CN109154597A - 用于测定多肽上的总羰基化水平的测定法 - Google Patents

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Abstract

本说明书涉及一种用于测定多肽上总羰基化水平的方法和试剂盒。

Description

用于测定多肽上的总羰基化水平的测定法
交叉引用
本申请要求2016年5月19日提交的美国临时申请号62/338,605的优先权，该临时申请通过引用整体并入本文。
发明领域
本说明书涉及一种用于测定多肽上的总羰基化水平的方法。
背景技术
由于在制造或储存过程中mAb与金属或金属离子接触，因此金属催化的氧化产物是单克隆抗体(mAb)的高度相关的质量属性。在纯化或储存期间，不锈钢是常见的表面接触材料。细胞培养基中存在或从不锈钢中浸出的铁离子可导致mAb的Fc区中的甲硫氨酸和组氨酸氧化。除甲硫氨酸和组氨酸氧化外，蛋白质羰基化(指蛋白质中醛/酮基团的形成)是金属催化的氧化反应的主要降解途径并且尚未对mAb进行广泛研究。作为氧化羰基化的结果，赖氨酸和精氨酸侧链上的正电荷和脯氨酸残基的位阻限制丧失。那些变化可能导致蛋白质聚集倾向增加，从而潜在地影响mAb产物质量和稳定性特征。此外，由金属催化的氧化诱导的mAb聚集体在转基因小鼠中比由其它胁迫条件诱导的那些更具免疫原性。因此，在制造和储存期间由金属催化的氧化鉴定mAb的羰基化程度是非常重要的。
为了定量测量总蛋白质羰基化水平，已采用不同的酰肼作为衍生化试剂以与蛋白质上的羰基反应(Yan等,2011)。定量通常基于酰肼和衍生化后相应的腙的独特特征。例如，广泛使用的分光光度羰基化测定法测量衍生样品在375nm处的吸光度，其中衍生化试剂2,4-二硝基苯肼(DNPH)和所得的腙强烈吸收(Levine等,1990)。荧光羰基化测定法测定荧光素氨基硫脲衍生化后衍生样品的485nm激发和535nm发射的荧光(Mohanty等,2010)。在通过DNPH衍生化样品后，ELISA羰基化测定法使用抗DNPH抗体进行定量(Buss等,1997)。虽然不同的酰肼试剂已被用于衍生化和定量目的，但蛋白质羰基化测定法中的常用程序是在衍生化步骤后除去未结合的酰肼，以防止羰基化水平的过量定量(Rogowska-Wrzesinska等,2014)。通常，未结合的酰肼通过蛋白质沉淀和洗涤除去，这是劳动密集型过程并且构成实验变异性的主要来源。实际上，已经证明，当使用采用DNPH的分光光度羰基化测定法时，两个额外的洗涤步骤将羰基化结果降低了15％(Matthijssens等,2007)。与洗涤步骤相关的大的测定变异性和劳动密集型性质使得难以广泛应用这些羰基化测定法来在产物开发期间测量mAb羰基化。最近使用简化的方法报道了改进的ELISA(Uehara等,2015)和DNPH(Mesquita等,2014)测定法。然而，这些改进的方法仍然是相对劳动密集型的，并且尚未评估其稳健性。荧光黄碳酰肼(LY-CH)先前已被用作衍生化试剂以定量通过高碘酸对抗体的N-聚糖寡糖残基进行氧化所形成的醛基(Morehead等,1991)。描述了一种用LY-CH检测氧化抗体碳水化合物残基的定量标记的测定法(Keener等,1994)。在该测定法中，衍生化反应中LY-CH与多肽的摩尔比因使用常规缓冲系统而受到限制，并导致更难以除去未结合的LY-CH。此外，该测定法不能校正蛋白质对酰肼试剂各自吸光度的贡献来定量羰基含量，这导致高估羰基化含量。
US 2006/0216756 A1公开了一种用于二维评估氧化蛋白质性质的方法，该方法包括在取自皮肤的角质层试样中氧化蛋白质的羰基的特异性荧光标记的步骤。US 2007/0110670 A1公开了包括用荧光染料标记氧化蛋白质的羰基以评估毛发损伤的方法。WO2012175519 A1描述了一种用于检测和/或定量至少一种含蛋白质的样品中的蛋白质羰基的方法，其包括用酰肼标记蛋白质羰基，然后使用一维或二维凝胶电泳分析样品的步骤。
在本说明书中，描述了一种使用荧光黄碳酰肼(CALY)的简化的、更稳健的和更准确的蛋白质羰基化测定法，其克服了如上所述的现有技术的问题。
发明内容
本说明书涉及一种用于测定多肽上的总羰基化水平的方法和试剂盒。
在一个方面中，本说明书涉及一种用于测定多肽上的总羰基化水平的方法，其中该方法包括以下步骤：a)在酰肼染料可以与多肽的氨基酸残基上存在的羰基反应以形成多肽-染料-复合物的条件下，使多肽溶液与酰肼染料接触，b)从步骤a)的所得溶液中除去未结合的酰肼染料，c)在步骤b)的所得溶液中测定多肽-染料-复合物中结合的酰肼染料的浓度和多肽-染料-复合物中结合的多肽的浓度，和d)基于多肽-染料-复合物中结合的酰肼染料的浓度与多肽-染料-复合物中结合的多肽的浓度的比率测定多肽的总羰基化水平。
在一个实施方案中，酰肼染料是LY-CH。在一个实施方案中，步骤a)在碱金属离子存在下进行。在一个实施方案中，多肽的氨基酸残基选自由精氨酸、赖氨酸、脯氨酸和苏氨酸组成的组。在一个实施方案中，多肽是抗体。在一个实施方案中，抗体是多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、多特异性抗体、抗体片段、抗体药物缀合物、THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。在一个实施方案中，多肽和酰肼染料在步骤a)中以6,000-10,000的最终摩尔比接触。在一个实施方案中，步骤a)在非离子表面活性剂存在下进行。在一个实施方案中，非离子表面活性剂是还原型Triton X-100。在一个实施方案中，步骤a)在35℃-39℃的温度下进行。在一个实施方案中，步骤a)进行10-20h。在一个实施方案中，步骤b)通过选自由过滤、凝胶过滤和透析组成的组的方法进行。在一个实施方案中，步骤b)通过过滤进行。在一个实施方案中，过滤在100-300mM磷酸钾存在下和在200-300mM氯化钾存在下进行。
在另一方面中，本说明书涉及一种用于实施本文所述方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含酰肼染料和缓冲液。在一个实施方案中，酰肼染料是LY-CH。在一个实施方案中，缓冲液是锂MES缓冲液。在一个实施方案中，试剂盒进一步包含非离子表面活性剂、多肽的标准品和酰肼染料的标准品。在一个实施方案中，非离子表面活性剂是还原型Triton X-100。
附图说明
图1显示了来自金属催化的氧化的主要羰基化产物。
图2A显示了LY-CH与羰基之间的衍生化反应。
图2B显示了CALY的工作流程。
图3A显示了LY-CH衍生的mAb样品(箭头显示峰积分的开始和结束)和缓冲液空白(较低的图谱)在280nm下的吸光度的尺寸排阻色谱图。
图3B显示了LY-CH衍生的mAb样品(箭头显示峰积分的开始和结束)和缓冲液空白(较低的图谱)在428nm下的吸光度的尺寸排阻色谱图。
图4A显示了多肽和LY-CH在280nm下的标准曲线。在标准曲线的线性回归拟合之后，m1＝4813.9；b1＝-125.98；m3＝35.507；b3＝1.4328。
图4B显示了多肽和LY-CH在428nm处的标准曲线。在标准曲线的线性回归拟合之后，m2＝10.085；b2＝3.2458；m4＝18.735；b4＝1.3937。
图5显示了衍生化反应条件对LY-CH与mAb摩尔比的优化，其中反应时间为18h。
图6显示了衍生化反应条件对反应时间的优化，其中LY-CH与mAb摩尔比为8000：1。
图7A显示了对CALY测定法的稳健性评估，特别是衍生化反应的mAb浓度。
图7B显示了对CALY测定法的稳健性评估，特别是衍生化反应的摩尔比。
图7C显示了对CALY测定法的稳健性评估，特别是衍生化反应的pH值。
图7D显示了对CALY测定法的稳健性评估，特别是缓冲液交换(通过过滤)步骤的数量。
图7E显示了对CALY测定法的稳健性评估，特别是注射体积。
图7F显示了对CALY测定法的稳健性评估，特别是样品相对于冷冻/解冻循环次数的稳定性。
图8显示了对在2-8℃下储存在自动进样器中长达15h的LY-CH衍生的mAb样品的稳定性的稳健性评估。
图9显示了通过两位分析人员在三天内和在两种不同的HPLC仪器上分析共混样品，该方法对测定线性和测定精确度的性能。
图10显示了通过分析共混样品，DNPH方法对测定线性和测定精确度的性能。
图11显示了利用和不利用PNG酶F处理的氧化mAb样品的总蛋白质羰基化水平。
图12A显示了所得总羰基化水平与Fe(II)之间的关系。
图12B显示了所得的总羰基化水平与用于金属催化的氧化的过氧化氢浓度之间的关系。
图12C显示了总羰基化水平、Fe(II)与用于金属催化的氧化的过氧化氢浓度之间的关系。
图13显示了含有不同量的Fe(II)(0.1μM和0.8μM)和PS20(0.02％和0.16％，w/v)并在室温下在黑暗中储存4周、8周和16周的mAb样品的总蛋白质羰基化水平。条件B5：0.8μMFe(II)和0.16％PS20；条件B3：0.1μM Fe(II)和0.16％PS20；条件B4：0.8μM Fe(II)和0.02％PS20；条件B2：0.1μM Fe(II)和0.02％PS20；条件B1：不含Fe(II)或PS20(对照)。
具体实施方式
I.定义
出于解释本说明书的目的，以下定义将适用，并且在适当时，以单数使用的术语也将包括复数，反之亦然。在下面列出的任何定义与通过引用并入本文的任何文件冲突的情况下，则以下列出的定义为准。
如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”，“或”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。应理解，本文描述的本发明的方面和变化包括“由方面和变化组成”和/或“基本上由方面和变化组成”。
本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的通常误差范围。文中对“约”值或参数的提及包括(并描述)针对该值或参数本身的实施方案。
本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、只要它们表现出所需的抗原结合活性的抗体片段、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、抗体药物缀合物、THIOMABTM和THIOMABTM药物缀合物。
本文所用的术语“羰基化”是指在多肽中的氨基酸残基上形成醛或酮基团，例如，如图1中所示。如本文所用，术语“总羰基化水平”是指每单位量(以nmol或mg计)多肽的羰基(以nmol计)的量。
如本文所用的术语“衍生化”是指改变氨基酸或多肽的化学性质，同时保持氨基酸或多肽主链结构不变的化学反应。具体地，本文中LY-CH用于如图2A所示的化学反应以化学上修饰氨基酸或多肽上的羰基，从而形成多肽-染料-复合物(通过荧光黄碳酰肼上的酰肼基团与多肽上的羰基之间形成希夫碱的反应，如图2A所示)。
如本文所用的术语“积分吸光度峰面积”是指在特定波长下针对特定分析物测量的色谱图中的曲线下面积。例如，图3显示了LY-CH衍生的mAb样品在280nm(图3A)和428nm(图3B)下的吸光度的尺寸排阻色谱图。箭头显示峰积分的起点和终点。图3中的积分吸收峰面积是起点与终点之间的曲线下面积。
本文使用术语“线性回归拟合”，如Yan,X.,Gang Su,X.(2009),LinearRegression Analysis:Theory and Computing,World Scientific中所述。
本文所用的术语“荧光黄”、“荧光黄碳酰肼”、“荧光黄CH”、“LY”或“LY-CH”是指未结合和/或结合形式的荧光黄。荧光黄是一种水溶性染料，在280nm和428nm下具有强烈的电磁辐射吸收。本文所用的术语“多肽-染料-复合物”是指与酰肼染料反应从而形成多肽-染料-复合物的多肽。具体地，本文所用的术语“多肽-染料-复合物”是指与如上所述的LY-CH反应的多肽。术语“未结合的酰肼染料”具体地是指本文中用作衍生化试剂的酰肼染料，即其不结合在多肽-染料-复合物中。术语“未结合的LY-CH”具体地是指本文中用作衍生化试剂的LY-CH，即其不结合在多肽-染料-复合物中。术语“荧光黄”、“荧光黄碳酰肼”、“荧光黄CH”、“LY”或“LY-CH”可互换使用。如本文所用的LY-CH用作LY-CH二锂盐。
如本文所用的术语“酰肼染料”是指包含酰肼作为官能团的染料。酰肼染料的通用结构是E-N(R)-N(R)2，其中R可以是氢，E是染料。术语“染料”是指吸收例如波长为428nm的电磁辐射的分子或部分。
如本文所用的术语“摩尔比”是指本文所述的衍生化反应中使用的LY-CH的量(以摩尔计)与多肽的量(以摩尔计)的比率。
如本文所用，术语过滤单元的“标称分子量极限”是指至少90％的特定分子量的溶质被保留的过滤单元的孔径，例如，标称分子量极限为30kDa的过滤单元保留至少90％的分子量为30kDa的溶质。
如本文所用的术语“非离子表面活性剂”是指一种具有降低两种液体之间或液体与固体之间的表面张力的能力的非离子试剂。非离子表面活性剂的实例是Nonidet P-40、泊洛沙姆188、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Triton X-100、还原型Triton X-100、吐温20和吐温80。本文所用的术语“还原型Triton X-100”涉及其中苯环已被还原成环己烷环的Triton X-100。由于苯环，因此未还原的Triton X-100具有与多肽的吸收光谱重叠的吸收光谱(260nm-280nm)。还原成环己烷环使得Triton X-100适合于分析多肽，因为Triton X-100和多肽的吸收光谱没有发生重叠。
术语“多肽”或“蛋白质”在本文中可互换使用以指具有任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。该术语还包括天然或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，例如与标记组分的缀合。定义中还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)，以及本领域已知的其它修饰的多肽。本文使用的术语“多肽”和“蛋白质”特别地包括抗体。
II.方法
在本说明书中，提供了一种用于测量多肽的总羰基化水平的简化的、更稳健的和更准确的蛋白质羰基化测定法。如前所述，通过蛋白质沉淀和洗涤除去未结合的酰肼是劳动密集型过程，并且构成实验变异性的主要来源，例如，由于样品损失。将LY-CH选择作为衍生化试剂，因为它在水中具有相对高的溶解度(约200mM)并且比许多酰肼试剂如DNPH明显更亲水。LY-CH的可溶性和亲水性使得能够通过缓冲液交换过滤方法除去未结合的LY-CH，这导致优异的样品回收。在本说明书中，LY-CH的溶解度通过使用氢氧化锂进行缓冲液制备而进一步提高。与常规缓冲液系统相比，基于在改进的缓冲液中存在锂离子而提高LY-CH的溶解度允许使用更高的LY-CH与多肽的摩尔比进行衍生化反应，并且更容易除去残留的LY-CH试剂。LY-CH用作衍生化试剂的另一个优点是荧光黄部分在水溶液中的化学稳定性。即使在一次分析多个样品时，该性质也确保了衍生化试剂的发色团以及所得腙在分析的时间过程中的稳定性。
在一个方面中，本说明书涉及一种用于测定多肽上的总羰基化水平的方法，其中该方法包括以下步骤：a)在酰肼染料可以与多肽的氨基酸残基上存在的羰基反应以形成多肽-染料-复合物的条件下，使多肽溶液与酰肼染料接触，b)从步骤a)的所得溶液中除去未结合的酰肼染料，c)在步骤b)的所得溶液中测定多肽-染料-复合物中结合的酰肼染料的浓度和多肽-染料-复合物中结合的多肽的浓度，和d)基于多肽-染料-复合物中结合的酰肼染料的浓度与多肽-染料-复合物中结合的多肽的浓度的比率测定多肽的总羰基化水平。
在另一个方面中，本说明书涉及一种用于测定多肽上的总羰基化水平的方法，其中该方法包括以下步骤：a)在酰肼染料可以与多肽的氨基酸残基上存在的羰基反应以形成多肽-染料-复合物的条件下，使多肽溶液与酰肼染料接触，b)从步骤a)的所得溶液中除去未结合的酰肼染料，c)将来自步骤b)的所得溶液应用于色谱以产生i)第一波长下的色谱图，得到第一积分峰面积，和ii)第二波长下的色谱图，得到第二积分峰面积，以及d)基于多肽-染料-复合物中结合的酰肼染料的浓度与多肽-染料-复合物中结合的多肽的浓度的比率测定多肽的总羰基化水平，各自基于第一积分峰面积和第二积分峰面积测定。
在又另一个方面中，本说明书涉及一种用于测定多肽上的总羰基化水平的方法，其中该方法包括以下步骤：a)在酰肼染料可以与多肽的氨基酸残基上存在的羰基反应以形成多肽-染料-复合物的条件下，使多肽溶液与酰肼染料接触，b)从步骤a)的所得溶液中除去未结合的酰肼染料，c)将来自步骤b)的所得溶液应用于色谱以产生i)第一波长下的色谱图，得到第一积分峰面积，和ii)第二波长下的色谱图，得到第二积分峰面积，d)产生四条标准曲线，i)第一波长下酰肼染料的标准曲线，ii)第二波长下酰肼染料的标准曲线，iii)第一波长下多肽的标准曲线，和iv)第二波长下多肽的标准曲线，e)基于四条标准曲线、第一积分峰面积和第二积分峰面积计算多肽-染料-复合物中结合的酰肼染料的浓度和多肽-染料-复合物中结合的多肽的浓度，和f)基于多肽-染料-复合物中结合的酰肼染料的浓度与多肽-染料-复合物中结合的多肽的浓度的比率测定多肽的总羰基化水平。
在一个实施方案中，酰肼染料选自由Cy3酰肼、Cy5酰肼、Cy5.5酰肼、Cy7酰肼、Cy7.5酰肼、香豆素酰肼、iFluorTM染料酰肼、HiLyteTMFluor 647酰肼、Alexa 488酰肼、Alexa 568酰肼、Alexa 633酰肼和荧光黄酰肼组成的组。在一个实施方案中，酰肼染料是LY-CH。在一个实施方案中，酰肼染料是LY-CH二锂盐。
在一个实施方案中，步骤a)在碱金属离子存在下进行。在一个实施方案中，碱金属离子以1-100mM的浓度存在。在一个实施方案中，碱金属离子以10-90mM的浓度存在。在一个实施方案中，碱金属离子以20-80mM的浓度存在。在一个实施方案中，碱金属离子以30-70mM的浓度存在。在一个实施方案中，碱金属离子以40-60mM的浓度存在。在一个实施方案中，碱金属离子以45-55mM的浓度存在。在一个实施方案中，碱金属离子以46-54mM的浓度存在。在一个实施方案中，碱金属离子以47-53mM的浓度存在。在一个实施方案中，碱金属离子以48-52mM的浓度存在。在一个实施方案中，碱金属离子以49-51mM的浓度存在。在一个实施方案中，碱金属离子以约50mM的浓度存在。在一个实施方案中，碱金属离子以50mM的浓度存在。
在一个实施方案中，步骤a)中存在的碱金属离子选自由锂离子、钠离子和钾离子组成的组。在一个实施方案中，步骤a)中存在的碱金属离子是锂离子。在一个实施方案中，锂离子以1-100mM的浓度存在。在一个实施方案中，锂离子以10-90mM的浓度存在。在一个实施方案中，锂离子以20-80mM的浓度存在。在一个实施方案中，锂离子以30-70mM的浓度存在。在一个实施方案中，锂离子以40-60mM的浓度存在。在一个实施方案中，锂离子以45-55mM的浓度存在。在一个实施方案中，锂离子以46-54mM的浓度存在。在一个实施方案中，锂离子以47-53mM的浓度存在。在一个实施方案中，锂离子以48-52mM的浓度存在。在一个实施方案中，锂离子以49-51mM的浓度存在。在一个实施方案中，锂离子以约50mM的浓度存在。在一个实施方案中，锂离子以50mM的浓度存在。
在本说明书中，通过减去428nm下的多肽贡献使用428nm下的校正吸光度以计算样品中羰基的摩尔浓度；相应地，通过减去280nm下的LY-CH贡献使用280nm下的校正吸光度以计算多肽浓度/量。相比之下，其它测定法不对酰肼试剂的各自吸光度的428nm下的多肽贡献进行校正以定量羰基含量，导致高估羰基化含量。换句话说，因为多肽结合的荧光黄部分和多肽组分在280nm和428nm下对测量的吸光度峰面积都有贡献，所以使用利用LY-CH标准品和未衍生的mAb(作为多肽标准品)产生的标准曲线，计算LY-CH的各自浓度和多肽的各自浓度。因此，在一个实施方案中，对荧光黄的吸光度进行校正和对多肽的吸光度进行校正。
在一个实施方案中，第一波长为420-440nm。在一个实施方案中，第一波长为425-435nm。在一个实施方案中，第一波长为426-430nm。在一个实施方案中，第一波长为427-428nm。在一个实施方案中，第一波长为约428nm。在一个实施方案中，第一波长为428nm。
在一个实施方案中，第二波长为270-290nm。在一个实施方案中，第二波长为275-285nm。在一个实施方案中，第二波长为278-282nm。在一个实施方案中，第二波长为279-281nm。在一个实施方案中，第二波长为约280nm。在一个实施方案中，第二波长为280nm。
如本文所述，羰基化发生在多肽如抗体的氨基酸残基上。在一个实施方案中，发生羰基化的氨基酸残基选自由精氨酸、赖氨酸、脯氨酸和苏氨酸组成的组。在一个实施方案中，羰基化发生在多肽的氨基酸残基的醛基上。在一个实施方案中，羰基化发生在多肽的氨基酸残基的酮基上。
在一个实施方案中，多肽是同源多聚体多肽。在一个实施方案中，多肽是同源二聚体或同源三聚体。在一个实施方案中，多肽是异源多聚体多肽。在一个实施方案中，多肽是生物活性多肽。在一个实施方案中，多肽是抗体。在一个实施方案中，抗体选自由多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、多特异性抗体、抗体药物缀合物、THIOMABTM和THIOMABTM药物缀合物组成的组。在一个实施方案中，抗体属于G类IgG1亚类或IgG4亚类或其变体。在一个实施方案中，抗体是抗体片段。在一个实施方案中，抗体片段选自Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、双抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)和由抗体片段形成的多特异性抗体。
在一个实施方案中，使多肽和酰肼染料以6,000-10,000的最终摩尔比接触。在一个实施方案中，使多肽和酰肼染料以7,000-9,000的最终摩尔比接触。在一个实施方案中，使多肽和酰肼染料以7,500-8,500的最终摩尔比接触。在一个实施方案中，使多肽和酰肼染料以7,800-8,200的最终摩尔比接触。在一个实施方案中，使多肽和酰肼染料以7,900-8,100的最终摩尔比接触。在一个实施方案中，使多肽和酰肼染料以7,950-8,050的最终摩尔比接触。在一个实施方案中，使多肽和酰肼染料以选自由6,000、7,000、8,000、9,000和10,000组成的组的最终摩尔比接触。在一个实施方案中，使多肽和酰肼染料以约8,000的最终摩尔比接触。在一个实施方案中，使多肽和酰肼染料以8,000的最终摩尔比接触。在一个实施方案中，酰肼染料是LY-CH。
在一个实施方案中，步骤a)在非离子表面活性剂存在下进行。在一个实施方案中，非离子表面活性剂以0.01％(w/v)-5％(w/v)的浓度存在。在一个实施方案中，非离子表面活性剂以0.1％(w/v)-5％(w/v)的浓度存在。在一个实施方案中，非离子表面活性剂以0.2％(w/v)-4％(w/v)的浓度存在。在一个实施方案中，非离子表面活性剂以0.3％(w/v)-3％(w/v)的浓度存在。在一个实施方案中，非离子表面活性剂以0.4％(w/v)-2％(w/v)的浓度存在。在一个实施方案中，非离子表面活性剂以0.5％(w/v)-1.5％(w/v)的浓度存在。在一个实施方案中，非离子表面活性剂以0.6％(w/v)-1.4％(w/v)的浓度存在。在一个实施方案中，非离子表面活性剂以0.7％(w/v)-1.3％(w/v)的浓度存在。在一个实施方案中，非离子表面活性剂以0.8％(w/v)-1.2％(w/v)的浓度存在。在一个实施方案中，非离子表面活性剂以0.9％(w/v)-1.1％(w/v)的浓度存在。在一个实施方案中，非离子表面活性剂以1％(w/v)的浓度存在。在一个实施方案中，非离子表面活性剂以约0.05％(w/v)的浓度存在。
在一个实施方案中，非离子表面活性剂选自由Nonidet P-40、泊洛沙姆188、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Triton X-100、还原型Triton X-100、吐温20和吐温80组成的组。在一个实施方案中，非离子表面活性剂是还原型Triton X-100。
在一个实施方案中，步骤a)在黑暗中进行。在一个实施方案中，步骤a)在不含伯胺或仲胺的缓冲液中进行。在一个实施方案中，步骤a)在具有pH4-7的容量的缓冲液中进行。在一个实施方案中，步骤a)在选自由MES、MOPS、HEPES和PIPES组成的组的缓冲液中进行，其不含伯胺或仲胺。在一个实施方案中，步骤a)在MES缓冲液中进行。在一个实施方案中，步骤a)在锂MES缓冲液中进行。
在一个实施方案中，步骤a)在5-7的pH值下进行。在一个实施方案中，步骤a)在5.5-6.5的pH值下进行。在一个实施方案中，步骤a)在5.6-6.4的pH值下进行。在一个实施方案中，步骤a)在5.7-6.3的pH值下进行。在一个实施方案中，步骤a)在5.8-6.2的pH值下进行。在一个实施方案中，步骤a)在5.9-6.1的pH值下进行。在一个实施方案中，步骤a)在约5.9的pH值下进行。在一个实施方案中，步骤a)在约6.0的pH值下进行。在一个实施方案中，步骤a)在约6.1的pH值下进行。在一个实施方案中，步骤a)在5.9的pH值下进行。在一个实施方案中，步骤a)在6.0的pH值下进行。在一个实施方案中，步骤a)在6.1的pH值下进行。
在一个实施方案中，步骤a)在35℃-39℃的温度下进行。在一个实施方案中，步骤a)在36℃-38℃的温度下进行。在一个实施方案中，步骤a)在36.5℃-37.5℃的温度下进行。在一个实施方案中，步骤a)在约37℃的温度下进行。在一个实施方案中，步骤a)在37℃的温度下进行。
在一个实施方案中，步骤a)进行1-50h。在一个实施方案中，步骤a)进行5-40h。在一个实施方案中，步骤a)进行8-30h。在一个实施方案中，步骤a)进行11-25h。在一个实施方案中，步骤a)进行12-20h。在一个实施方案中，步骤a)进行13-19h。在一个实施方案中，步骤a)进行14-18h。在一个实施方案中，步骤a)进行15-17h。在一个实施方案中，步骤a)进行约16h。在一个实施方案中，步骤a)进行16h。在一个实施方案中，步骤a)进行17-19h。在一个实施方案中，步骤a)进行约18h。在一个实施方案中，步骤a)进行18h。
在一个实施方案中，未结合的酰肼染料的除去通过选自由过滤、凝胶过滤和透析组成的组的方法进行。在一个实施方案中，未结合的酰肼染料的除去通过过滤进行。可以使用能够将酰肼染料与多肽分离的任何过滤器。在一个实施方案中，过滤利用标称分子量极限为5-50kDa的过滤单元进行。在一个实施方案中，过滤利用标称分子量极限为5kDa的过滤单元进行。在一个实施方案中，过滤利用标称分子量极限为10kDa的过滤单元进行。在一个实施方案中，过滤利用标称分子量极限为15kDa的过滤单元进行。在一个实施方案中，过滤利用标称分子量极限为20kDa的过滤单元进行。在一个实施方案中，过滤利用标称分子量极限为25kDa的过滤单元进行。在一个实施方案中，过滤利用标称分子量极限为30kDa的过滤单元进行。在一个实施方案中，过滤利用标称分子量极限为35kDa的过滤单元进行。在一个实施方案中，过滤利用标称分子量极限为40kDa的过滤单元进行。在一个实施方案中，过滤利用标称分子量极限为45kDa的过滤单元进行。在一个实施方案中，过滤利用标称分子量极限为50kDa的过滤单元进行。在一个实施方案中，未结合的酰肼染料的除去通过凝胶过滤进行。在一个实施方案中，未结合的酰肼染料的除去通过透析进行。
在一个实施方案中，过滤在100-300mM磷酸钾存在下进行。在一个实施方案中，过滤在110-290mM磷酸钾存在下进行。在一个实施方案中，过滤在120-280mM磷酸钾存在下进行。在一个实施方案中，过滤在130-270mM磷酸钾存在下进行。在一个实施方案中，过滤在140-260mM磷酸钾存在下进行。在一个实施方案中，过滤在150-250mM磷酸钾存在下进行。在一个实施方案中，过滤在160-240mM磷酸钾存在下进行。在一个实施方案中，过滤在170-230mM磷酸钾存在下进行。在一个实施方案中，过滤在180-220mM磷酸钾存在下进行。在一个实施方案中，过滤在190-210mM磷酸钾存在下进行。在一个实施方案中，过滤在195-205mM磷酸钾存在下进行。在一个实施方案中，过滤在约200mM磷酸钾存在下进行。在一个实施方案中，过滤在200mM磷酸钾存在下进行。
在一个实施方案中，过滤在200-300mM氯化钾存在下进行。在一个实施方案中，过滤在210-290mM氯化钾存在下进行。在一个实施方案中，过滤在220-280mM氯化钾存在下进行。在一个实施方案中，过滤在230-270mM氯化钾存在下进行。在一个实施方案中，过滤在240-260mM氯化钾存在下进行。在一个实施方案中，过滤在245-255mM氯化钾存在下进行。在一个实施方案中，过滤在约250mM氯化钾存在下进行。在一个实施方案中，过滤在250mM氯化钾存在下进行。
在一个实施方案中，过滤在100-300mM磷酸钾存在下和在200-300mM氯化钾存在下进行。在一个实施方案中，过滤在200mM磷酸钾存在下和在250mM氯化钾存在下进行。
在一个实施方案中，过滤在5.4-7.0的pH值下进行。在一个实施方案中，过滤在5.5-6.9的pH值下进行。在一个实施方案中，过滤在5.6-6.8的pH值下进行。在一个实施方案中，过滤在5.7-6.7的pH值下进行。在一个实施方案中，过滤在5.8-6.6的pH值下进行。在一个实施方案中，过滤在5.9-6.5的pH值下进行。在一个实施方案中，过滤在6.0-6.4的pH值下进行。在一个实施方案中，过滤在6.1-6.3的pH值下进行。在一个实施方案中，过滤在约6.2的pH值下进行。在一个实施方案中，过滤在6.2的pH值下进行。
在一个实施方案中，在色谱期间，将多肽-染料-复合物与未结合的酰肼染料分离，使得多肽-染料-复合物与未结合的酰肼染料之间不发生干扰，如图3A和3B所示。如文中所用，术语“无干扰”意指在色谱期间，多肽-染料-复合物的基线分辨峰(在10与22分钟之间洗脱)与未结合的酰肼染料的基线分辨峰(在约24分钟时洗脱)之间没有或没有相关的重叠。
此外，在上述步骤c)中使用尺寸排阻色谱(SEC)，其中将未结合的LY-CH与多肽-染料-复合物分离。使用SEC的益处在于定量不受样品中存在的可变量的未结合的LY-CH的影响，如以下实施例中描述的稳健性实验所证明。因此，使用LY-CH进行衍生化和使用SEC分析进行定量的组合提供了改进的样品制备程序，其不依赖于彻底和可重复地除去未结合的酰肼试剂以获得最佳方法性能。
因此，在一个实施方案中，色谱是尺寸排阻色谱。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱以0.1-0.9ml/min的等度流速进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱以0.2-0.8ml/min的等度流速进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱以0.3-0.7ml/min的等度流速进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱以0.4-0.6ml/min的等度流速进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱以约0.5ml/min的等度流速进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱以0.5ml/min的等度流速进行。
在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在20℃-30℃的柱温下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在21℃-29℃的柱温下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在22℃-28℃的柱温下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在23℃-27℃的柱温下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在24℃-26℃的柱温下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在约25℃的柱温下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在25℃的柱温下进行。
在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在100-300mM磷酸钾存在下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在110-290mM磷酸钾存在下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在120-280mM磷酸钾存在下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在130-270mM磷酸钾存在下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在140-260mM磷酸钾存在下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在150-250mM磷酸钾存在下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在160-240mM磷酸钾存在下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在170-230mM磷酸钾存在下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在180-220mM磷酸钾存在下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在190-210mM磷酸钾存在下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在195-205mM磷酸钾存在下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在约200mM磷酸钾存在下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在200mM磷酸钾存在下进行。
在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在200-300mM氯化钾存在下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在210-290mM氯化钾存在下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在220-280mM氯化钾存在下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在230-270mM氯化钾存在下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在240-260mM氯化钾存在下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在245-255mM氯化钾存在下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在约250mM氯化钾存在下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在250mM氯化钾存在下进行。
在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在5.4-7.0的pH值下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在5.5-6.9的pH值下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在5.6-6.8的pH值下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在5.7-6.7的pH值下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在5.8-6.6的pH值下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在5.9-6.5的pH值下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在6.0-6.4的pH值下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在6.1-6.3的pH值下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在约6.2的pH值下进行。在一个实施方案中，尺寸排阻色谱在6.2的pH值下进行。
在一个实施方案中，四条标准曲线通过尺寸排阻色谱产生。在一个实施方案中，四条标准曲线使用以下等式产生：
使用等式1得到第四标准曲线(在280nm下的多肽)：y1＝m1x+b1
使用等式2得到第三标准曲线(在428nm下的多肽)：y2＝m2x+b2
使用等式3得到第二标准曲线(在280nm下的荧光黄)：y3＝m3z+b3
使用等式4得到第一标准曲线(在428nm下的荧光黄)：y4＝m4z+b4,
其中x是多肽的浓度，单位为mg/mL，z是荧光黄的摩尔浓度，单位为μM，m1至m4和b1至b4是从线性回归拟合得到的常数。
在一个实施方案中，通过求解双变量(x和z)线性等式，将多肽的羰基化水平计算为z/x(nmol/mg)：
等式5：A280＝m1x+b1+m3z+b3
等式6：A428＝m2x+b2+m4z+b4
其中z是羰基的摩尔浓度(μM)，x是蛋白质浓度(mg/mL)；A280是来自280nm吸光度的LY-CH衍生的mAb物质的积分峰面积，如图3A所示；A428是来自428nm吸光度的LY-CH衍生的mAb物质的积分峰面积，如图3B所示。
.
z和x可以通过求解如下所示的线性等式5和6来确定。
x＝[m4*A280-m3*A428-m4*(b1+b3)+m3*(b2+b4)]/(m4*m1-m2*m3)
z＝[m2*A280-m1*A428-m2*(b1+b3)+m1*(b2+b4)]/(m2*m3-m1*m4)
然后将总羰基化水平计算为z/x。
III.试剂盒
为了用于本文描述的应用，还提供了试剂盒或制品。该试剂盒可以包括载体装置，其被分隔以在封闭限制下接收一个或多个容器装置，例如小瓶、管等，每个容器装置包括在该方法中使用的单独元件中的一个。在一个实施方案中，容器装置中的一个可包括酰肼染料。在一个实施方案中，酰肼染料选自由Cy3酰肼、Cy5酰肼、Cy5.5酰肼、Cy7酰肼、Cy7.5酰肼、香豆素酰肼、iFluorTM染料酰肼、HiLyteTMFluor 647酰肼、Alexa 488酰肼、Alexa 568酰肼、Alexa 633酰肼和LY-CH组成的组。在一个实施方案中，酰肼染料是LY-CH。在一个实施方案中，酰肼染料是LY-CH二锂盐。在一个实施方案中，容器装置中的一个包括缓冲器。在一个实施方案中，容器装置中的一个包括含有锂离子的缓冲液。在一个实施方案中，缓冲液不含伯胺或仲胺。在一个实施方案中，缓冲液具有pH 4-7的容量。在一个实施方案中，缓冲液选自由MES、MOPS、HEPES和PIPES组成的组，其不含伯胺或仲胺。在一个实施方案中，缓冲液是锂MES缓冲液。在一个实施方案中，缓冲液是pH值为6.0的锂MES缓冲液。在一个实施方案中，缓冲液是pH值为6.1的锂MES缓冲液。
在一个实施方案中，容器装置中的一个包括非离子表面活性剂。在一个实施方案中，非离子表面活性剂选自由Nonidet P-40、辛基-β-葡糖苷、泊洛沙姆188、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Triton X-100、还原型Triton X-100、吐温20和吐温80组成的组。在一个实施方案中，非离子表面活性剂是还原型Triton X-100。
在一个实施方案中，容器装置中的一个包括多肽的标准品，容器装置中的一个包括酰肼染料的标准品。在一个实施方案中，容器装置中的一个包括过滤单元。在一个实施方案中，过滤单元是30kDa过滤单元。在一个实施方案中，容器装置中的一个包括磷酸钾。在一个实施方案中，容器装置中的一个包括氯化钾。
试剂盒通常包括上述容器和一个或多个其它容器，其包括从商业和用户角度所需的材料，包括缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器和具有使用说明的包装说明书。标签可以存在于容器上以指示该组合物用于非治疗性应用，并且还可以指示体外使用的指导，例如上述那些。试剂盒中的其它任选组分包括一种或多种缓冲液(例如，衍生缓冲液、封闭缓冲液、洗涤缓冲液、底物缓冲液等)、其它试剂如通过酶标记化学上改变的底物(例如色素原)、表位修复溶液、对照样品(阳性和/或阴性对照)、对照载玻片等。
IV.具体实施方案
1.一种用于测定多肽上总羰基化水平的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)在酰肼染料可以与多肽的氨基酸残基上存在的羰基反应以形成多肽-染料-复合物的条件下，使多肽溶液与酰肼染料接触，
b)从步骤a)的所得溶液中除去未结合的酰肼染料，
c)在步骤b)的所得溶液中测定多肽-染料-复合物中结合的酰肼染料的浓度和多肽-染料-复合物中结合的多肽的浓度，以及
d)基于多肽-染料-复合物中结合的酰肼染料的浓度与多肽-染料-复合物中结合的多肽的浓度的比率测定多肽的总羰基化水平。
2.一种用于测定多肽上总羰基化水平的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)在酰肼染料可以与多肽的氨基酸残基上存在的羰基反应以形成多肽-染料-复合物的条件下，使多肽溶液与酰肼染料接触，
b)从步骤a)的所得溶液中除去未结合的酰肼染料，
c)将来自步骤b)的所得溶液应用于色谱以产生i)第一波长下的色谱图，得到第一积分峰面积，和ii)第二波长下的色谱图，得到第二积分峰面积，以及
d)基于多肽-染料-复合物中结合的酰肼染料的浓度与多肽-染料-复合物中结合的多肽的浓度的比率测定多肽的总羰基化水平，各自基于第一积分峰面积和第二积分峰面积测定。
3.一种用于测定多肽上总羰基化水平的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)在酰肼染料可以与多肽的氨基酸残基上存在的羰基反应以形成多肽-染料-复合物的条件下，使多肽溶液与酰肼染料接触，
b)从步骤a)的所得溶液中除去未结合的酰肼染料，
c)将来自步骤b)的所得溶液应用于色谱以产生i)第一波长下的色谱图，得到第一积分峰面积，和ii)第二波长下的色谱图，得到第二积分峰面积，
d)产生四条标准曲线，i)第一波长下酰肼染料的标准曲线，ii)第二波长下酰肼染料的标准曲线，iii)第一波长下多肽的标准曲线，和iv)第二波长下多肽的标准曲线，
e)基于四条标准曲线、第一积分峰面积和第二积分峰面积计算多肽-染料-复合物中结合的酰肼染料的浓度和多肽-染料-复合物中结合的多肽的浓度，以及
f)基于多肽-染料-复合物中结合的酰肼染料的浓度与多肽-染料-复合物中结合的多肽的浓度的比率测定多肽的总羰基化水平。
4.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述酰肼染料选自由Cy3酰肼、Cy5酰肼、Cy5.5酰肼、Cy7酰肼、Cy7.5酰肼、香豆素酰肼、iFluorTM染料酰肼、HiLyteTM Fluor647酰肼、Alexa 488酰肼、Alexa 568酰肼、Alexa 633酰肼和LY-CH组成的组。
5.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述酰肼染料是LY-CH。
6.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤a)在碱金属离子存在下进行。
7.根据实施方案6所述的方法，其中所述碱金属离子以1-100mM的浓度存在。
8.根据实施方案6所述的方法，其中所述碱金属离子以50mM的浓度存在。
9.根据实施方案6-8中任一项所述的方法，其中所述碱金属离子选自由锂离子、钠离子和钾离子组成的组。
10.根据实施方案6-8中任一项所述的方法，其中所述碱金属离子是锂离子。
11.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤a)在锂MES缓冲液中进行。
12.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤a)中的反应是衍生化。
13.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一波长在426nm-430nm范围内。
14.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一波长为428nm。
15.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第二波长在278nm-282nm范围内。
16.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第二波长为280nm。
17.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述氨基酸残基选自由精氨酸、赖氨酸、脯氨酸和苏氨酸组成的组。
18.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述多肽是抗体。
19.根据实施方案18所述的方法，其中所述抗体是多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、多特异性抗体、抗体片段、抗体药物缀合物、THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。
20.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述多肽和所述酰肼染料在步骤a)中以6,000-10,000的最终摩尔比接触。
21.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述多肽和所述酰肼染料在步骤a)中以8,000的最终摩尔比接触。
22.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤a)在非离子表面活性剂存在下进行。
23.根据实施方案22所述的方法，其中所述非离子表面活性剂选自由Nonidet P-40、泊洛沙姆188、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Triton X-100、还原型Triton X-100、吐温20和吐温80组成的组。
24.根据实施方案22所述的方法，其中所述非离子表面活性剂是还原型Triton X-100。
25.根据实施方案22-24中任一项所述的方法，其中所述非离子表面活性剂以0.01％(w/v)-5％(w/v)的浓度存在。
26.根据实施方案22-24中任一项所述的方法，其中所述非离子表面活性剂以0.05％(w/v)的浓度存在。
27.根据实施方案22-24中任一项所述的方法，其中所述非离子表面活性剂以1％(w/v)的浓度存在。
28.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤a)在黑暗中进行。
29.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤a)在5-7的pH值下进行。
30.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤a)在6.0的pH值下进行。
31.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤a)在6.1的pH值下进行。
32.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤a)在35℃-39℃的温度下进行。
33.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤a)在37℃的温度下进行。
34.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤a)进行10-20h。
35.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤a)进行16h。
36.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤a)进行18h。
37.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤b)中所述未结合的酰肼染料的除去通过选自由过滤、凝胶过滤和透析组成的组的方法进行。
38.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述未结合的酰肼染料的除去通过过滤进行。
39.根据实施方案35所述的方法，其中所述过滤使用标称分子量极限为5-50kDa的过滤单元进行。
40.根据实施方案35中任一项所述的方法，其中所述过滤使用标称分子量极限为30kDa的过滤单元进行。
41.根据实施方案35-37中任一项所述的方法，其中过滤在100-300mM磷酸钾存在下进行。
42.根据实施方案35-38中任一项所述的方法，其中过滤在200mM磷酸钾存在下进行。
43.根据实施方案35-39中任一项所述的方法，其中过滤在200-300mM氯化钾存在下进行。
44.根据实施方案35-40中任一项所述的方法，其中过滤在250mM氯化钾存在下进行。
45.根据实施方案35-41中任一项所述的方法，其中所述过滤在6-7的pH值下进行。
46.根据实施方案35-42中任一项所述的方法，其中过滤在6.2的pH值下进行。
47.根据实施方案2-43中任一项所述的方法，其中在色谱期间，将所述多肽-染料-复合物与所述未结合的酰肼染料分离，使得所述多肽-染料-复合物和所述未结合的酰肼染料之间不发生干扰。
48.根据实施方案2-44中任一项所述的方法，其中所述色谱是尺寸排阻色谱。
49.根据实施方案45所述的方法，其中尺寸排阻色谱在0.2-0.8ml/min的等度流速下进行。
50.根据实施方案45中任一项所述的方法，其中尺寸排阻色谱在0.5ml/min的等度流速下进行。
51.根据实施方案45-47中任一项所述的方法，其中尺寸排阻色谱在20℃-30℃的柱温下进行。
52.根据实施方案45-48中任一项所述的方法，其中尺寸排阻色谱在25℃的柱温下进行。
53.根据实施方案45-49中任一项所述的方法，其中尺寸排阻色谱在100-300mM磷酸钾存在下进行。
54.根据实施方案45-50中任一项所述的方法，其中尺寸排阻色谱在200mM磷酸钾存在下进行。
55.根据实施方案45-51中任一项所述的方法，其中尺寸排阻色谱在200-300mM氯化钾存在下进行。
56.根据实施方案45-52中任一项所述的方法，其中尺寸排阻色谱在250mM氯化钾存在下进行。
57.根据实施方案45-53中任一项所述的方法，其中尺寸排阻色谱在6-7的pH值下进行。
58.根据实施方案45-54中任一项所述的方法，其中尺寸排阻色谱在6.2的pH值下进行。
59.根据实施方案3-55中任一项所述的方法，其中四条标准曲线通过尺寸排阻色谱产生。
60.根据实施方案3至56中任一项所述的方法，其中四条标准曲线使用以下等式产生：
使用等式1得到第四标准曲线(在280nm下的多肽)：y1＝m1x+b1
使用等式2得到第三标准曲线(在428nm下的多肽)：y2＝m2x+b2
使用等式3得到第二标准曲线(在280nm下的荧光黄)：y3＝m3z+b3
使用等式4得到第一标准曲线(在428nm下的荧光黄)：y4＝m4z+b4，
其中x是多肽的浓度，单位为mg/mL，z是荧光黄的摩尔浓度，单位为μM，m1至m4和b1至b4是从线性回归拟合得到的常数。
61.根据实施方案3至57中任一项所述的方法，其中通过求解双变量(x和z)线性等式，将多肽的羰基化水平计算为z/x(nmol/mg)：
等式5：A280＝m1x+b1+m3z+b3
等式6：A428＝m2x+b2+m4z+b4
其中z是羰基的摩尔浓度(μM)，x是蛋白质浓度(mg/mL)；A280是来自280nm吸光度的LY-CH衍生的mAb物质的积分峰面积，如图3A所示；A428是来自428nm吸光度的LY-CH衍生的mAb物质的积分峰面积，如图3B所示。
z和x可以通过求解如下所示的线性等式5和6来确定。
x＝[m4*A280-m3*A428-m4*(b1+b3)+m3*(b2+b4)]/(m4*m1-m2*m3)
z＝[m2*A280-m1*A428-m2*(b1+b3)+m1*(b2+b4)]/(m2*m3-m1*m4)
然后将总羰基化水平计算为z/x。
62.一种用于实施根据前述实施方案中任一项所述的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含酰肼染料和缓冲液。
63.根据实施方案59所述的试剂盒，其中所述酰肼染料选自由Cy3酰肼、Cy5酰肼、Cy5.5酰肼、Cy7酰肼、Cy7.5酰肼、香豆素酰肼、iFluorTM染料酰肼、HiLyteTM Fluor 647酰肼、Alexa 488酰肼、Alexa 568酰肼、Alexa 633酰肼和LY-CH组成的组。
64.根据实施方案59所述的试剂盒，其中所述酰肼染料是LY-CH。
65.根据实施方案59-61所述的试剂盒，其中所述缓冲液是锂MES缓冲液。
66.根据实施方案59-62所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含非离子表面活性剂。
67.根据实施方案63所述的试剂盒，其中所述非离子表面活性剂选自由NonidetP-40、泊洛沙姆188、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Triton X-100、还原型Triton X-100、吐温20和吐温80组成的组。
68.根据实施方案63所述的试剂盒，其中所述非离子表面活性剂是还原型TritonX-100。
69.根据实施方案59-65所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含所述多肽的标准品和所述酰肼染料的标准品。
V.实施例
以下是根据本发明的方法的实施例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实施各种其它实施方案。
虽然出于清楚理解的目的通过说明和实施例详细地描述了前述发明，但是说明书和实施例不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容明确地通过引用整体并入。
材料
本说明书中使用的所有mAb均在Genentech(South San Francisco,CA)制造。LY-CH二锂盐、硫酸亚铁、过氧化氢溶液(30％H2O，w/w)、蛋氨酸(Met)、乙二胺四乙酸(EDTA)、琥珀酸钠、琥珀酸、磷酸钾(二价和一价)、氯化钾、乙酸钠、乙酸、氢氧化钠溶液(1M H2O)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、氢氧化锂、还原型Triton X-100和聚山梨醇酯20购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。TSK G3000SWXL(7.8×300mm)尺寸排阻柱购自TosohBioscience(King of Prussia,PA,USA)。OxiSelectTM蛋白质羰基测定试剂盒购自CellBiolabs(San Diego,CA,USA)。PNG酶F(不含甘油)购自New England Biolabs(Ipswich,MA,USA)。
实施例1：氧化的mAb样品的制备和用LY-CH衍生化mAb样品
使用芬顿反应(Fenton’s reaction)，产生用于本文所述的方法的氧化的mAb样品，称为氧化标准品mAb或氧化标准品mAb(II)。因此，将抗体样品与FeSO4和过氧化氢在50mM琥珀酸钠缓冲液(pH 6.5)中混合至分别5mg/mL、2mM和10mM的最终浓度。将反应混合物在室温下温育2h，然后通过加入过量的甲硫氨酸和EDTA终止反应。
衍生化在衍生化缓冲液(50mM锂MES缓冲液，1％Triton X-100，pH 6.0)中进行，所述衍生化缓冲液通过用1M氢氧化锂溶液滴定MES溶液至pH6.0来制备。首先使用AmiconUltra-15 30KDa过滤单元(Millipore，Billerica,MA,USA)将mAb样品缓冲交换到衍生化缓冲液中。随后，将mAb样品(0.2mg/mL最终浓度)与LY-CH(LY-CH与mAb最终摩尔比为8,000)和还原型Triton X-100(1％重量/体积最终浓度)在衍生化缓冲液中混合。衍生化在黑暗中在37℃下进行16h。衍生化后，使用15mL Amicon Ultra-15 30kDa过滤单元将500μL衍生化样品的等分试样三次缓冲交换到200mM磷酸钾、250mM氯化钾，pH 6.2中。
衍生化在衍生化缓冲液(50mM锂MES缓冲液，0.05％Triton X-100，pH 6.0)中进行，所述衍生化缓冲液通过用1M氢氧化锂溶液滴定MES溶液至pH6.0来制备。首先使用Amicon Ultra-15 30KDa过滤单元(Millipore，Billerica,MA,USA)将mAb样品缓冲交换到衍生化缓冲液中。随后，将mAb样品(0.5mg/mL最终浓度)与LY-CH(LY-CH与mAb最终摩尔比为8,000)和还原型Triton X-100(0.05％重量/体积最终浓度)在衍生化缓冲液中混合。衍生化在黑暗中在37℃下进行18h。衍生化后，使用15mL Amicon Ultra-15 30kDa过滤单元将500μL衍生化样品的等分试样三次缓冲交换到200mM磷酸钾、250mM氯化钾，pH 6.2中。
实施例2：测定mAb的蛋白质羰基水平
CALY的总体工作流程在图2B中示出。使用TSK G3000SWXL(7.8×300mm)尺寸排阻柱以Agilent HPLC系统产生的0.5ml/min的等度流速通过尺寸排阻色谱分析mAb样品。流动相含有200mM磷酸钾、250mM氯化钾，pH6.2。柱温控制在25℃，自动进样器温度控制在8℃。对于每个样品，注射25μL mAb材料(约25μg)用于分析。通过280nm和428nm下的UV吸光度检测流出物。
在衍生化和缓冲交换后，mAb样品通过尺寸排阻色谱分析，其中将样品中的残留LY-CH与衍生的mAb分离。羰基化水平的定量基于尺寸排阻色谱图上衍生的mAb的UV 280nm和428nm吸光度峰面积(在约10与22分钟之间洗脱)。由于蛋白质结合的荧光黄部分和蛋白质组分都对测量的UV 280和428nm吸光度峰面积有贡献，因此使用LY-CH标准品和未衍生的mAb(作为蛋白质标准品)的标准曲线计算荧光黄部分和蛋白质的各自浓度。
mAb标准曲线通过在各种蛋白质浓度(0.25、0.5、1、2和3mg/mL)下对25μL注射量的相应的未衍生的mAb样品进行尺寸排阻色谱分析来制备。LY-CH标准曲线通过在各种摩尔浓度(1、5、10、15和20μM)下注射25μL LY-CH标准品类似地制备。四个线性等式分别通过所得UV吸光度峰面积与mAb和LY-CH标准品浓度的线性回归拟合产生。在这些等式中，x是mAb蛋白质浓度(mg/mL)；z是LY-CH摩尔浓度(μM)；m1至m4和b1至b4是从线性回归拟合获得的常数。
等式1(mAb的UV 280nm响应)：y1＝m1x+b1
等式2(mAb的UV 428nm响应)：y2＝m2x+b2
等式3(LY-CH的UV 280nm响应)：y3＝m3z+b3
等式4(LY-CH的UV 428nm响应)：y4＝m4z+b4
如图4A和4B所示，在标准曲线的线性回归拟合后，m1＝4813.9；b1＝-125.98；m2＝10.085；b2＝3.2458；m3＝35.507；b3＝1.4328；m4＝18.735；b4＝1.3937。
然后通过求解双变量(x和z)线性等式5和6，将mAb样品的羰基化水平计算为z/x(nmol/mg)，其中x是羰基的摩尔浓度(μM)并且z是蛋白质浓度(mg/mL)。
等式5：A280＝m1x+b1+m3z+b3
等式6：A428＝m2x+b2+m4z+b4
为了说明定量过程，衍生的氧化标准品mAb的典型尺寸排阻色谱图显示在图3A和3B中。来自未衍生的氧化标准品mAb和LY-CH的四条标准曲线显示在图4A和4B中，其显示了吸光度峰面积与各自的mAb和LY-CH浓度之间的线性响应。来自数据的线性回归拟合的测定系数(R2)大于0.99。然后基于来自衍生的氧化标准品mAb的积分峰面积和来自标准曲线的四个等式计算每个衍生化条件的总羰基化水平。例如，A280和A428值如下测定。4347.7的峰面积(A280)是mAb和LY-CH在280nm下的吸光度贡献的结果，并且通过积分SEC曲线中从约10.1min到22.2min的曲线下面积来测定。因此，224.0的峰面积(A428)通过积分具有428nm吸光度的SEC曲线中从约10.1min到22.2min的曲线下面积来测定。结合上面的等式5和6，得到以下两个等式：
i)4347.7＝4813.9*x-125.98+35.507*z+1.4328
ii)224.0＝10.085*x+3.2458+18.735*z+1.3937
然后通过求解两个线性等式i)和ii)测定两个变量x和z，其中x＝0.846mg/mL mAb和z＝11.253μM LY-CH，得到13.3nmol/mg的羰基化水平。
实施例3：衍生化条件的优化
确定最佳缓冲系统和pH值
为了建立CALY的最佳衍生条件，将如上文实施例1中所述的氧化标准品mAb样品用作测试样品以优化衍生化缓冲液、LY-CH与mAb摩尔比和衍生化时间。为了确定允许使用LY-CH作为衍生化试剂的最佳缓冲液，考虑了用于衍生化反应的第一个不同的缓冲液pH值。在pH 5.0及以下，观察到衍生化反应期间一定程度的样品沉淀。为了避免样品沉淀，基于考虑到在上述pH 5.0下没有观察到沉淀并且在pH 7.0和更高下观察到衍生化反应变得明显更慢，选择pH 6.0作为衍生化pH。相应地，选择pKa为6.13的MES作为缓冲系统。缓冲液通过使用氢氧化锂将50mM MES溶液滴定至pH 6.0来制备。使用氢氧化锂进行缓冲液制备是基于LY-CH的锂盐具有比钠盐和钾盐更高的溶解度的考虑。缓冲液中具有锂离子的所得的具有更高溶解度的LY-CH允许将较高的LY-CH与mAb摩尔比用于衍生化反应，并允许在衍生化后更容易除去残留的LY-CH试剂。最后，考虑的另一个因素是氧化的蛋白质样品倾向于具有更高的聚集倾向，这可能在衍生化反应期间引起样品沉淀。为了解决这个问题，将还原型Triton X-100作为表面活性剂加入至在衍生化缓冲液中0.05％或1％的最终浓度(重量/体积)。还原型Triton X-100在280和428nm下没有任何显著的吸光度。使用最终优化的缓冲系统，在所有后续分析中未观察到样品沉淀。
LY-CH与样品摩尔比和衍生化时间的优化
LY-CH与样品的摩尔比和衍生化时间通过在各种衍生化条件下定量氧化标准品mAb的总羰基化水平来优化。首先，LY-CH与样品的摩尔比通过评估各种摩尔比在50、500、1000、1500、2000、4000、6000、8000和10,000下的衍生化程度来优化。在目标条件下，所有其它衍生化条件没有变化，例如反应混合物中的最终氧化标准品mAb浓度(0.2mg/mL)、反应温度(37℃)和反应时间(18小时)。来自各种摩尔比的相应羰基化水平(图5)显示衍生化反应在摩尔比为8000时达到平稳期，超过该摩尔比未观察到羰基化水平的显著增加。因此，选择LY-CH与样品的摩尔比为8000作为衍生化反应的最终条件。类似地，通过改变温育时间同时保持摩尔比为8000并且所有其它衍生化条件在目标条件下保持不变来优化反应时间。得到的总羰基化水平(图6)显示衍生化反应在18小时达到平稳期。因此，选择18小时作为衍生化反应的最终反应时间。
实施例4：CALY的评估
稳健性评估
CALY的稳健性通过在不改变其它方法条件的情况下对一种方法条件/参数进行微小改变，并随后评估这些微小改变对氧化标准品mAb的总羰基化结果的影响来评估。具体地，研究了衍生化反应条件、衍生化后的样品处理和分析过程，以及在SEC分析期间衍生化样品的稳定性对评估的影响。对于衍生化反应条件，将来自不同的mAb蛋白质浓度(0.45、0.50和0.55mg/mL)、不同的LY与mAb摩尔比(7000：1、8000：1和9000：1)以及衍生化缓冲液的不同pH值(5.9、6.0和6.1)的氧化标准品mAb的总羰基化水平进行比较。如图7A至7B所示，对于反应蛋白质浓度或LY-CH与mAb的摩尔比，观察到羰基化水平的非常小的变化。从缓冲液pH稳健性数据来看，pH6.1的总羰基化水平略低于pH5.9和6.0的那些(图7C)，这可能是由于pH6.1的反应速率稍慢，并且表明严格控制衍生化缓冲液pH可能是最佳方法稳健性所必需的。
对于样品处理过程，值得一提的是，在衍生化之后，每轮通过过滤的缓冲交换相当于将样品中存在的残留LY-CH的量减少约50倍。研究了使用两轮、三轮和四轮缓冲交换的影响以了解样品中不同量的残留LY-CH是否影响羰基化结果。如图7D所示，在两轮、三轮或四轮缓冲交换的结果中没有观察到显著差异，这表明在衍生化样品中存在各种量的残留LY-CH对结果的影响非常小。对于尺寸排阻分析，我们测试了衍生化和缓冲交换的氧化标准品mAb的各种注射体积(从20μL到30μL)。相应的羰基化水平显示在图7E中，其证明该方法对于注射体积/量的微小变化是稳健的。
我们通过比较经过一次、两次和三次冷冻(在-80℃)/解冻循环的衍生化/缓冲交换的氧化标准品mAb样品的结果与新鲜制备的样品以评估了样品经多次冷冻/解冻循环的稳定性。数据(图7F)显示衍生的样品对多次冷冻/解冻循环是稳定的。衍生化样品对于HPLC分析的稳定性通过测量存储在HPLC自动进样器(温度控制在8℃)中1、3、5、7、9、11、13和15h的衍生化和缓冲交换的氧化标准品mAb的羰基化水平来评估。此外，如图8所示，未观察到测量的羰基化水平的显著差异，这支持衍生化样品在2-8℃下稳定至少15h。
总之，使用氧化标准品mAb作为测试样品，由稳健性评估研究产生总共31个数据点，显示了平均总羰基化水平为13.0nmol/mg，变异系数(RSD)为2.4％。这些数据支持CALY是非常稳健的。
特异性评估
通过使样品空白(其具有除mAb物质之外的所有样品缓冲组分)进行衍生化，缓冲交换和SEC分析步骤来研究特异性。如图3A和3B所示，在感兴趣峰区域(10至22分钟)中未观察到峰，这表明缓冲剂赋形剂不干扰定量过程，并且CALY方法对于测量mAb样品的总蛋白质羰基化具有特异性。
检测限和定量限
检测限(LOD)和定量限(LOQ)分别计算为阴性对照的羰基化水平的标准偏差的3倍和10倍。如表1所示，通过分析未受胁迫和未衍生化的mAb作为阴性对照样品，在不同蛋白质浓度下重复注射(总共27个数据点)，测定标准偏差为0.058nmol/mg。然后测定CALY的LOD和LOQ分别为0.2和0.6nmol/mg。
表1.在各种浓度下重复注射后未被LY-CH衍生化的未受胁迫的mAb样品作为阴性对照的羰基化水平。这些数据的标准偏差0.0581nmol/mg用于测定LOD和LOQ。
线性和精确度
在方法优化和稳健性研究之后，制备另一批用于后续评估的氧化标准mAb样品。通过CALY测定第二批的总蛋白质羰基化水平为11.5nmol/mg，略低于第一批。但是，这不会影响后续方法对线性和精确度的性能评估。为简单起见，下文将第二批氧化标准品mAb称为氧化标准mAb(II)样品。
为了评估CALY的线性，通过将氧化标准品mAb(II)与未受胁迫的mAb在0至100、25至75、50至50、75至25、和100至0(质量与质量)比率下混合制备一系列共混样品。随后，共混样品由两位分析师在两台HPLC仪器上利用两个尺寸排阻柱和由每个分析师制得的三种独立制备物，并且在三个不同的日子分析。对每种共混样品进行总共六次独立测量。如图9所示，我们观察到，测量的总蛋白质羰基化与各自共混样品中胁迫的mAb的百分比成比例的线性响应，线性回归比为0.997。该数据表明CALY具有优异的线性。此外，来自两位分析师对每种共混样品的日内和日间分析的测量值的变异系数(CV)低于15％，这证明了CALY的精确度。
实施例5：通过DNPH比色测定法测定mAb的蛋白质羰基水平
一些mAb样品的总蛋白质羰基化水平也通过使用OxiSelectTM蛋白质羰基分光光度测定试剂盒(Cell Biolabs,Inc.,San Diego,CA)定量。进行三次独立制备以报告每种样品的平均蛋白质羰基化水平。
与DNPH分光光度测定法的比较
DNPH分光光度测定法是常规蛋白质羰基化测定法。通过DNPH方法和CALY方法测定氧化标准品mAb(II)、50：50共混物和未受胁迫的mAb的总蛋白质羰基化水平，以确定两种方法的结果有多接近，并且比较两种方法的性能。总之，如图9和10所示，由两种方法测定的各自羰基化水平是相似的，而CALY方法清楚地证明了比DNPH方法更好的测定精确度。
实施例6：经PNG酶F处理的mAb的CALY分析
LY-CH先前已用作衍生化试剂，以定量通过对抗体的N-聚糖寡糖残基进行高碘酸氧化形成的醛基。由于LY-CH与氨基酸残基上的醛和酮的反应性可能与N-聚糖醛不相同，因此评估了LY-CH是否适合于定量mAb的氨基酸残基上金属催化的氧化羰基化。通过CALY测量利用和不利用PNG酶F处理的未受胁迫和受芬顿(Fenton)胁迫的mAb样品的总蛋白质羰基化水平。由于PNG酶F处理从mAb样品中除去了N-聚糖，因此在PNG酶F处理后测量的mAb样品的总蛋白质羰基化水平归因于mAb上氨基酸残基的羰基化。如图11所示，利用和不利用PNG酶F处理的氧化标准mAb(II)样品的总蛋白质羰基化水平分别为9.9nmol/mg和11.9nmol/mg。这些数据证实了CALY特别适于量化氨基酸残基上的金属催化的羰基化。此外，这些数据表明，在本研究中测试的芬顿氧化条件下，在mAb样品上没有形成显著量的N-聚糖醛。
通过PNG酶F处理进行去糖基化
通过将250μg mAb样品与12500单位的PNG酶F在100mMHEPES缓冲液(pH8.0)中混合至最终体积1mL来进行去糖基化反应。将混合物在37℃下温育16小时。
实施例7：使用各种量的Fe(II)和过氧化氢氧化的mAb的蛋白质羰基水平的测定
如表2中所示，使用具有各种最终浓度的Fe(II)(4μM、20μM、100μM和500μM)和过氧化氢(8μM、40μM、200μM和1000μM)的组合的总共16种条件制备mAb样品。最终mAb浓度为5mg/mL。将混合物在室温下在50mM琥珀酸钠缓冲液(pH6.5)中温育2小时。随后，通过加入过量的甲硫氨酸和EDTA终止反应。
如图12A、12B和12C所示，各种量的Fe(II)和过氧化氢对总蛋白质羰基化水平的影响是非常复杂的。观察到，在较低的Fe(II)浓度(4μM和20μM)下，即使利用宽范围的过氧化氢量(8μM至1000μM)，受胁迫的mAb的总羰基化水平仅略微变化。相反，对于测试的每种过氧化氢浓度，存在一致的趋势，其显示了4μM至500μM范围内的Fe(II)浓度更高，总羰基化更高。这些数据似乎表明，在这些特定的胁迫条件下，氧化羰基化的程度对金属离子浓度的变化比对过氧化氢的变化相对更敏感。因此，在这些条件下，对于在mAb上产生蛋白质羰基化，Fe(II)可能是比过氧化氢更重要的因子。
表2.具有各种Fe(II)和H2O2浓度(最终)；最终mAb浓度为5mg/mL的总共16种条件；氧化在室温下进行2小时，然后加入过量的EDTA和甲硫氨酸进行淬灭。
实施例8：在储存期间用PS20制剂和低水平的Fe(II)测定mAb的蛋白质羰基水平
聚山梨醇酯20(PS20)是抗体制剂中常用的表面活性剂用以解决抗体聚集，但也已知其含有过氧化物(Jaeger等，1994)。在mAb的储存期间，来自PS20的过氧化物可以与铁离子反应以诱导抗体羰基化。为了研究储存期间PS20和铁对mAb羰基化的影响，如表3所示，在含有各种最终Fe(II)(0.1μM和0.8μM)和PS20(0.02％和0.16％，w/v)浓度的50mM琥珀酸钠缓冲液(pH 6.0)中制备mAb样品。PS20浓度基于mAb制剂中报道的PS20浓度范围(Hawe等，2010)。Fe(II)浓度基于报道的浸出铁离子的浓度范围(Zhou等，2011)。然后将这些样品在室温下在黑暗中储存4、8和16周。在每个时间点，将过量的甲硫氨酸和EDTA加入样品中以淬灭羰基化反应。随后，将这些样品储存在-80℃下直至通过CALY进一步分析。
表3.用于储存实验的具有各种Fe(II)和PS20浓度(最终)的总共5种条件。包括B1作为对照。
<u>条件</u> <u>Fe(II)</u> <u>PS20</u>
B1 0uM 0％(w/v)
B2 0.1uM 0.02％(w/v)
B3 0.1uM 0.16％(w/v)
B4 0.8uM 0.02％(w/v)
B5 0.8uM 0.16％(w/v)
如图13所示，对于含有PS20和Fe(II)的所有四个样品(B2至B5)，在储存期间观察到羰基化水平的显著增加。相比之下，对照样品(B1)中未观察到羰基化水平的显著变化。这些数据表明，当储存期间存在低水平的铁离子时，利用PS20制剂的mAb易于羰基化。有趣的是，利用0.16％PS20的样品(B5和B3)在4、8和16周时始终具有比利用0.02％PS20的样品(B4和B2)更高水平的羰基化，而与铁浓度无关。该观察结果表明PS20在这些情况下对mAb羰基化具有主要影响。因此，来自PS20的氢过氧化物(可能是自由基的来源)成为在储存条件下限制mAb羰基化程度的更关键因素。因此，含有更多氢过氧化物的0.16％PS20制剂始终具有较高水平的蛋白质羰基化。这进一步表明，在低水平的铁离子存在下，表面活性剂的氢过氧化物含量在储存期间可能对mAb羰基化具有显著影响。另一个有趣的观察结果是样品B3和B5的羰基化水平从第8周到第16周显著降低。这些样品的羰基化含量的降低表明可能存在脱羰过程。
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Claims (20)

1.一种用于测定多肽上总羰基化水平的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)在酰肼染料可以与所述多肽的氨基酸残基上存在的羰基反应以形成多肽-染料-复合物的条件下，使所述多肽溶液与所述酰肼染料接触，
b)从步骤a)的所得溶液中除去未结合的酰肼染料，
c)在步骤b)的所得溶液中测定所述多肽-染料-复合物中结合的所述酰肼染料的浓度和所述多肽-染料-复合物中结合的所述多肽的浓度，以及
d)基于所述多肽-染料-复合物中结合的所述酰肼染料的所述浓度与所述多肽-染料-复合物中结合的所述多肽的所述浓度的比率测定所述多肽的所述总羰基化水平。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述酰肼染料是LY-CH。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)在碱金属离子存在下进行。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述碱金属离子是锂离子。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述多肽的所述氨基酸残基选自由精氨酸、赖氨酸、脯氨酸和苏氨酸组成的组。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述多肽是抗体。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述抗体是多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、多特异性抗体、抗体片段、抗体药物缀合物、THIOMABTM或THIOMABTM药物缀合物。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述多肽和所述酰肼染料在步骤a)中以6,000-10,000的最终摩尔比接触。
9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)在非离子表面活性剂存在下进行。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述非离子表面活性剂是还原型Triton X-100。
11.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)在35℃-39℃的温度下进行。
12.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)进行10-20小时。
13.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b)通过选自由过滤、凝胶过滤和透析组成的组的方法进行。
14.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b)通过过滤进行。
15.根据权利要求14所述的方法，其中过滤在100-300mM磷酸钾存在下和在200-300mM氯化钾存在下进行。
16.一种用于实施根据权利要求1所述的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含酰肼染料和缓冲液。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述酰肼染料是LY-CH。
18.根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述缓冲液是锂MES缓冲液。
19.根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含非离子表面活性剂、所述多肽的标准品和所述酰肼染料的标准品。
20.根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述非离子表面活性剂是还原型Triton X-100。
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