CN109180512B - 一种从γ-氨基丁酸发酵液中除去谷氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物化工领域，具体涉及一种从γ‑氨基丁酸发酵液中高效除去谷氨酸的方法，本发明的核心是一种新型试剂的应用；以及基于该试剂的反复沉淀‑溶解操作，使谷氨酸‑GABA的相互作用逐步减弱，最终完全分离GABA与谷氨酸，所用的试剂A为:乙醇:乙酸乙酯为2:1(v/v)；试剂B为1M醋酸锌水溶液，本发明所采用的工艺可以完全回收GABA，可以除去谷氨酸，涉及常规操作，采用普通易得的试剂，除谷氨酸效果好，效率达100％。

Description

一种从γ-氨基丁酸发酵液中除去谷氨酸的方法
技术领域
本发明属于生物化工领域，具体涉及一种从γ-氨基丁酸发酵液中高效除去谷氨酸的方法。
背景技术
γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid，GABA)是哺乳动物体内主要的抑制性神经递质，具有多种生理功能，如安神、降血压和利尿等。可作为生物活性因子应用于食品、医药和饲料工业。已批准为新资源食品(卫生部2009年第12号公告)。也是合成2-吡咯烷酮和尼龙4的前体，在化工领域用途广泛。
乳酸菌是通常认为安全的微生物，与人和动物的生命活动息息相关，在食品、医药等领域具有重要地位。产GABA肠道乳酸菌据信通过肠-脑轴参与调控神经性疾病。GABA益生化合成逐步受到关注，是未来的发展方向。
然而，产GABA乳酸菌的筛选、GABA发酵过程优化与监测、产物分离等工作涉及大量繁复的测定工作；获得高纯度的产物，也是GABA 发酵需要解决的问题。这些工作的共同点是，需要分离其中的底物谷氨酸。HPLC、氨基酸分析仪和气相色谱等方法，在定量前需通过色谱柱对产物进行分离。
本发明提出了一种廉价、高效地去除发酵液中谷氨酸的新方法。本发明的核心是一种新型试剂的应用；以及基于该试剂的反复沉淀- 溶解操作，使谷氨酸-GABA的相互作用逐步减弱，最终完全分离GABA 与谷氨酸。
发明内容
本发明旨在提供一种从γ-氨基丁酸发酵液中高效除去谷氨酸的方法，以克服现有技术中的需要进行复杂、繁琐的测定工作。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种从γ-氨基丁酸发酵液中高效除去谷氨酸的方法，通过以下方法实现的：
1)第一轮沉淀：将2.85mL试剂A加入到0.15mL混合发酵液样品中，充分震荡混匀，室温静置2min，然后加入5μL试剂B，充分混合后静置3分钟沉淀谷氨酸，6000×g离心3min，回收上清液，有一些γ-氨基丁酸与谷氨酸发生了共沉淀；
2)第一轮溶解：在上述沉淀中加入75μL纯水，超声处理5min，使与谷氨酸共沉淀的γ-氨基丁酸完全溶解，大部分谷氨酸留在沉淀里面，仍然有少量谷氨酸与γ-氨基丁酸共同溶解出来，因此有必要再次对溶出液进行沉淀；
3)第二轮沉淀：先后加入2.925mL试剂A与5μL试剂B，操作方法同上述步骤1)，完全沉淀与GABA共溶解的谷氨酸，离心后，回收上清液，上清液中只含γ-氨基丁酸；谷氨酸得以完全沉淀，只有微量的γ-氨基丁酸与谷氨酸发生了共沉淀；
4)第二轮溶解：步骤3)中只有微量的γ-氨基丁酸与谷氨酸发生了共沉淀，为了保障γ-氨基丁酸完全溶出，且谷氨酸完全不溶出，本步骤在沉淀中加入1mL谷氨酸排斥试剂，所述排斥试剂为：试剂A： H2O,17:3(v/v)，超声处理2min，使γ-氨基丁酸完全溶解，而谷氨酸完全留在沉淀里面，离心回收上清液，丢弃沉淀。
所述试剂A为:乙醇:乙酸乙酯为2:1(v/v)；试剂B为1M醋酸锌水溶液。
本发明的有益效果：
1、本发明可以完全回收GABA，可以除去谷氨酸，涉及常规操作，采用普通易得的试剂，除谷氨酸效果好，效率达到100％；
2、无需经过HPLC、氨基酸分析仪和气相色谱等测定中间步骤。
具体实施方案
实施例1
1)第一轮沉淀：将2.85mL试剂A加入到0.15mL混合发酵液样品中，充分震荡混匀，室温静置2min，然后加入5μL试剂B，充分混合后静置3分钟沉淀谷氨酸，6000×g离心3min，回收上清液，有一些γ-氨基丁酸与谷氨酸发生了共沉淀；
2)第一轮溶解：在上述沉淀中加入75μL纯水，超声处理5min，使与谷氨酸共沉淀的γ-氨基丁酸完全溶解，大部分谷氨酸留在沉淀里面，仍然有少量谷氨酸与γ-氨基丁酸共同溶解出来，因此有必要再次对溶出液进行沉淀；
3)第二轮沉淀：先后加入2.925mL试剂A与5μL试剂B，操作方法同上述步骤1)，完全沉淀与GABA共溶解的谷氨酸，离心后，回收上清液，上清液中只含γ-氨基丁酸；谷氨酸得以完全沉淀，只有微量的γ-氨基丁酸与谷氨酸发生了共沉淀；
4)第二轮溶解：步骤3)中只有微量的γ-氨基丁酸与谷氨酸发生了共沉淀，为了保障γ-氨基丁酸完全溶出，且谷氨酸完全不溶出，本步骤在沉淀中加入1mL谷氨酸排斥试剂，所述排斥试剂为：试剂A： H2O,17:3(v/v)，超声处理2min，使γ-氨基丁酸完全溶解，而谷氨酸完全留在沉淀里面，离心回收上清，丢弃沉淀。
所述试剂A为:乙醇:乙酸乙酯为2:1(v/v)；试剂B为1M醋酸锌水溶液。
将除去谷氨酸后的实施例1进行检测，检测其上清液的谷氨酸含量，γ-氨基丁酸的回收率，结果见表1
表1
Figure BDA0001836214750000041

Claims (1)

1.一种从γ-氨基丁酸发酵液中除去谷氨酸的方法，其特征在于，通过以下方法实现的：
1)第一轮沉淀：将2.85mL试剂A加入到0.15mL混合发酵液样品中，充分震荡混匀，室温静置2min，然后加入0.5μL试剂B，充分混合后静置3分钟沉淀谷氨酸，6000×g离心3min，回收上清液，有一些γ-氨基丁酸与谷氨酸发生了共沉淀；
2)第一轮溶解：在上述沉淀中加入75μL纯水，超声处理5min，使与谷氨酸共沉淀的γ-氨基丁酸完全溶解，大部分谷氨酸留在沉淀里面，仍然有少量谷氨酸与γ-氨基丁酸共同溶解出来，因此有必要再次对溶出液进行沉淀；
3)第二轮沉淀：先后加入2.925mL试剂A与5μL试剂B，操作方法同上述步骤1)，完全沉淀与GABA共溶解的谷氨酸，离心后，回收上清液，上清液中只含γ-氨基丁酸；谷氨酸得以完全沉淀，只有微量的γ-氨基丁酸与谷氨酸发生了共沉淀；
4)第二轮溶解：步骤3)中只有微量的γ-氨基丁酸与谷氨酸发生了共沉淀，为了保障γ-氨基丁酸完全溶出，且谷氨酸完全不溶出，本步骤在沉淀中加入1mL谷氨酸排斥试剂，所述排斥试剂是体积比为17:3的试剂A和H2O的混合溶液，超声处理2min，使γ-氨基丁酸完全溶解，而谷氨酸完全留在沉淀里面，离心回收上清液，丢弃沉淀，其中试剂A是体积比为2:1的乙醇和乙酸乙酯的混合溶液，试剂B是1mol/L醋酸锌水溶液。
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短乳杆菌CCTCCM208054生物转化制备γ-氨基丁酸及其GAD系统关键基因分析;李海星;《中国博士学位论文全文数据库(电子期刊)工程科技I辑》;20121015;第B018-6页 *

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