CN109153712A - Peg化生物活性肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文描述了用PEG部分在一个或更多个位置处修饰的生物活性肽。这样的PEG化生物活性肽的一个实例是用PEG部分在一个或更多个位置处修饰的GHRH类似物。还描述了其可药用盐和包含这样的类似物或其盐的药物组合物，以及其方法、试剂盒和用途，例如用于在对象中诱导或刺激生长激素分泌以及用于在对象中诊断、预防或治疗GH缺乏性病症。

Description

PEG化生物活性肽及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年4月19日提交的美国临时申请No.62/324,600的权益，其通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开内容涉及与聚乙二醇缀合的生物活性肽及其用途。
序列表引用
根据37C.F.R.1.821(c)，在此作为ASCII兼容文本文件提交序列表，该文件命名为“Sequence_Listing.txt”，其创建于2017年4月18日，并且具有约26,000字节的大小。命名为“Sequence_Listing.txt”的上述文件的内容在此通过引用整体并入。
背景技术
生长激素释放激素(growth hormone releasing hormone，GHRH)，也称为生长激素释放因子(growth hormone releasing factor，GRF或GHRF)，是由支配垂体前叶的神经元分泌的44-氨基酸肽，并且引发从促生长素细胞分泌生长激素(growth hormone，GH；也称为促生长素)。确定GHRH肽的最低生物活性构象存在于全长肽的前29个氨基酸中(Frohman等，1986a)，但是可在GHRH(1-21)中检测到低效力的生物活性(Ling等1984a)；发现，短于21个氨基酸的GHRH肽是无活性的。GH是参与提高线性生长，肌肉、骨骼和软骨量，以及降低脂肪量的生理合成代谢剂。已知GH缺乏或GH分泌降低与儿童身材矮小、脂肪增加(特别是深腹部贮库中的脂肪增加)和心血管风险提高相关。
GHRH的治疗效用由于肽的蛋白水解不稳定性而受损；GHRH通过体内二肽基肽酶IV(DPPIV)经由在Ala2-Asp3之间切割(Frohman等，1986b)和其他蛋白酶在Arg11-Lys12和Lys12-Val13(Frohman等1989)作用而快速失活。为了提供GHRH的蛋白水解稳定的类似物，已经使用了多种方法，包括氨基酸替换、氨基酸侧链的环化以及用合成聚合物和脂肪酸进行修饰。
本说明书涉及许多文件，其内容通过引用整体并入本文。
发明概述
本公开内容涉及与聚乙二醇(PEG)缀合的生物活性肽及其用途，例如连接有一个或更多个PEG部分的GHRH类似物。
在一方面，提供了包含具有式(I)中所示序列(SEQ ID NO：1)的肽的生长激素释放激素(GHRH)类似物或其可药用盐：
X1-X2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-X8-X9-Tyr-X11-X12-Val-Leu-X15-Gln-Leu-X18-Ala-X20-X21-X22-Leu-X24-X25-X26-X27-X28-X29-X30
(I)
其中：
X1是Tyr、His、N-甲基Tyr或脱氨基Tyr；
X2是Ala、D-Ala、Ser或α氨基异丁酸(Aib)；
X8是Asn、Asp、Ala、Gln、Ser或Aib；
X9是Ser、Asp、Ala或与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys；
X11是Arg或L-高精氨酸(Har)；
X12是Lys或L-鸟氨酸(Orn)；
X15是Gly或Ala；
X18是Ser或Ala；
X20是Arg或Har；
X21是Lys或Orn；
X22是Leu、Val、Ala或与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys；
X24是Gln或与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys；
X25是Asp或Ala；
X26是Ile或Ala；
X27是Met、Leu或正亮氨酸；
X28是Ser、Ala或与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys；
X29是Lys、Arg、Orn、Har或胍丁胺；以及
X30是NH2基团或Asn-NH2；
其中X9、X22、X24和X28中的至少一个是与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys。
在一个实施方案中，X9是与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys。在另一个实施方案中，X22是与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys。在另一个实施方案中，X24是与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys。在另一个实施方案中，X28是与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys。
在一个实施方案中，X9和X22各自独立地是与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys。在另一个实施方案中，X9和X24各自独立地是与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys。在另一个实施方案中，X9和X28各自独立地是与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys。
在一些实施方案中，X1是Tyr。在一些实施方案中，X2是Ala或D-Ala。在一个实施方案中，X2是D-Ala。在一些实施方案中，X8是Ala。在一些实施方案中，X9是Ser。在一些实施方案中，X11是Arg或Har；在一个实施方案中，X11是Arg。在一些实施方案中，X12是Lys或Orn；在一个实施方案中，X12是Orn。在一些实施方案中，X15是Ala。在一些实施方案中，X18是Ser。在一些实施方案中，X20是Arg或Har；在一个实施方案中，X20是Arg。在一些实施方案中，X21是Lys或Orn；在一个实施方案中，X21是Orn。在一些实施方案中，X22是Ala。在一些实施方案中，X24是Gln。在一些实施方案中，X25是Asp。在一些实施方案中，X26是Ile。在一些实施方案中，X27是Leu。在一些实施方案中，X28是Ser。在一些实施方案中，X29是Lys、Orn或Har；在一个实施方案中，X29是Lys；在另一个实施方案中，X29是Har。在一些实施方案中，X30是Asn-NH2。
在式(I)的一些实施方案中，本文所述的小于或等于约5kDa的PEG聚合物是约2kDa的PEG聚合物。
在一些实施方案中，本文提供的GHRH类似物包含以下肽或其可药用盐：
YaDAIFTAC(Peg-5K)YROVLAQLSAROALQDILSZ(SEQ ID NO：2)；
YaDAIFTASYROVLAQLSAROC(Peg-5K)LQDILSZ(SEQ ID NO：3)；
YaDAIFTASYROVLAQLSAROALC(Peg-5K)DILSZ(SEQ ID NO：4)；
YaDAIFTASYROVLAQLSAROALQDILC(Peg-5K)Z(SEQ ID NO：5)；
YaDAIFTAC(Peg-5K)YROVLAQLSAROC(Peg-5K)LQDILSZ(SEQ ID NO：6)；
YaDAIFTAC(Peg-5K)YROVLAQLSAROALC(Peg-5K)DILSZ(SEQ ID NO：7)；或
YaDAIFTAC(Peg-5K)YROVLAQLSAROALQDILC(Peg-5K)Z(SEQ ID NO：8)；
其中：a是D-Ala；O是L-鸟氨酸(Orn)；C(Peg-5K)是与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys；并且Z是Lys、Arg、Har或胍丁胺。在一些实施方案中，GHRH类似物包含具有SEQID NO：2-8中任一个中所示序列的肽；在一些实施方案中，这样的类似物还包含与Z连接的一个或更多个另外的氨基酸。
在一些实施方案中，本文提供的GHRH类似物是以下或其可药用盐：
YaDAIFTASYROVLAQLSAROALQDILC(Peg-2K)KN-NH2(SEQ ID NO：9)；
YaDAIFTASYROVLAQLSAROALC(Peg-2K)DILSKN-NH2(SEQ ID NO：1O)；
YaDAIFTASYROVLAQLSAROC(Peg-2K)LQDILSKN-NH2(SEQ ID NO：11)；
YaDAIFTASYROVLAQLSC(Peg-2K)ROALQDILSKN-NH2(SEQ ID NO：12)；
YaDAIFTASYROVLC(Peg-2K)QLSAROALQDILSKN-NH2(SEQ ID NO：13)；
YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALQDILSKN-NH2′(SFQ ID NO：14)；
YaDAIFTC(Peg-2K)SYROVLAQLSAROALQDILSKN-NH2(SEQ ID NO：15)；
YaDAIFTASYROVLAQLSAROALQDC(Peg-2K)LSKN-NH2(SEQ ID NO：16)；
YaDAIFTASYROVLAC(Peg-2K)LSAROALQDILSKN-NH2(SEQ ID NO：17)；
YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALQDILS-(Har)-NH2(SEQ ID NO：18)；
YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALQDILSRNC(Peg-2K)-NH2(SEQ ID NO：19)；
YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALQDILC(Peg-2K)RN-NH2(SEQ ID NO：20)；
YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALC(Peg-2K)DILSRN-NH2(SEQ ID NO：21)；
YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROC(Peg-2K)LQDILSRN-NH2(SEQ ID NO：22)；
YaDAIFTAC(Peg-5K)YROVLAQLSAROALQDILS(Har)-NH2(SEQ ID NO：23)；或
YaDAIFTAC(Peg-40K)YROVLAQLSAROALQDILS(Har)-NH2′(SEQ ID NO：24)；
其中：a是D-Ala；O是L-鸟氨酸(Orn)；C(Peg-2K)是与约2kDa的PEG聚合物缀合的Cys；C(Peg-5K)是与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys；C(Peg-40K)是与约40kDa的PEG聚合物缀合的Cys；并且Har是L-高精氨酸。
在一些实施方案中，GHRH类似物或其盐包含具有如本文限定的SEQ ID NO：1-11、14和18-24中任一个中所示序列的肽或其可药用盐。
在一些实施方案中，GHRH类似物或其盐由具有如本文限定的SEQ ID NO：1-11、14和18-24中任一个中所示序列的肽或其可药用盐组成。
在一些实施方案中，本文提供的GHRH类似物是SEQ ID No：9、10、11、14、18、20、21和22中的任一个或其可药用盐。
在一些实施方案中，本文提供的GHRH类似物或其盐还包含(i)氨基末端修饰基团；(ii)羧基末端修饰基团；或(iii)(i)和(ii)二者。在一个实施方案中，羧基末端修饰基团是NH2。
在另一方面，提供了包含本文提供的GHRH类似物或其盐的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物还包含一种或更多种可药用的载体、赋形剂和/或稀释剂。
在另一方面，提供了用于在有此需要的对象中诱导生长激素分泌的方法，其包括向对象施用有效量的本文所述的GHRH类似物或其盐或者本文所述的药物组合物。
在另一方面，提供了用于在有此需要的对象中提高生长激素水平的方法，其包括向对象施用有效量的本文所述的GHRH类似物或其盐或者本文所述的药物组合物。
在另一方面，提供了本文所述的GHRH类似物或其盐或者本文所述的药物组合物用于在对象中诱导生长激素分泌的用途。
在另一方面，提供了本文所述的GHRH类似物或其盐或者本文所述的药物组合物用于在对象中提高生长激素水平的用途。
在另一方面，提供了本文所述的GHRH类似物或其盐或者本文所述的药物组合物用于制备用于在对象中诱导生长激素分泌或提高生长激素水平的药物的用途。
在另一方面，提供了本文所述的GHRH类似物或其盐或者本文所述的药物组合物，其用于在对象中诱导生长激素分泌或提高生长激素水平。
在另一方面，提供了本文所述的GHRH类似物或其盐或者本文所述的药物组合物，其用于制备用于在对象中诱导生长激素分泌或提高生长激素水平的药物。
在另一方面，提供了用于在有此需要的对象中治疗、预防或诊断GH缺乏性病症的方法，其包括向对象施用有效量的本文所述的GHRH类似物或其盐，或者本文所述的药物组合物。可以使用本文提供的方法治疗、预防和/或诊断的GH缺乏性病症的非限制性实例包括：HIV相关性脂肪增生(lipohypertophy)；HIV相关性畸形/代谢障碍综合征(HIV-associated dysmorphia/dysmetabolic syndrome，HADDS)；生长激素缺乏；下丘脑GH-RH缺乏；体质性生长延迟；垂体性侏儒症；生长迟缓；创伤或骨愈合；骨质疏松症；特纳综合征(Turner Syndrome)；家族性身材矮小；慢性肾功能不全和严重生长迟缓；宫内发育迟缓；垂体或下丘脑病变的放射治疗后GH缺乏；与低于正常生长速度相关的长期糖皮质激素治疗；以及与代谢综合征或HIV相关性脂肪增生相关的腹部肥胖。
在一个实施方案中，提供了用于在有此需要的对象中诊断生长激素缺乏的方法，其包括向对象施用有效量的本文所述的GHRH类似物或其盐或者本文所述的药物组合物，并测量生长激素响应。
在一个实施方案中，提供了用于在有此需要的对象中治疗HIV相关性脂肪营养不良的方法，其包括向对象施用有效量的本文所述的GHRH类似物或其盐或者本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，所述治疗包括治疗内脏脂肪堆积。在一些实施方案中，所述对象正在接受抗病毒治疗。
在一个实施方案中，提供了用于在有此需要的对象中治疗垂体性侏儒症或生长迟缓的方法，其包括向对象施用有效量的本文所述的GHRH类似物或其盐或者本文所述的药物组合物。
在一个实施方案中，提供了用于在有此需要的对象中治疗创伤或骨愈合的方法，其包括向对象施用有效量的本文所述的GHRH类似物或其盐或者本文所述的药物组合物。
在一个实施方案中，提供了用于在有此需要的对象中治疗骨质疏松症的方法，其包括向对象施用有效量的本文所述的GHRH类似物或其盐或者本文所述的药物组合物。
在一个实施方案中，提供了用于在有此需要的对象中改善蛋白质合成代谢的方法，其包括向对象施用有效量的本文所述的GHRH类似物或其盐或者本文所述的药物组合物。
在一个实施方案中，提供了用于在有此需要的对象中诱导脂解作用的方法，其包括向对象施用有效量的本文所述的GHRH类似物或其盐或者本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，所述对象患有临床肥胖。
在一个实施方案中，提供了用于在有此需要的对象中治疗HIV相关性畸形/代谢障碍综合征(HADDS)的方法，其包括向对象施用有效量的本文所述的GHRH类似物或其盐或者本文所述的药物组合物。
在本文提供的方法和用途的一些实施方案中，向对象施用有效量的本文所述的GHRH类似物或其盐或者本文所述的药物组合物。
附图简述
为了更好地理解本发明并且更清楚地显示其可以如何实施，现在将通过示例的方式参照附图，附图示出了根据本发明的一些实施方案的一些方面和特征，并且其中：
图1是显示在施用在第8位(类似物7-三角形)、第9位(类似物6-正方形)和第28位(类似物1-圆圈)含有PEG2K链的肽之后生长激素分泌刺激相对于时间的图。
图2是显示在施用在第9位含有PEG2K链(类似物10-三角形)、在第9位含有PEG5K链(类似物15-圆圈)和在第9位含有PEG40K链(类似物16-正方形)的肽之后生长激素分泌刺激相对于时间的图。
发明详述
GHRH(或GRF或GHRF)是指生长激素释放肽或生长激素释放激素。这种下丘脑激素是一种44个氨基酸的肽，并且GHRH的生物活性片段是29个氨基酸的肽，GHRH1-29。因此，全长GHRH1-44与生物活性片段GHRH1-29的不同之处在于对应于GHRH1-44中第30至44位的序列。
天然人GHRH(也称为GHRH1-44)具有以下结构：
YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGARARL-酰胺(SEQ ID NO：26)。
GHRH1-29具有以下结构：
YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSR-酰胺(SEQ ID NO：25)。
对应于天然人GHRH的第30至44位的序列是：
QQGESNQERGARARL(SEQ ID NO：27)。
介于GHRH1-29和GHRH1-44之间的中间体形式，例如在其C-末端添加有对应于上述第30至44位的序列(SEQ ID NO：27)的前14个氨基酸(在一些实施方案中，前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续氨基酸)中一个或更多个氨基酸的GHRH1-29也具有GHRH活性。包含如本文所述的生物活性1-29区段或其变体的所有GHRH肽均经受本文所述的改进和修饰。
在临床上有用的治疗剂来源于全长肽，例如N-己烯酰基-GHRH(1-44)-酰胺，其在N-末端具有N-己烯酰基修饰，并且在商业上被称为替莫瑞林(tesamorelin)或)；和29个氨基酸的生物活性肽GHRH(1-29)-酰胺，其在商业上被称为舍莫瑞林(Sermorelin)或并且其已经分别被规定用于HIV相关性脂肪增生的治疗和生长激素缺乏的诊断。已经研究了GHRH的多种修饰(参见，例如，Campbell等，1991、1992、1994和1997；Cervini等，1998；Ling等，1984a和1984b；Kubiak等，1993；Sato等，1987和1990；Felix等，1988和1995；Hodate等，1986；Bokser等，1990；Zarandi等，1990、1992和1994；Kovacs等，1988；Murphy等，1988；Freidman等，1991；以及美国专利/公开申请US4914189；US20090023646；US20060128615；US8435945；US8481489；US7316997；US8361964；US5023322；US4689318；US4659693；US6551996；US7256258；US20030148948；US5084442；US5137872；US5846936；US4622312；US5696089；US20050059605；US5091365；US5847066；US9096684；US5792747；US20140058068；和US20110288011)。上述出版物和专利中描述的GHRH肽通过引用并入本文。
已经研究了GHRH肽在特定位置处的PEG化。例如，已经研究了在N-末端(Tyr1)、Lys12、Lys21或在C-末端(使用GGC-接头)处的PEG化，并且发现，在内部位置Lys12和Lys21处连接PEG链降低效力但延长生物半衰期(Campbell等，1997；Felix等，1995；Youn等，2007；Lu等，1994；Digilio等，2003；Lu等，1993；Esposito等，2003)。在Asp8或Lys12处的PEG链(2K、5K或10K)降低生物效力。无论分子量(MW)如何，羧基末端PEG化都提高生物活性(Felix等，1995)。因此，由于N末端中几乎所有残基都在GHRH受体内紧密接触的事实，可以合理地预期在GHRH分子的N-末端一半中用大体积PEG链进行共价修饰会降低其生物活性。鉴于目前公认的GHRH受体的配体结合的观点，令人惊讶地发现，如本文所提供的，在GHRH的第9个氨基酸而不是第8个氨基酸处的聚二乙醇化产生生物学上有效的肽。
为了探索GHRH1-29肽内PEG化的新位置，本发明人通过用PEG部分在某些新的氨基酸位置对GHRH进行共价修饰开发了新的GHRH类似物。聚乙二醇(PEG)是指商业上生产的具有不同分子量(例如，200至50,000kDa或更高)的乙二醇聚合物。这样的经修饰类似物通过用具有以下侧链基团的氨基酸替换GHRH中的某些氨基酸来制备，所述侧链基团可以用合适的基团反应性试剂进行修饰。例如，可以用硫醇反应剂修饰Cys侧链，或者可以用胺反应剂修饰Lys侧链。例如，用一个或更多个Cys残基替换随后与硫醇反应性马来酰亚胺基-PEG反应产生具有一个或更多个Cys替换并且在Cys侧链处用PEG共价修饰的GHRH类似物。如本文所述，使用GHRH1-29(即，含有前29个氨基酸且保留生物活性的GHRH的截短形式)，并且在第8、9、15、16、19、22、24、26、28和30位研究了这样的替换和PEG修饰(最后一种情况表示在GHRH1-29的C-末端添加一个氨基酸(例如Cys)，其侧链被PEG修饰，从而产生具有经PEG修饰的C-末端残基的30个氨基酸的GHRH类似物)。如本文实施例中所述，使用固相肽合成来合成产生Cys-替换的肽(在第8、9、15、16、19、22、24、26、28和30位)，将其纯化并与马来酰亚胺基-PEG(2000MW)反应。将PEG化肽纯化，冻干并进行进一步分析。
本文提供了GHRH类似物，其是经PEG修饰的GHRH或者其活性片段和/或变体，例如包含一个或更多个共价连接的PEG部分的GHRH或者其活性片段和/或变体。这些GHRH类似物对表达GHRH受体(GHRHr)的细胞表现出激动剂活性，并且在动物模型中诱导GH分泌。术语“GHRH”(生长激素释放激素)和“GRF”(生长激素释放因子)在本文中可互换使用。类似地，术语“GHRH受体”、“GHRHr”、“GRF受体”和“GRFr”在本文中可互换使用。
在一方面，提供了包含具有式(I)中所示序列(SEQ ID NO：1)的肽的生长激素释放激素(GHRH)类似物或其可药用盐：
X1-X2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-X8-X9-Tyr-X11-X12-Val-Leu-X15-Gln-Leu-X18-Ala-X20-X21-X22-Leu-X24-X25-X26-X27-X28-X29-X30
(I)
其中：
X1是Tyr、His、N-甲基Tyr或脱氨基Tyr；
X2是Ala、D-Ala、Ser或α氨基异丁酸(Aib)；
X8是Asn、Asp、Ala、Gln、Ser或Aib；
X9是Ser、Asp、Ala或与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys；
X11是Arg或L-高精氨酸(Har)；
X12是Lys或L-鸟氨酸(Orn)；
X15是Gly或Ala；
X18是Ser或Ala；
X20是Arg或Har；
X21是Lys或Orn；
X22是Leu、Val、Ala或与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys；
X24是Gln或与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys；
X25是Asp或Ala；
X26是Ile或Ala；
X27是Met、Leu或正亮氨酸；
X28是Ser、Ala或与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys；
X29是Lys、Arg、Orn、Har、胍丁胺；以及
X30是NH2基团或Asn-NH2。
在一个实施方案中，X9、X22、X24和X28中的至少一个是与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys。
在一些实施方案中，除如本文限定的具有式(I)中所示序列的肽之外，GHRH类似物还可以包含与该肽的羧基末端共价连接的一个或更多个氨基酸(天然存在的或合成的)。在一些实施方案中，GHRH类似物在如本文限定的式(I)中所示肽的C-末端包含多至25个另外的氨基酸。在另一些实施方案中，GHRH类似物在如本文限定的式(I)中所示肽的C-末端包含多至20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个另外的氨基酸。在一些实施方案中，GHRH类似物含有约60个残基或更少，在另一些实施方案中含有约55、约50、约45、约40或约35个残基或更少。在一些实施方案中，GHRH类似物含有约29个残基至约60个残基。在另一些实施方案中，GHRH类似物含有约29个残基至约50个残基。在另一些实施方案中，GHRH类似物含有约29个残基至约44个残基。
在一些实施方案中，GHRH类似物还可以包含N-末端基团，例如C1-C16酰基(直链的或支链的、饱和的或不饱和的)；在另一个实施方案中，C1-C10酰基(直链的或支链的、饱和的或不饱和的)；在另一个实施方案中，饱和的C1-C6酰基(直链的或支链的)；或不饱和的C3-C6酰基(直链的或支链的)。在另一个实施方案中，GHRH类似物还可以包含乙酰基(CH3-CO-，Ac)。在另一些实施方案中，GHRH类似物还可以包含(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、经取代的(C1-C6)烷基、经取代的(C2-C6)烯基、经取代的(C2-C6)炔基、丙基、丁基戊基、己酰基或己烯酰基。
在一些实施方案中，GHRH类似物还可以包含式-NH2、-NHR或-NRR的C-末端基团，其中R是C1-C16酰基(直链的或支链的、饱和的或不饱和的)；在另一个实施方案中，C1-C10酰基(直链的或支链的、饱和的或不饱和的)；在另一个实施方案中，饱和的C1-C6酰基(直链的或支链的)或不饱和的C3-C6酰基(直链的或支链的)；在另一个实施方案中，乙酰基(CH3-CO，Ac)；在另一些实施方案中，(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、经取代的(C1-C6)烷基、经取代的(C2-C6)烯基或经取代的(C2-C6)炔基；或者在另一些实施方案中，C-末端基团可以是大于2kDa的直链或支链PEG链。
在一些实施方案中，GHRH类似物或其盐包含具有如本文限定的SEQ ID NO：1-11、14和18-24中任一个中所示序列的肽。
聚乙二醇(PEG)和PEG化
“聚乙二醇”或“PEG”是指支链或直链的乙二醇聚合物，其由通式HO(CH2CH2O)nH表示，其中n是至少2的整数。PEG包括具有选自约500至约50,000道尔顿或更高的范围的平均总分子量的乙二醇聚合物。PEG链的平均分子量由数字表示，例如，PEG-5,000或Peg-5K是指总分子量平均为约5,000道尔顿、或者约5千道尔顿或kDa或K(1kDa＝1K＝1000道尔顿)的聚乙二醇链。不同尺寸的PEG可商购获得并且可用于本文所述的产品和方法中，例如，平均尺寸为约200、约300、约400、约500、约600、约1,000、约1,500、约2,000、约3,000、约3,350、约4,000、约5,000、约6,000、约8,000、约10,000、约12,000、约20,000、约35,000或约50,000道尔顿。
在一个实施方案中，本文所述的一个或更多个PEG部分的平均分子量小于或等于约5kDa(本文也称为5K)。在另一些实施方案中，本文所述的一个或更多个PEG部分的平均分子量为约2kDa至约5kDa，或者为约1、约2、约3、约4或约5kDa。在另一个实施方案中，本文所述的一个或更多个PEG部分为约2kDa。此外，在一些实施方案中，具有多个PEG修饰的本文所述GHRH类似物可以通过不同尺寸的PEG部分修饰，即，同一类似物可以连接有不同尺寸的PEG部分。在另一个实施方案中，具有多个PEG修饰的本文所述GHRH类似物可以通过大约相同尺寸的PEG部分修饰。
本文所述的GHRH类似物的PEG化(即，PEG部分的连接)可以通过本领域已知的方法进行。例如，可以使用对特定氨基酸侧链具有反应性的反应性PEG化试剂。一个实例是硫醇-或巯基-反应性PEG，例如具有马来酰亚胺部分的硫醇-或巯基-反应性PEG(PEG-马来酰亚胺)，其可以与Cys侧链反应。另一个实例是胺-反应性PEG，例如具有N-羟基琥珀酰亚胺酯的胺-反应性PEG(PEG-NHS酯)，其可以与胺侧链(例如Lys)反应。在一些实施方案中，可以使用胺-或羧基-反应性试剂在N-和/或C-末端处进行PEG修饰。在另一些实施方案中，可以通过接头，即位于PEG部分和肽之间的接头或间隔区部分进行PEG修饰。这样的接头包括例如异双官能或同双官能试剂。
氨基酸
如本文所用的“氨基酸”包括天然存在的氨基酸以及肽化学中用于制备肽的合成类似物的其他氨基酸(例如，天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸、不由核酸序列编码的氨基酸等)的L-和D-异构体二者。其他氨基酸包括例如非遗传编码形式的氨基酸，例如β-丙氨酸、3-氨基-丙酸、2，3-二氨基丙酸、α-氨基异丁酸(Aib)、4-氨基-丁酸、N-甲基甘氨酸(肌氨酸)、羟脯氨酸、鸟氨酸(例如L-鸟氨酸)、瓜氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸、2-萘基丙氨酸、吡啶基丙氨酸、3-苯并噻吩丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、青霉胺、1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-羧酸、β-2-噻吩丙氨酸、甲硫氨酸亚砜、L-高精氨酸(Har)、N-乙酰基赖氨酸、2-氨基丁酸、2-氨基丁酸、2，4-二氨基丁酸(D-或L-)、对氨基苯丙氨酸、N-甲基缬氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸(HoSer)、半胱磺酸、ε-氨基己酸、6-氨基戊酸、或2，3-二氨基丁酸(D-或L-)等。
在一些实施方案中，本文所述的GHRH类似物可包括功能上等同的氨基酸残基的替换。例如，序列中的一个或更多个氨基酸残基可以被具有类似物理化学特性，即在一种或更多种特性上属于同一组群或家族的另一种氨基酸替换。在一个氨基酸家族内进行的替换通常被理解为保守替换，即保守替换可定义为在以下五组之一内的交换：(i)小的脂族非极性残基：Ala、Gly；(ii)大的非极性残基：Met、Leu、Ile、Val、Pro；(iii)不带电荷的极性残基：Ser、Thr、Cys、Tyr、Gly；(iv)极性的带负电荷残基：Asp、Glu、及其酰胺：Asn、Gln；(v)极性的带正电荷残基：His、Arg、Lys；和(vi)大的芳香族残基：Phe、Tyr、Trp。氨基酸替换的另一些实例如下：Tyr(N-甲基Tyr、脱氨基-Tyr、His、D-tyr)；Ala(D-Ala、Aib、Abu)；Val/Leu/Ile(在特定位置可互换)；Asn(Gln)；Met(正亮氨酸、Leu)；Lys(高赖氨酸、精氨酸、高精氨酸(Har)、鸟氨酸、γ氨基丁酸(Gab)、γ氨基丙酸(Gap)、胍丁胺；Arg(高精氨酸、赖氨酸、高赖氨酸、鸟氨酸、γ氨基丁酸(Gab)、γ氨基丙酸(Gap)、胍丁胺)；Asp/Glu(在特定位置可互换)；和Ser/Thr(在特定位置可互换)。
本文所述的GHRH类似物可以全部包含L-氨基酸或者包含L-和D-氨基酸的混合物。在一个实施方案中，本文提供的GHRH类似物包含至少一个D-氨基酸，例如在一个实施方案中，是D-Ala。在一个实施方案中，所述至少一个D-氨基酸位于本文提供的GHRH类似物的N-末端部分中(例如，在最后2或3个N-末端残基中)。一个或更多个D-氨基酸的存在通常产生这样的肽，其由于对蛋白酶/肽酶切割的易感性降低而提高稳定性(例如，在体内)但保留生物活性。
肽合成
肽可以通过本领域公知的人工和自动化固相操作容易地合成。可以例如通过利用“T-boc”或“Fmoc”操作进行合适的合成。用于固相合成的技术和操作在例如Solid PhasePeptide Synthesis：A Practical Approach，E.Atherton和R.C.Sheppard，由IRL，OxfordUniversity Press出版，1989中进行描述。或者，可以通过区段缩合制备肽，例如Liu等，1996；Baca等，1995；Tam等，1995；Schnolzer和Kent，1992；Liu和Tam，1994a；Liu和Tam，1994b；以及Yamashiro和Li，1988中所述的。Nakagawa等，1985中描述了可用于合成肽的另一些方法。
还可以使用标准方法使用重组DNA技术制备包含由遗传密码编码的天然存在氨基酸的肽和肽类似物。可以使用本领域公知的方法修饰(例如，通过N-末端酰化、通过乙酰化、通过C-末端酰胺化等修饰)通过重组技术产生的肽。
因此，在一些实施方案中，在本文所述的GHRH类似物含有由遗传密码编码的天然存在氨基酸的情况下，GHRH类似物可以使用重组方法产生，并且在一些实施方案中可以经受例如上述修饰(例如酰化、酰胺化等)。因此，在另一方面，提供了编码本文提供的GHRH类似物的核酸。在另一方面，提供了包含核酸的重组载体；在另一方面，提供了包含重组载体的宿主细胞。
本文所述的GHRH类似物可以通过本领域公知的许多肽纯化技术进行纯化，例如反相色谱、高效液相色谱(HPLC)、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱、凝胶电泳等等。用于纯化特定肽或肽类似物的实际条件部分地取决于合成策略和例如净电荷、疏水性、亲水性等等因素，并且对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。对于亲和色谱纯化，可以例如使用特异性结合肽或肽类似物的任何抗体。
可药用盐
本文所述的GHRH类似物是碱性的，但含有负电荷和正电荷二者；因此，可以使用阳离子和阴离子二者形成盐。因此，本文所述的GHRH类似物可以是盐的形式，例如可药用的无毒盐，例如酸加成盐。“可药用盐”是指化合物的盐，其保留母体化合物的生物活性并且在生物学上或其他方面不是不合期望的。这样的盐可以在GHRH类似物的最终分离和纯化过程中原位制备，或者可以通过使游离碱官能团与合适的酸反应而单独制备。本文公开的许多GHRH类似物由于存在氨基和/或羧基或与其类似的基团而能够形成酸和/或碱盐。可药用酸加成盐的一些实例包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、延胡索酸盐、葡糖酸盐、丹宁酸盐、马来酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、藻酸盐、双羟萘酸盐、苹果酸盐、抗坏血酸盐、酒石酸盐等等。特别优选的是低溶解度的盐，例如低分子量脂肪酸(C4-C12)的盐、双羟萘酸盐等等。另一些盐包含金属阳离子例如Zn+2和Mg+2，其可以表现出长活性持续时间。
组合物/制剂
在另一方面，提供了包含本文所述的GHRH类似物或其盐的组合物(例如，药物组合物)或制剂。在一个实施方案中，所述组合物还包含一种或更多种可药用的载体、赋形剂和/或稀释剂。
如本文所用的“可药用的”(或“生物学上可接受的”)是指在体内不具有(或具有很少)毒性或不利生物学作用的物质。其是指那些与合理的利益/风险比相称的适合用于与对象(例如动物、哺乳动物、人)的生物流体和/或组织和/或器官接触而没有过多毒性、刺激性、变应性应答、或者其他问题或并发症的化合物、组合物和/或剂型。
术语“可药用的载体、赋形剂和/或稀释剂”是指通常用于制备药物组合物的添加剂，并且包括例如溶剂、分散介质、盐水溶液、表面活性剂、增溶剂、润滑剂、乳化剂、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、螯合剂、pH调节剂、安抚剂、缓冲剂、还原剂、抗氧化剂、等张剂、吸收延迟剂等等(参见，例如，Rowe等，Handbook of Pharmaceutical Excipients，Pharmaceutical Press；第6版，2009)。
还可以将本文所述的GHRH类似物与阴离子或中性脂质一起配制以形成肽脂质体。例如，将血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)与阴离子磷脂一起配制以防止蛋白水解性降解并增强体内生物活性(Gololobov等，1998)。另外，PCT公开WO 95/27496和Gao等，1994描述了与在水溶液中的递送相比使用脂质体递送VIP。发现，VIP在脂质体中的包封保护肽免于蛋白水解性降解，并且在高血压仓鼠中与在水溶液中的VIP相比显著增强VIP的能力且实现平均动脉压的降低。脂质体可以由本领域公知且常规用以产生脂质体的脂质材料的组合产生，并且所述脂质材料包括与水溶性聚合物共价键合的至少一种脂质组分。脂质可包括相对刚性的种类，例如鞘磷脂；或流体类型，例如具有不饱和酰基链的磷脂。
本文所述的聚合物可以包括SSL技术和可用于增加蛋白质的循环半衰期的技术的领域中已知和常规使用的任何化合物，包括例如聚乙烯醇、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚甘油、聚唑啉(polyaxozline)、或具有聚合物头基的合成脂质。在一些实施方案中，聚合物是平均分子量为约1000至约5000道尔顿的PEG。
用于产生本文所述脂质体的脂质可包括与PEG共价键合的二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)、磷脂酰胆碱(PC)和/或磷脂酰甘油(PG)，其进一步与胆固醇(Choi)组合。在一个实施方案中，用于产生脂质体的脂质和胆固醇的组合的PEG-DSPE∶PC∶PG∶Chol摩尔比为0.5∶5∶1∶3.5。
本文所述的GHRH类似物的控制释放还可以通过将高分子量聚合物和合适的载剂混合来获得。这样的技术在从可注射贮库制剂中控制释放肽和小分子的领域中是公知的。可与本文提供的方法和组合物结合使用的聚合物是可生物侵蚀的，即其在患者体内的水性流体中逐渐降解(例如酶促降解)、或水解、溶解、物理侵蚀或以其他方式崩解。一般地，聚合物由于水解或物理侵蚀的作用而发生生物侵蚀，但是主要的生物侵蚀过程通常是水解或酶促降解。
这样的聚合物包括但不限于聚丙交酯、聚乙交酯、基于己内酯的聚合物、聚己内酯、聚酸酐、聚胺、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚二烷酮、聚缩醛、聚缩酮、聚碳酸酯、聚原碳酸酯、聚磷腈、琥珀酸酯、聚(苹果酸)、聚(氨基酸)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚羟基纤维素、羟甲基纤维素聚磷酸酯、聚酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、多糖、甲壳质、壳聚糖、透明质酸及其共聚物、三元共聚物和混合物。如US7368126B2中给出的聚合物的一些实例包括但不限于聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)50∶50 RG502、聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)50∶50 RG502H、聚D，L丙交酯( R 202、 R203)；聚二烷酮( X 210)(Boehringer Ingelheim Chemicals，Inc.，Petersburg，Va)。另外的实例包括但不限于DL-丙交酯/乙交酯100∶0(聚合物100DL高、聚合物100DL低)；DL-丙交酯/乙交酯85/15(聚合物8515DL高、聚合物8515DL低)；DL-丙交酯/乙交酯75/25(聚合物7525DL高、聚合物7525DL低)；DL-丙交酯/乙交酯65/35(聚合物6535DL高、聚合物6535DL低)；DL-丙交酯/乙交酯54/46(聚合物5050DL高、聚合物5050DL低)；DL-丙交酯/乙交酯54/46(聚合物5050DL 2A(3)、聚合物5050DL 3A(3)、聚合物5050DL 4A(3))(Medisorb TechnologiesInternational L.P.，Cincinnati，Ohio)；聚D，L-丙交酯-共-乙交酯50∶50；聚D，L-丙交酯-共-乙交酯65∶35；聚D，L-丙交酯-共-乙交酯75∶25；聚D，L-丙交酯-共-乙交酯85∶15；聚DL-丙交酯；聚L-丙交酯；聚乙交酯；聚ε-己内酯；聚DL-丙交酯-共-己内酯25∶75；和聚DL-丙交酯-共-己内酯75∶25(Birmingham Polymers，Inc.，Birmingham，Ala.)。
施用途径
本文所述的GHRH类似物或其盐、及其组合物可以通过以下途径施用于对象(例如动物、哺乳动物、人)：皮下(s.c)、肌内(i.m.)、静脉内(i.v)、经口、或局部；鼻内或通过经肺吸入；通过透皮递送；或者以由生物可降解的合适聚合物(例如D，L-丙交酯-共-乙交酯)配制的贮库形式(例如，微囊剂、微粒或圆柱棒状植入物)。在一个实施方案中，微囊剂或微粒用作贮库形式。另一些等效施用模式也在本文提供的方法和组合物的范围内，即持续滴注、皮肤贴剂、贮库型注射剂、输注泵和控时释放模式例如微囊剂等等。施用可以在任何生理上可接受的可注射载体中进行，生理盐水是可接受的，但也可以使用本领域已知的其他载体。
GHRH类似物或其盐、及其组合物优选地与可药用载体例如等张盐水一起肠胃外、肌内、皮下或静脉内施用。或者，GHRH类似物或其盐、及其组合物可以作为鼻内喷雾剂与合适的载体一起施用或通过经肺吸入施用。在一个实施方案中，合适的施用途径是由生物可降解的合适聚合物例如聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯配制的贮库形式，如含有分散的拮抗剂化合物的微囊剂、微粒或圆柱形植入物。
适应证
GHRH引发从垂体的脉冲式生长激素(GH)分泌。因此，本文所述的GHRH类似物或其盐可用于在对象中诱导或刺激GH的分泌。在一方面，提供了用于在(有此需要的)对象中诱导或刺激GH分泌的方法，其包括向对象施用有效量的如本文所述的GHRH类似物或其盐、或者包含其的药物组合物。还提供了本文所述的GHRH类似物或其盐、或者包含其的药物组合物用于在对象中诱导或刺激GH分泌的用途。还提供了本文所述的GHRH类似物或其盐、或者包含其的药物组合物用于制备用于在对象中诱导或刺激GH分泌的药物的用途。还提供了本文所述的GHRH类似物或其盐、或者包含其的药物组合物，其用于在对象中诱导或刺激GH分泌。
如本文所用的“诱导”或“刺激”是指生物活性的可测量提高。在一些实施方案中，所述提高为相对于对照生物活性提高至少约10％、20％、40％、60％、80％、90％、95％、100％(2倍)或200％(3倍)。例如，当与施用之前对象中的水平相比或相对于未施用GHRH类似物或其盐的对照对象在向对象(例如动物、人)施用GHRH类似物或其盐之后测量到GH水平提高时，发现GHRH类似物刺激GHRHr活性。
GH对肝的作用可导致IGF-1及其主要结合蛋白IGFBP3的产生。这些生物活性蛋白一起可以对肌肉、骨和软骨细胞产生合成代谢作用。GH还可以刺激脂肪分解，特别是来自内脏脂肪沉积物的脂肪分解。GHRH还可以对心脏功能具有直接和间接的作用，保护免受缺血性后遗症，神经增强引起认知提升，促进慢波睡眠和白天警觉。缺乏GH和GHRH中的一种或更多种可导致GH和IGF-1相关的病理。因此，本文提供的GHRH类似物及其盐可用于诊断，以及治疗或预防GH缺乏性病症。这些病症可包括但不限于：(1)筛选生长激素缺乏；(2)治疗下丘脑GH-RH缺乏；(3)体质性生长延迟；(4)特纳综合征；(5)家族性身材矮小；(6)具有慢性肾功能不全和严重生长迟缓的青春期前儿童；(7)具有宫内发育迟缓的婴幼儿；(8)具有垂体或下丘脑病变的放射治疗后GH缺乏的儿童；(9)长期用糖皮质激素治疗且以低于正常速度生长的儿童；以及上文提到的其他病症。
GHRH类似物在成人中的另一些临床应用可包括但不限于：降低或预防肌肉、骨和皮肤质量的损失，以及减少体脂增加，其通常伴随(1)衰老过程；(2)分解代谢状态；(3)创伤愈合；(4)骨折愈合延迟；(5)骨质疏松症；(6)由代谢综合征或HIV相关性脂肪增生导致的腹部肥胖；(7)作为对于患有慢性阻塞性肺病的营养不良患者中全肠胃外营养的补充；(8)心力衰竭；(9)在太空飞行期间和之后用以抵消GH分泌降低。太空飞行的失重显著降低生长激素的释放，这可以解释许多宇航员在长时间太空飞行之后经历的骨损失和肌肉无力；(10)轻度认知损伤(mild cognitive impairment，MCI)，其是正常衰老过程中的一部分或是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)或老年性痴呆的前期或由例如运动、意外跌倒或机动车事故中遭受的创伤性脑损伤所致。
其中GHRH类似物及其盐的施用可以有益的疾病和病症已在本领域中广泛描述(参见，例如WO 2009/009727、WO 2006/042408、WO 2005/037307和WO 2004/105789)。这样的病症/障碍/疾病包括例如与脂肪堆积相关的综合征、高胆固醇血症、肥胖、X综合征、脂肪增生、脂肪萎缩、脂肪营养不良(例如，HIV相关性脂肪营养不良综合征)、认知功能受损、白天警觉受损、免疫系统功能下降(例如免疫缺陷，例如T细胞缺陷)、肌肉蛋白分解代谢、与肌肉消耗相关的疾病/病症(例如肌肉减少症)、虚弱、放射治疗和/或化学治疗相关的副作用(例如，在HIV感染和癌症患者中)、恶病质(例如在癌症患者中)、下丘脑垂体性侏儒症、烧伤、骨质疏松症、肾衰竭、非愈合性骨折、急性/慢性衰弱性疾病或感染、创伤愈合、术后问题、泌乳衰竭、女性不孕、神经退行性疾病、GHRH受体依赖性肿瘤，以及与衰老或睡眠障碍/损伤相关的病症。
因此，在另一些方面，提供了用于以下的方法：(1)刺激白天警觉和/或认知功能，例如，在涉及衰老、轻度认知损伤(MCI)、阿尔茨海默病前期症状(阿尔茨海默病发作前)、痴呆和/或睡眠障碍(例如年龄相关性睡眠障碍)的病症中；(2)改善/预防/治疗与脂肪堆积和/或高胆固醇血症相关的代谢病症(肥胖、腹部肥胖/肥胖症、代谢紊乱的腹部肥胖、相对GH缺乏的腹部肥胖、代谢综合征或X综合征、脂肪增生、脂肪萎缩、脂肪营养不良(例如HIV相关性脂肪营养不良综合征)、血脂异常、高甘油三酯血症)；(3)改善分解代谢/消耗性病症中的合成代谢，例如在以下中观察到的那些：急性或慢性肾衰竭(例如急性或慢性肾衰竭消耗)、慢性心力衰竭(例如慢性心力衰竭消耗)、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维化(例如成人中的囊性纤维化消耗)、虚弱、烧伤、感染(脓毒症)、肌营养不良、充血性心力衰竭、神经退行性疾病(阿尔茨海默病、阿尔茨海默病前期综合征、肌萎缩侧索硬化(amyotrophiclateral sclerosis，ALS)、AIDS、长期皮质类固醇治疗后的蛋白质营养不良、非愈合性骨折后、髋部骨折、创伤、或大手术(术后问题)、骨质疏松症、长期固定、癌症相关性恶病质、肌肉减少症(例如年龄相关性肌肉减少症)、GI吸收不良(短肠综合征(Short Bowel Syndrome，SBS)、克罗恩病(Crohn′s disease))，特别是在年长对象中，例如以提高肌肉质量和/或功能；(4)提高免疫功能或重建免疫缺陷状态(例如T细胞免疫缺陷)例如与以下相关的：衰老、HIV感染/AIDS或高剂量化学治疗和/或放射治疗后(在HIV感染和癌症患者中)；(5)改变脂质参数((a)降低胆固醇；(b)降低非HDL胆固醇；(c)降低甘油三酯；和/或(d)降低总胆固醇/HDL胆固醇的比例)；(6)改变身体组成参数((a)增加瘦体重；(b)减少躯干脂肪；(c)减少内脏脂肪；(d)减小腹围；(e)减少内脏脂肪组织(VAT)；和/或(f)降低VAT/皮下脂肪组织(SAT)比率)；(7)提高生育力或治疗(女性)不孕、治疗泌乳衰竭；(8)治疗GH缺乏(例如伴随腹部肥胖的GH缺乏)，提供GH替代疗法，例如在成人中，治疗特发性身材矮小症(idiopathic shortstature，ISS)；(9)治疗GHRH受体相关肿瘤；(10)治疗下丘脑垂体性侏儒症；(11)改善创伤愈合；(12)治疗烧伤；(13)治疗急性/慢性衰弱性疾病或感染；和/或(14)预防/治疗以骨形成不足或降低为特征的病症(例如骨质疏松症)；所述方法包括向有此需要的对象施用有效量的本文所述GHRH类似物或其盐或者包含其的组合物(例如，与可药用载体/赋形剂一起)。
如本文所用的“治疗”及其变化形式是指对患有病症、疾病或者具有病症或疾病的症状的对象的施加或施用，目的是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进、降低病症或疾病和/或病症或疾病的症状的进展，或者影响病症或疾病和/或病症或疾病的症状。本文所用的“预防”及其变化形式是指对易患病症或疾病或者处于发生病症或疾病风险之中的对象的施加或施用，目的是当在疾病或病症或者其症状发生或出现之前施用时预防或延迟疾病或病症或者其症状的发生，或者降低疾病或病症或者其症状的严重程度。
如本文所用的“对象”是指温血动物。在一个实施方案中，对象是哺乳动物。在另一个实施方案中，对象是人。在一个实施方案中，对象是动物。
剂量
如本文所用的“有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现期望的生物活性(例如，诱导GH分泌)和/或预防/治疗结果(例如，预防和/或治疗上述疾病和病症)的量。本文所用的“治疗有效量”是指在治疗的情况下的有效量；“预防有效量”是指在预防的情况下的有效量。本文提供的化合物或组合物的有效量可以根据例如以下因素而变化：对象的疾病状态、年龄、性别和体重，以及化合物或组合物在对象中引发期望的响应的能力。可以调整剂量方案以提供最佳的预防/治疗响应。有效量也是预防性/治疗性有益效果超过化合物的任何毒性或有害作用的量。
所需的GHRH类似物的量取决于药物组合物的类型和施用模式。在人对象接受通过i.m.或s.c.注射或者以鼻内喷雾剂或经肺吸入的形式施用的GHRH类似物或其盐的溶液的情况下，通常的剂量为2至20mg/天，每天给予一次或分成2至4次施用/天。当向人对象静脉内施用GHRH类似物或其盐时，通常的剂量为8至80μg/kg体重/天，分成1至4次推注注射/天或作为持续输注给予。当使用GHRH类似物或其盐的贮库制剂，例如通过i.m.注射棕榈酸盐或其他低溶解度盐或者通过i.m.或s.c.施用含有分散在生物可降解聚合物中的GHRH类似物或其盐的微囊剂、微粒或植入物时，通常的剂量为1至10mg/天。在一些实施方案中，GHRH类似物或其盐以约0.1mg至约20mg的日剂量施用。在一个实施方案中，GHRH类似物或其盐以约1mg或约2mg的日剂量施用。
试剂盒/包装
本文还提供了包含本文所述GHRH类似物或其盐、或者包含其的组合物的试剂盒或包装。在一个实施方案中，试剂盒或包装还包含使用说明书，例如用于在对象中诱导或刺激GH分泌或者用于诊断、治疗或预防GH缺乏性病症。试剂盒或包装还可以包含一个或更多个容器。
实施例
通过以下非限制性实施例进一步详细地举例说明本发明。提供实施例是为了举例说明本发明，而不应解释为以任何方式限制本发明的范围。
除非另外限定或上下文另有明确指示，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。应理解，与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料均可以用于本发明的实践或测试。
缩写：
本文使用了以下缩写：
Abu：α氨基丁酸
Aib：氨基异丁酸
BHA：二苯甲基胺树脂
Boc：叔丁氧基羰基
COMU：(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉代-碳六氟磷酸盐
DIEA：二异丙基乙胺
DMF：N，N-二甲基甲酰胺
EA：酶受体
ED：酶供体
EFC：酶片段互补
EIA：酶免疫测定
ELISA：酶联免疫吸附测定
FMOC：芴基甲氧基羰基
HCTU：2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基铵六氟磷酸盐
HPLC：高效液相色谱
MALDI-TOF：基质辅助激光解吸/电离质谱
Nle：L-正亮氨酸
Orn：L-鸟氨酸
Har：L-高精氨酸
Pbf：2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
RLU：相对光单位
RP-HPLC：反相高效液相色谱
t-Bu：叔丁基
TFA：三氟乙酸
Trt：三苯甲基
命名法：
本文用于限定氨基酸残基和合成肽的命名法是由IUPAC-IUB生物化学命名委员会规定的命名法(European J.Biochem，1984，138，9-37)。天然氨基酸意指在蛋白质中发现的常见天然存在氨基酸之一，其包括：Gly(G)、Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Ser(S)、Thr(T)、Lys(K)、Arg(R)、Asp(D)、Asn(N)、Glu(E)、Gln(Q)、Cys(C)、Met(M)、Phe(F)、Tyr(Y)、Pro(P)、Trp(W)和His(H)。括号中给出了单字母代码。其他缩写是Nle(正亮氨酸)、Aib(氨基异丁酸)、Abu(α氨基丁酸)、Orn(鸟氨酸)和Har(高精氨酸)。单字母代码中的小写字母用于表示D-氨基酸，例如“a”代表D-Ala。
实施例1：材料和方法
GHRH类似物的合成和制备
使用具有适当侧链保护的芴基甲氧基羰基保护的α-氨基酸和载量为0.75mmol/g的二苯甲基胺(BHA)树脂(Bachem AG)，使用人工或自动化固相肽合成方法制备本文所述的GHRH类似物。在氨基酸偶联之前，将6-氨基己酸和Rink接头偶联到树脂上，然后使用[2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基铵六氟磷酸盐](HCTU)或(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉代-碳六氟磷酸盐(COMU)与二异丙基乙胺(DIEA)在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中偶联Fmoc-[9H-芴-9-基甲氧基羰基]保护的氨基酸约1小时。使用在DMF中的20％(v/v)哌啶进行Fmoc脱保护约0.5小时。使用乙酸酐和DIEA进行用乙酰基对本文所述肽进行N-封端的一般操作。合成完成之后，在同时进行侧链脱保护下将肽从固相支持物上切下。通过使用在0.1％三氟乙酸(TFA)中的乙腈梯度在C18-柱上进行制备型RP-HPLC来对粗制线性(也称为直链的或未支化的)肽进行进一步纯化。将肽真空干燥以除去乙腈并从0.1％TFA中冻干。通过分析型高效液相色谱(HPLC)评估纯度，并使用VoyagerTM仪器(PerSeptive Biosystems Inc.)通过基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI-TOF MS)分析确定质量。制备了GHRH类似物1至16，如表1中所示。
表1：本研究中制备的GHRH类似物
1a＝D-丙氨酸；O＝L-鸟氨酸；Har＝L-高精氨酸；C(Peg-2K)是与约2kDa的PEG聚合物缀合的Cys；C(Peg-5K)是与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys；C(Peg-40K)是与约40kDa的PEG聚合物缀合的Cys。
实施例2：PEG化GHRH肽在基于细胞的Hit(DiscoveRxTM)测定中的激动剂效力的测定
DiscoveRxTM开发了一组稳定表达通过cAMP传导信号的未标记GPCR的细胞系。Hit cAMP测定使用由DiscoveRxTM开发的称为酶片段互补(Enzyme FragmentComplementation，EFC)的技术(其具有β-半乳糖苷酶(β-Gal)作为功能性报道子)，以均匀的非成像测定形式通过Gs第二信使信号传导监测GPCR的激活。
根据标准操作由冷冻贮存液扩增cAMP HunterTM细胞系。将细胞以20μL的总体积接种到白壁384孔微板中，并在测试前在37℃下孵育合适的时间。使用DiscoveRxTMHitHunterTM cAMP XS+测定确定cAMP调节。对于激动剂测定，将细胞与样品一起孵育以诱导响应。从细胞中吸出培养基并用15μL2∶1HBSS/10mM Hepes：cAMP XS+Ab试剂替换。进行样品贮存液的中间稀释以在测定缓冲液中产生4x样品。将4.5μL的4x样品添加到细胞中并在37℃或室温下孵育30或60分钟。载剂浓度为1％。在适当的化合物孵育之后，通过在室温下与20μL cAMP XS+ED/CL裂解混合物一起孵育1小时，然后与20μL cAMP XS+EA试剂孵育3小时，产生测定信号。用PerkinElmer EnvisionTM仪器在产生信号后读取微板用于化学发光信号检测。使用CBIS数据分析套件(ChemInnovation，CA)分析化合物活性。对于Gs激动剂模式测定，使用下式计算百分比活性：％活性＝100％x(测试样品的平均RLU-载剂对照的平均RLU)/(最大对照的平均RLU-载剂对照的平均RLU)。结果示于表2中。
表2：GHRH类似物在对人GHRH受体特异性的基于细胞的测定中的效力(与基线相比的％EC50)和效能(与基线相比的最大响应[％])
名称 SEQ ID No： EC50(nM) 效力(％) 最大响应
GHRH<sub>1-29</sub> 25 0.36 100 104.41
类似物1(C28) 9 0.29 125 105.09
类似物2(C24) 10 0.28 130 107.97
类似物3(C22) 11 0.25 143 100.17
类似物4(C19) 12 1.32 27 94.913
类似物5(C15) 13 1.38 26 106.95
类似物6(C9) 14 0.29 123 101.87
类似物7(C8) 15 0.69 52 108.48
类似物8(C26) 16 0.98 37 105.6
类似物9(C16) 17 0.92 39 107.12
结果表明，在第8、15、16、19和26位的若干Cys-PEG(2kDa)替换是不耐受的，并且这样的肽显示出降低的效力(例如，分别为类似物7、5、9、4和8)。这种不利影响在肽的N-末端一半中特别明显。出乎意料的是，在N-末端部分中第9位(天然GHRH序列中的丝氨酸9)处连接2kDa PEG不仅耐受良好，而且使肽(类似物6)的生物活性提高123％。相比之下，在第8位(天然GHRH序列中的Asn)处的PEG化(类似物7)是不耐受的。
与天然肽相比，在第22位(天然GHRH中的Leu 22)、第24位(天然GHRH中的Gln 24)和第28位(天然GHRH中的Ser 28)处的PEG化也产生具有增强的生物活性(分别为143％、130％、125％)的肽(分别为类似物3、2和1)。
表3：GHRH类似物在对人GHRH受体特异性的基于细胞的测定中的效力(与基线相比的％EC50)和效能(与基线相比的最大响应[％])
在一项独立实验中，产生除第9位之外还在第22、24、28和31位含有2kDa(也称为2K)PEG链的GHRH类似物，并在基于GHRH受体细胞的测定中对其进行测试。结果示于表3中(分别为类似物14、13、12和11)。结果表明，在保持最大效能的同时，双PEG化肽的效力也是天然肽的2至4倍多高。
我们还通过产生含有5kDa(也称为5K)和40kDa(也称为40K)PEG链(分别为类似物15和16)的GHRH类似物研究了在第9位可耐受的PEG链的长度。体外测试显示，与体内结果相比，可以在第9位连接较长的PEG链而不丧失体外生物活性(参见实施例3)。然而，含有2KPEG的类似物(类似物10)的效力几乎是天然肽的14倍多高，并且其效力是5K和40KPEG化GHRH肽(分别为类似物15和16)的2至6倍多高。
实施例3：在Sprague-Dawley大鼠中响应于皮下注射选定的GHRH类似物的GH释放动力学
力案：Sprague-Dawley大鼠(雌性，体重250至300g)从Charles River Inc.获得。根据动物护理委员会的方案以及加拿大动物保护委员会的实验动物护理和使用指南的原则使用动物。将动物在12∶12光照：黑暗循环下维持食用标准实验室食物。将其以每笼4只大鼠的组保持。用异氟烷2.5％麻醉动物。在颈部形成中段开口以暴露颈动脉。用聚丙烯管(PE-50)对颈动脉进行插管以允许抽血。在手术准备之后，使大鼠接受溶解于20mM AcONa+5％甘露醇(pH 5)中的GHRH类似物(10至100μg/kg)的皮下注射。从每组2至4只动物中收集血样(400μL/时间点)。在药物注射之后0、10、20、30、45和60分钟通过颈动脉导管收集血样。将血液收集到含有K3EDTA的microtainer管中，混合并立即在台式离心机中以13,000RPM离心2分钟。收集血浆并置于螺帽EppendorfTM管中并快速在液氮中冷冻。然后，将样品保持在-80℃直至测定。如下所述进行GH水平的确定。
血浆样品中GH水平的确定：小心地涡旋大鼠和小鼠血浆样品，并在4℃下以9,000RPM离心2分钟。使用来自MilliporeTM(目录号EZRMGH-45K)的大鼠/小鼠生长激素ELISA试剂盒进行GH水平的确定。首先用GH ELISA测定缓冲液将样品上清液稀释20倍，并将10μL的该稀释液添加到具有90μL GH EIA测定缓冲液的ELISA板中。该操作的其余部分根据制造商的说明书进行，并使用GraphPad PrismTM软件分析获得的数据。将在GHRH肽的第8、9和28位含有PEG2K链的三种肽以0.04mg/kg的单剂量皮下注射。在血液的定时等分试样中确定生长激素水平，并示于图1中。PEG2K在GHRH肽的C末端部分(在第28位)的连接有效地刺激GH分泌。正如从基于细胞的测定中的效力结果所预期的，在第9位(Cmax：651ng/ml；AUC(0-90分钟)：29075ng/ml/90分钟)而不是8位(Cmax：397ng/ml，AUC(0-90分钟)15657ng/ml/90分钟)的PEG2K连接在大鼠中产生更大的GH分泌刺激。这些体内结果证实了体外生物学测定并且突出了GHRH序列中的第9位氨基酸位置是能够耐受短PEG链连接而不显著影响肽的生物活性的位置。
已知GHRH肽的N-末端部分埋藏在GHRH受体的细胞外环和跨膜结构域中，并且因此N-末端结构域中的几乎所有氨基酸都参与GHRH肽与受体的高亲和力结合。Felix等(1995)已经表明PEG(2K和5K)在Asn8和Lys12(其在GHRH的N-末端结构域中)的共价连接导致GHRH的生物活性降低。因此，令人惊讶的是，在第9个氨基酸处具有PEG2KPEG化的GHRH肽在体外和体内保留完整的生物活性。为了了解在生物活性受到阻碍之前可以连接在第9个氨基酸处的PEG链的长度，合成了含有2K、5K和40K PEG链的肽，并使用上述方案在雌性大鼠中对其进行测试。简单地说，将肽(0.04mg/kg)皮下注射到雌性大鼠中，并在从动物中抽取的血液的定时等分试样中确定生长激素水平。结果示于图2中。在第9位氨基酸位置处，具有5K和更高长度的PEG链的肽产生的生长激素显著少于含有2K PEG链的肽。该实验证明，长于5K的PEG链在GHRH的第9位氨基酸位置处可能不如较短的PEG链那样耐受。
本文所述的肽的序列示于表4中。在表4中，X1、X2、X8、X9、X11、X12、X15、X18、X20、X21、X22、X24、X25、X26、X27、X28、X29、X30、C(Peg-5K)、C(Peg-2K)和C(Peg-40K)如本文所述；a是D-丙氨酸；O是L-鸟氨酸；Har是L-高精氨酸；并且Z是Lys、Arg、Har或胍丁胺。
表4：本文所述的肽的序列
前述内容是对本发明的举例说明，而不应解释为对其进行限制。尽管上文已经通过本发明的具体实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员将容易理解，在示例性实施方案中可以进行许多修改而不实质上脱离本发明的教导和优点。因此，所有这些修改旨在包括在如权利要求书中限定的本发明的范围内。在权利要求书中，词语“包括/包含”用作开放式术语，基本上等同于短语“包括但不限于”。除非上下文另有明确指示，否则没有数量词修饰的名词包括一个/种或更多个/种。
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Claims (27)

1.包含具有式(I)中所示序列(SEQ ID NO：1)的肽的生长激素释放激素(GHRH)类似物或其可药用盐：
X1-X2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-X8-X9-Tyr-X11-X12-VaI-Leu-X15-Gln-Leu-X18-Ala-X20-X21-X22-Leu-X24-X25-X26-X27-X28-X29-X30
(I)
其中：
X1是Tyr、His、N-甲基Tyr或脱氨基Tyr；
X2是Ala、D-Ala、Ser或α氨基异丁酸(Aib)；
X8是Asn、Asp、Ala、Gln、Ser或Aib；
X9是Ser、Asp、Ala或与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys；
X11是Arg或L-高精氨酸(Har)；
X12是Lys或Orn；
X15是Gly或Ala；
X18是Ser或Ala；
X20是Arg或Har；
X21是Lys或Orn；
X22是Leu、Val、Ala或与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys；
X24是Gln或与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys；
X25是Asp或Ala；
X26是Ile或Ala；
X27是Met、Leu或正亮氨酸；
X28是Ser、Ala或与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys；
X29是Lys、Arg、Orn、Har或胍丁胺；以及
X30是NH2基团或Asn-NH2；
其中X9、X22、X24和X28中的至少一个是与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys。
2.权利要求1所述的GHRH类似物或其盐，其中X9、X22、X24和X28中的至少两个是与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys。
3.权利要求1所述的GHRH类似物或其盐，其中X9是与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys。
4.权利要求1或3所述的GHRH类似物或其盐，其中X22是与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys。
5.权利要求1、3和4中任一项所述的GHRH类似物或其盐，其中X24是与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys。
6.权利要求1、3、4和5中任一项所述的GHRH类似物或其盐，其中X28是与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys。
7.权利要求1或2所述的GHRH类似物或其盐，其中X9和X22各自独立地是与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys。
8.权利要求1或2所述的GHRH类似物或其盐，其中X9和X24各自独立地是与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys。
9.权利要求1或2所述的GHRH类似物或其盐，其中X9和X28各自独立地是与小于或等于约5kDa的PEG聚合物缀合的Cys。
10.权利要求1至9中任一项所述的GHRH类似物或其盐，其中所述小于或等于约5kDa的PEG聚合物是约2kDa的PEG聚合物。
11.权利要求1或2所述的GHRH类似物或其盐，其中所述GHRH类似物或其盐是以下或其可药用盐：
YaDAIFTASYROVLAQLSAROALQDILC(Peg-2K)KN-NH2(SEQ ID NO：9)；
YaDAIFTASYROVLAQLSAROALC(Peg-2K)DILSKN-NH2(SEQ ID NO：10)；
YaDAIFTASYROVLAQLSAROC(Peg-2K)LQDILSKN-NH2(SEQ ID NO：11)；
YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALQDILSKN-NH2(SEQ ID NO：14)；
YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALQDILS-(Har)-NH2(SEQ ID NO：18)；
YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALQDILC(Peg-2K)RN-NH2(SEQ ID NO：20)；
YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALC(Peg-2K)DILSRN-NH2(SEQ ID NO：21)；或
YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROC(Peg-2K)LQDILSRN-NH2(SEQ ID NO：22)；
其中a是D-Ala，O是L-鸟氨酸(Orn)，Har是L-高精氨酸，并且C(Peg-2K)是与约2kDa的PEG聚合物缀合的Cys。
12.权利要求11所述的GHRH类似物或其盐，其中所述GHRH类似物或其盐是：
YaDAIFTASYROVLAQLSAROALQDILC(Peg-2K)KN-NH2(SEQ ID NO：9)。
13.权利要求11所述的GHRH类似物或其盐，其中所述GHRH类似物或其盐是：
YaDAIFTASYROVLAQLSAROALC(Peg-2K)DILSKN-NH2(SEQ ID NO：10)。
14.权利要求11所述的GHRH类似物或其盐，其中所述GHRH类似物或其盐是：
YaDAIFTASYROVLAQLSAROC(Peg-2K)LQDILSKN-NH2(SEQ ID NO：11)。
15.权利要求11所述的GHRH类似物或其盐，其中所述GHRH类似物或其盐是：
YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALQDILSKN-NH2(SEQ ID NO：14)。
16.权利要求11所述的GHRH类似物或其盐，其中所述GHRH类似物或其盐是：
YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALQDILS-(Har)-NH2(SEQ ID NO：18)。
17.权利要求11所述的GHRH类似物或其盐，其中所述GHRH类似物或其盐是：
YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALQDILC(Peg-2K)RN-NH2(SEQ ID NO：20)。
18.权利要求11所述的GHRH类似物或其盐，其中所述GHRH类似物或其盐是：
YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROALC(Peg-2K)DILSRN-NH2(SEQ ID NO：21)。
19.权利要求11所述的GHRH类似物或其盐，其中所述GHRH类似物或其盐是：
YaDAIFTAC(Peg-2K)YROVLAQLSAROC(Peg-2K)LQDILSRN-NH2(SEQ ID NO：22)。
20.药物组合物，其包含权利要求1至19中任一项所述的GHRH类似物或其盐。
21.权利要求20所述的药物组合物，其还包含一种或更多种可药用的载体、赋形剂和/或稀释剂。
22.用于在有此需要的对象中诱导生长激素分泌的方法，其包括向所述对象施用有效量的权利要求1至19中任一项所述的GHRH类似物或其盐或者权利要求20或21所述的药物组合物。
23.权利要求1至19中任一项所述的GHRH类似物或其盐或者权利要求20或21所述的药物组合物用于在对象中诱导生长激素分泌的用途。
24.权利要求1至19中任一项所述的GHRH类似物或其盐或者权利要求20或21所述的药物组合物用于制备用于在对象中诱导生长激素分泌的药物的用途。
25.用于在有此需要的对象中治疗、预防或诊断GH缺乏性病症的方法，其包括向所述对象施用有效量的权利要求1至19中任一项所述的GHRH类似物或其盐或者权利要求20或21所述的药物组合物。
26.权利要求22或25所述的方法，其中所述GHRH类似物或其盐以约0.1mg至约10mg的日剂量施用。
27.权利要求22、25和26中任一项所述的方法，其中所述GHRH类似物或其盐通过静脉内、经口、透皮、皮下、黏膜、肌内、鼻内或经肺途径施用。
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