奈德(fluocinolone acetonide),醋酸氟轻松(fluocinonide),氟考丁酯(fluocortin butyl),氟可的松(fluorocortisone),氟可龙(fluorocortolone),氟可龙己酸酯(fluocortolone caproate),氟可龙新戊酸酯(fluocortolone pivalate),氟米龙(fluorometholone),氟泼尼定(fluprednidene),氟泼尼定乙酸酯,氟氢缩松(flurandrenolone),氟替卡松(fluticasone),氟替卡松丙酸酯(fluticasone propionate),哈西奈德(halcinonide),氢化可的松(hydrocortisone),氢化可的松乙酸酯,氢化可的松丁酸酯,氢化可的松醋丙酯(hydrocortisone aceponate),氢化可的松丁丙酸酯(hydrocortisone buteprate),氢化可的松戊酸酯,艾可米松(icomethasone),醋丁艾可米松(icomethasone enbutate),甲泼尼松(meprednisone),甲泼尼龙(methylprednisolone),莫米松(mometasone)帕拉米松(paramethasone),糠酸莫米他松一水合物(mometasone furoate monohydrate),泼尼卡酯(prednicarbate),泼尼松龙(prednisolone),泼尼松(prednisone),替可的松(tixocortol),替可的松新戊酸酯,曲安奈德(triamcinolone),醋酸曲安奈德(triamcinolone acetonide),曲安奈德醇及其各自药学上可接受的衍生物。可以使用类固醇的组合,例如本段中提及的两种或更多种类固醇的组合;
(x)靶向疗法,例如PI3Kd抑制剂,例如爱拉利西(idelalisib)和哌立福辛(perifosine);或抑制PD-1、PD-L1和CAR T的化合物。
所述一种或多种其他活性剂也可以是抗生素。
“癌症干细胞”
癌症干细胞,有时也被称为“肿瘤起始细胞”,是本领域技术人员公知的。如本文所用,术语“癌症干细胞”应根据其广泛接受的含义来解释,它是一种具有通过不对称分裂自我更新、引发肿瘤形成和通过分化产生更成熟的非干细胞癌后代的能力的细胞。
癌症干细胞在癌症的发展、进展、复发和传播中起主要作用。因此,本发明化合物能够靶向癌症干细胞并从而减少其数量这一发现提供了预防或治疗这些活动的治疗可能性。
如本说明书中其他地方更详细讨论的,癌症干细胞存在于癌前病况中,在其中它们的存在被认为有助于这些病况发展成癌症。因此,其中本发明化合物用于靶向癌症干细胞的本发明的治疗方法和医学用途可用于减少癌前病况(例如骨髓增生异常综合征,或本说明书中其他地方考虑的其他病况)中的癌症干细胞数量,并因此防止这种癌前病况进展为癌症。
如上所述,癌症干细胞的不对称细胞分裂产生分化的非干细胞癌细胞。因此,癌症干细胞负责大部分肿瘤的形成和维持。
这种非干细胞癌细胞的积累在癌症的进展中起主要作用。通过本发明化合物靶向癌症干细胞能够减少癌症干细胞数量,这反过来减少了非干细胞癌细胞后代的数量。因此,根据本发明的本发明治疗方法和化合物的医学用途通过预防癌症进展而有益于治疗癌症。在本说明书的其他地方更详细地描述了这些实施方案。
癌症干细胞还能够充当癌细胞的储库,它们可以引起癌症缓解后的复发。即使在大多数的患者癌细胞已被去除(例如通过单独或联合使用的手术、放疗或化疗)从而没有可观察到的癌症迹象的情况下,癌症干细胞的持续存在也可能使癌症的复发随时间集结(nucleate)。通过本发明化合物靶向癌症干细胞提供了一种新模式,通过该模式可以减少癌症干细胞数量并杀死癌症干细胞。因此,并且如在说明书中其他地方更详细讨论的,在合适的实施方案中,本发明提供了这样的方法和医学用途,其中本发明的化合物预防或延迟癌症的复发。
此外,癌症干细胞从癌症部位移动到体内的另一个位置可以促进癌症的传播,例如通过引起转移。因此,本发明化合物靶向癌症干细胞的能力因此提供了预防或治疗癌症传播的新治疗方法和医学用途。
除了它们的生物学活性之外,癌症干细胞可以通它们某些特征性细胞表面标志物的表达来鉴定。在血液系统恶性肿瘤中鉴定的癌症干细胞通常是CD34+,而在实体瘤中CD44+、CD133+和CD90+被鉴定为癌症干细胞标志物。下表总结了已知癌症干细胞表面表型的实例。预期这些形式的癌症干细胞中的每一种都可以根据本发明使用本发明化合物进行靶向,因此使用了本发明化合物的方法或用途可以用于预防或治疗与表达任意这些标记物组的癌症干细胞相关的癌症。
实施例中呈现的数据证明,本发明的化合物能够靶向白血病干细胞系的癌症干细胞,特别是存在于急性髓性白血病细胞系KG1a中的癌症干细胞。该细胞系表现出具有独特的免疫表型(Lin-/CD34+/CD38-/CD123+)的较小的干细胞样区室,其被本发明化合物靶向。因此,根据本发明的治疗方法或本发明化合物的医学用途可用于预防或治疗与表达这些特征性标志物的癌症干细胞相关的白血病或其他癌症。
本发明还提供了这样的方法和医学用途,其中基于鉴定癌症干细胞在代表患者癌症或癌前病况的生物样品中的存在来选择患者以使用本发明化合物进行癌症的预防或治疗。上述标志物提供了可用于根据本发明的此类实施方案鉴定是否存在癌症干细胞的合适实例。在本说明书的其他地方进一步考虑了可以在生物样品中研究这些标志物的表达的合适技术。
“靶向癌症干细胞”
本发明提供了本发明化合物可用于靶向癌症干细胞的第一指征(indication)。本说明书中公开的实施例说明了本发明化合物靶向癌症干细胞的能力。
从实施例中可以看出,当将本发明的化合物提供给含有癌症干细胞的癌细胞群时,其靶向存在的癌症干细胞,导致癌细胞的总数和呈现癌症干细胞表型标志物的总癌细胞的比例减少。
虽然母体前药化合物克拉屈滨能够以某些较高浓度靶向癌症干细胞,但本发明化合物显示出在较宽范围的浓度下实现这种靶向的能力。值得注意的是,体外研究(其结果在本申请中报道)表明,本发明化合物能够在低浓度下比克拉屈滨更有效地靶向癌症干细胞。在某些浓度下,癌症干细胞靶向上的提高使得用本发明化合物处理的细胞群中残留癌症干细胞的比例显著低于用克拉屈滨处理的细胞群。应当理解,通常需要在低浓度的细胞毒性剂下实现有效靶向癌症干细胞的能力,因为这降低了不希望的副作用的可能性。
据信,本发明的化合物具有增强的细胞膜通透性(与克拉屈滨相比),并且这有助于本发明化合物的抗癌效力相较于衍生它们的母体核苷增强。
不希望受任何假说的束缚,发明人认为癌症干细胞数量的减少是由于靶向杀死癌细胞群中的癌症干细胞而产生的。也就是说,与杀死非干细胞癌细胞相比,本发明的化合物似乎优先杀死癌症干细胞,从而导致癌症干细胞死亡,以及总癌细胞群中癌症干细胞的比例减少。
虽然本发明人认为与非干细胞癌细胞相比,本发明化合物优先杀死癌症干细胞,但是其他机制也可能有助于由本发明化合物靶向这些细胞而引起的癌症干细胞的比例减少。
仅举例来说,用本发明化合物治疗可以引起癌症干细胞分化的增加,从而减少癌症干细胞数量以及由癌症干细胞代表的总癌细胞的比例。或者,本发明化合物可使癌症干细胞丧失其干细胞表型,例如丧失其自我更新能力,从而减少癌症干细胞数量。
应当相应地解释本公开中提及靶向癌症干细胞的内容。出于本公开的目的,“靶向”癌症干细胞可以被认为包括本发明化合物减少细胞群中存在的癌症干细胞的比例的任何机制,无论是体外还是体内。特别地,靶向癌症干细胞可以被认为包括与其他细胞类型相比,特别是与非干细胞癌细胞相比,优先杀死癌症干细胞。
“预防或治疗癌症”
本发明提供了这样的医学用途和治疗方法,其中使用本发明的化合物来预防或治疗癌症。在本发明的上下文中,癌症的“预防”被认为涉及在癌症发展之前使用的本发明化合物的预防性应用,目的是阻止癌症发展。另一方面,癌症的“治疗”被认为涉及在癌症发生之后使用本发明化合物,目的是通过减缓或阻止癌细胞增殖和肿瘤生长来减轻癌症。有利地,癌症的治疗可以导致癌细胞数量和肿瘤大小的部分或完全减少。根据RECIST(实体瘤的疗效评价标准(Response Evaluation Criteria In Solid Tumours))规则,癌症的有效治疗可能导致疾病“稳定”或“缓解(respond)”。
如下文更详细描述的,根据本发明的癌症预防对于具有增加其发展癌症可能性的癌前病况的患者可能是特别有益的。
“预防癌症”
根据本发明的癌症预防可以通过使用本发明的化合物根据本文所述的本发明的多个方面或实施方案对癌前病况进行治疗来实现。
特别地,在本发明的上下文中,癌症预防可以通过本发明的方法或医学用途来实现,其中将本发明的化合物提供给患有癌前病况的患者。根据该实施方案的治疗方法或医学用途可以防止所治疗的癌前病况发展成癌症,从而提供有效的癌症预防。
在本发明的上下文中提及癌症预防还可以包括本发明化合物的其他预防性应用。例如,本发明化合物靶向癌症干细胞从而预防癌症发展和/或预防癌症进展和/或预防癌症复发和/或预防癌症传播的能力。
“癌前病况”
癌症之前经常发生癌前病况,其本身不是癌症,但与癌症风险增加有关。遗传或表观遗传变化的累积可能导致先前正常的细胞发展成癌症干细胞表型。因此,癌症干细胞也可以存在于这种癌前病况中以及癌症病况中。
据信,癌前病况中癌症干细胞的存在有助于这些病况发展成癌症。本发明的方法和医学用途可用于靶向癌前病况中存在的癌症干细胞,从而治疗这些病况。应当理解,本发明化合物靶向癌症干细胞这一新的且意外的发现意味着用这些化合物治疗癌前病况可用于预防所治疗的病况发展成癌症。这代表了本发明化合物可以在医学上用于预防癌症的方式,如本说明书中其他地方所认为的。
可根据本发明治疗的癌前病况的实例包括但不限于选自由以下组成的组的那些:光化性角化病、Barrett食管、萎缩性胃炎、先天性角化不良、缺铁性吞咽困难、扁平苔藓、口腔粘膜下纤维化、日光弹性纤维变性、宫颈非典型增生(cervical dysplasia)、黏膜白斑、黏膜红斑、意义不明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、单克隆B细胞淋巴细胞增多症(MBL)、骨髓增生异常综合征以及胃的癌前病况如萎缩性胃炎、胃溃疡、恶性贫血、残胃(gastricstump)、胃息肉和Ménétrier病。在所列出的胃的癌前病况中,萎缩性胃炎、恶性贫血、残胃和某些类型的胃息肉可能具有特别高的发展成癌症的风险。
癌前病况通常表现为包括非典型增生的细胞或增生的细胞的病变形式。因此,作为表达癌症干细胞特征性标志物或表型的细胞的存在的替代或补充,发育异常或增生的存在可用于鉴定癌前病况。
发育异常的严重程度可以因不同的癌前病况而已,或者因单个癌前病况随时间的发展而异。一般来说,与癌前病况相关的发育异常越晚期,癌前病况发展为癌症的可能性越大。发育异常通常分为轻度、中度或重度。如果不治疗,重度发育异常通常会发展为癌症。适当地,使用了本发明化合物的治疗方法或医学用途因此可用于治疗患有与重度发育异常相关的癌前病况的患者。
在本发明的一个合适的实施方案中,本发明化合物用于治疗患有重度宫颈非典型增生的患者。重度宫颈非典型增生可以通过涂片检查的手段来诊断。在本发明的另一个实施方案中,本发明化合物用于治疗重度食管非典型增生(“Barrett食管”)。在组织活检后可以诊断出重度食管非典型增生。
最近已经报道,还可以通过检测未知患有癌症的个体的细胞中的体细胞突变来鉴定癌症前兆(pre-malignancy)。特别地,据报道,与年龄相关的克隆性造血是一种常见的癌前病况,其与总体死亡率增加和心血管代谢疾病风险增加有关。在血细胞中检测到的大多数突变发生在三个基因中:DNMT3A、TET2和ASXL1。因此,受益于使用本发明化合物靶向癌症干细胞并由此治疗癌前病况的患者可以通过测定包含血细胞的样品中的DNMT3A和/或TET2和/或ASXL1中的至少一个中是否存在指示癌前病况的遗传突变来鉴定。
可能受益于根据本发明的用本发明化合物治疗以靶向癌症干细胞的癌前病况也可以通过参考任意基于癌症干细胞特征性标志物或癌症干细胞表型的表达的技术(在说明书的其他地方有讨论)来确定是否存在癌症干细胞来鉴定。
“癌症的治疗”
技术人员将理解,可以通过许多测量法来评估癌症的“治疗”。仅作为示例,癌症发展、癌症进展、癌症复发或癌症传播的任何减少或预防均可以被认为表示癌症的有效治疗。
在某些实施方案中,本发明的化合物可用于:降低癌细胞群中癌症干细胞的比例;和/或抑制肿瘤生长;和/或减少致肿瘤性;和/或预防或治疗原发性癌症;和/或预防或治疗复发性癌症;和/或预防或治疗转移性或继发性癌症;和/或治疗、预防或抑制转移或复发;和/或治疗或预防难治性癌症。
使用本发明化合物进行癌症治疗以使肿瘤尺寸减小并在施用治疗期间/之后维持肿瘤尺寸减小的能力代表了有效癌症治疗的特别相关的指征。如实施例中所述,本发明的治疗或医学用途已经证明在这方面出人意料地有效,甚至在使用代表复发性或难治性癌症(这些癌症先前对用其他疗法治疗有抗性)的细胞的模型中也是如此。
实施例中呈现的数据说明用本发明化合物治疗降低了癌细胞群中癌症干细胞的比例。可以鉴定癌症干细胞的特征性生物活性或细胞表面标志物在说明书的其他地方描述。在一个合适的实施方案中,根据本发明的癌症治疗可以使患者癌症中存在的癌症干细胞的比例减少至少10%、至少20%、至少30%或至少40%。在合适的实施方案中,根据本发明的癌症治疗可以使患者癌症中存在的癌症干细胞的比例减少至少50%、至少60%、至少70%或至少80%。根据本发明的癌症治疗可以使患者癌症中存在的癌症干细胞的比例减少至少85%、至少90%或至少95%。实际上,根据本发明的癌症治疗可以使患者癌症中存在的癌症干细胞的比例减少至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或者甚至100%(使得基本上没有癌症干细胞残留)。
癌症干细胞的不对称分裂有助于肿瘤的生长。根据本发明用本发明化合物治疗癌症可使肿瘤生长抑制至少10%、至少20%、至少30%或至少40%。根据本发明适当地治疗癌症可使肿瘤生长抑制至少50%、至少60%、至少70%或至少80%。根据本发明治疗癌症可以在如此治疗的患者中使肿瘤生长抑制至少85%、至少90%或至少95%。实际上,根据本发明治疗癌症可以在所治疗的癌症中使肿瘤生长抑制至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或甚至100%。
可以通过任意合适的方法来评估肿瘤生长,其中随时间评估肿瘤尺寸的变化。适当地,可以将癌症治疗前肿瘤的尺寸与同一个肿瘤在癌症治疗期间或之后的尺寸进行比较。已知有多种方式可以评估肿瘤的尺寸。例如,可以通过在患者体内原位对肿瘤成像来评估肿瘤的尺寸。合适的技术,例如成像技术,能够确定肿瘤的体积,并评估肿瘤体积的变化。
如本说明书的实施例中列出的结果所示,本发明的治疗方法和本发明化合物的医学用途不仅能够阻止肿瘤生长,而且实际上能够使癌症患者(包括复发性或难治性癌症患者)的肿瘤体积减小。根据本发明适当地治疗癌症可以使肿瘤体积减小至少10%、至少20%、至少30%或至少40%。在合适的实施方案中,根据本发明治疗癌症可以使肿瘤体积减小至少50%、至少60%、至少70%或至少80%。根据本发明治疗癌症可以使肿瘤体积减小至少85%、至少90%或至少95%。实际上,根据本发明治疗癌症可以使肿瘤体积减小至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或甚至100%。
上述那样的肿瘤体积的减小可以参考合适的对照来计算。例如,在合适的动物模型中体外或体内进行的研究中,肿瘤体积的减小可以通过直接比较用本发明化合物治疗的肿瘤的体积和对照肿瘤(它可以是未经治疗的,或者可以接受除本发明化合物以外的治疗)的体积来确定。应当理解,在临床试验或患者的治疗管理的背景下,这种需要缺乏肿瘤治疗的模型可能在伦理上是不可接受的,在这种情况下,肿瘤体积的减小可以通过比较治疗后肿瘤的体积与同一个肿瘤在治疗前的体积或者未经治疗的肿瘤可达到的预测体积来评估。
本发明化合物的治疗方法和医学用途可以使指示癌症的生物标志物减少。这种生物标志物的减少提供了进一步的评估,通过该评估可以证明癌症的有效治疗。可以根据待治疗的癌症类型选择此类生物标志物的合适实例:在妇科癌症的情况下,CA125代表生物标志物的合适实例,而在胰腺癌或胆道癌(biliary cancer)的情况下,CA19.9代表生物标志物的合适实例,并且在结直肠癌的情况下,CEA可以是合适的生物标志物。
根据本发明适当地治疗癌症可以使癌症生物标志物减少至少10%、至少20%、至少30%或至少40%。在合适的实施方案中,根据本发明的癌症治疗可以使癌症生物标志物降低至少50%、至少60%、至少70%或至少80%。根据本发明的癌症治疗可以使癌症生物标志物减少至少85%、至少90%或至少95%。实际上,根据本发明的癌症治疗可以使癌症生物标志物减少至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或甚至100%。
在根据本发明的癌症治疗中观察到的有益效果,例如存在的癌症干细胞的比例减少、肿瘤生长减少或肿瘤体积或癌症生物标志物减少可以维持至少一个月。适当地,这种有益效果可以维持至少两个月、至少三个月、至少四个月、至少五个月或者至少六个月。实际上,这种有益效果可以维持至少12个月、至少18个月或至少24个月。适当地,该有益效果可以维持至少三年、至少四年、至少五年、至少六年、至少七年、至少八年、至少九年或十年或更长。
在本发明的一个合适的实施方案中,本发明化合物通过靶向癌症干细胞用于预防或治疗癌症或癌前病况的方法中。在一个合适的实施方案中,本发明提供了本发明化合物在预防或治疗癌症或癌前病况的方法中的用途,其中所述方法降低了一种或多种癌症干细胞的致肿瘤性。适当地,此类方法可以预防癌症的进展或抑制肿瘤生长。
当本发明化合物用于本发明的方法或医学用途中以预防或治疗癌症的进展时,这种预防或治疗可以导致癌症进展减慢、延迟或完全停止。
癌症的进展通常通过为癌症指定阶段来确定。分期通常通过为癌症指定从I到IV的数字来进行,I是孤立的癌症,IV是已经扩散到评估测量极限的癌症。分期的具体情况因癌症而异,但阶段通常考虑到肿瘤的大小、是否侵入邻近器官、它已扩散到多少区域性(附近的)淋巴结(如果有的话)以及是否已出现在较远的地方(转移)。
通常,I期位于身体的一个部分并且可以通过手术切除进行治疗(对于足够小的实体瘤)。II期是局部晚期,可通过化学疗法、放射疗法、手术或其组合治疗。III期也是局部晚期,II期或III期的指定取决于癌症的具体类型,但是III期通常被认为是“晚的”局部晚期。IV期癌症经常已转移到第二器官。在本发明的方法或医学用途中使用本发明化合物治疗癌症可用于通过靶向癌症干细胞来治疗I、II、III或IV期癌症。用本发明化合物治疗可用于预防癌症从一个阶段进展到下一个阶段。在一个实施方案中,用本发明化合物治疗用于预防从I期进展到II期。在另一个实施方案中,用本发明化合物治疗用于预防从II期进展到III期。在另一个实施方案中,用本发明化合物治疗用于预防从III期进展到IV期。
预防或抑制癌症的进展对于预防癌症的扩散尤其重要,例如从I期进展为II期,其中癌症在局部扩散,或从III期进展为IV期,其中癌症转移到其他器官。癌症干细胞是致肿瘤的,因此被认为在癌症的局部和转移性扩散中发挥关键作用。因此,使用了本发明化合物的本发明治疗方法或医学用途可以通过靶向致肿瘤性癌症干细胞并因此减少其数量来预防癌症的扩散。
“癌症”
与衍生本发明某些化合物的克拉屈滨相比,本发明的某些化合物显示出增强的抗癌活性。这种抗癌活性的增强似乎是由于对癌症干细胞和非干细胞癌细胞的活性增加所致。
癌症干细胞在多种癌症的生物活性中起作用。因此,根据本发明可以预防或治疗多种癌症。
如本文其他地方所讨论的,已知癌症干细胞存在于多种肿瘤类型中,包括液体肿瘤(包括血液肿瘤,例如白血病和淋巴瘤)和实体瘤(例如乳腺、肺、结肠、前列腺、卵巢、皮肤、膀胱、胆道和胰腺肿瘤)。因此预期靶向癌症干细胞的本发明化合物的治疗方法和医学用途可用于预防或治疗此类癌症。
适当地,本发明化合物可用于预防或治疗选自由以下组成的组的癌症:白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、头颈癌、神经母细胞瘤、甲状腺癌、皮肤癌(包括黑色素瘤)、口腔鳞状细胞癌、膀胱癌、Leydig细胞瘤、胆道癌(如胆管细胞癌或胆管癌)、胰腺癌、结肠癌、结直肠癌和妇科癌症(包括卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌、子宫癌和宫颈癌(包括宫颈上皮细胞癌))。在合适的实施方案中,癌症是白血病并且可以选自由以下组成的组:急性成淋巴细胞性白血病、急性髓源性白血病(也称为急性髓性白血病或急性非淋巴细胞白血病)、急性早幼粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓源性白血病(也是称为慢性髓性白血病、慢性髓细胞白血病或慢性粒细胞白血病)、慢性淋巴细胞白血病、单核细胞白血病和毛细胞白血病。在进一步优选的实施方案中,癌症是急性成淋巴细胞性白血病。在一个合适的实施方案中,癌症是淋巴瘤,其可以选自由以下组成的组:霍奇金淋巴瘤;非霍奇金淋巴瘤;伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma);和小淋巴细胞淋巴瘤。
适当地,靶向此类癌症中的癌症干细胞可以通过预防或治疗癌症的发展、通过预防或治疗癌症的进展、通过预防或治疗癌症的复发或通过预防或治疗癌症的传播而实现癌症的有效治疗。
在一个合适的实施方案中,本发明提供了用于靶向癌症干细胞以预防或治疗转移性癌症的本发明化合物。
在一个合适的实施方案中,本发明提供了用于靶向癌症干细胞以治疗复发性或难治性癌症的本发明化合物。
在一个合适的实施方案中,本发明提供了用于靶向癌症干细胞以治疗原发性癌症的本发明化合物。适当地,所治疗的原发性癌症可以是第二原发性癌症。
本发明提供了用于靶向癌症干细胞以治疗继发性癌症的本发明化合物。在一个合适的实施方案中,继发性癌症是转移性癌症。
在一个合适的实施方案中,本发明提供了用于靶向癌症干细胞的本发明化合物,其中癌症干细胞的靶向预防或抑制:(i)癌症的复发;(ii)第二原发性癌症的发生;或(iii)癌症的转移。
基于本发明化合物的靶向癌症干细胞的能力而使用了本发明化合物的治疗方法或医学用途可用于治疗复发性或难治性癌症。除了上下文另有要求之外,在该类实施方案中关于复发性或难治性癌症的考虑因素与关于本发明其他方面的复发性或难治性癌症的治疗相同。
“复发性或难治性癌症”
如上所述,本发明的某些方面和实施方案特别涉及本发明化合物在治疗复发性或难治性癌症中的用途。
出于本发明的目的,难治性癌症可以被视为对除使用本发明化合物以外的抗癌疗法的治疗表现出抗性的癌症。例如,本发明化合物可用于治疗对用放射疗法治疗有抗性的难治性癌症。或者或另外,本发明化合物可用于治疗对癌症治疗中所使用的生物剂有抗性的难治性癌症。在一个合适的实施方案中,本发明化合物可用于治疗对用除本发明化合物以外的化学治疗剂的治疗有抗性的难治性癌症。
特别地,可受益于采用了本发明化合物的本发明治疗方法或医学用途的难治性癌症包括对克拉屈滨具有抗性的那些癌症。
复发性癌症(relapsed cancer)(或复发性癌症(recurrent cancer))是在缓解期后复发的癌症,在缓解期期间癌症不能被检测到。癌症复发可能发生在原始癌症部位(局部癌症复发)、接近原始癌症的部位(区域性癌症复发)或远离原始癌症的部位(远端癌症复发)。癌症干细胞被认为在癌症的复发中起作用,提供了产生复发性癌症的细胞的来源。因此,根据本发明的治疗方法和本发明化合物的医学用途(其能够靶向癌症干细胞),在复发性癌症的背景下可能具有很大益处。本发明化合物靶向癌症干细胞的能力可用于除去能够引起复发的这些细胞群,从而预防复发性癌症的发生。本发明化合物的抗癌症干细胞活性也可用于靶向已经复发的癌症中的癌症干细胞,并且可能对非干细胞癌细胞发挥细胞毒性作用,从而提供复发性癌症的治疗。
鉴于以上所述,应理解,本发明化合物可用于本发明的方法或用途中,用于预防或治疗复发性癌症。本发明化合物可用于本发明的方法或用途中,用于预防或治疗局部(local)、区域性(regional)或远端复发性癌症。
本发明的化合物可用于本发明的方法或用途,以通过提供至少2个月、至少6个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或至少30个月的缓解期来预防癌症的复发。实际上,本发明的化合物可用于通过提供至少4年、至少5年、至少6年、至少7年、至少8年、至少9年或至少10年的缓解期来预防癌症的复发。
本发明的化合物可用于本发明的方法或用途,以治疗在至少2个月、至少6个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或至少30个月的缓解期后复发的复发性癌症。实际上,本发明的化合物可用于治疗在至少4年、至少5年、至少6年、至少7年、至少8年、至少9年或至少10年的缓解后复发的复发性癌症。
本发明化合物靶向癌症干细胞的能力产生了这些化合物根据本发明的医学用途或治疗方法来预防或治疗癌症的能力。然而,应该注意的是,本发明化合物还对构成肿瘤的大部分的非干细胞癌细胞发挥直接的细胞毒性作用。虽然癌症干细胞的活性可能是使复发性或难治性癌症难以治疗的大部分抗性的基础,但非干细胞癌细胞也是这种复发性或难治性癌症的主要成分。
本发明的某些化合物对非干细胞癌细胞发挥比克拉屈滨(衍生本发明化合物的化学治疗分子)更大的细胞毒性作用。因此,本发明化合物在治疗复发性或难治性癌症中的作用机制可能不仅限于该化合物的抗癌症干细胞活性,还可能利用了本发明化合物对非干细胞癌细胞的作用。在这种用途中,用本发明化合物治疗将减少癌症干细胞和非干细胞癌细胞的总数,但优先降低治疗后残留的癌症干细胞的比例。
治疗有效剂量的本发明化合物
治疗有效量的本发明化合物可以是足以诱导癌细胞死亡的量。治疗有效量的本发明化合物可以是足以诱导癌症干细胞死亡的量。在一些实施方案中,特别是与治疗复发性或难治性癌症有关的实施方案中,治疗有效量的本发明化合物可以是足以诱导癌症干细胞死亡并且还诱导非干细胞癌细胞死亡的量。
有多种不同的方式来计算和表达待向患者施用的治疗有效化合物(例如本发明化合物)的量。一种方式是待施用的药剂的量/单位患者体表面积,该方式被认为与用于预防或治疗癌症的药剂的剂量特别相关。此类剂量通常以药剂的量(可由质量确定)/平方米(m2)表面积表示。
贯穿本说明书的描述和权利要求书,词语“包含”和“含有”及其变体意指“包括但不限于”,并且其不旨在(且不是)排除其他部分、添加剂、组分、整数或步骤。贯穿本说明书的描述和权利要求书,除非上下文另有要求,否则单数涵盖复数。特别地,在使用不定冠词的情况下,除非上下文另有要求,否则说明书应被理解为考虑复数以及单数。
结合本发明的特定方面、实施方案或示例描述的特征、整体、特性、化合物、化学部分或组应被理解为适用于本文所述的任意其它方面、实施方案或示例,除非与其不兼容。本说明书(包括任意所附权利要求、摘要和附图)中公开的所有特征和/或如此公开的任意方法或过程的所有步骤可以任意组合,除了这些特征和/或步骤中的至少一些相互排斥的组合之外。本发明不限于任意前述实施方案的细节。本发明延伸至本说明书(包括任意所附权利要求书、摘要和附图)中公开的任一新特征或任意新特征组合,或如此公开的任意方法或过程的任一新步骤或任意新步骤组合。
读者的关注指向与本申请有关的与本说明书同时提交或在本说明书之前提交的并且与本说明书一起公开于公众的所有文章和文件,并且所有这些文章和文件的内容通过引用并入本文。
实施例
实施例1-合成方法
在本说明书中,下列缩写具有以下含义:
DCM–二氯甲烷 DMF–N,N-二甲基甲酰胺
TBDMS–叔丁基二甲基甲硅烷基 TFA–三氟乙酸
THF–四氢呋喃 MeOH–甲醇
br s–宽信号 tBuMgCl–叔丁基氯化镁
5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基克拉屈滨A
将克拉屈滨(0.25g,0.88mmol)溶于无水DMF(10mL)中,在氩气环境下加入TBDMSCl(0.15g,1.03mmol)和咪唑(0.26g,3.82mmol)。将混合物在室温下搅拌24小时,然后加入水。将沉淀物滤出并通过硅胶柱色谱法纯化,得到3',5'-双-O-叔丁基二甲基甲硅烷基克拉屈滨(0.12g,27%)和所需产物(0.12g,34%)。
1H NMR(500MHz,DMSO):δ8.28(1H,s,H-8),7.78(2H,br s,NH2),6.26(1H,t,J=6.6Hz,H-1’),5.39(1H,br s,3’-OH),4.40(1H,m,H-3’),3.87(1H,m,H-4’),3.84–3.68(2H,m,2x H-5’),2.69,2.33(2H,2x m,2x H-2’)0.85(9H,s,C(CH3)3),0.02(6H,s,Si(CH3)2)。
标准方法A
在氩气下将保护的核苷A(78mg,0.20mmol)溶解在无水四氢呋喃中,滴加1MtBuMgCl的THF(0.4mL,0.4mmol)溶液,然后缓慢加入所需的氯代磷酸酯(0.4mmol)的无水THF溶液。将混合物在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂并将残余物通过硅胶柱色谱法纯化,用3%MeOH的DCM溶液作为洗脱剂。将所得化合物溶于H2O/THF(1:1)中,滴加TFA。将混合物在室温下搅拌30分钟并加入NaHCO3以中和溶液。蒸发溶剂并通过硅胶柱色谱和制备型薄层色谱(TLC)(10%MeOH的DCM溶液)纯化残余物。
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(乙氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯1
根据标准方法A制备,使用5'-保护的克拉屈滨A(0.1g,0.17mmol)的无水THF溶液,tBuMgCl(1M溶液THF,0.34mL,0.34mmol)、苯基-(乙氧基-L-丙氨酰基)-氯代磷酸酯(0.10g,0.34mmol)。用TFA脱保护后,将粗混合物通过柱色谱法(4%MeOH的DCM溶液)纯化,然后通过制备型TLC(4%MeOH的DCM溶液)纯化,得到纯产物,为白色固体(19.0mg,21%)。31P-NMR(202MHz,CD3OD):δ3.28,2.76.1H-NMR(500MHz,CD3OD):δ8.32,8.28(1H,2x s,H-8),7.41–7.22(5H,m,H-Ar),6.43,6.33(1H,2x t,J=7.0Hz,H-1’),5.3,5.29(1H,2x br s,H-3’),4.32,4.31(1H,2x br s,H-4’),4.22–4.15(2H,m,CH2CH3),4.05–4.00(1H,m,NHCHCH3),3.86–3.80(2H,m,2x H-5’),3.01–2.90(1H,m,H-2’a),2.81–2.78(0.5H,m,H-2’b一种非对映异构体),2.68–2.64(0.5H,m,H-2’b一种非对映异构体),1.42–1.36(3H,2x d,J=7.0Hz,NHCHCH3),1.30–1.24(3H,m,CH2CH3)。MS(ES+)m/z:563.1(M+Na+,100%);精确质量:C21H26ClN6O7NaP理论值m/z 563.1187,实测值m/z 563.1183。反相HPLC,用H2O/CH3CN(从100/0至0/100,20min内)洗脱,流速=1ml/min,λ=254,tR=12.31,12.41min。
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(叔丁氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯2
根据标准方法A制备,使用5'-保护的克拉屈滨A(0.10g,0.17mmol)的无水THF溶液,tBuMgCl(1M溶液THF,0.34mL,0.34mmol)、苯基-(叔丁氧基-L-丙氨酰基)-氯代磷酸酯(0.11g,0.34mmol)。用TFA脱保护后,通过柱色谱(4%MeOH的DCM溶液)纯化粗品,得到纯产物,为白色固体(43.8mg,45%)。31P-NMR(202MHz,CD3OD):δ3.30,2.91;1H-NMR(500MHz,CD3OD):δ8.31,8.27(1H,2x s,H-8),7.42–7.21(5H,m,H-Ar),6.43,6.34(1H,2x t,J=7.0Hz,H-1’),5.36,5.30(1H,2x br s,H-3’),4.35,4.30(1H,2x br s,H-4’),3.91–3.80(3H,m,NHCHCH3,2x H-5’),3.02–2.90(1H,m,H-2’a),2.81–2.77(0.5H,m,H-2’b一种非对映异构体),2.68–2.65(0.5H,m,H-2’b一种非对映异构体),1.49,1.46(9H,2x s,C(CH3)3),1.38,1.34(3H,2x d,J=7.0Hz,NHCHCH3)。MS(ES+)m/z:591.1(M+Na+,100%);精确质量:C23H30CIN6O7NaP理论值m/z 591.1500,m/z实测值591.1509。反相HPLC,用H2O/CH3CN(从100/0至0/100,20min内)洗脱,流速=1ml/min,λ=254,tR=15.24,15.36min。
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(苯甲氧基-D-丙氨酰基)]-磷酸酯3
根据标准方法A制备,使用5'-保护的克拉屈滨A(0.11g,0.19mmol)的无水THF溶液,tBuMgCl(1M溶液THF,0.37mL,0.37mmol)、苯基-(苯甲氧基-D-丙氨酰基)-氯代磷酸酯(0.13g,0.37mmol)。用TFA脱保护后,通过柱色谱(4%MeOH的DCM溶液)纯化粗品,得到纯产物,为白色固体(40.0mg,35%)。31P-NMR(202MHz,CD3OD):δ3.06,2.77.1H-NMR(500MHz,CD3OD):δ8.24,8.22(1H,2x s,H-8),7.39–7.16(10H,m,H-Ar),6.32–6.26(1H,m,H-1’),5.34–5.32,5.23–5.21(1H,2x m,H-3’),5.19–5.14(2H,m,CH2Ph),4.36–4.34(0.5H,m,H-4’一种非对映异构体),4.22–4.20(0.5H,m,H-4’一种非对映异构体)4.10–4.04(1H,m,NHCHCH3),3.85–3.72(2H,m,2x H-5’),2.87–2.82,2.77–2.67(1H,2x m,H-2’a),2.59,2.48(1H,2x ddd,J=14.0,5.8,1.9Hz,H-2’b),1.41,1.38(3H,2x dd,J=7.0,4.5Hz,NHCHCH3)。MS(ES+)m/z:625.1(M+Na+,100%);精确质量:C26H28CIN6O7NaP理论值m/z 625.1343,实测值m/z 625.1351。反相HPLC,用H2O/CH3CN(从100/0至0/100,20min内)洗脱,流速=1ml/min,λ=254,tR=14.16min。
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(苯甲氧基-甘氨酰基)]-磷酸酯4
根据标准方法A制备,使用5'-保护的克拉屈滨A(0.12g,0.20mmol)的无水THF溶液,tBuMgCl(1M溶液THF,0.40mL,0.40mmol)、苯基-(苯甲氧基-L-甘氨酰基)-氯代磷酸酯(0.14g,0.40mmol)。用TFA脱保护后,通过柱色谱(4%MeOH的DCM溶液)纯化粗品,得到纯产物,为白色泡沫固体(15.0mg,13%)。31P-NMR(202MHz,CD3OD):δ4.21,4.05.1H-NMR(500MHz,CD3OD):δ8.14,8.13(1H,2x s,H-8),7.29–7.08(10H,m,H-Ar),6.23–6.16(1H,m,H-1’),5.24–5.21(1H,m,H-3’),5.08–5.06(2H,m,CH2Ph),4.20–4.19(0.5H,m,H-4’一种非对映异构体),4.14–4.12(0.5H,m,H-4’一种非对映异构体),3.77–3.63(4H,m,NHCH2,2x H-5’),2.76–2.70(1H,m,H-2’),2.51–2.47(1H,m,H-2’)。MS(ES+)m/z:611.1(M+Na+,100%);精确质量:C25H26CIN6O7NaP理论值m/z611.1187,实测值m/z 611.1180。反相HPLC,用H2O/CH3CN(从100/0至0/100,20min内)洗脱,流速=1ml/min,λ=254,tR=13.64min。
本发明的其他化合物可根据标准方法A类似于化合物1至4制备。实例包括以下化合物:
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(苯甲氧基-L-亮氨酰基)]-磷酸酯5
31P-NMR(CD3OD,202MHz):δ3.58,2.81;1H-NMR(CD3OD,500MHz):δ8.28,8.23(1H,2xs,H-8),7.40–7.22(10H,m,H-Ar),6.36,6.25(1H,2x t,J=7.0Hz,H-1’),5.30,5.24(1H,2xbr s,H-3’),5.19–5.14(2H,m,CH2Ph),4.25(1H,br s,H-4’),3.98–3.95(1H,m,NHCH),3.84–3.73(2H,m,2x H-5’),2.89–2.55(2H,m,2x H-2'),1.77–1.72(1H,m,CH(CH3)2),1.60–1.56(2H,m,CH2CH(CH3)2),0.94–0.88(6H,m,CH(CH3)2)。MS(ES+)m/z:667.2(M+Na+,100%);精确质量:C29H34CIN6O7NaP理论值m/z 667.1813,实测值m/z 667.1799。反相HPLC,用H2O/CH3CN(从100/0至0/100,20min内)洗脱,流速=1ml/min,λ=254,tR=16.27,16.47min。
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[1-萘基-(2,2-二甲基丙氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯6
31P-NMR(202MHz,CD3OD):δ3.68,3.27.1H-NMR(500MHz,CD3OD):δ8.28–8.20(2H,m,H-8,H-Ar),7.92(1H,d,J=8.0Hz,H-Ar),7.75(1H,d,J=8.2Hz,H-Ar),7.63–7.47(4H,m,H-Ar),6.38–6.21(1H,2x m,H-1’),5.39–5.33(1H,2x m,H-3'),4.32–4.23(1H,2x m,H-4'),4.17–4.11(1H,m,NHCHCH3),3.89–3.71(4H,m,2x H-5',CH2C(CH3)3),2.96–2.78,2.58–2.55(2H,2x m,2x H-2'),1.43,1.38(3H,2x d,J=7.25Hz,NHCHCH3),0.95,0.93(2x s,9H,CH2C(CH3)3)。MS(ES+)m/z:656(M+Na+),634(M+H+);C28H34CIN6O7P的理论质量633.03。
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[1-萘基-(戊氧基-L-亮氨酰基)]-磷酸酯7
31P-NMR(202MHz,CD3OD):δ4.02,3.48.1H-NMR(500MHz,CD3OD):δ8.24,8.21(1H,2xs,H-8),7.94,7.92(1H,2x s,H-Ar),7.76,7.53(1H,2x s,H-Ar),7.63–7.55(4H,m,H-Ar),7.52,7.47(1H,2x s,H-Ar),6.40–6.33,6.23–6.20(1H,2x m,H-1'),5.40–5.38,5.32–5.29(1H,2x m,H-3'),4.34–4.33,4.26–4.24(1H,2x m,H-4'),4.08–4.05(2H,m,2x H-5'),4.01–3.97(1H,m,NHCHCH2CH(CH3)2),3.88–3.80(2H,m,NHCHCH2CH(CH3)2),3.00–2.95,2.89–2.79,2.58–2.54(2H,3x m,2x H-2'),1.75–1.69(1H,m,NHCHCH2CH(CH3)2),1.63–1.55(4H,m,2x CH2,OCH2CH2CH2CH2CH3),1.35–1.28(4H,m,2x CH2,OCH2CH2CH2CH2CH3),0.91–0.82(9H,m,OCH2CH2CH2CH2CH3,NHCHCH2CH(CH3)2)。MS(ES+)m/z:697(M+Na+),675(M+H+),C31H40CIN6O7P的理论质量674.24。
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[1-萘基-(环己氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯8
31P-NMR(202MHz,CD3OD)δ3.34,2.80.1H-NMR(500MHz,CD3OD):δ8.33–8.28(2H,m,H-8,H-Ar),7.85–7.81(1H,m,H-Ar),7.62–7.59(1H,m,H-Ar),7.56–7.52(3H,m,H-Ar),7.47–7.43(1H,m,H-Ar),6.30(1H,t,J=6.5Hz,H-1’),4.66–4.57(3H,m,H-3’,OCH-酯),4.51–4.48(2H,m,2x H-5’),4.20–4.18(1H,m,H-4’),4.12–3.96(1H,m,NHCHCH3),2.67–2.54(1H,m,H-2’),2.50–2.46(1H,m,H-2’),1.75–1.71(4H,m,2x CH2-酯),1.32–1.30(9H,m,3x CH2-酯,NHCHCH3)。MS(ES+)m/z:667(M+Na+),645(M+H+);C29H34CIN6O7P的理论质量644.19。
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(环己氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯9
31P-NMR(202MHz,CD3OD):δ3.34,2.80.1H-NMR(500MHz,CD3OD):δ8.32–8.28(1H,m,H-8),7.43–7.37(2H,m,H-Ar),7.31–7.22(3H,m,H-Ar),6.44–6.41,6.36–6.29(1H,2x m,H-1’),5.37–5.34,5.30–5.27(1H,2x m,H-3’),4.81–4.74(1H,m,CH-酯),4.33–4.25(1H,m,H-4’),4.01–3.92(1H,m,NHCHCH3),3.87–3.79(2H,m,2x H-5’),3.01–2.89(1H,m,H-2’),2.82–2.77,2.67–2.63(1H,2x m,H-2’),1.86–1.74(4H,m,2x CH2-酯),1.57–1.30(9H,m,3xCH2-酯,NHCHCH3)。MS(ES+)m/z:617(M+Na+),595(M+H+);C25H32CIN6O7P的理论质量594.18。
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(2,2-二甲基丙氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯10
31P-NMR(202MHz,CD3OD):δ3.30,2.76.1H-NMR(500MHz,CD3OD):δ8.32,8.27,8.23,8.07(1H,4x s,H-8),7.57–7.52,7.43–7.38,7.31–7.22(5H,3x m,H-Ar),6.44–6.41,6.36–6.30(1H,2x m,H-1’),5.38–5.36,5.30–5.27(1H,2x m,H-3’),4.32–4.30,4.27–4.25(1H,2x m,H-4’),4.15–4.12,4.08–4.04(1H,2x m,NHCHCH3),3.87–3.79(1H,m,H-5’),3.92–3.80(2H,m,CH2C(CH3)3),3.68,3.58(1H,2x dd,J=12.0,5.0Hz,H-5’),3.01–2.89,2.81–2.64,2.35–2.29(2H,3x m,2x H-2’),1.44,1.39(3H,2x d,J=7.5Hz,NHCHCH3),0.98,0.96(9H,2x s,CH2C(CH3)3)。MS(ES+)m/z:605(M+Na+),583(M+H+),C24H32CIN6O7P的理论质量582.18。
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(乙氧基-2,2-二甲基甘氨酰基)]-磷酸酯11
31P-NMR(202MHz,CD3OD):δ1.60,1.55.1H-NMR(500MHz,CD3OD):δ8.32,8.28(1H,2xs,H-8),7.45–7.38,7.33–7.27,7.24–7.21(5H,3x m,H-Ar),6.41,6.33(1H,2x dd,J=8.1,5.8Hz,H-1’),5.36–5.32(1H,m,H-3’),4.39,4.29(1H,2x m,H-4’),4.20,4.19(2H,2x q,J=7.2Hz,CH2CH3),3.92–3.76(2H,m,2x H-5’),3.00–2.88,2.78–2.63(2H,3x m,2x H-2’),1.53(6H,br s,(CH3)2),1.29,1.28(3H,2x t,J=7.1Hz,CH2CH3)。MS(ES+)m/z:577.7(M+Na+),C22H28CIN6O7P的理论质量554.92
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(苯甲氧基-L-苯丙氨酰基)]-磷酸酯12
31P-NMR(202MHz,CDCl3):δ1.42,1.23.1H-NMR(500MHz,CDCl3):δ7.69,7.55(1H,2xs,H-8),7.28–6.92(15H,m,H-Ar),6.11(2H,br s,NH2),6.01–5.86(1H,m,H-1’),5.30–5.02(4H,m,H-3’,OH-3’,OCH2Ph),4.31–4.15(2H,m,H-4’,NHCHCH2Ph,3.86–3.65(3H,m,2x H-5’,NHCHCH2Ph),2.98–2.81(3H,m,NHCHCH2Ph,H-2a’),2.39–2.31(1H,m,H-2b’)。MS(ES+)m/z:679[M+H+],681[M(37Cl)+H+],701[M+Na+],703[M(37Cl)+Na+],717[M+K+],719[M(37Cl)+K+];C32H32CIN6O7P的理论质量m/z 678.18。反相HPLC,用H2O/CH3CN(从100/0至0/100,10min内)洗脱,流速=1ml/min,λ=254,tR=9.19min。
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[1-萘基-(苯甲氧基-L-苯丙氨酰基)]-磷酸酯13
31P-NMR(202MHz,CDCl3):δ2.09,1.78.1H-NMR(500MHz,CDCl3):δ8.02–7.91(1H,m,H-8),7.81–7.79(1H,m,H-Ar),7.65–7.60(1H,m,H-Ar),7.49–7.41(4H,m,H-Ar),7.33–6.75(11H,m,H-3Naph,OCH2Ph,CHCH2Ph),6.00(2H,br s,NH2),5.92–5.62(1H,2m,H-1’),5.28–5.13(2H,m,H-3’OH-3’),5.05–4.89(2H,m,OCH2Ph),4.34–4.27(1H,m,NHCHCH2Ph),4.18–4.12(1H,2m,H-4’)3.83–3.61(3H,m,2x H-5’,NHCHCH2Ph),2.95–2.88(2H,m,NHCHCH2Ph),2.84–2.79(1H,m,H-2’a),2.30–2.14(1H,m,H-2’b)。MS(ES+)m/z:729[M+H+],751[M+Na+],767[M+K+];精确质量:C36H34CIN6O7P理论值m/z 728.19。反相HPLC,用H2O/CH3CN(从100/0至0/100,10min内)洗脱,流速=1ml/min,λ=254,tR=10.33min。
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(苯甲氧基-L-缬氨酰基)]-磷酸酯14
31P-NMR(202MHz,CDCl3):δ2.40,2.20.1H-NMR(500MHz,CDCl3):δ7.74,7.58(1H,2xs,H-8),7.30–7.09(10H,m,H-Ar),6.13–6.11,6.27–6.24(1H,2x m,H-1’),5.91(2H,br s,NH2),5.27–5.25(1H,m,H-3’),5.10–5.04(2H,m,CH2Ph),4.25–4.21(1H,m,H-4’),3.86–3.62(4H,m,2x H-5’,NHCHCH(CH3)2,NHCHCH(CH3)2,),2.95–2.90(1H,m,H-2’a),2.45–2.37(1H,m,H-2’b),2.02–1.99(1H,m,NHCHCH(CH3)2),0.88–0.77(6H,m,NHCHCH(CH3)2)。MS(ES+)m/z:632[M+H+],655[M+Na+]。C28H32CIN6O7P的理论质量m/z 631.18。
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(异丙氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯15
31P-NMR(202MHz,CDCl3):δ1.54,1.34.1H-NMR(500MHz,CDCl3):δ7.79,7.71(1H,2s,H-8),7.31–7.12(5H,m,H-Ar),6.21–6.17,6.05–6.01(1H,2x m,H-1’),5.70(2H,br s,NH2),5.31–5.26(1H,m,H-3’),4.99–4.93(1H,m,OCH(CH3)2),4.44–4.42(1H,m,H-4’),3.98–3.87(2H,m,NHCHCH3,OH-5’),3.82–3.74(1H,m,NHCHCH3),3.67–3.53(3H,m,2x H-5’,NHCHCH3),3.08–2.97(1H,m,H-2’),2.62–2.49(1H,m,H-2’),1.34,1.30(3H,2x d,J=7.0Hz,NHCHCH3),1.22–1.19(6H,m,OCH(CH3)2)。MS(ES+)m/z:555[M+H+],556[M(13C)+H+],557[M(37Cl)+H],558[M(37Cl,13C)+H+],577[M+Na+],578[M(13C)+Na+],579[M(37Cl)+Na+],580[M(37Cl,13C)+Na+]。C22H28CIN6O7P的理论质量m/z 554.14。反相HPLC,用H2O/CH3CN(从100/0至0/100,15min内)洗脱,流速=1ml/min,λ=254,tR=9.92min。
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(2-丁氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯16
31P-NMR(202MHz,CDCl3):δ1.62,1.60.1H-NMR(500MHz,CDCl3):δ7.81,7.73(1H,2xs,H-8),7.30–7.11(5H,m,H-Ar),6.21–6.03(3H,m,H-1’,NH2),5.32–5.23(2H,m,H-3’,NHCHCH3),4.85–4.76(1H,m,OCH(CH3)CH2CH3),4.34–4.31(1H,m,H-4’),3.95–3.75(4H,m,NHCHCH3,2x H-5’,OH-5’),3.07–2.95(1H,m,H-2a’),2.48–2.26(1H,m,H-2b’),1.55–1.47(2H,m,OCH(CH3)CH2CH3),1.37–1.31(3H,m,NHCHCH3),1.19–1.09(3H,m,OCH(CH3)CH2CH3),0.85–0.79(3H,m,OCH(CH3)CH2CH3)。MS(ES+)m/z:569[M+H+],570[M(13C)+H+],571[M(37Cl)+H+],572[M(37Cl,13C)+H+],591[M+Na+],592[M(13C)+Na+],593[M(37Cl)+Na+],594[M(37Cl,13C)+Na+],607[M+K+],608[M(13C)+K+],609[M(37Cl)+K+]。C23H30CIN6O7P的理论质量m/z 568。反相HPLC,用H2O/CH3CN(从100/0至0/100,15min内)洗脱,流速=1ml/min,λ=254,tR=10.48min。
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-((S)-1-苯基乙氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯17
31P-NMR(202MHz,CDCl3):δ3.34,2.65.1H-NMR(500MHz,CDCl3):δ8.20(1H,m,H-8),7.47–7.28(8H,m,H-Ar),7.27–7.15(2H,m,H-Ar),6.40–6.33,6.32–6.26,(1H,2x m,H-1’),5.96–5.84(1H,m,CHCH3Ph),5.35–5.21(1H,m,H-3’),4.40–4.26(1H,m,H-4’),4.10–4.02(1H,m,NHCHCH3),3.87–3.74(2H,m,2x H-5’),2.94–2.83(1H,m,H-2a’),2.74–2.57(1H,m,H-2b’),1.60–1.48(3H,m,CHCH3Ph),1.43–1.20(3H,m,NHCHCH3)。MS(ES+)m/z:639[M+Na+],640[M(37Cl)+Na+]。C27H30CIN6O7PNa的理论质量m/z 639.99。反相HPLC,用H2O/MeOH(从100/0至0/100,35min内)洗脱,流速=1ml/min,λ=254,tR=29.19,29.54min。
2-氯-2’-脱氧腺苷3’-[1-萘基-(苯甲氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯18
在氩气下将受保护的核苷A(78mg,0.20mmol)溶解在无水THF(7mL)中,滴加tBuMgCl(1.0M的THF溶液,1.0mL,1.0mmol),然后缓慢加入1-萘基-(苯甲氧基-L-丙氨酰基)-氯代磷酸酯(0.40g,0.99mmol)的无水THF(2.0mL)溶液。将混合物在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂并将残余物通过硅胶柱色谱法(3%MeOH的DCM溶液)纯化。将所得化合物溶于H2O/THF(4mL+4mL)中,滴加TFA(1mL)。将混合物在室温下搅拌30分钟并加入NaHCO3以中和溶液。蒸发溶剂并通过硅胶柱色谱(0-4%MeOH的DCM溶液)和制备型TLC(10%MeOH的DCM溶液)纯化残余物。产量:50mg,经2步收率为38%。31P-NMR(202MHz,CD3OD):δ3.71,3.10.1H-NMR(500MHz,CD3OD):δ8.17,8.14(2H,2x s,H-8,H-Ar),7.88(1H,d,J=7.7Hz,H-Ar),7.71(1H,dd,J=8.1,4.2Hz,H-Ar),7.59–7.41(4H,m,H-Ar),7.35–7.16(5H,m,H-Ar),6.30,6.15(1H,2x dd,J=8.4,5.9Hz,H-1’),5.33(1H,m,H-3’),5.18–5.06(2H,m,CH2Ph),4.27–4.24,4.21–4.12(2H,2x m,H-4’,NHCHCH3),3.84–3.67(2H,m,2x H-5’),2.82–2.78(1H,m,H-2a’),2.69–2.65,2.64–2.61(1H,2x m,H-2b’),1.40,1.35(3H,2x d,J=7.2Hz,NHCHCH3)。MS(ES+)m/z:676.16(M+Na+).C30H30CIN6O7PNa的理论质量m/z 676.02。反相HPLC,用H2O/MeOH(从100/0至0/100,40min内)洗脱,流速=1ml/min,λ=254,tR=20.6,21.1min。
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(苯甲氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯19
在氩气下将保护的核苷A(0.12g,0.30mmol)溶解在无水THF(10mL)中,滴加tBuMgCl(1.0M的THF溶液,1.5mL=1.5mmol)。缓慢加入苯基-(苯甲氧基-L-丙氨酰基)-氯代磷酸酯(0.53g,1.50mmol)的无水THF(2mL)溶液,将混合物在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂并将残余物通过硅胶柱色谱法(4%MeOH的DCM溶液)纯化。将所得化合物溶于H2O/THF(4mL+1mL)中,滴加TFA(1mL)。将混合物在室温下搅拌45分钟,然后加入NaHCO3以中和溶液。硅胶柱色谱法得到所需产物。产量:37mg,经2步收率为20%。31P-NMR(202MHz,CD3OD):δ3.3,2.6.1H-NMR(500MHz,CD3OD):δ8.26,8.21(1H,2x s,H-8),7.41–7.18(10H,m,H-Ar),6.36,6.26(1H,2x dd J=8.4,5.8Hz,H-1’),5.31–5.28,5.27–5.24(1H,2x m,H-3’),5.19,5.15(2H,2x s,CH2Ph,),4.26–4.21(1H,m,H-4’),3.85–3.74(2H,m,2x H-5’),2.85–2.81,2.69–2.62,2.60–2.57(2H,3x m,H-2’),1.41,1.37(3H,2x dd,J=7.2,1.2Hz,NHCHCH3)。MS(ES+)m/z:626.11(M+Na+).C26H28CIN6O7PNa的理论质量m/z 626.14。反相HPLC,用H2O/MeOH(从100/0至0/100,35min内)洗脱,流速=1ml/min,λ=254,tR=18.9,19.6min。
抗癌活性
将本发明化合物与克拉屈滨和化合物Y(克拉屈滨的5'-氨基磷酸酯)进行比较。
使用的细胞系包括:
HEL92.1.7:红白血病
HL-60:早幼粒细胞白血病
KG-1:急性髓源性白血病
K562:慢性髓源性白血病
L1210:源自患有淋巴细胞白血病的小鼠的淋巴母细胞系
MCF7:人乳腺上皮腺癌(雌激素敏感)细胞系
NB4:全反式维甲酸敏感的急性早幼粒细胞白血病
NB4R2:全反式维甲酸不敏感的急性早幼粒细胞白血病
RL:非霍奇金淋巴瘤
U937:组织细胞性淋巴瘤
Z-138:套细胞淋巴瘤
实施例1:体外细胞毒性研究
在体外针对六种白血病细胞系(KG1、U937、K562、NB4R2、NB4和HL-60)对克拉屈滨氨基磷酸酯衍生物进行评估。测定50%的细胞不再存活时的抑制浓度(IC50)(使用MTS测定计算)。将细胞用通过连续稀释使浓度在100μM和0.02μM之间的克拉屈滨及其3'-氨基磷酸酯衍生物处理,并在37℃、5%CO2下在90μL的最终体积中孵育72小时。将20微升MTS试剂(Promega UK Ltd,Southampton,Hants)加入到肿瘤细胞培养物中,并将反应物在37℃、5%CO2下再孵育4小时。通过分光光度法在490nm处读取此时间后反应物的吸光度,并且相对于相同测定中的未处理的对照细胞计算活细胞的百分比。
表1示出了本发明化合物针对白血病细胞系KG1、U937、K562、NB4R2、NB4和HL-60的体外结果。
可以看到,所有的化合物均具有一定的抗癌活性。特别值得注意的是,针对所测试的6种细胞系中的4种,化合物19比化合物Y(具有与化合物19相同的氨基磷酸酯部分的5'磷酰胺酯前药)更具活性。
实施例2:进一步的体外细胞毒性研究
然后使用以下测定法测定一组本发明化合物在更广泛的不同实体瘤和血液恶性肿瘤中的细胞毒活性。
实体瘤和血液恶性肿瘤测定
使用CellTiterGlo(CTG,Promega-G7573)测定法进行体外活力测定以评估化合物对所选细胞系的细胞活力超过72h的影响。测试一式两份进行,在9个点用化合物处理,在~72h内,在96孔板中,3.16倍滴定。化合物起始浓度为198mM。使用CellTiterGlo在96孔板中进行细胞活力测定。用解冻的100%DMSO将化合物溶解至40mM。将化合物在解冻的DMSO中以3.16倍连续稀释,并温热至37℃,然后溶解于培养基中(2μl+200μl)。将化合物溶解在培养基中后,将含有化合物的培养基在培养箱中温热至37℃,然后将培养基中的化合物一式两份加入到细胞板中(50μl+50μl)。化合物的最终浓度为198μM至19.9nM。检查所有化合物的溶解度并再次记录,然后立即将板转移到CO2组织培养箱中并孵育3天。DMSO终浓度为0.5%。
进一步筛选的结果列于表2中。
表2:
表2显示,如从MCF-7细胞系的结果可以看出,本发明化合物在实体瘤中特别有效。
实施例3—细胞毒性和癌症干细胞活性的评估
在扩展的剂量范围内在KG1a细胞系中对化合物的毒性进行了进一步的比较分析,并且在整个剂量范围内评估了化合物对KG1a细胞系内白血病干细胞区室的相对效果。因此,对本发明的某些化合物进行了实验测试以评估它们在白血病细胞系中靶向癌症干细胞的能力。使用急性髓性白血病(AML)细胞系KG1a来评估化合物对干细胞区室的相对影响。选择KG1a细胞系是因为它表现出具有独特免疫表型(Lin-/CD34+/CD38-/CD123+)的较小的干细胞样区室。
材料和方法
KG1a细胞培养条件
将KG1a细胞系的细胞维持在补充有100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和20%胎牛血清的RPMI培养基(Invitrogen,Paisley,UK)中。随后将细胞等分(105个细胞/100μl)到96孔板中,并在核苷类似物和它们各自的氨基磷酸酯(其浓度针对每个系列的化合物而实验确定)的存在下,在37℃、潮湿的5%二氧化碳气氛中孵育72小时。另外,进行对照培养,其中未加入药物。随后通过离心收获细胞,并使用膜联蛋白V测定法通过流式细胞术分析细胞。
体外细胞凋亡的测量。通过离心收获培养的细胞,然后将其重悬于195μl富含钙的缓冲液中。随后,将5μl膜联蛋白V(Caltag Medsystems,Botolph Claydon,UK)加入细胞悬浮液中,并将细胞在黑暗中孵育10分钟,然后洗涤。最后将细胞与10μl碘化丙啶一起重悬于190μl富含钙的缓冲液中。如前所述,通过双色免疫荧光流式细胞术评估细胞凋亡。随后计算每种核苷类似物和氨基磷酸酯的LD50值(杀死培养物中50%的细胞所需的剂量)。
白血病干细胞区室的免疫表型鉴定
将KG1a细胞在多种浓度的各种测定化合物的存在下培养72小时。然后收获细胞并用抗谱系抗体(PE-cy7)、抗CD34(FITC)、抗CD38(PE)和抗CD123(PERCP cy5)的混合物标记。随后鉴定表达白血病干细胞(LSC)表型的亚群,并表示为留在培养物中的所有活细胞的百分比。然后将剩余干细胞的百分比绘制在剂量-反应图上,并将化合物的效果与8-氯腺苷(chloroadenosine)进行比较。
统计学分析
使用单因素方差分析(one wayANOVA)评估在这些实验中获得的数据。使用综合K2检验确认所有数据均为高斯(Gaussian)或高斯近似。从非线性回归曲线和S形剂量-反应曲线的最佳拟合分析线计算LD50值。使用Graphpad Prism 6.0软件(Graphpad SoftwareInc.,San Diego,CA)进行所有统计学分析。
结果
体外细胞毒性
使用膜联蛋白V/碘化丙啶测定法测量体外药物敏感性。计算的LD50值也示于表5中。
表3
化合物18和19均表现出干细胞选择性。化合物19比化合物Y(具有与化合物19相同的氨基磷酸酯部分的5'磷酰胺酯前药)更有效。当与克拉屈滨相比时,化合物18显示出优先靶向LSC。
实施例4:感染支原体的细胞中的体外细胞毒性研究
用猪鼻支原体(M.hyorhinis)(ATCC 17981)感染肿瘤细胞培养物,在两次或更多次传代后(以避免初始接种物产生的偏差)使用MycoAlertTM支原体检测试剂盒(Lonza,Basel,Switzerland)确认感染成功。虽然该测定仅是半定量的,但在暴露于支原体的细胞的传代培养后3至4天观察到了最大感染。慢性感染的肿瘤细胞系进一步称为细胞系.Hyor。将所有肿瘤细胞培养物维持在补充有10%胎牛血清(Biochrom AG,Berlin,Germany)、10mmHEPES和1mm丙酮酸钠(Invitrogen)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(Invitrogen)中。细胞在37℃下在潮湿的培养箱中生长,培养箱中的气相含有5%CO2。
在支原体感染的和未感染的癌细胞系中检查测试化合物的细胞抑制活性。当测定猪鼻支原体感染的效果时,将单层MCF7和MCF7.Hyor细胞以10,000个细胞/孔(CorningInc.,Corning,NY)以100,000个细胞/孔接种于48孔微量滴定板(NuncTM,Roskilde,Denmark)中。24小时后,将细胞暴露于不同浓度的测试化合物并使其增殖72小时(以确保足够的细胞增殖和支原体生长),之后用胰蛋白酶消化细胞并使用Coulter计数器(Analis,Suarlée,Belgium)计数。在不同浓度的测试化合物的存在下,将悬浮细胞(L1210、L1210.Hyor、FM3A和FM3A.Hyor)以60,000个细胞/孔接种在96孔微量滴定板(Nunc)中。使细胞增殖48小时,然后使用Coulter计数器计数。50%抑制浓度(IC50)定义为使细胞增殖减少50%所需的化合物浓度。
表4:用猪鼻支原体(HYOR)感染的MCF7细胞
针对被猪鼻支原体感染的MCF7细胞,化合物19显示出比化合物Y(具有与化合物19相同的氨基磷酸酯部分的5'磷酰胺酯前药)和克拉屈滨更小的效力损失。
表5:用猪鼻支原体(HYOR)感染的L1210细胞
针对被猪鼻支原体感染的L1210细胞,化合物6显示出比克拉屈滨更小的效力损失。
Claims (22)
1.式(I)的化合物或其药学上可接受的盐:
R1为芳基;
R2选自C1-C24-烷基、C3-C24-烯基、C3-C24-炔基、C0-C4-亚烷基-C3-C7-环烷基或C0-C4-亚烷基-芳基;
R3和R4各自独立地选自H、C1-C6-烷基和C1-C3-亚烷基-R9;或其中R3和R4与它们所连接的原子一起形成3至6元的环烷基或杂环烷基;
R5和R7各自独立地选自H和C1-C4烷基;
R6独立地选自H和C(O)R10;
R8独立地选自H、C(O)OR10和C(O)R10;
R9独立地选自芳基(例如苯基)、咪唑、吲哚、SRa、ORa、CO2Ra、CO2NRaRa、NRaRb和NH(=NH)NH2;
R10每次出现时独立地选自C1-C24-烷基、C3-C24-烯基、C3-C24-炔基、C0-C4-亚烷基-C3-C7-环烷基或C0-C4-亚烷基-芳基;
其中任何芳基是苯基、萘基或四氢萘基,并且其中任何苯基、烷基、炔基、烯基、亚烷基、环烷基、萘基或四氢萘基任选地被1-4个选自下列的取代基取代:卤素、硝基、氰基、NRaRa、NRaS(O)2Ra、NRaC(O)Ra、NRaCONRaRa、NRaCO2Ra、ORa;SRa、SORa、SO3Ra、SO2Ra、SO2NRaRa、CO2RaC(O)Ra、CONRaRa、CRaRaNRaRa、C1-C4-烷基、C2-C4-烯基、C2-C4-炔基和C1-C4-卤代烷基;
其中Ra每次出现时独立地选自:H和C1-C4-烷基;并且Rb每次出现时独立地选自:H和C1-C4-烷基、C(O)-C1-C4-烷基、S(O)2-C1-C4-烷基。
2.根据权利要求1所述的化合物,其中式(I)的化合物是式(II)的化合物:
3.根据权利要求1或2所述的化合物,其中R1为苯基。
4.根据权利要求1或3所述的化合物,其中R1为未取代的苯基。
5.根据权利要求1或2所述的化合物,其中R1为1-萘基。
6.根据权利要求1或5所述的化合物,其中R1为未取代的1-萘基。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的化合物,其中R2为C4-C8烷基。
8.根据权利要求7所述的化合物,其中R2选自异丁基、叔丁基、正丁基、正戊基、CH2C(Me)3或正己基。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的化合物,其中C5-C7环烷基。
10.根据权利要求9所述的化合物,其中R2为未取代的环己基。
11.根据权利要求1至6中任一项所述的化合物,其中R2为CHR11-苯基;其中R11选自H和C1-C4-烷基。
12.根据权利要求11所述的化合物,其中R2为未取代的苄基。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的化合物,其中R3和R4之一是H,而另一个选自:H、Me、异丙基、异丁基和苄基。
14.根据权利要求13所述的化合物,其中R4是H,并且R3选自:H、Me、异丙基、异丁基和苄基。
15.根据权利要求14所述的化合物,其中R4是H,并且R3是Me。
16.式(I)的化合物可以是选自如下的化合物:
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(乙氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(叔丁氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(苯甲氧基-D-丙氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(苯甲氧基-甘氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(苯甲氧基-L-亮氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2’-脱氧腺苷-3'-[1-萘基-(2,2-二甲基丙氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2'-脱氧腺苷-3'-[1-萘基-(戊氧基-L-亮氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2'-脱氧腺苷-3’-[1-萘基-(环己氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(环己氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(2,2-二甲基丙氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(乙氧基-2,2-二甲基甘氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(苯甲氧基-L-苯丙氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[1-萘基-(苯甲氧基-L-苯丙氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(苯甲氧基-L-缬氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2’-脱氧腺苷-3'-[苯基-(异丙氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2'-脱氧腺苷-3’-[苯基-(2-丁氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-((S)-1-苯基乙氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯,
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[1-萘基-(苯甲氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯和
2-氯-2’-脱氧腺苷-3’-[苯基-(苯甲氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯。
17.根据权利要求1至16中任一项的化合物,其用于医学用途。
18.根据权利要求1至16中任一项的化合物,其用于治疗癌症。
19.根据权利要求18所述的化合物,其中所述癌症选自由以下组成的组:白血病、多发性骨髓瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、头颈癌、神经母细胞瘤、甲状腺癌、皮肤癌、口腔鳞状细胞癌、膀胱癌、Leydig细胞瘤、结肠癌、结直肠癌和妇科癌症。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的化合物,其中所述患者具有支原体感染的细胞。
21.根据权利要求1至16中任一项所述的化合物,其用于通过靶向癌症干细胞来治疗癌症。
22.一种药物制剂,其包含权利要求1至16中任一项所述的化合物和药学上可接受的赋形剂。
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